一种芋螺毒素变异体GMVIIA及其制备方法和应用技术领域
本发明公开了一种芋螺毒素变异体GMVIIA的制备方法，属于基因工程领域。
背景技术
芋螺毒素是由海洋软体动物芋螺(Conus)分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素，通常由10-30个氨基酸残基组成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。芋螺毒素能特异性地作用于体内多种（钾、钠、钙等）离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。因此，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等方面具有广泛的应用前景。ω-芋螺毒素MVIIA（ω-MVIIA）来源于海洋生物幻芋螺（Conusmagus，也称僧袍芋螺），能特异地阻断钙离子通道，阻止疼痛信号的传导，以其为有效成分的Ziconotide（商品名PrialtTM）已被FDA批准用于治疗慢性疼痛（Terlau,Olivera.Conusvenoms:arichsourceofnovelionchannel-targetedpeptides.PhysiolRev.2004,84:41-68）。
由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生态平衡，所以，利用经典的生化提取的方法直接从芋螺中分离芋螺毒素已经难以满足研究和药物生产的需要。许多科学家希望采用多肽固相合成的方法来解决这一困难，但是人工合成芋螺毒素的成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。因此，有科学家提出可将芋螺毒素的基因转化到大肠杆菌等微生物中表达（Zhanetal.AfusionproteinofconotoxinMVIIAandthioredoxinexpressedinEscherichiacolihassignificantanalgesicactivity.BiochemBiophysResCommun.2003,311:495-500）。
在表达的重组芋螺毒素中，Trx标签（硫氧还蛋白标签）不仅有利于目的蛋白的可溶性表达，还能促进三对二硫键的正确形成。但是Trx标签本身长度为109个氨基酸残基，分子量较大，如不切除，会极大程度地影响芋螺毒素的在体内的渗透性，从而影响镇痛效果。在理论上，使用肠激酶切割重组蛋白即可去除Trx标签，但是在天然的成熟ω-MVIIA的C末端为半胱氨酸残基（Cys），当肠激酶切割位点（DDDDK）之后为半胱氨酸残基（Cys）时，肠激酶不能有效地切割。为了克服这一问题，本发明在ω-MVIIA的C末端引入了一个侧链集团较小的甘氨酸残基（Gly），研究证实，甘氨酸残基（Gly）的引入，可使芋螺毒素变异体GMVIIA被肠激酶有效切割下来。利用本发明提出的方案制备的芋螺毒素变异体GMVIIA表现出较高的镇痛活性，具有极大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于公开一种高效表达具镇痛活性的芋螺毒素变异体GMVIIA的制备方法及其应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种芋螺毒素变异体GMVIIA的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）设计并合成ω-MVIIA变异体基因GMVIIA；
（2）利用步骤（1）合成的ω-MVIIA变异体基因GMVIIA构建重组质粒pET-32a-GMVIIA，将重组质粒导入宿主菌，得到基因工程菌；
（3）将步骤（2）得到的基因工程菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基震荡培养，经IPTG诱导后高效表达产生可溶性重组蛋白Trx-GMVIIA；
（4）用镍离子亲和层析纯化后获得重组蛋白Trx-GMVIIA。
（5）切割重组蛋白Trx-GMVIIA获得重组芋螺毒素变异体GMVIIA。
其中，步骤（1）中所述的设计并合成ω-MVIIA变异体基因GMVIIA的具体方法为：根据大肠杆菌密码子使用频率优化芋螺毒素ω-MVIIA基因的密码子，在优化后的芋螺毒素ω-MVIIA的N端引入一个甘氨酸（Gly）残基，命名为GMVIIA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
其中，步骤（2）中所述的重组质粒是将步骤（1）合成的ω-MVIIA变异体基因GMVIIA经KpnI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的原核表达载体pET-32a得到的；所述宿主菌为大肠杆菌Origami（DE3）菌株感受态细胞。
其中，步骤（5）中所述的切割重组蛋白Trx-GMVIIA具体操作为：采用肠激酶切割重组蛋白Trx-GMVIIA释放出GMVIIA，进一步用镍离子亲和层析去除Trx标签，获得重组芋螺毒素变异体GMVIIA。
本发明还提供一种根据上述方法得到的重组芋螺毒素变异体GMVIIA，所述重组芋螺毒素变异体GMVIIA具有镇痛活性。
本发明另外提供一种所述重组芋螺毒素变异体GMVIIA在制备镇痛药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明借助基因工程手段在大肠杆菌中高效表达可溶性的Trx-GMVIIA（15.3kDa），经镍离子亲和层析分离纯化后，采用肠激酶切割Trx-GMVIIA，进而去除Trx标签及His标签，获得分子量较小（2.8kDa）的重组芋螺毒素变异体GMVIIA。以2.0mg/kg剂量注射小鼠，进行小鼠醋酸扭体实验，结果显示，注射GMVIIA后，小鼠的平均扭体次数为3.55次，与注射生理盐水阴性对照相比，具有显著的镇痛活性，与注射Trx-GMVIIA的阳性对照组相比，小分子量GMVIIA具有更强的镇痛活性。因此，使用本发明制备的重组芋螺毒素变异体GMVIIA具有极高的镇痛活性，在镇痛领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1：重组芋螺毒素Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA结构示意图。Trx标签能促进重组蛋白的可溶性表达，并促进形成正确的二硫键。His标签为多聚His标签，可用于镍离子亲和层析分离纯化重组蛋白。箭头所示为肠激酶的切割位点。×表示虽有肠激酶切割位点，但肠激酶并不能有效切割。
图2：肠激酶切割重组蛋白后的电泳结果。M：蛋白质marker，1：未经肠激酶切割的重组蛋白Trx-GMVIIA，2：重组蛋白Trx-ω-MVIIA的肠激酶切割产物，3：重组蛋白Trx-GMVIIA的肠激酶切割产物，4：纯化的GMVIIA。箭头所示为肠激酶切割后GMVIIA对应条带。
图3：重组芋螺毒素GMVIIA的镇痛活性分析结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明实施例所用的表达载体pET-32a易被类似功能的表达载体替换，本发明所用的表达菌株也可被类似功能的大肠杆菌菌株替换。
实施例1：芋螺毒素GMVIIA基因的合成与鉴定
根据大肠杆菌密码子使用频率，对芋螺毒素ω-MVIIA基因（GenBank：FJ959111）的密码子进行优化。为了能使肠激酶有效切割重组蛋白以去除表达标签，在芋螺毒素ω-MVIIA的N端引入一个甘氨酸（Gly）残基，命名为GMVIIA。所设计的芋螺毒素ω-MVIIA变异体GMVIIA的基因序列为SEQIDNO.1（以在GMVIIA上游引入了限制性内切酶KpnI的酶切位点，肠激酶切割位点DDDDK的编码序列），其编码的GMVIIA蛋白的序列为SEQIDNO.2。
采用化学方法合成GMVIIA基因（由上海捷瑞生物技术有限公司合成），经KpnI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的原核表达载体pET-32a（购自Novagen公司），重组质粒pET-32a-GMVIIA经DNA测序验证。为了以ω-MVIIA作为对照，用同样的方法构建重组质粒pET-32a-ω-MVIIA。
利用本发明设计表达的重组蛋白的结构示意见图1。
实施例2：重组芋螺毒素GMVIIA的表达、分离纯化和切割
采用热击法将验证正确的重组质粒pET-32a-GMVIIA、pET-32a-ω-MVIIA分别导入大肠杆菌Origami（DE3）菌株（购自Novagen公司）感受态细胞，得到基因工程菌Origami-GMVIIA、Origami-ω-MVIIA。
分别将Origami-GMVIIA、Origami-ω-MVIIA菌株接种于LB培养基（含氨苄青霉素100μg/mL），37℃震荡培养，至OD600值为0.8左右，将培养的细胞冷却至28℃，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，28℃震荡培养12小时。离心收集细胞，37℃/-20℃反复冻融5次，200w超声破碎。高速离心后，利用镍离子树脂从上清中分离带有His标签的可溶性重组Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA。纯化的重组蛋白经透析去除咪唑等杂质，然后用冷冻干燥法对重组蛋白溶液进行浓缩。用Bradford法测定溶液中蛋白质浓度，并用SDS-PAGE检测重组蛋白。
使用肠激酶对分离纯化的重组蛋白Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA进行切割，37℃过夜切割。SDS-PAGE电泳结果表明，肠激酶能有效切割重组蛋白Trx-GMVIIA，但不能切割Trx-ω-MVIIA（见图2）。可见ω-MVIIA的C端的半胱氨酸（Cys）残基会严重影响肠激酶对重组蛋白的切割效率。而在GMVIIA中，由于在设计时在C端引入了一个甘氨酸（Gly）残基，肠激酶能对重组蛋白Trx-GMVIIA进行有效切割。
经肠激酶切割后，利用镍离子树脂从切割产物中特异性截留带有多聚His的Trx标签，流出的溶液中含有释放的GMVIIA。采用Bradford法对获得的GMVIIA蛋白浓度进行测定，并采用SDS-PAGE检测。
实施例3：重组芋螺毒素GMVIIA的镇痛活性分析
实验组以实施例2中得到的重组芋螺毒素GMVIIA、Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA溶液注射小鼠，使用剂量为2.0mg/kg，阴性对照组注射生理盐水（0.9%NaCl）。每组注射20只雄性小鼠，每只小鼠的体重为20±0.2g。给药后45min，给每只小鼠注射0.2mL0.6%冰醋酸刺激扭体行为，对20min内每只小鼠的扭体动作进行计数，然后对实验数据进行统计分析。结果显示，注射Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA溶液的小鼠的平均扭体次数分别为20.60次和20.05次，生理盐水对照组为37.4次，可见重组蛋白Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA均有显著的镇痛活性，但Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA的镇痛活性无显著差异。使用肠激酶切割后纯化的GMVIIA注射小鼠，平均扭体次数为3.55次（见图3），远低于注射重组蛋白Trx-GMVIIA、Trx-ω-MVIIA的平均扭体次数。因此，使用本发明制备的重组芋螺毒素GMVIIA具有极高的镇痛活性，具有潜在的应用价值。
SEQUENCELISTING
<110>江苏大学
<120>一种芋螺毒素变异体GMVIIA及其制备方法和应用
<130>一种芋螺毒素变异体GMVIIA及其制备方法和应用
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>108
<212>DNA
<213>幻芋螺（Conusmagus）
<400>1
ctgggtaccgacgacgacgacaagggttgcaagggtaaaggcgcgaaatgtagccgtctg60
atgtatgactgctgcaccggctcgtgccgcagtggtaaatgtggctaa108
<210>2
<211>27
<212>PRT
<213>幻芋螺（Conusmagus）
<400>2
GlyCysLysGlyLysGlyAlaLysCysSerArgLeuMetTyrAspCys
151015
CysThrGlySerCysArgSerGlyLysCysGly
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