利用乙酰化二糖治疗疾病的组合物与方法.pdf

本发明提供了利用乙酰化二糖及其类似物来治疗疾病的组合物与方法。

1.  糖基转移酶的二糖抑制剂，包括结构：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。

2.  药物组合物，包括制药可接受的载体和有效剂量的权利要求1的乙酰化二糖。

3.  哺乳动物个体疾病的治疗方法，包括进行治疗有效剂量的权利要求2所述的组合物的给药。

4.  如权利要求3所述的方法，其中所述疾病为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。

5.  如权利要求3所述方法，其中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量给药。

6.  如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、
过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R，或
过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，
其中R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；Y为氧原子。

7.  如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)，或
过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。

8.  如权利要求1所述的二糖，其中所述二糖为
GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
GlcNAcβ3Galβ-O-R，
其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]_n-2-萘酚；GlcN[³H]Acβ3Galβ-O-NM或GlcNAcβ3Galβ-O-[³H]NM。

9.  减轻哺乳动物个体癌症的方法，包括对所述哺乳动物个体进行治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
且其中所述哺乳动物个体中的所述癌症被减轻。

10.  如权利要求9所述的方法，其中所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。

11.  如权利要求9所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。

12.  如权利要求9所述方法，其中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg剂量给药。

13.  抑制哺乳动物个体肿瘤转移的方法，包括治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基-，芳基-，环氧基-，酰氨基-，巯基-或卤素-取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。

14.  如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R，
过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R，或
过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，
其中，R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。

15.  如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
过-O-乙酰Galβl，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，
过-O-乙酰GlcNAcβl，3Gal-O-2-萘酚，
过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβl，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，
过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，
过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)，或
过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。

16.  如权利要求13所述的方法，其中所述二糖为
GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；
6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；
6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；
GlcNAcβ3Galβ-O-R，
其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]_n-2-萘酚；GlcN[³H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[³H]NM。

17.  调节细胞中天然发生多糖的生物合成的方法，包括用药物有效剂量的组合物接触细胞的步骤，所述组合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基-，芳基-，环氧基-，酰氨基-，巯基-或卤素-取代；
所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基、C-酰基取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。

18.  鉴别有效癌症治疗的方法，
包括步骤：
用有效剂量的二糖接触肿瘤细胞培养物，所述二糖具有结构：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
还包括步骤：
检测培养的所述肿瘤细胞的结合；及
通过所述培养的肿瘤细胞的结合减少来确定对于哺乳动物个体的所述有效的癌症治疗。

19.  如权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤细胞为腺癌细胞。

20.  如权利要求18所述的方法，还包括检测所述肿瘤细胞与选择素包被的培养皿的结合。

21.  如权利要求18所述的方法，还包括检测所述所述肿瘤细胞与凝血酶活化的血小板的结合。

22.  如权利要求18所述的方法，还包括检测所述所述肿瘤细胞与肿瘤坏死因子α(TNFα)-活化的内皮细胞的结合。

23.  如权利要求18所述的方法，还包括在免疫缺陷小鼠中检测二糖处理的肿瘤细胞的肺集落形成，并通过减少所述免疫缺陷小鼠中的肿瘤转移来鉴定对哺乳动物个体的所述有效的治疗。

24.  减轻哺乳动物疾病状态的方法，所述哺乳动物对用阻断细胞表面糖类抗原表达的化合物的治疗有反应，所述方法包括对所述哺乳动物进行治疗有效剂量的化合物的给药，所述化合物包括：
                糖-X-糖-Y-R，
或其制药可接受的盐或前药；
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。

25.  如权利要求24所述方法，其中所述糖类抗原为细胞表面受体的配体。

26.  如权利要求25所述方法，其中所述糖类抗原为Lewis糖类抗原。

27.  如权利要求26所述方法，其中所述Lewis糖类抗原为唾液酸(sLe^x)糖或唾液酸(sLe^a)糖。

28.  如权利要求25所述的方法，其中所述的糖类抗原为选择素的配体。

29.  如权利要求28所述的方法，其中所述的选择素为E-选择素、P-选择素或L-选择素。

30.  如权利要求24所述的方法，其中所述的疾病状态为肿瘤性疾病。

31.  如权利要求30所述的方法，其中所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。

32.  如权利要求30所述的方法，其中所述的肿瘤性疾病为转移性疾病。

33.  如权利要求24所述的方法，其中所述的疾病状态为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。

利用乙酰化二糖治疗疾病的组合物与方法
本研究是由国立健康研究所(NIH)基金CA46462资助的。因此政府对本发明拥有权利。
发明领域
本发明通常涉及利用乙酰化二糖及其类似物治疗疾病的组合物与方法。
发明背景
肿瘤转移被认为是依赖于血液运载的肿瘤细胞、循环血小板(促进血小板-肿瘤栓形成)与内皮间的细胞粘附，以促进在脉管系统的停留、生长和外渗。参见唐等人(Tang et al.)，《入侵转移》(InvasionMetastasis)，14卷：109-122页，1994年；迈克埃弗尔等人(McEver etal.)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：585-591页，1997年；克劳斯等人(Krause et al.)，《临床试验转移》(Clin.Exp.Metastasis)，17卷：183-192页，1999年。已有报道揭示了此过程中作为重要元件的一些类型的粘附受体和配体，包括选择素(selectin)、趋化因子和整合素(integrin)。参见唐等人(Tang et al.)，《入侵转移》(InvasionMetastasis)，14卷：109-122页，1994年；康奈基(Kannagi)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：577-584页，1997年；伯恩斯(Behrens)，《乳腺癌研究与治疗》(Breast Cancer Res.Treat.)，24卷：175-184页，1993年。总之，这些肿瘤细胞的粘附特征类似于在炎症过程中的白细胞渗出特性。在两种情况下，在细胞表面糖轭合物上，寡糖、唾液酸Lewis X[sLe^XSiaα2，3Galβ1，4(Fucα1，3)GlcNAc]与唾液酸Lewis a[sLe^aSiaα2，3Galβ1，3(Fucal，4)GlcNAc]的表达，使得细胞具有粘附内皮细胞、血小板或白细胞上的E-选择素、P-选择素和L-选择素的能力。对一种或多种选择素遗传改变的人肿瘤与小鼠的研究强调了这些相互作用在癌细胞血源性转移中的重要性。参见拜安科恩等人(Biancone et al.)，《试验医学杂志》(J.Exp.Med.)，183卷：581-587页，1996年；菜克宁等人(Renkonen et al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，74卷：296-300页，1997年；弗伦特等人(Frenette et al.)，(Thromb Haemost)，78卷：60-64页，1997年；金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年。
对所述选择素的糖类配体以O-连接的糖蛋白粘蛋白和糖酯为主，其在簇排列(clustered arrangement)中表现为sLe^X或sLe^a。参见福田(Fukuda)，《癌症研究》(Cancer Res.)，56卷：2237-2244页，1996年；堪萨斯(Kansas)，《血液》(Blood)，88卷：3259-3287页，1996年；金等人(Kim et al.)，《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)，155卷：461-472页，1999年。一些侵袭性的实体肿瘤表现出对抗sLe^X单克隆抗体、E选择素和P选择素有显著的反应性。这些肿瘤包括来自肺、结肠与乳腺的较大部分的肿瘤。参见康奈基(Kannagi)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，14卷：577-584页，1997年；莱克宁等人(Renkonenet al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，74卷：296-300页，1997年；金等人(Kim et al.)，《美国病理学杂志》(Am.J.Pathol.)，155卷：461-472页，1999年；福岛等人(Fukushima et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，44卷：5279-5285页，1984年；康奈基等人(Kannagi et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，46卷：2619-2626页，1986年；曼诺里等人(Mannoriet al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，55卷：4425-4431页，1995年；中森等人(Nakamori et al.)，(J.Clin.Oyacol.)，15卷：816-825页，1997年。有sLe^X参与的粘附作用可能通过血小板上的P选择素或白细胞上的L-选择素来稳定“肿瘤栓(neoplastic emboli)”、或通过促进粘附于并有可能渗出内皮，从而在转移的病理生理的早期步骤中发挥重要作用。参见金等人(Kim et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95卷：9325-9330页，1998年；伯斯基等人(Borsig et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98卷：3352-3357页，2001年；莱斯等人(Rice et al.)，《科学》(Science)，246卷：1303-1306页，1989年；斯通等人(Stone et al.)，《临床调查杂志》(J.Clin.Invest.)，92卷：804-813页，1993年；洪等人(Honn et al.)，《癌症转移评论》(Cancer Metastasis Rev.)，11卷：325-351页，1992年；弗伦特等人(Frenette et al.)，《试验医学杂志》(J.Exp.Med.)，191卷：1413-1422页，2000年。这些相互作用的重要性来自结肠、肺、胃以及其它癌症切除后的患者的研究，此研究表明活存与sLe^X的肿瘤表达呈逆相关。参见小川等人(Ogawa et al.)，(J.Thorac.Cardiovasc.Surg.)，108卷：329-336页，1994年；等人(Nakamori et al.)，(Dis.Colon Rectum)，40卷：420-431页，1997年；巴尔杜斯等人(Baldus et al.)，《肿瘤生物学》(Tumour Biol.)，19卷：445-453页，1998年。
目前研究已经集中于可阻断细胞上Lewis糖类抗原表达的小分子抑制剂的开发上。过-O-乙酰化二糖(Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇[AcGGn-NM]或GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇[AcGnG-NM]的乙酰化形式)被细胞摄取，通过高尔基体中相关的糖基转移酶脱乙酰化且被用作底物。当所述二糖发生寡糖聚集时，会导致源自内源性糖轭合物的聚糖生物合成的转移。参见沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，272卷：25608-25616页，1997年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年。此结果伴随细胞表面sLe^x表达的减少。单糖GalNAca-O-苄基以相似的方式发挥作用，改变离体结肠细胞系和白细胞系的粘蛋白上O-连接的链的表达，并改变细胞对血小板和内皮的粘附。参见尼弗等人(Niv et al.)，《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)，50卷：147-152页，1992年；等人小岛等人(Kojimaet al.)，《生物化学与生物物理研究通报》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，182卷：1288-1295页，1992年；德拉诺伊等人(Delannoy etal.)，《糖轭合物杂志》(Glycoconjugate J.)，13卷：717-726页，1996年。然而，需要更高浓度的单糖才能实现与二糖相似的抑制程度(分别为1-5mM对10-50μM)。参见弗斯特等人(Fuster et al.)，《癌症研究》(Cancer Res.)，63卷：2775-2781页，2003年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92卷：3323-3327页，1995年；辛德斯高尔等人(Hindsgaul et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，266卷：17858-17862页，1991年；汗等人(Khan et al.)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，268卷：2468-2473页，1993年；罗沃维等人(Lowary et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，251卷：33-67页，1994年；林科尔等人(Linker et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，245卷：323-331页，1993年。因此，本领域需要更有效的阻断Lewis糖类抗原表达并能够作为治疗试剂来控制和预防肿瘤转移的抑制剂。
发明概述
本发明通常涉及肿瘤疾病或转移疾病的治疗或预防的化合物和方法。本发明中的用于治疗的所述化合物和方法使用了一类包括乙酰二糖的化疗试剂。本发明的益处包括通过该类二糖，即过-O-乙酰化二糖，例如，GlcNAcβ1，3Gal(3-O-萘甲醇(AcGnG-NM)的乙酰化形式的作用，来抑制腺癌细胞对固定的重组选择素以及对活化的人血小板和内皮细胞上的选择素的粘附。这些结果表明，以此种方式抑制肿瘤细胞的糖基化会在转移的实验模型中引起与选择素的相互作用降低，增加对白细胞介导的溶胞作用的敏感性并且导致器官中的集落形成减少。
在本发明的一个实施方案中，用于治疗的化合物与方法在肿瘤转移的小鼠模型中显示出了在肺组织中降低肿瘤细胞聚合并形成肿瘤的能力。本发明还提供的治疗组合物，用于将治疗剂量的本发明的乙酰化二糖进行给药，来治疗肿瘤性疾病(neoplastic disease)、以及预防或减少肿瘤的转移。
在一个实施方案中，糖基转移酶的二糖抑制剂包括这样的结构：
                  糖-X-糖-Y-R，
其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚地杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基(amid)，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在更详细的实施方案中，所述疾病为为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAc β1，4GlcNAc-Y-R，其中R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；Y为氧原子。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM、过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM、过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。在更详细的实施方案中，所述二糖为GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM，2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]n-2-萘酚；GlcN[³H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[³H]NM。
在另一个实施方案中，所述药物组合物包括制药可接受的载体和有效剂量的本发明的乙酰二糖。在另一个实施方案中，治疗哺乳动物个体疾病的的方法包括进行治疗有效剂量的本发明所述组合物的给药。在更详细的实施方案中，所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量给药。
在另一实施方案中，减轻哺乳动物个体癌症的方法包括对所述哺乳动物个体治疗进行治疗有效剂量的组合物给药，所述组合物包括：糖-X-糖-Y-R，或其制药可接受的盐或前药，其中：所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，
所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；
所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或
所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
且其中所述哺乳动物个体中的所述癌症被减轻。
在详细的实施方案中，所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。在更详细的实施方案中，所述癌症为转移性癌症。在更详细的实施方案中所述组合物以约0.1mg/kg至约20mg/kg剂量给药。
在另一实施方案中，抑制哺乳动物个体肿瘤转移的方法，包括治疗有效剂量的组合物的给药，所述组合物包括：糖-X-糖-Y-R，其中：所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。
在更详细的实施方案中，所述二糖为过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚、过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM、过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM、过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM、过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM、过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。在进一步详细的实施方案中，所述二糖为GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM  ；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)、8-甲氧基-NM、2-苄基、苯基、2-萘酚、2-萘硫醇、6-羟基喹啉、5-羟基吲哚、顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯基]_n-2-萘酚；GlcN[³H]Acβ3Galβ-O-NM；或GlcNAcβ3Galβ-O-[³H]NM。
在另一个实施方案中，调节细胞中天然发生多糖的生物合成的方法包括用药物有效剂量的组合物接触细胞的步骤，所述组合物包括糖-X-糖-Y-R，其中所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基、C-酰基取代；或所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。
在另一实施方案中，鉴别有效癌症治疗的方法包括用有效剂量的二糖或其制药可接受的盐或前药接触肿瘤细胞培养物的步骤，所述二糖具有结构糖-X-糖-Y-R，其中：
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代；
还包括步骤：检测培养的所述肿瘤细胞的结合；及通过所述培养的肿瘤细胞的结合减少来鉴定对于哺乳动物个体所述有效的癌症治疗。在详细的实施方案中，所述肿瘤细胞为腺癌细胞。
在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述所述肿瘤细胞与选择素包被的培养皿的结合。在另一个实施方案中，所述包括检测所述肿瘤细胞与凝血酶活化的血小板的结合。在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述所述肿瘤细胞与肿瘤坏死因子α(TNFα)-活化的内皮细胞的结合。
在另一个实施方案中，所述方法包括在免疫缺陷小鼠中检测二糖处理的肿瘤细胞的肺集落形成，并通过减少所述免疫缺陷小鼠中的肿瘤转移来鉴定对哺乳动物个体的所述有效的治疗。
在另一实施方案中，减轻哺乳动物疾病状态的方法，所述哺乳动物对用阻断细胞表面糖类抗原表达的化合物的治疗有反应，所述方法包括对所述哺乳动物进行治疗有效剂量的化合物的给药，所述化合物包括，糖-X-糖-Y-R，或其制药可接受的盐或前药；
其中，
所述糖为葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；
X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；
Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；
R为糖苷配基、苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；
且其中，所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；或所述每一种糖的羟基独立地被S-烷基、N-烷基、S-酰基、N-酰基、C-酰基、S-芳基或N-芳基取代。
在详细的实施方案中，所述糖类抗原为细胞表面受体的配体。在更详细的实施方案中，所述糖类抗原抗原为Lewis糖类抗原。在更详细的实施方案中，所述Lewis糖类抗原为唾液酸(sLe^X)糖或唾液酸(sLe^a)糖。在详细的实施方案中，所述糖类抗原为选择素的配体。在更详细的实施方案中，所述的选择素为E-选择素、P-选择素或L-选择素。
在详细的实施方案中，所述的疾病状态为肿瘤性疾病。在更详细的实施方案中，所述癌症为腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌或黑素瘤。在更详细的实施方案中，所述的肿瘤性疾病为转移性疾病。在更详细的实施方案中，所述的疾病为肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化或糖尿病。
附图的简要描述
图1所示为利用二糖引发剂(primer)来抑制肿瘤细胞表面的sLe^X。
图2所示为AcGnG-NM改变了LS180细胞中的细胞表面唾液酸Lewis X。
图3所示为AcGnG-NM处理肿瘤细胞对固化的选择素的粘附变化。
图4所示为AcGnG-NM处理的肿瘤细胞对培养的人微血管内皮细胞(HMVEC)粘附变化。
图5所示为用AcGnG-NM处理之后，血小板对肿瘤细胞的粘附减少。
图6所示为小鼠中抑制剂处理的肿瘤细胞的生物分布变化。
图7所示为用AcGnG-NM进行处理后抑制了转移的肺肿瘤的形成。
图8所示为用AcGnG-NM处理肿瘤细胞后，血小板存在时的细胞溶解作用减少。
图9所示为合成的二糖诱饵(decoy)的化学结构。
图10所示为二糖处理后LLC细胞的离体特征。
图11所示为二糖处理的细胞对固化的P-选择素的粘附变化。
图12所示为过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM对实验性转移的抑制。
图13所示为过乙酰化GlcNAcβ3Gal-NM对自发肿瘤转移的抑制。
图14所示为小鼠中AcGnG-NM处理的P-Sel^-/-表型模拟。
图15所示为sLe^X表达的寡糖引发(primering)与抑制。
图16所示为脱氧AcGnG-NM对Lewis肺肿瘤(LLC)细胞的实验性转移抑制。
发明详述
总体来讲，本发明涉及用于治疗或预防疾病的二糖化合物和方法。本发明中的所述用于治疗的化合物和方法使用了一类治疗剂，该治疗剂包括修饰的多糖，例如乙酰化二糖。所述乙酰化二糖的作用方式是抑制参与糖蛋白的生物合成的糖基转移酶。所述乙酰化二糖作为糖基转移酶的抑制剂在有限种类的细胞中参与糖生成，为治疗或预防疾病的化合物和方法提供了特异性，如本发明的肿瘤性疾病或转移性疾病，并具有最少的副作用。本发明的化合物和方法可治疗或预防疾病包括但不限于肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。
用于治疗或预防诸如肿瘤性疾病或转移性疾病的疾病的化合物和方法，包括乙酰化二糖，还包括对可提高特异性糖基转移酶的抑制活性的所述糖的修饰。这些修饰包括但不限于脱氧、脱氢、环氧化、烷化、芳基化、氨化或卤化。还可以从医学化学中的现有技术中考虑对制备母化合物乙酰化二糖的类似物进行其他的化学修饰。
如上所述，含有修饰的乙酰化二糖的化合物在进行体内给药时具有改进的溶解性和药理特性。此外，还提供了对所述乙酰化二糖的修饰，其中所述化合物抑制了糖基转移酶的活性(竞争性或非竞争性)而不是作为糖基转移酶的底物。本发明的所述乙酰化二糖包括结构：糖-X-糖-Y-R；其中所述糖选自唾液酸、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖或甘露糖；X和Y为桥联原子，其可为氧、硫、氮、或碳；R为糖苷配基。在一个实施方案中，所述乙酰化二糖可以是过乙酰化-4-脱氧-GlcNAcβ3Gal-NM(4-脱氧AcGnG-NM)。参见，如美国专利第5,639,734号，在此将其全文及所有用途全部引用以作参考。
本发明的本发明的化合物和方法包括具有修饰的可被识别为寡糖代谢中间产物的二糖，如乙酰化二糖，所以当对细胞进行饲喂时，乙酰化二糖被转变为更复杂的寡糖。所产生的新化合物将以特异的方式进行修饰，以使其代谢活性较低但依然保持所述母化合物的充分特征，因而其在所述寡糖生物合成途径中依然与酶结合。使用这些修饰的类似物可以获得更佳的特异性。乙酰化二糖及其类似物旨在抑制糖基转移酶反应，该反应可产生特定的细胞表面糖轭合物，如糖蛋白和糖脂。这些糖轭合物可促进细胞粘附，从而参与多种生物学和生理学过程，其包括但不限于肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。所以，通过其对糖轭合物产生的抑制，乙酰化二糖可以干扰这些类型的生物学过程，且籍此提供了对如肿瘤性疾病和转移性疾病的癌症的治疗。
本发明的乙酰化二糖包括“糖-X-糖-Y-R”的结构，例如在聚乳糖胺聚糖和唾液酸Lewis X(sLe^x)集合的起始、延伸和加帽反应中的类似中间体。对过乙酰化Galβ1，4GlcNAc-萘甲醇(AcLacNAc-NM)化合物的研究表明乙酰化二糖化合物可作为引发剂(primer)。作为引发剂，其可与正常的生物合成中间体竞争酶活性，从而抑制正常糖轭合物的形成。此外，研究还表明乙酰化二糖化合物(乙酰化Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇和乙酰化GlcNAcβ1，3Gal-O-萘甲醇)在包括各种肿瘤细胞系的多种人源和鼠源的培养细胞中引发了寡糖。不仅如此，用这些化合物对人肿瘤细胞进行的处理降低了其致肿瘤性，说明所述类似物也具有类似的效果。
本发明的益处在于包括了可抑制腺癌细胞与固化的重组选择素以及对活化的人血小板和内皮上的选择素发生粘附的一类过-O-乙酰化二糖及其类似物的二糖的能力，如乙酰化形式的GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)和过乙酰化4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM(4-脱氧AcGnG-NM)。其结果说明通过这一方式对肿瘤细胞糖基化的抑制，导致了在转移的实验模型中选择素互作的降低、升高了白细胞介导的溶胞作用的敏感性，同时导致器官中的集落形成减少。
在肿瘤细胞粘蛋白上唾液酸Lewis X(sLe^X)的簇提呈被认为可通过与在血小板和内皮细胞表达的选择素粘附受体结合来促进转移作用。所以，对sLe^X集合的干扰可以为治疗转移性疾病提供化疗方法。研究表明过乙酰化二糖可在细胞中作为与sLe^X合成有关的寡糖的集合的底物，且二糖上的寡糖集合可以转移源自内源细胞表面糖轭合物sLe^X集合。
本发明提供了治疗或预防肿瘤性疾病或转移性疾病的化合物和方法，证明了用微摩尔浓度的如(Ac)₆GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇(AcGnG-NM)的过乙酰化二糖处理培养的人腺癌细胞，可以降低sLe^X的表达，以及降低体外对选择素包被培养皿的结合、以及降低与凝血酶活化的血小板和TNF-α活化的内皮细胞的结合。以这种方式改变的糖基化降低了在静脉注射3小时后分布到所述野生型小鼠肺中的肿瘤细胞的活性。尽管与野生型小鼠相比，肺种植的程度有所降低，但是在向P-选择素缺乏的小鼠注射了AcGnG-NM处理的肿瘤细胞之后，并未在生物分布中看到显著性差异。在体外已证明，正常的小鼠血小板而不是P-选择素缺乏的血小板，结合于对照肿瘤细胞并保护他们免于白细胞介导的胞质溶解。相反，采用二糖对肿瘤细胞进行处理显著地降低了正常血小板保护他们免于细胞溶解的活性。最终在实验性的转移模型中说明，向严重的组合免疫缺陷小鼠进行注射之后，用所述二糖对肿瘤细胞进行处理明显地降低了他们的肺集落形成潜能。本发明的化合物和方法代表了一类用于预防和治疗转移性疾病的化疗剂。
本发明提供了将乙酰化二糖用作糖基转移酶抑制剂进行疾病治疗的治疗组合物和方法，所述疾病如肿瘤性疾病、转移性疾病炎症、创伤愈合、溶菌酶贮积症、动脉粥样硬化和糖尿病。本发明的组合物和方法提供了糖基转移酶的二糖抑制剂，其包括结构：糖-X-糖-Y-R，其中所述糖是葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、唾液酸、岩藻糖或甘露糖；X为所述糖之间的桥联原子O、C、S或N，且其中X为具有α或β异构的1-2、1-3、1-4或1-6键；Y为桥联原子O、C、S或N，具有α或β异构；R为糖苷配基，包括苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯；且其中所述每一种糖的羟基独立地被O-烷基、O-酰基或O-芳基取代；所述每一种糖的羟基独立地被烷基，芳基，环氧基，酰氨基，巯基或卤素取代；所述每一种糖的羟基独立地被O-酰基、S-酰基、N-酰基或C-酰基取代；或所述每一种糖的羟基独立地被O-芳基、S-芳基或N-芳基取代。本发明的二糖还包括由1-16碳原子的烃基烷基化的所述糖。参见例如美国专利第5,639,734号，在此将其全文及所有用途全部引用以作参考。
本发明的化合物和方法可用于治疗肿瘤性疾病和转移性疾病，如腺癌。腺癌细胞的特征在于带有Lewis X结构的粘蛋白糖蛋白的表达，因此腺癌细胞也就成了本发明的化合物和方法的示例性的主要对象。乳腺、结肠和前列腺的腺癌是癌症的最流行类型。估计在美国2000年新增的癌症中，乳腺癌为184,200例，结肠癌为93,800例，前列腺癌为180,400例。肺癌中的主要部分也是腺癌。黑素瘤也是本发明的化合物和方法的一种实例性的主要对象，因为有证据表明干扰选择素结合的化合物可影响黑素瘤。可应用本发明的化合物和方法的癌症数量和种类包括肿瘤性和转移性疾病，如那些由带有Lewis-型糖结构的粘蛋白糖蛋白表达为特征的和由选择素结合介导的疾病。当对肿瘤性疾病和转移进行治疗时，本发明的化合物可作为手术肿瘤去除或其他形式的癌症化疗的辅助治疗手段。当对肿瘤性疾病和转移进行治疗时，本发明的组合物可与抑制癌细胞内其他生化途径的其他治疗组合物一起给药。
本发明还意图获得在个体中治疗炎症疾病的方法，包括以本发明药物组合物对所述个体进行所述糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物的治疗有效剂量给药的步骤。总的来讲，本发明的组合物可用于治疗多种炎症性疾病。炎症性疾病的代表性例子包括急性炎症疾病和慢性炎症疾病。急性炎症疾病的代表性例子包括阑尾炎、扁桃腺炎、延迟的超敏反应、由于脓血症的炎症、皮肤炎症和局部缺血性再灌注损伤。慢性炎症疾病的代表性例子包括类风湿关节炎。总的来讲，本发明的组合物可以减轻目标个体炎症的任意浓度进行给药。优选地，所述组合物以约0.1mg/kg到约20mg/kg的剂量给药。
本发明的化合物和方法可通过如降低诸如唾液酸Lewis X和唾液酸Lewis A的所述细胞表面的唾液酸糖的存在来起作用。唾液酸糖形成了称为选择素的与细胞粘附受体结合的配体成分。当所述配体在细胞表面糖轭合物上存在时，他们可促进与那些表达细胞表面选择素受体的细胞的粘附。大多数天然产生的选择素配体是粘蛋白-型糖蛋白，所述糖蛋白由通过糖苷键与含有sLex结构的若干糖链(多糖)连接的蛋白核心构成。
糖抗原包括但不限于ABO，Colton(AQP1)，Diego(SLC4A1)，Duffy(FY)，Hh(FUT1，FUT2)，Kell(Kel，XK)，Kidd/JK(SLC14A1)，Lewis(FUT3，FUT2)，Landsteiner-Weiner/LW(ICAM4/LW)，Lutheran(LU)，MNS(GYPA，GYPB，GYPE)，Rh(RHCE，RHD，RHAG)或YT/Cartwright(ACHE)。括号里的内容是所述糖抗原的基因座位。Lewis糖抗原包括但不限于H，Le^a，唾液酸Le^a，Le^b，Le^x，唾液酸Le^x，Le^y或唾液酸Le^y。在一个详细实施方案中，所述Lewis糖抗原是唾液酸Le^x(sLe^x)或唾液酸Le^y(sLe^y)。
肿瘤性疾病的明显特征是在肿瘤性细胞内的粘蛋白表达升高和糖基化活性的改变，包括增强肿瘤细胞和含有选择素的细胞之间的粘附的sLe^x表达，所述含有选择素的细胞如内皮细胞(E-和P-选择素)、血小板(P-选择素)和淋巴细胞(L-选择素)。通过与选择素受体互作的肿瘤细胞的粘附可以多种方式促进癌症进展。首先，E-和P-选择素在活化的血管内皮细胞上与含有粘蛋白的肿瘤细胞的sLe^x结构的结合，可有助于肿瘤细胞从血液向其他组织的运输(外渗)，在此组织中所述肿瘤细胞可种植继发肿瘤(转移)。其二，在肿瘤细胞、淋巴细胞和血小板之间的类似的细胞表面结合互作可以在循环系统中形成细胞集结，且这些血栓会停留在小血管中。其三，淋巴细胞和血小板的结合可提供刺激肿瘤细胞生长的生长因子或在免疫系统内的规避。其四，有证据表明血管细胞与选择素的互作对肿瘤血管发生至关重要，因此本发明的组合物也可以对此进行抑制。
“转移”是指涉及肿瘤细胞从其发源地进行迁移、规避了宿主的防御系统并继而在远端器官进行种植的多步级联。在转移转播的过程中，血中的肿瘤细胞与血小板和淋巴细胞互作，形成了停留(arrest)在所述微血管且粘附于所述内皮细胞的肿瘤性血栓。肿瘤细胞-宿主细胞的粘附可部分地通过称为选择素的细胞表面糖结合蛋白家族进行介导。血小板上的P-选择素可以促进血小板与肿瘤细胞的结合(“覆盖”)，其可以防止通过先天免疫系统的元件对肿瘤细胞的细胞溶解。在内皮细胞上的P-选择素和E-选择素可以在微血管中帮助锚定肿瘤细胞-血小板栓。L-选择素介导的淋巴细胞的粘附可导致协助继发肿瘤生长的细胞因子和生长因子的局部分泌。
“糖苷配基”是指缺乏糖半族且在本发明中有用的底物。
“环氧基”是指与两个连接的碳原子结合的氧原子。通常，任意环醚都具有三元环；特别的，三元环为环氧乙烷(oxirane)，四元环为氧杂环丁烷(oxetane)，五元环为四氢呋喃(oxolane)，六元环为噁烷(oxane)；氧化乙烷通常是由过酸对烯烃的反应生成的。
“烷基”是指通式为C_nH_2n+1的烃基。
可采用如乙酰基、丁酰基或苯甲酰基来乙酰化所述二糖，从而降低其亲水性并使其易于渗过细胞膜。二中所述二糖，如乙酰Galβ1，4GlcNAcβ-O-萘甲醇和乙酰GlcNAcβ1，3Galβ-O-萘甲醇都可在培养细胞中引发寡糖，并且抑制唾液酸Lewis X在HL-60人早幼粒白血病细胞、LS180人结肠癌、鼠Lewis肺癌、B16鼠黑色素瘤中抑制唾液酸Lewis X的形成。上述的多种二糖及其乙酰化或芳香族衍生物是本发明的逻辑性范围。此外，关键羟基缺乏或乙酰化的上述化合物的类似物将与糖基转移酶结合并抑制其活性。
本发明的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物还包括了与羟基结合的甲基。例如，可在所述糖的任意羟基上结合上甲基。此外，所述糖还可以用硫取代氧。例如，优选地可用硫原子取代所述糖的5-OH基团。
本发明的糖基转移酶的二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物的示例包括但不限于，过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-Y-R，过-O-乙酰Galβ1，3GlcNAc-Y-R，过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-Y-R，过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-Y-R或过-O-乙酰GlcNAcβ1，4GlcNAc-Y-R，其中Y为选自O、C、S或N的桥联原子；且其中R为糖苷配基，包括但不限于苄基、苯基、萘酚基、萘甲醇基、茚酚基、茚酚的杂环衍生物、萘酚的杂环衍生物、萘甲醇的杂环衍生物、1-16碳原子的烷基或聚类异戊二烯。
本发明还涉及对细胞中天然产生的糖的合成进行调控的方法，包括将所述细胞与药理学有效量的作为本发明药物组合物的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物接触的步骤。根据本发明的教导，可对乙酰化二糖进行设计，从而使其可破坏众多种类的天然产生物质，尤其是糖类的合成。例如，本发明提供了破坏与选择素结合的糖类合成的组合物。这些二糖的示例包括但不限于过-O-乙酰Galβ1，4GlcNAc-O-2-萘甲醇(NM)，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-Ph，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3Gal-O-2-萘酚，过-O-乙酰Galβ1，3GalNAc-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，3GalNAc-O-NM，过-O-乙酰GlcNAcβ1，6GalNAc-O-NM，过-O-乙酰3-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰4-脱氧-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰3-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰4-氟-GlcNAcβ1，3Gal-O-NM，过-O-乙酰Galβ1，4(3-甲氧基)-GlcNAc-O-NM，过-O-乙酰3-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-苄基(Bn)或过-O-乙酰4-甲氧基-GlcNAcβ1，3Gal-O-Bn。这些二糖的示例还包括但不限于GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-脱氧-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-氟-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；4’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；4’-氨基-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；3’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；3-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；3’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-脱氧-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氟-GlcNAcβ3Gal-Oβ-NM；6’-硫代-GlcNAcβ3Gal-O-NM；6’-甲氧基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；6’-氨基-GlcNAcβ3Galβ-O-NM；GlcNAcβ3Galβ-O-R，其中R＝2-萘甲醇(NM)，8-甲氧基-NM，2-苄基，苯基，2-萘酚，2-萘甲醇基，6-羟基喹啉，5-羟基吲哚，顺/反-十氢-2-萘酚或2-[氧乙烯]_n-2-萘酚；GlcN[³H]Acβ3Galβ-O-NM或GlcNAcβ3Galβ-O-[³H]NM。总地来讲，本发明的组合物可以任意浓度进行给药，所述浓度可对目标个体细胞中天然产生的糖类的合成进行调控。优选地，所述组合物以约0.1mg/kg到约20mg/kg的剂量给药。
治疗方案
本发明提供了包括这样一种药物组合物，该组合物包括具有抗肿瘤或抗转移活性的、与制药可接受载体一同进行组方的糖基转移酶二糖抑制剂的一种或其多种的组合，例如乙酰化二糖及其类似物。一些组合物包括本发明的多种(如两种或更多钟)乙酰化二糖的组合。
在预防性的应用中，以足以消除或降低所述疾病的风险、减轻所述疾病的严重程度或延缓所述疾病发病的剂量，将乙酰化二糖及其类似物的药物组合物或药剂对怀疑或有疾病或状态(如肿瘤性或转移性疾病)的风险的患者进行给药，所述疾病或状态包括该疾病的生化、组织学和/或行为症状，在所述疾病发展过程中该疾病的并发症以及中间病理学表型。
在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分阻止所述疾病症状(生化、组织学和/或行为学)的剂量，将组合物或药剂对怀疑或已经患有这些疾病的患者进行给药，这些疾病症状包括在所述疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型。
足以治疗或预防治疗的剂量被定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，通常以多种剂量进行药剂的给药，直到得到了充分的预防或治疗反应。通常，监控所述预防或治疗反应，如果所述反应开始衰退，则需要给予重复的剂量。
用于本发明组合物和方法中的乙酰化二糖及其类似物，可以对人类患者进行给药，所述乙酰化二糖及其类似物以其本身、前药、制药可接受的盐、水合物、溶剂化物、酸性盐水合物、N-氧化物或其同形晶体的形式或药物组合物的形式给药，在药物组合物中，所述化合物以治疗有效量与适合的载体或赋型剂相混合。
制药可接受的载体是由所述给药的特定组合物以及用于对所述组合物进行给药的特定方法部分决定的。所以，有众多对乙酰化二糖组合物进行给药的适合的药物组合物配方(参见，如，《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，迈克出版公司(Mack PublishingCo.)，伊斯顿(Easton)，宾西法尼亚州，第18版，1990年，在此将其全部引用作为参考)。所述药物组合物通常包括以适于对患者进行给药形式的乙酰化二糖或其类似物。所述药物组合物通常配制为无菌的，基本等渗的，并且完全符合美国食品与药品管理局(FDA)的《优质生产规范》(GMP)细则。
有效剂量
本发明所述的用于治疗如肿瘤性或转移性疾病的病状或疾病的乙酰化二糖及其类似物的有效剂量会根据诸多的不同因素发生改变，包括给药方式，靶位点，所述患者的生理状态，患者是人抑或是动物，其它给药药剂，以及所述治疗是预防性的或治疗性的。通常，所述患者是人但是包括转基因动物的非人类动物也可接收治疗。治疗剂量需要进行滴定从而优化安全性和有效性。
用包含乙酰化二糖及其类似物的药物组合物进行给药，所述剂量为所述宿主体重的约0.0001mg/kg到约100mg/kg，通常为0.01mg/kg到约40mg/kg，更通常为约0.1mg/kg到约20mg/kg。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或1-10mg/kg。在一些方法中，可将二种或更多种对糖基转移酶具有不同结合特异性的乙酰化二糖或其类似物同时给药，在这种情况下，给药的每种乙酰化二糖或其类似物的剂量处于所给的范围内。通常对乙酰化二糖组合物可进行多次给药。通过测定所述患者体内乙酰化二糖或其类似物的血液水平来指示，给药间隔可以是不规律的。在一些方法中，可将剂量调节至血浆乙酰二糖的浓度为1-100μg/ml。或者，可采用缓释制剂对乙酰化二糖及其类似物进行给药，该方法需要更低频率的给药。剂量与频率的变化都依赖于患者体内乙酰化二糖的半衰期。给药剂量与频率的变化依赖于所述治疗是预防性的或治疗性的。在预防性的应用中，以相对低的剂量进行相对低频率间隔的长时间给药。一些患者在其余生都将持续接受治疗。在治疗性的应用中，以相对高的剂量进行相对短间隔的给药有时候是必需的，直到所述疾病的发展被减弱或终止，优选地直到所述患者表现出该疾病症状的部分或完全好转。此后，所述患者可以用预防方案的有效剂量的包含乙酰化二糖及其类似物的药物组合物对所述患者进行给药。
给药途径
与制药可接受的载体组方的，具有抗肿瘤或抗转移活性的糖基转移酶二糖抑制剂，如乙酰化二糖及其类似物，可采用非肠道、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内、肌肉内或吸入的方式进行给药。尽管其他方式也是等效的，但乙酰化二糖或其类似物最常见的给药方式是皮下或静脉内。其次的最常用方式是非肠道的。在一些方法中，可将制剂直接注射到肿瘤发展的特定组织中去。在一些方法中，可将乙酰化二糖或其类似物作为缓释的组合物或装置，如Medipad装置进行给药。
本发明的药剂可任意地与其他对治疗多种疾病至少部分有效的其他药剂进行合并给药。例如，在肿瘤转移到大脑的情况下，本发明的药剂可以与其他药剂一起给药，以增加本发明的制剂穿过血脑屏障(BBB)。其他的例子还包括采用公知的化疗剂与本发明的药剂(联合治疗)治疗患者。
制剂
具有抗肿瘤或抗转移活性的乙酰化二糖及其类似物，通常被作为包含活性治疗剂和多种其他制药可接受组分的药物组合物进行给药。参见前述的《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，1990年。所述优选形式依赖于给药及治疗应用的预期方式。根据所需要的制剂，所述组合物还包括制药可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配置对人或动物进行给药的药物组合物的赋形剂。对所述稀释剂的选择应不影响所述组合的生物学活性。这种稀释剂的例子是蒸馏水、生理盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液以及汉克氏液(Hank’s solution)。此外，所述药物组合物或制剂还可以包括其他载体，佐剂、或非毒性、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等等。
药物组合物可以包括的较大的、代谢较慢的大分子，例如蛋白、诸如壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸以及共聚物(如乳胶官能化的琼脂糖(Sepharose^TM)、琼脂糖(agarose)、纤维素等等)的多糖，多聚氨基酸、氨基酸共聚物和酯聚集物(如油滴或脂质体)。此外，这些载体还具有免疫刺激制剂的功能(即佐剂)。
对非肠道给药而言，本发明的组合物可采用所述物质的溶液或悬液的注射剂型给药，所述剂型含有生理可接受稀释剂以及可以是如水油、盐水、甘油或乙醇的无菌液体的药物载体。此外，在所述组合物中也可以有辅助性物质，如湿润或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等。药物组合物的其他成分有石油、动物、蔬菜或合成来源的成分，例如，花生油、大豆油和矿物油。通常诸如丙二醇或聚乙二醇的二醇是优选的液体载体，尤其是对可注射的溶液而言。本发明的药剂可以储存注射(depot injection)或植入制剂(implant preparation)的方式进行给药，可采用这样方式组方，以使得持续或脉冲式释放所述活性成分。
通常，组合物被制备成液体溶液或悬液的可注射形式；也可以制备在注射前适于溶解于或悬浮于液体赋形剂的固体形式。如上所述，为了获得增强的佐剂效果，也可将所述制剂乳化或者包被入诸如多乳酸化合物、聚乙醇酸交酯或共聚物的脂质体或微粒中。参见，朗格(Langer)，《科学》(Science)，249卷：1527页，1990年；以及翰纳斯(Hanes)，《高级药物递送综述》(Advanced Drug Delivery Reviews)，28卷：97-119页，1997年。
适于其他给药途径的其他制剂包括口服、鼻内和肺制剂，栓剂、以及透皮应用。
对栓剂而言，粘合剂和载体包括，例如聚(亚烷基)二醇或甘油三酸酯；这样的栓剂可由含有活性成分为0.5％到10％，优选为1％-2％的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，如药物纯的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、含糖钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂，并含有10％-95％的活性成分，优选为25％-70％。
局部应用可导致透皮或皮肤内的传输。局部给药可以通过与霍乱毒素或其脱毒衍生物或其亚基或其他类似细菌毒素试剂的共给药得以增强。参见格莱恩等人(Glenn et al.)，《自然》(Nature)，391卷：851页，1998年。可将所述成分作为混合物使用实现共给药。
或者，透皮的传输可通过使用皮肤贴片(skin patch)或使用转递体(transferosomes)实现。参见保罗等人(Paul et al.)，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)，25卷：3521-24页，1995年；塞瓦克等人(Cevc et al.)《生物化学与生物物理学学报》(Biochem.Biophys.Acta)，1368卷：201-15页，1998年。
所述药物组合物通常配制为无菌的，基本等渗的，并且完全符合美国食品与药品管理局(FDA)的《优质生产规范》(GMP)细则。
毒性
在不引起基本中毒的情况下，本发明所述的乙酰二糖或其类似物的治疗有效剂量可提供治疗性的有益作用。
本发明所述的蛋白的毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序进行测定，例如，测定LD₅₀(50％所述动物的致死剂量)或LD₁₀₀(100％所述动物的致死剂量)。介于毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养分析和动物实验获得的数据可以被用在配制用于人类的无毒的剂量范围。
本发明所述的乙酰化二糖或其类似物的剂量优选处于包括具有极低或无毒有效剂量的循环浓度范围。根据使用的剂型和给药方式，所述剂量可在以上浓度内有所变动。根据所述患者的情况，医生可选择确切的制剂、给药途径以及剂量。(参见芬格尔等人(Fingl et al.)，1975年，《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)的第1章)。
试剂盒
同样，在本发明的范围之内，也包括有含有本发明组合物(如乙酰化二糖及其类似物)和使用指导的试剂盒。该试剂盒可进一步包括至少一种其他的试剂，或一或多种本发明的其他乙酰化二糖。试剂盒通常包括说明该试剂盒预期用途的内容的标签。所述术语标签包括任意所述试剂盒提供和附带文字、记录材料，或与所述试剂盒一同的其他材料。
示例性的实施方案
实施例1
过乙酰化GlcNacβ3Gal-NM的酶化学合成
已开发了为了动物实验和生产具有不同糖苷配基衍生物的合成克质量的GlcNacβ3Gal-NM的合成方法(方案1)。这是通过使用源自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的细菌β3GlcNac转移酶(LgtA)在大肠杆菌(E.Coli)中过量表达实现的(颜等人(Yan et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，328卷：3-16页，2000年)。这种酶催化从UDP-GlcNAc到Gal的GlcNAc转移，在无需保护所述糖的所述官能团的情况下，产生了具有高立体和区位选择性的β1，3-连接的二糖(方案1)。因为所述合成可以用粗细菌裂解物和便宜的底物(UDP糖；达沃斯化工集团(DavosChemical Corp.)，德国)完成，所以，可以有效并且合理的以低成本实现所述二糖的制备级的合成。所述终二糖是化学过乙酰化的，其异头碳被转化为溴化物或三氯亚氨逐乙酸酯(trichloroacetimidate)，且所述化合物与萘甲醇轭合，使得在离子交换和分子排阻色谱测得的过乙酰GlcNAcβGal-NM的产率为90％。就如我们过去对待其他糖一样，也使用了¹H，¹³C和2-D NMR、元素分析和质谱来对所述化合物的结构进行确定(沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，329卷：287-300页，2000年；沙尔卡等人(Sarkar et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，279卷：161-171页，1995年)。所述方法提供了大量的与不同的糖苷配基轭合的二糖，其将进行深入实验以测定所述糖苷配基对sLe^X形成的抑制的影响。
实施例2
过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM和过乙酰4-脱氧-GlcNAcβGal-NM的化学合成
方案2描述了过乙酰4-脱氧-GlcNAcβGal-NM的完整的化学合成，并描述了用可进行β1，3糖基化的3-羟基和在其4’位置适合被氢取代的glucosaminyl供体制备半乳糖的合成途径。所述半乳糖基受体4的合成涉及用吡啶和乙酸酐对化合物1的乙酰化，以97％的产率得到了所述二乙酸盐衍生物2。在酸性条件下去除所述异丙叉保护基团以及通过柱层析纯化所述产物，以96％的产率得到了化合物3。在p-甲苯磺酸存在的条件下将化合物3与triethylorthoacetate反应生成了原酸酯(orthoester)中间体，其随后在酸性条件下以86％的产率转化为化合物4。¹H和¹³C NMR也与4的预期结构一致。
根据文献报道(隆(Lonn)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，139卷：105-113页，1985年；张等人(Zhang et al.)，《生物体医学化学》(Bioorg.Med.Chem.)，4卷：1989-2001页，1996年)，从硫代-D-葡萄糖吡喃糖苷5制备了4-脱氧供体11。用吡啶和乙酸酐处理化合物5得到了3-O-乙酰中间体。随后在酸性条件下去除苯亚甲基保护基团并且用乙酰基在C6对原始羟基进行选择性保护，以69％的产率得到了化合物9。在化合物9的4位进行了硫代羰基咪唑化(Thiocarbonylimidazolylation)反应(TCDI)并且通过随后的自由基还原以81％的产率得到了4-脱氧葡萄糖胺供体11。

方案1(左)过乙酰GlcNAcβ3Gal-NM的酶化学合成
方案2(右)过乙酰4-脱氧GlcNAcβ3Gal-NM的合成
在三氟甲基磺酸甲酯存在的条件下，采用尾原(Kajihara)及其同事的反应方案(尾原等人(Kajihara et al.)，《糖研究》(Carbohydr.Res.)，306卷：361-378页，1998年)，将4与11轭合，以90％的产率得到了14。随后在吡啶和乙酸酐中的肼解和乙酰化得到了76％产率的4-脱氧二糖15。在化合物15的¹H NMR波谱中的δ4.77(J＝7.9Hz)和δ4.44(J＝7.9Hz)峰证实了在所述二糖之间的β糖苷连接，在δ5.75(J＝6.5Hz)的峰证实了GlcNAc残基的N-乙酰基团的存在。大约制备了50mg，足以进行预期的细胞培养以及酶学实验。
实施例3GlcNAcβ3Gal-R二糖类似物的合成
已制备了一系列的GlcNAcβ3Gal-R二糖类似物，其中3’-，4’-和6’-的OH羟基被缺失、氟化、硫醇化、烷基化或氨基化。这些类似物能潜在的抑制一或多种涉及sLe^X形成的半乳糖苷转移酶。类似物将与多种疏水性糖苷配基轭合并且采用不同的酯基进行封闭，从而确定抑制sLe^X形成的最有效衍生物。放射性的二糖将被用于体内的放射示踪研究。表1所示为已合成或即将合成的过乙酰化二糖及其类似物。
         表1：GlcNAcβ3Gal-R类似物的结构