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一种制备奈西利肽的方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及奈西利肽的固相一液相结合的制备方法。
背景技术
奈西利肽(Nesiritide)又称人脑利钠肽，由Sudoh于1988年从猪脑组织中分离出来，是内源性利钠家族的重要成员之一，主要由心脏分泌。其结构与心钠素相似，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素分泌等作用，主要用于治疗心力衰竭等，其效果较好且副作用小，是一种很有市场前景的多肽药物。
奈西利肽(Nesiritide)序列如下所示：

现有技术由于所选取树脂和氧化手段的原因，导致奈西利肽的收率低，成本高，环境污染大，不利于奈西利肽大规模的产业应用。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的奈西利肽的固—液结合的合成工艺。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种固相法和液相法结合制备奈西利肽的新工艺，包括以下步骤：
1)由Fmoc-His(Trt)-OH和替代度为0.3—1.5mmol/g的HMPB-AM树脂反应得到Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂；
2)在缩合剂、接肽试剂的作用下，通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到侧链全保护线性奈西利肽HMPB-AM树脂；
3)裂解，得到线性奈西利肽粗肽；
4)采用液相氧化得到奈西利肽粗肽；
5)纯化、转盐，冻干。
步骤1)所述的“反应”指HMPB-AM树脂经过DMF或DCM浸泡，然后加入Fmoc-His(Trt)-OH，DIEA或DMAP，在10-50℃的条件下反应制得Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂。其中优选DIEA，温度优选室温，DIEA或DMAP摩尔数为树脂的2-20倍，Fmoc-His(Trt)-OH摩尔数为树脂的2-5倍。HMPB-AM树脂替代度优选0.5mmol/g。
步骤2)所述“固相合成法”特指多肽的固相合成法，所述的“缩合剂”是指多肽固相合成法常用的缩合剂，优选DIC/HOBt、PyBOP/HOBt或HATU/HOAt；接肽碱性试剂是指多肽固相合成法常用的有机碱，优选TMP、NMM或DIEA；本发明的固相合成法采用20％DBLK(20％哌啶/DMF)或NaOH/MeOH为脱帽剂，优选20％DBLK。
步骤3)所述的“裂解”是指侧链全保护线性奈西利肽HMPB-AM树脂得到侧链全保护线性奈西利肽的过程，即通过本领域常用的“切肽反应”获得，本发明所选取的裂解剂为TFA。侧链全保护线性奈西利肽HMPB-AM树脂是指末端Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联结束后的Fmoc脱保护后的线性奈西利肽HMPB-AM树脂。
步骤4)所述的“液相氧化”是在液相中对线性奈西利肽进行氧化，优选液相鼓氧气氧化，即氧气液相氧化线性奈西利肽，可通过向液相中通入氧气实现。
步骤5)所述“纯化”优选使用高效液相色谱纯化。
本发明与已有技术相比，工艺具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
制备流程示意：

具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
 

Fmoc9-芴甲氧羰基HBTUO-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐HATUO-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐TBTUO-(苯并三唑-1-氧)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟硼酸盐PyBOP(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐DIC二异丙基碳二亚胺HOBt1-羟基苯并三唑HOAt1-羟基-7-偶氮苯并三唑DIEAN，N-二异丙基乙胺TMP2，4，6-三甲基吡啶pbf2，2，4，6，7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonylTrt三苯甲基tBu叔丁基
 DMFN，N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷DBLK六氢吡啶/DMF溶液HMPB-AM树脂4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)butyryl-AM-polystyrenePIP六氢吡啶或哌啶DMF二甲基甲甲酰胺TFA三氟乙酸
具体实施例
实施例1：Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂的制备
将HMPB-AM树脂7.2g，替代度为1.1mmol/g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，将4.9g Fmoc-His(Trt)-OH，加入上述装有树脂的反应柱中反应2小时，为提高反应效率可选择加入DIEA5—15ml。反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用甲醇封闭30分钟，后用甲醇收缩得到Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂，检测替代度为0.19mmol/g。
实施例2：侧链全保护奈西利肽-HMPB-AM树脂的制备
称取20g Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂(0.19mmol/g，3.8mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀0.5小时。溶胀结束，用20％DBLK去除Fmoc保护，后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将6.16g Fmoc-Arg(pbf)-OH(9.5mmol)，1.5g HOBt(11.4mmol)，1.8g DIC(14.3mmol)溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，加入固相反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。重复以上步骤，依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH等剩余氨基酸的连接。当Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联结束、脱除Fmoc后，将树脂用DMF洗涤3次，DCM洗3次，后用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到侧链全保护奈西利肽-HMPB-AM树脂37.07g(树脂增重率95.6％)。
实施例3：侧链全保护奈西利肽-HMPB-AM树脂的规模制备
称取825g Fmoc-His(Trt)-HMPB-AM树脂(0.19mmol/g，156.8mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀0.5小时。溶胀结束，用20％DBLK去除Fmoc保护，后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将254.3g Fmoc-Arg(pbf)-OH(392mmol)，63.5g HOBt(470.4mmol)，74.3g DIC(588mmol)溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，加入固相反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。重复以上步骤，依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH等剩余氨基酸的连接。当Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联结束、脱除Fmoc后，将树脂用DMF洗涤3次，DCM洗3次，后用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到侧链全保护奈西利肽-HMPB-AM树脂1458.26g(树脂增重率88.3％)。
实施例4：线性奈西利肽粗肽的制备
将192.12g侧链全保护奈西利肽-HMPB-AM树脂加入到50L反应釜中，配制裂解试剂30L(三氟乙酸0.3L，DCM29.7L)，将裂解试剂倒入树脂中，室温反应4小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液，将滤液减压蒸干，并且真空干燥，得到线性奈西利肽粗肽67.03g。
实施例5：奈西利肽粗肽的制备
将12.32g线性奈西利肽粗肽进行液相鼓氧氧化，反应pH值介于8.0至9.0，反应液浓度介于0.1mg/ml至0.5mg/ml，利用分析色谱跟踪反应，待线性奈西利肽基本消失时终止反应，固相萃取浓缩，得到11.8g奈西利肽粗品
实施例6：奈西利肽精肽的制备
将11.8g奈西利肽粗品使用高效液相制备色谱纯化，经过转盐，浓缩，冻干得到1.24g奈西利肽精肽(HPLC纯度>98.5％，收率18.0％)，总收率5.8％。
综上所述：本发明采用替代度在0.3—1.5mmol/g的HMPB-AM树脂，采用方便的固相法和液相氧化法结合制备奈西利肽，该工艺具有反应操作简单、后处理容易、收率高、等特点，适于规模化生产。对形成二硫键的长肽合成具有借鉴意义。
序列表
<110>深圳市瀚宇药业有限公司
<120>一种制备奈西利肽的方法
<140>2009101048609
<141>2009-01-09
<160>1
<210>1
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>DISULFID
<222>(10)...(26)
<223>“FROM”和“TO”终点均是Cys，二硫键是链-间键
<400>1