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菊芋组织培养的方法及其专用培养基
    【技术领域】

    本发明涉及一种植物组织培养领域，特别涉及一种菊芋组织培养的方法其专用培养基。

    背景技术

    菊芋(Helianthus tuberosus L.)又名洋姜，鬼子姜，为菊科向日葵属多年生植物。叶片基部下延在两侧成翼为不完全叶，对生、轮生或互生于直立茎上；茎秆高度一般2m左右；管状花黄色，头状花序较小；果实为瘦果，一般不能正常成熟，没有发芽能力，不能种子繁殖；块状地下茎，其产量受地理位置、栽培品种和生长环境等方面因素影响，多在1250‑5000公斤/亩范围。菊芋原产北美，我国各地普遍栽培。耐旱、耐寒、耐各种病害、抗风沙、以块茎繁殖，即使在不施肥的废墟、撂荒、盐碱等地块都能生长，适应性很强。

    菊芋是一种多用途原料植物，块茎中含有丰富的菊糖，可供食用。菊糖转为果糖后，不仅甜度高(是蔗糖的1.8倍)，而且其在体内代谢不受胰岛素影响，进入血液速度慢，高血压、肥胖病、糖尿病患者均可食用，对人类的饮食健康有着非常重要的作用，是制糖和生产高果糖浆的原料。菊芋也能提制酒精和白酒，果糖发酵后可用来生产乙醇，每升块茎汁液可以获得每升大约100g乙醇，每公顷每年生产的块茎可以转化成4500L乙醇和碳氢燃料，被称为“绿色石油”，是很好的代用燃料。此外，新鲜的茎、叶可做饲料；茎杆中的纤维也可供造纸用等。因此，菊芋是一种用途广泛、极具开发潜力的植物。

    【发明内容】

    本发明的目的在于提供一种菊芋的丛生芽分化培养基。

    本发明提供的菊芋的丛生芽分化培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：IAA、6‑BA、ZT、碳源和凝胶剂；

    所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

    所述丛生芽分化培养基中IAA的终浓度是0.05‑0.15mg/L、6‑BA终浓度是0.1‑2.0mg/L、ZT的终浓度是0.3‑0.5mg/L。

    表1.MS基本培养液的溶质

    

    

    上述凝胶剂可以是琼脂粉、卡拉胶或Gel rite等组织培养常用固化剂，优选的是琼脂；琼脂以能达到的培养基硬度为基础，可适当调整用量，本发明中所有培养基中的琼脂均可以是6g/L。

    上述碳源可以是20‑40g/L的葡萄糖或蔗糖，优选为30g/L蔗糖。

    进一步，上述丛生芽分化培养基中IAA、6‑BA和ZT的终浓度分别是如下1)‑4)中任一种：

    1)IAA为0.05‑0.15mg/L、6‑BA为0.5‑1.5mg/L和ZT为0.3‑0.5mg/L；

    2)IAA为0.1mg/L、6‑BA为0.5mg/L和ZT为0.4mg/L；

    3)IAA为0.1mg/L、6‑BA为1.0mg/L和ZT为0.4mg/L；

    4)IAA为0.1mg/L、6‑BA为1.5mg/L和ZT为0.4mg/L。

    本发明的又一目的是为了提供一种生产菊芋再生苗的方法。

    本发明提供的生产菊芋再生苗的方法，包括以下步骤：

    a)将菊芋的带叶茎段置于上述的丛生芽分化培养基中培养，得到苗；

    b)将步骤a)得到的苗转接到生根培养基中进行生根培养，得到菊芋再生苗。

    所述生根培养基是在MS基本培养液中，添加IAA、NAA、6‑BA、ZT、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；

    所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

    所述生根培养基中IAA的终浓度是0.1‑0.3mg/L，NAA的终浓度为0.5‑1.5mg/L，6‑BA的终浓度为0.05‑0.15mg/L，ZT的终浓度为0.05‑0.15mg/L以及蔗糖的终浓度为20‑40g/L。

    进一步，上述生根培养基中IAA、NAA、6‑BA和ZT的终浓度分别是如下1)‑3)中任一种：

    1)IAA 0.2mg/L、NAA 0.5mg/L、6‑BA 0.1mg/L和ZT0.1mg/L；

    2)IAA 0.2mg/L、NAA 1.0mg/L、6‑BA 0.1mg/L和ZT0.1mg/L；

    3)IAA 0.2mg/L、NAA 1.5mg/L、6‑BA 0.1mg/L和ZT0.1mg/L。

    上述菊芋的带叶茎段是由菊芋顶芽置于顶芽培养基中培养得到的无菌小苗经剪切得到的。

    所述顶芽培养基是在MS基本培养液中，添加IAA、6‑BA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基；所述顶芽培养基中IAA的终浓度为0.05‑0.15mg/L，6‑BA的终浓度为0.05‑0.1mg/L以及蔗糖的终浓度为20‑40g/L。

    进一步，上述顶芽培养基中IAA和6‑BA终浓度分别是如下1)‑3)中任一种：

    1)IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为0.1mg/L；

    2)IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为0.5mg/L；

    3)IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为1.0mg/L。

    上述生产菊芋再生苗的方法中的步骤a)与步骤b)之间还有一继代培养的步骤；所述继代培养的步骤是将所述步骤a)得到的苗转接在继代培养基上扩繁得到无根苗的步骤；所述继代培养基为上述的丛生芽分化培养基。

    上述菊芋顶芽可以是经过预处理的，所述预处理是将菊芋顶芽用70％的乙醇消毒后，再用0.1％的HgCl₂进行消毒，然后用无菌水冲洗至少一次。

    本发明的方法是利用菊芋的顶芽作为外植体建立组织培养体系，最终通过诱导丛生芽的分化建立稳定高效的组织培养体系。该体系可用于菊芋的快速繁殖，也可以用于外源基因的快速遗传转化、还可用于分化率遗传研究、组织培养的材料选育等方面。

    采用本发明提供的菊芋组织培养的方法，丛生芽的分化率可达到100％，每个芽的年增殖系数理论上达1.6×10⁷以上，生根率可达95％，移栽成活率可达95％。

    【附图说明】

    图1为菊芋顶芽无菌苗。

    图2为菊芋诱导分化得到的丛生芽。

    图3为菊芋再生苗的生根情况。

    【具体实施方式】

    下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

    下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

    实施例1、菊芋再生苗的获得及其观察分析

    一、带叶茎段的获得

    1)外植体的获得

    选生长健壮的菊芋(从北京市石景山苹果园农贸市场购买)块茎作材料，在28℃，5000Lx、14h/D光照培养箱中萌发培养10天，取顶芽作外植体，建立无菌体系，提供诱导不定芽的材料。

    2)外植体的预处理

    取上述步骤1)中健康饱满的菊芋顶芽，用70％的乙醇表面消毒1分钟，再用0.1％的升汞消毒10分钟，灭菌蒸馏水洗三次，每次10分钟。将预处理好的菊芋顶芽外植体备用。

    3)得到无菌小苗

    将上述步骤2)中处理好的菊芋顶芽外植体接种到顶芽培养基中培养，得到无菌小苗。

    上述顶芽培养基是在MS基本培养液中添加IAA、6‑BA、蔗糖和琼脂得到的培养基。其中蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为6g/L，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，该培养基的pH值为5.8‑6.0；

    IAA和6‑BA的终浓度设置为以下T1、T2、T3三组：

    T1：IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为0.1mg/L；

    T2：IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为0.5mg/L；

    T3：IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为1.0mg/L。

    培养基的灭菌均采用121℃灭菌20分钟高压湿热灭菌。

    顶芽外植体培养的条件为：光照培养箱中，温度为25℃±2，光照时间为12小时，光照强度为90μM m^‑2s^‑1。

    4)统计观察

    实验重复3次，统计观察上述步骤3)中三组顶芽培养基的培养效果。接种在顶芽培养基中的菊芋顶芽在光照培养箱中培养2～3周后大部分都能萌发长出幼叶，实验结果见下表2。从表2可以看出，萌发率最高且生长最好的是T3培养基(IAA的终浓度为0.1mg/L，6‑BA的终浓度为1.0mg/L)，培养1.5个月后，顶芽生长旺盛，苗高达2.0cm‑4.0cm。其中T3培养基培养1个月的照片如图1所示。

    表2.顶芽在不同顶芽培养基中的萌发情况统计(平均值±标准差)

    

    备注：每组实验重复3次，每次10瓶，每瓶3个外植体。

    二、丛生芽的获得

    1)带叶茎段的获得

    采用上述步骤一的T3培养基中培养得到无菌小苗剪成5～10mm长短的带叶茎段备用。

    2)诱导丛生芽分化

    将上述步骤1)中得到的带叶茎段接种到丛生芽分化培养基中培养，得到丛生芽。

    上述丛生芽分化培养基是在MS基本培养液中添加如下物质得到的培养基：IAA、6‑BA、ZT、碳源和凝胶剂；其中蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为6g/L，该培养基的pH值为5.8‑6.0，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

    将丛生芽分化培养基中IAA、6‑BA和ZT的终浓度设置为B1‑B6六组：

    B1：IAA为0mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.4mg/L；

    B2：IAA为0.1mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.4mg/L；

    B3：IAA为0.1mg/L，6‑BA为0.5mg/L，ZT为0.4mg/L；

    B4：IAA为0.1mg/L，6‑BA为1.0mg/L，ZT为0.4mg/L；

    B5：IAA为0.1mg/L，6‑BA为1.5mg/L，ZT为0.4mg/L；

    B6：IAA为0.1mg/L，6‑BA为2.0mg/L，ZT为0.4mg/L。

    培养基的灭菌均采用121℃灭菌20分钟高压湿热灭菌。

    诱导丛生芽的培养条件为：光照培养箱中，温度为25℃±2，光照时间为14小时，光照强度为100μM m^‑2s^‑1。

    3)统计观察

    实验重复3次，统计观察上述B1‑B6各组丛生芽分化培养基诱导分化丛生芽的效果。实验结果见下表3。从表3可以看出，在光照培养箱中培养4周后，高细胞分裂素、低生长素B3‑B5培养基中分化较好，以B4最好，可从茎段叶腋处和基部长出腋芽和不定芽，细胞分裂素过高将会抑制不定芽的分化。其中B3培养基中培养4周的照片如图2所示。

    表3、不同丛生芽分化培养基的丛生芽诱导情况(平均值±标准差)

    

    备注：每组实验重复3次，每次10瓶，每瓶接5个茎段。

    三、继代培养得到无根苗

    在得到步骤二中的从生芽后进一步进行继代培养。经过复数次的继代培养，可得到所需数量的无根苗。继代培养的次数可根据所需无根苗的数量和继代培养的增殖系数而定。

    以B1‑B6各自对应的丛生芽分化培养基作为继代培养基，分别剪取各培养基中长出的所有小芽(包括腋芽)，分别剪切成带叶茎段，并将较高的小芽切成长约10～20mm带叶茎段，按形态学向上的原则，将茎段的下端插入到各自的继代培养基上培养(培养条件与步骤二中的一致)。培养至1个月，每个培养物从叶腋处和基部长出4‑7个腋芽和不定芽，其中B3‑B5培养基中分化最好。按此方法每个月继代培养，分化频率为100％，每个芽的年增殖系数理论上为1.6×10⁷以上。

    四、再生苗的获得

    1)诱导生根

    选取上述步骤三中得到的生长健壮、高度为1.5‑3.0cm的无根苗转接到生根培养基中进行生根培养，得到菊芋再生苗。

    上述生根培养基是在MS基本培养液中，添加IAA、NAA、6‑BA、ZT、蔗糖和琼脂得到的培养基；其中蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂的终浓度为6g/L，pH值为5.8‑6.0，MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

    其中IAA、NAA、6‑BA和ZT的终浓度设置为R1‑R4四组：

    R1：IAA为0.2mg/L，NAA为0.1mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.1mg/L；

    R2：IAA为0.2mg/L，NAA为0.5mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.1mg/L；

    R3：IAA为0.2mg/L，NAA为1.0mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.1mg/L；

    R4：IAA为0.2mg/L，NAA为1.5mg/L，6‑BA为0.1mg/L，ZT为0.1mg/L。

    培养基的灭菌均采用121℃灭菌20分钟高压湿热灭菌。

    生根培养的培养条件：置于光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为10小时，光照强度为110μM m^‑2s^‑1。

    2)统计观察

    实验重复3次，统计观察上述R1‑R4各组生根培养基诱导生根的情况。无根苗在光照培养箱中培养3周统计观察，实验结果见下表4。从表4可以看出，高生长素和低细胞分裂素的R2～R4培养基都有较好效果。

    表4、不同生根培养基诱导生根的情况(平均值±标准差)

    

    备注：每组实验重复3次，每次10瓶，每瓶接5个茎段。

    3)炼苗移栽

    将步骤2)中获得的再生苗在培养瓶中再培养1周后，使根和苗生长更加粗壮(R3培养基的照片如图3所示)，即可出瓶炼苗。用自来水洗去再生苗的培养基。然后，将再生苗移栽至装有按1∶1混合的草炭土和蛭石的塑料小盆中，将其转移光照培养箱中，在温度为25℃±2，光照时间为10小时，光照强度为110μM m^‑2s^‑1条件下培养，并统计成活率。实验重复3次，统计观察。实验结果丛表5中可以看出，成活率为95％以上。

    表5、炼苗移栽的成活率

       炼苗培养时间  移栽苗数  成活苗数  成活率(％)  21天  768  741  96.5