激活人体呈递抗原细胞的方法， 被激活的人体呈递抗原细胞及其用途 发明背景1.发明领域
本发明涉及新型被激活的人体呈递抗原细胞，体外激活人体呈递抗原细胞的方法，用该被激活的人体呈递抗原细胞治疗癌症和传染病包括AIDS的方法，以及应用该被激活的人体呈递抗原细胞制备用于这些治疗的药物的方法。
2.相关技术的公开
对癌症患者的治疗疗法一直有各种对策，包括肿瘤病灶的手术摘除、化学疗法、放射治疗和免疫疗法。但是，这些对策的治愈率并不如期望的那样高。因此，强烈要求开发新的能在治疗癌症上提供提高治愈率的治疗剂和方法。已经知道作为呈递抗原细胞(APC)成员的巨噬细胞、B细胞和树突细胞是免疫反应的必需细胞。最近，一种应用APCs，特别是树突细胞诱发癌症免疫在治疗癌症上可能是有效的概念(Grabbe，S.等，1995，Immunol.Today，16，117)已引起极大关注。
已经知道几种由鼠制备树突细胞地方法，例如从脾脏(Clowley，M.等，1989，Cell.Immunol.，118，108)、从骨髓(Inaba，K.等，1992，J.Exp.Med.，176，1693)和从表皮(该源于表皮的树突细胞被称作“朗格汉斯细胞”)(Witmer-Pack，M.等，1987，J.Exp.Med.，166，1487)制备。另外，已证实：在将肿瘤细胞移植到受试者上之前和之后用肿瘤抗原激发(pulsing)由鼠骨髓制备的树突细胞以及给与受试者激发的树突细胞可以诱发肿瘤免疫(Celluzzi，C.M.等，1996，J.Exp.Med.，183，283；Paglia，P.等.，1996，J.Exp.Med.，183，317)。
下列从外周血或脐带血中制备人体APCs，特别是树突细胞的方法是熟知的：一种使用来自外周血单核细胞中的抗下列细胞的抗体将FcR+细胞、T细胞、B细胞和NK细胞从人体外周血中取出得到APCs的方法(Hsu等，1996，Nature Med.，2，52)；以及一种将从中取出CD19+B细胞和CD2+T细胞的人体外周血单核细胞中的贴壁细胞与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)培养约一周的方法(Sallusto，F.等，1994，J.Exp.Med.，179，1109)。已报道这些人体外周血衍生的APCs具有增加异源的和自体的MLR(混合白细胞反应)的作用。另一方面，从人体脐带血中或骨髓细胞中制备APCs，已知的方法是使用GM-CSF和肿瘤坏死因子-α(THF-α)制备从在脐带血或骨髓里发现的CD34+细胞中的 APCs(Santiago-Schwartz，F.等，1992，J.Leukocyte Biol.，52，274；Caux，C.等，1992，Nature，360，258)。然而，虽然通过以上提到的方法从人体脐带血中或骨髓细胞中制备的APCs具有增加异源的MLR的作用，但是它们没有(Santiago-Schwartz，F.等)或，如果有，也是极小的(Caux，C.等)增加自体的MLR的作用。
近来，已证实：用已经用肿瘤抗原激发的APCs的疗法对治疗B细胞淋巴瘤患者是有效的(Hsu，F.J.等，1996，Nature Med.，2，52)。即一种通过将从B细胞淋巴瘤患者的外周血中制备的APCs在体外与B细胞淋巴瘤抗原一起培养，再将培养的APCs给予B细胞淋巴瘤患者的治疗B细胞淋巴瘤患者的方法获得成功。
如此典型疗法中所示，其中将APC用肿瘤抗原激发的方法可能对治疗癌症非常有效，如果该癌症可被它们的肿瘤抗原清晰鉴定的话，如B细胞淋巴瘤。但是以上所提的方法要花费大量时间和费用，因为肿瘤抗原一般对个别患者是专一的，因此，必须针对相应的患者，而且必须大量制备这些专一的肿瘤抗原用以激发APCs。此外，由于对多数癌症患者来讲，鉴定他们的肿瘤抗原是不可能的，所以用肿瘤抗原激发APCs的方法的应用范围是有限的。鉴于以上情况，为了应用被认为非常有效的治疗癌症的采用APCs的疗法(以后称作“APC疗法”)，对尽可能多的患者来讲，一直强烈要求开发一种制备在没有肿瘤抗原帮助下对治疗癌症有效的人体APCs的方法。
在活体中，存在各种β-半乳糖苷神经酰胺和β-葡糖神经酰胺，它们各自有一通过β-键与神经酰胺相连的糖(Svennerholm，L.等，1972，Biochem.Biophys.Acta.，280，626；Karlsson，K.A.等，1973，Biochim.Biophys.Acta.，316，317)。另一方面，本发明者发现α-半乳糖苷神经酰胺具有明显的免疫刺激性质和抗肿瘤性质(Morita，M.等，1995，J.Med.Chem.，38，2176)，而且α-半乳糖苷神经酰胺和α-葡糖神经酰胺的这些性质比对应的β-端基异构体更有效力(Motoki，K.等，1995，Biol.Pharm.Bull.，18，1487)。还发现具有α-糖基神经酰胺结构的化合物当给予活体时显示出抗辐射的保护作用(Motoki，K.等，1995，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5，2413)，并且引起血小板和白细胞数量的增加(Motoki，K.等，1996，Biol.Pharm.Bull.，19，952)。本发明者还发现α-半乳糖苷神经酰胺、KRN7000可以增强从鼠脾脏中制备的富含树突细胞的APCs的功能，并且这些增强的APCs在将肿瘤移植到受试者之前给予受试者时显示出抗肿瘤作用(Koezuka，Y.等，1995，The 9th International Congress of Immunology，Abstract，55；Yamaguchi，Y.等，1996，Oncol.Res.8，399)。
但是，糖苷化合物，如KRN7000，或其盐对富含来自鼠骨髓中的树突细胞和来自鼠表皮中的朗格汉斯细胞的APCs的作用尚不明确。另外，没有关于富含在鼠脾脏和骨髓-衍生的树突细胞中的APCs的抗肿瘤作用的报道，该APCs在将肿瘤移植到受试者之后给予受试者时，已用KRN7000刺激。还已知道糖苷化合物如KRN7000或其盐对人体APCs没有作用。
针对以上所提的要求，本发明提供新型人体APC激活剂，其用于制备被激活的人体APCs，后者对癌症和各种传染病包括AIDS显示出足够的治疗作用而且无需用肿瘤抗原激发该呈递抗原细胞，本发明还提供用这种激活剂激活人体APCs的方法。
发明概述
本发明提供激活人体APCs的方法，它包括在体外用至少其中一个式(A)代表的糖苷化合物或其盐培养人体衍生的APCs：其中R1-R9和X在以下定义。
根据一个实施方案，本发明提供激活人体APCs的方法，它包括在体外用一糖苷化合物(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰胺基-3，4-十八烷二醇或其盐培养人体衍生的APCs。
本发明还提供被激活的人体APCs，它可通过在体外用至少一个以上的式(A)代表的糖苷化合物或其盐培养人体衍生的APCs而制备。
本发明还提供治疗癌症和传染病包括AIDS的方法，它包括应用用如以上定义的这些被激活的人体APCs的APC疗法。
本发明还提供如以上定义的这些被激活的人体APCs在制备通过应用APC疗法治疗癌症和传染病包括AIDS的药物上的用途。
附图的简要说明
图1表示吸收到按说明不同处理的细胞中的3H-TdR的量。在图1中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的人体外周血-衍生的APCs。
图2表示APCs数量与吸收到异源T细胞中的3H-TdR的量的关系。图2中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000刺激的人体脐带血-衍生的APCs(CD1c+细胞)。
图3表示APCs数量与吸收到自体T细胞中的3H-TdR的量的关系。图3中，“V-APC”和“KRN-APC”指与图2中所用相同的APCs。
图4表示APCs数量与吸收到脾脏细胞中的3H-TdR的量的关系。图4中，“V-APC”、“KRN-APC”、“583-APC”、“517-APC”、“564-APC”、“563-APC”和“562-APC”指分别用溶媒、KRN7000、AGL-583、AGL-517、AGL-564、AGL-563和AGL-562预处理的鼠脾脏衍生的APCs。
图5表示当给鼠静脉注射用溶媒或KRN7000预处理的鼠脾脏衍生的APCs时，带有EL-4的鼠的存活期。
图6表示APCs数量与吸收到T细胞中的3H-TdR的量的关系。图6中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的鼠骨髓衍生的APCs。
图7表示当给鼠静脉注射按图6中相同方式制备的V-APC或KRN-APC时，带有肿瘤的鼠的肝脏的重量。
图8表示APCs数量与吸收到脾脏细胞中的3H-TdR的量的关系。图8中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的鼠表皮衍生的APCs。
图9表示当给鼠静脉注射分别用溶媒、溶媒+B16-肿瘤细胞溶胞产物、KRN7000或KRN7000+B16-肿瘤细胞溶胞产物(分别为V-APC、V-T-APC、KRN-APC或KRN-T-APC)预处理的APCs时，每个带有肿瘤的鼠皮下肿瘤的体积。
图10表示培养3天后得到的APCs数量与吸收到人体外周血衍生的FcR-细胞中3H-TdR的量的关系。图10中，“V-APC”、“KRN-APC”、“V-APC-GM”和“KRN-APC-GM”指分别用溶媒、KRN7000、溶媒+GM-CSF+IL4和KRN+GM-CSF+IL4预处理的、人体外周血衍生的APCs。
图11表示培养7天后得到的APCs数量与吸收到人体外周血衍生的FcR-细胞中的3H-TdR的量的关系。图11中，“V-APC-GM”和“KRN-APC-GM”是指与图10中所用相同的APCs。
图12表示培养11天后得到的APCs数量与吸收到人体外周血衍生的FcR-细胞中的3H-TdR的量的关系。图12中，“V-APC-GM”和“KRN-APC-GM”是指与图10中所用相同的APCs，“MCM+”和“MCM-”分别指有或无单核细胞条件培养基(MCM)存在下培养APCs。
图13表示培养3天后得到的APCs数量与吸收到人体脐带血衍生的FcR-细胞中的3H-TdR的量的关系。图13中，“V-APC-GM”和“KRN-APC-GM”指分别用溶媒+GM-CSF+IL4和KRN7000+GM-CSF+IL4预处理的人体脐带血衍生的APCs。
图14表示当分别用化合物第1、2、5、10和16(除KRN7000之外)，称为AGL506、AGL514、AGL571、AGL512和AGL525刺激时，对鼠脾脏衍生APCs的激活作用。
本发明详述
由本发明者对以上所提的问题所进行的广度和深度研究的结果发现：本发明的糖苷化合物(代表物，KRN7000)能明显增强由人体外周血和人体脐带血制备的人体APCs的功能。该糖苷化合物也能明显增强富含来自鼠骨髓中的APCs的树突细胞和富含来自鼠耳郭中的APCs的朗格汉斯细胞，以及富含来自鼠脾脏中的APCs的树突细胞的功能。还发现当将来自在体外一直用本发明的糖苷化合物(代表物，KRN7000)培养的鼠脾脏或鼠骨髓中的富含APCs的树突细胞注射给已被移植肿瘤细胞的鼠中时，可观察到明显的抗肿瘤作用。基于这些发现，完成了本发明。
即，本发明涉及含有专一糖苷化合物的激活剂(即，呈递抗原功能增强剂)，它用于制备对癌症和传染病包括AIDS具有治疗作用的被激活的人体APCs。准确地说，本发明涉及由人体外周血、人体脐带血、人体骨髓细胞或人体表皮制备的APCs的激活剂(即，APCs被激活)。更准确地说，本发明涉及人体单核细胞、人体树突细胞或人体CD1c+细胞的激活剂。
本发明提供激活人体呈递抗原细胞的方法，它包括在体外用至少其中一个式(A)代表的糖苷化合物或其盐培养人体衍生的呈递抗原细胞：其中：R1是H或OH；X是7-25的整数；R2是以下(a)-(e)中任一个定义的取代基：
(a)-CH2(CH2)YCH3；
(b)-CH(OH)(CH2)YCH3；
(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2；
(d)-CH＝CH(CH2)YCH3；以及
(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3；
其中Y是5-17的整数；R3是H；R4是OH、NH2、NHCOCH3或R5和R6其中之一是H，另一个是OH、R7和R8其中之一是H，另一个是OH、R9是H、CH3、CH2OH、
在优选的实施方案中，本发明提供激活人体呈递抗原细胞的方法，它包括使用至少一个式(B)代表的糖苷化合物或其盐：其中：R1、X和R2按式(A)中的定义；和R3-R9是以下(i)-(iii)中任一个定义的取代基：
(i)[半乳糖型]
R3、R6和R8各自是H；
R4是OH或R5是OH、R7是OH、R9是H、CH3、CH2OH、(ii)[葡萄糖型] R3、R6和R7各自是H； R4、R5和R9按(i)中定义； R8是OH、(iii)[阿洛糖型] R3、R5和R7各自是H；
R4、R6和R8各自是OH；和
R9是H、CH3或CH2OH。
以上式(A)或(B)定义的糖苷化合物由糖部分和糖苷配基部分组成，其中一些也被称作α-脑苷脂、α-糖基神经酰胺、α-葡糖神经酰胺、α-半乳糖脑苷脂或α-半乳糖苷神经酰胺。这些化合物具有α-形式的端基异构体构型的特性。
在糖苷化合物中，糖的部分优选是(i)中定义的[半乳糖型]，更优选其中R3、R6和R8各自是H，R4、R5和R7各自是OH，R9是CH2OH的半乳糖型(即，α-吡喃半乳糖基)。
在糖苷化合物中，糖苷配基部分优选具有作为以上(b)、(c)和(e)任何其一取代基的R2，更优选具有作为H的R1(即，角苷脂型)和作为取代基(b)的R2。X优选是21-25的整数，Y优选是11-15的整数。
以下列出优选的本发明糖苷化合物的实例。在该表中，化合物(1)-(9)、(10)-(24)、(25)-(31)、(32)-(33)和(34)是其中R2分别为以上的取代基(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的那些化合物。化合物名称后字母A、B、C和D分别表示参照说明书WO93/05055、WO94/02168、WO94/09020和WO94/24142，它们说明所注释化合物的合成方法。在以下糖苷化合物中，最优选化合物(14)(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰胺基-3，4-十八烷二醇(以后称为“KRN7000”)。对于该化合物，将在以下的制备实施例和方案1中说明合成方法的实例。(1) (2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟基二
十四烷酰胺基]-3-十八烷醇 A(2) (2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十四烷酰胺
基-3-十八烷醇 A(3) (2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰胺基-
3-十八烷醇 A(4) (2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡萄糖基氧基)-2-十四烷酰胺基-
3-十八烷醇 C(5) (2S，3R)-1-(6’-去氧-α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四
烷酰胺基-3-十八烷醇 C(6) (2S，3R)-1-(β-L-阿拉伯吡喃糖基氧基)-2-十四烷酰胺
基-3-十八烷醇 C(7) (2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰胺基-
3-十六烷醇 A(8) (2R，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰胺基-
3-十六烷醇 A(9) (2R，3S)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰胺基-
3-十六烷醇 A(10) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟
基二十四烷酰胺基]-3，4-十八烷二醇 A(11) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟
基二十四烷酰胺基]-3，4-十一烷二醇 A(12) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟
基二十六烷酰胺基]-3，4-二十烷二醇 A(13) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(S)-2-羟
基二十四烷酰胺基]-3，4-十七烷二醇 A(14) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰
胺基-3，4-十八烷二醇
制备实施例(15) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十八烷酰
胺基-3，4-十七烷二醇 B(16) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十四烷酰
胺基-3，4-十八烷二醇 A(17) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十四烷酰
胺基-3，4-十一烷二醇 A(18) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-二十六烷酰
胺基-3，4-十八烷二醇 C(19) O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰
基]-1，3，4-十八烷三醇 D(20) O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八
烷三醇 D(21) O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八
烷三醇 D(22) O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八
烷三醇 D(23) O-(N-乙酰基-2-氨基-2-去氧)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→
3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖
基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十六烷
酰基]-1，3，4-十八烷三醇 D(24) O-(N-乙酰基-2-氨基-2-去氧)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→
3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖
-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷
酰基-1，3，4-十六烷二醇 D(25) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟
基二十三烷酰胺基]-16-甲基-3，4-十七烷二醇 A(26) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(S)-2-羟
基二十四烷酰胺基]-16-甲基-3，4-十七烷二醇 A(27) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-16-甲基-2-二
十四烷酰胺基-3，4-十七烷二醇 A(28) O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰
基]-17-甲基-1，3，4-十八烷三醇 D(29) O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1
→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰
基]-15-甲基-1，3，4-十六烷二醇 D(30) O-(N-乙酰基-2-氨基-2-去氧)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→
3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖
基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十六烷
酰基]-16-甲基-1，3，4-十八烷三醇 D(31) O-(N-乙酰基-2-氨基-2-去氧)-α-D-吡喃半乳糖基-(1→
3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖
基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷
酰基]-16-甲基-1，3，4-十七烷三醇 D(32) (2S，3S，4E)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十八烷酰胺
基-4-十八碳烯-3-醇 A(33) (2S，3S，4E)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-十四烷酰胺
基-4-十八碳烯-3-醇 A(34) (2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧基)-2-[(R)-2-羟
基二十五烷酰胺基]-16-甲基-3，4-十八烷二醇 A
式(A)或(B)定义的糖苷化合物可以与药学上可接受的酸形成酸加成盐。用于形成这种酸加成盐的酸的实例包括无机酸如盐酸、硫酸、硝酸和磷酸；和有机酸如乙酸、丙酸、马来酸、油酸、棕榈酸、构橼酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸、谷氨酸、泛酸、十二烷基磺酸、甲磺酸和苯二甲酸。
可以使用本发明的人体APC-激活剂激活由各种人体组织如外周血、脐带血、骨髓细胞和表皮中制备的APCs。一般地说，在体外将本发明的激活剂在制备人体APCs(例如，从人体外周血、脐带血或骨髓细胞中，如果必要，可用GM-CSF和IL-4)之中或之后加入而得到被激活的人体APCs。除GM-CSF和IL-4之外，可通过加入物质如SCF、IL-1、IL-3、TNF-α和Flk2/Flt3配位体或单核细胞条件培养基(MCM)更有效的制备被激活的人体APCs。另外，在制备被激活的人体APCs中，可以加入肿瘤抗原、病毒抗原或其抗原特异肽而得到更有效治疗癌症和传染病的被激活的人体APCs。
可将本发明的人体APC-激活剂溶于适当的溶解溶剂如DMSO中，然后用生理盐水、培养基等稀释至适当的浓度。用于激活人体APCs的在适当培养基中激活剂的最后浓度的范围是0.1ng/mL-10μg/mL，优选0.01μg/mL-1μg/mL。优选制备本发明的人体APC-激活剂并在使用前立即加入。
因此，本发明也提供通过用至少一种以上定义的式(A)或(B)代表的糖苷化合物或其盐在体外培养人体衍生的APCs而制备的被激活的人体APCs。
在本发明一个实施方案中，人体衍生的APCs是阳性CD1c即富含CD1c的细胞。这些细胞可由，但不限于：人体外周血、人体脐带血、人体骨髓细胞、人体表皮等来制备。
使用具有本发明激活剂激活的人体APCs能对癌症的患者进行有效的APC治疗。另外，期望能应用通过将被激活的APCs和患者的外周血共培养而制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)有效地治疗患有癌症或传染病包括AIDS的患者。
因此，本发明还提供用被激活的人体APCs治疗癌症和传染病包括AIDS的方法。
本发明还提供应用被激活的人体APCs来制备应用APC疗法治疗癌症和传染病包括AIDS的药物。
用下列实施例更清楚地说明本发明；但是，这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例
制备实施例
方案1
方案1(续)化合物G1的合成
向D-来苏糖(200g，1.33mol)的用氯化钙干燥的丙酮(3.0L)溶液中加入硫酸(0.5mL)。将混合液于室温搅拌18小时，然后向其中加入分子筛4A粉末(100g)。中和后，将反应溶液用硅藻土过滤，将残留物用丙酮洗涤。将滤液和洗液合并，减压浓缩，得到化合物G1的粗产物，240g(收率95％)。该粗产物无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶丙酮(9∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。mp76-78℃；FDMS m/z 191(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.45(1H，d，J＝1.8Hz)，4.83(1H，dd，J＝3.7，5.5Hz)，4.64(1H，d，J＝6.1Hz)，4.27-4.30(1H，m)，3.90-3.99(2H，m)，1.48(3H，s)，1.32(3H，s)。化合物G2的合成
向化合物G1(239g，约1.26mol)的二氟甲烷溶液(168mL)中加入吡啶(10mL)和三苯甲基氯(39.0g)，将混合液在32℃下搅拌4小时。然后向该混合液中滴加乙醇(8mL)，于室温下搅拌2小时。将该溶液用饱和氯化铵水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，减压浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯中，然后冷却至0℃产生沉淀，得到化合物G2的产物，501g(以D-来苏糖的量计，收率：87％)。mp 174-176℃；FDMS m/z 432 M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.49(15H，m)，5.38(1H，d，J＝2.4Hz)，4.75(1H，dd，J＝3.7，6.1Hz)，4.59(1H，d，J＝6.1Hz)，4.31-4.35(1H，m)，3.43(1H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.39(1H，dd，J＝6.7，9.8Hz)，1.29(3H，s)，1.28(3H，s)。化合物G3的合成
向溴化十三烷三苯磷鎓(962g，1.16mol；通过在140℃下加热1-溴十三烷和三苯膦4.5小时制备的产物)的THF溶液(1500mL)中，在0℃、通氩气下滴加2.5M的正丁基锂的己烷溶液(462mL，1.16mol)。滴加完毕后，将得到的溶液搅拌15分钟。向该溶液中滴加化合物G2(250g，579mmol)的THF溶液(450mL)。将得到的溶液搅拌18小时，同时逐渐将溶液温度升至室温。将反应溶液减压浓缩。向该残留物中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3，1000mL)混合溶液，用饱和氯化铵水溶液洗涤。将水溶液层用己烷(500mL)提取数次。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G3的粗产物，339g(收率：98％)。该粗产物无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。FDMS m/z 598 M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.45(15H，m)，5.48-5.59(2H，m)，4.91(0.7H，t，J＝7.3Hz)，4.44(0.3H，t，J＝7.3Hz)，4.26(0.3H，dd，J＝4.3，7.3Hz)，4.21(0.7H，dd，J＝4.3，6.7Hz)，3.75(0.7H，m)，3.69(0.3H，m)，3.24(0.3H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.17(0.7H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.09-3.14[1H，(3.11，dd，J＝4.9，9.2Hz)，H1bE重叠]，1.75-2.03(2H，m)，1.49(3H，s)，1.39和1.38(3H，各自s)，1.21-1.34(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。化合物G4的合成
向化合物G3(338g，约565mmol)的二氯甲烷溶液(1500mL)中加入吡啶(500mL)。再向其中滴加甲磺酰氯(49mL，633mmol)，然后在31℃搅拌24小时。向其中滴加乙醇(40mL)，室温下搅拌1小时。将反应溶液减压浓缩后，向该残留物中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3，1000mL)混合溶液使溶液分离成水溶液层和有机层。将水溶液层用己烷(200mL)提取3次。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G4的粗产物，363g(收率：95％)。该粗产物无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。FDMS m/z 676M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.47(15H，m)，5.41(0.7H，ddd，J＝5.5，9.2，11.0Hz)，5.32(0.7H，bt，J＝11.0Hz)，5.22(0.3H，bdd，J＝9.2，15.0Hz)，5.02(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝15.0Hz)，4.8(0.7H，ddd，J＝3.1，5.5，7.9Hz)，4.73(0.7H，dd，J＝5.5，9.8Hz)，4.64-4.67(0.3H，m)，4.61(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，4.48(0.7H，dd，J＝5.5，7.9Hz)，4.22(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，3.55(0.3H，dd，J＝2.4，11.6Hz)，3.45(0.7H，dd，J＝3.2，11.0Hz)，3.06-3.12[4H，(3.12，s)，(3.11，s)，(3.09，dd，J＝3.1，11.0Hz)]，1.66-1.82(2H，m)，1.47和1.46(3H，各自s)，1.39(3H，s)，1.13-1.35(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.8Hz)。化合物G5的合成
向化合物G4(362g，约536mmol)的二氯甲烷溶液(1500mL)中加入甲醇(350mL)。向该溶液中滴加浓盐酸(200mL)，然后在室温下搅拌5小时。将反应溶液用碳酸氢钠中和，然后过滤。将滤液减压浓缩，向该残留物中加入乙酸乙酯，然后用盐水洗涤。将水溶液层用乙酸乙酯提取数次。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。将得到的产物用己烷结晶得到化合物G5的产物，161g(以化合物G2的量计收率：70％)。mp 66-67℃；FDMS m/z 377(M-H2O)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5.86(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝14.7Hz)，5.77(0.7H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝10.4Hz)，5.55(0.3H，br.dd，J＝7.3，14.7Hz)，5.49(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，4.51(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.11(0.3H，bt，J＝7.3Hz)，3.94-4.03(2H，m)，3.67-3.73[1H，(3.70，dd，J＝3.1，6.7Hz)，(3.69，dd，J＝3.1，7.3Hz)]，3.20和3.19(3H，各自s)，2.05-2.22(2H，m)，1.22-1.43(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz).化合物G6的合成
向化合物G5(160g，405mmol)的THF溶液(780mL)中加入5％硫酸钡负载的钯(16g)。将反应容器用氢气清洗后，将混合液在室温下搅拌20小时。将反应溶液用硅藻土过滤，将滤饼用氯仿∶甲醇(1∶1)的混合溶液洗涤。将滤液和洗液合并，减压浓缩。将残留物用乙酸乙酯结晶得到化合物G6的产物，146g(收率：91％)。[α]23D+12°(c 1，CHCl3/MeOH＝1∶1)；mp 124-126℃；FDMS m/z 397(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3/CD3＝1∶1)δ4.93-4.96(1H，m，H2)，3.91(1H，dd，J＝6.7，12.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，12.2Hz)，3.54-3.60(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝1.8，8.5Hz)，3.19(3H，s)，1.75-1.83(1H，m)，1.53-1.62(1H，m)，1.2-1.45(24H，m)，0.89(3H，t，J＝6.7Hz)。化合物G7的合成
向化合物G6(145g，365mmol)的DMF溶液(1000mL)中加入叠氮化钠(47g，730mmol)，将混合液在95℃下搅拌4小时。将反应溶液浓缩。向该残留物中加入乙酸乙酯(450mL)，将得到的溶液用水洗涤。将水层用乙酸乙酯再提取数次。将得到的所有有机层合并，用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G7的粗产物，122g(收率：97％)。该粗产物无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。[α]23D+16.5°(c 0.5，CHCl3/MeOH＝1∶1)；mp 92-93℃；FDMS m/z 344(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ3.91(1H，dd，J＝3.7，11.6Hz)，3.75(1H，dd，J＝7.9，11.6Hz)，3.49-3.61(3H，m)，1.50-1.71(2H，m)，1.22-1.46(24H，m)，0.90(3H，t，J＝6.7Hz)。化合物G8的合成
向化合物G7(121g，约352mmol)的二氯甲烷溶液(750mL)中加入吡啶(250mL)和三苯甲基氯(124g，445mL)，将混合液在室温下搅拌16小时。向其中滴加乙醇(30mL)，然后室温下搅拌30分钟。用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤后，将反应溶液用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。将残留物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(10∶1)作为洗脱液经层析纯化，得到化合物G8的产物，34.4g(以化合物G6的量计收率：52％)。[α]24D+11.9°(c 0.9，CHCl3)；FDMS m/z 585M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.24-7.61(15H，m)，3.62-3.66(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.0，10.4Hz)，1.23-1.56(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。化合物G9的合成
向化合物G8(33.5g，57.3mmol)的DMF溶液(300mL)中加入60％氢化钠(5.5g，约138mmol的NaH)，将混合物搅拌40分钟。将反应溶液冷却至0℃，然后向其中滴加苄基氯(15mL，120mmol)。将得到的溶液搅拌18小时，期间逐渐将溶液温度升至室温。向该反应溶液中加入冰冷却的水(100mL)终止反应，然后将反应溶液用乙酸乙酯提取。将提取液用盐水洗涤3次。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G9的粗产物，42.2g(收率：96％)。该粗产物无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(100∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。[α]24D+9.8°(c 1.0，CHCl3)；FDMS m/z 738(M-N2)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.07-7.48(25H，m)，4.57(1H，d，J＝11.6Hz)，4.44(1H，d，J＝11.6Hz)，4.41(2H，s)，3.73-3.79(1H，m)，3.46-3.56(2H，m)，3.37(1H，dd，J＝8.6，10.4Hz)，1.20-1.64(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。化合物G10和G11的合成
向化合物G9(41.2g，约54mmol)的1-丙醇溶液(250mL)中加入甲醇(30mL)，再向其中加入5％钯碳(4.1g)和甲酸铵(27.1g，4.3mol)。将混合物于室温搅拌16小时后，用乙酸乙酯稀释，然后用硅藻土过滤。将滤液减压浓缩，然后溶于乙酸乙酯中。将得到的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次，再用盐水洗涤。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G10的粗产物，38.9g(收率：98％)。该粗产物(化合物G10)无需进一步纯化直接可用于下一步反应。
向化合物G10的二氯甲烷溶液(300mL)中加入二十六烷酸(22.4g，56.5mmol)和WSC盐酸盐(12.6g，64.6mmol)，将混合物加热回流2小时。冷却至室温后，将反应溶液减压浓缩。向残留物中加入乙酸乙酯(500mL)，将得到的溶液用0.5M盐酸水溶液、盐水、饱和碳酸氢钠水溶液和最后用盐水洗涤数次。将得到的所有有机层合并，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩，得到化合物G11的粗产物，53.2g(收率：88％)。该粗产物(化合物G11)无需进一步纯化直接可用于下一步反应。为制备分析样品，可将部分粗产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(100∶1)作为洗脱液经层析进一步纯化。[α]24D+5.3°(c 0.4，CHCl3)；FDMS m/z 1118M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.20-7.38(25H，m)，5.57(1H，d，J＝9.1Hz)，4.80(1H，d，J＝11.6Hz)，4.48-4.50(3H，m)，4.24-4.32(1H，m)，3.83(1H，dd，J＝3.0，6.7Hz)，3.43-3.51(2H，m，H1a)，3.29(1H，dd，J＝4.3，9.8Hz)，1.92(2H，t，J＝7.3Hz)，1.28-1.60(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)。化合物G12的合成
向化合物G11(52.2g，约47mmol)的二氯甲烷溶液(180mL)中加入甲醇(36mL)，再向其中滴加10％盐酸的甲醇溶液(3.0mL)。将混合物于室温搅拌2小时。将反应溶液用碳酸氢钠粉末(18g)中和，然后用硅藻土过滤。将残留物用二氯甲烷洗涤。将滤液和洗液合并，然后用盐水洗涤。将得到的有机层用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。将残留物溶于热丙酮中，然后冷却至0℃生成纯化形式的化合物G12的产物的沉淀，38.6g(以G9的量计收率：77％)。[α]24D-29.7°(c 0.7，CHCl3)；mp 75-76.5℃；FDMS m/z 876M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.30-7.47(10H，m)，6.03(1H，d，J＝7.9Hz)，4.72(1H，d，J＝11.6Hz)，4.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.61(1H，d，J＝11.6Hz)，4.45(1H，d，J＝11.6Hz)，4.12-4.17(1H，m)，4.00(1H，dt，Jt＝4.3Hz，Jd＝7.3Hz)，3.67-3.72(2H，m)，3.61(1H，ddd，J＝4.3，8.6，11.6Hz)，1.94-2.05(2H，m)，1.15-1.69(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.1Hz)。化合物G13的合成
(1)将2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖基乙酸酯(79.8g)溶于甲苯(160mL)和异丙基醚(520mL)的混合溶液中，然后冷却至-10-0℃。向该溶液中加入含有2.0当量HBr的异丙基醚的溶液(2.8mmol/mL，约100mL)。将该反应溶液在-10-0℃搅拌约90分钟后，向其中倒入5％碳酸氢钠水溶液，搅拌中和过量的HBr。将全部溶液转移至分液漏斗中，分出水溶液层和有机层。将得到的水层弃掉，有机层用10％氯化钠水溶液洗涤2次。将有机层减压浓缩，得到浆状产物2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基溴(Gal-Br)。
(2)向含有化合物G12(60.0g，68.6mmol)、溴化四己基铵(89.4g，206mmol)和分子筛4A粉末(60g)的甲苯溶液(420mL)中加入DMF(140mL)，随后加入Gal-Br(约137mmol)的甲苯溶液(250mL)。将混合物于室温搅拌72小时。向该反应溶液中加入甲醇(12mL)，搅拌2小时。将溶液用硅藻土过滤后，将滤液用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。向该残留物中加入乙腈，将得到的溶液搅拌2小时生成沉淀。减压干燥得到的沉淀得到干燥粉末产物。将该粉末产物在硅胶柱上用己烷∶乙酸乙酯(8∶1)作为洗脱液经层析纯化，得到化合物G13，70.9g(收率：74％)。[α]24D+18.8°(c 0.9，CHCl3)；mp 74-75℃；FDMS m/z1399(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.37(30H，m)，6.12(1H，d，J＝9.0Hz)，4.91(1H，d，J＝11.6Hz)，4.84(1H，d，J＝3.7Hz)，4.72-4.80(4H，m)，4.35-4.65(7H，m)，4.12-4.18(1H，m)，3.99-4.05(2H，m)，3.84-3.93(4H，m)，3.73(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.47-3.51(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.1，9.1Hz)，1.87-1.99(2H，m)，1.18-1.70(72H，m)，0.88(6H，t，J＝7.4Hz)。(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-N-二十六烷酰基-2-氨基-1，3，4-十八烷三醇(KRN7000)
将化合物G13(60.0g，42.9mmol)混悬于乙醇(960mL)中，向其中加入20％氢氧化钯(6.0g)的乙醇混悬液。向该混悬液中加入4-甲基环己烯(120mL，93.5mmol)作为氢的供体化合物，然后加热回流4小时。之后，将得到的溶液过滤除去催化剂。将残留物用热乙醇洗涤。将滤液室温放置产生白色产物的沉淀。将白色沉淀过滤，然后减压干燥。将得到的粉末产物混悬于乙醇∶水(92∶8，3.5L)k，加热搅拌溶解，然后放置再产生沉淀。过滤沉淀溶液，将得到的滤饼减压干燥，得到白色粉末形式的标题化合物，35.0g(收率：95％)。[α]24D+43.6°(c 1.0，吡啶)；mp 189.5-190.5℃；负FABMS m/z 857(M-H)-；IR(cm-1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，1070；1H-NMR(500MHz，C5D5N)δ8.47(1H，d，J＝8.5Hz)，5.58(1H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，m)，4.63-4.70(2H，m)，4.56(1H，m)，4.52(1H，t，J＝6.1Hz)，4.37-4.47(4H，m)，4.33(2H，m)，2.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25-2.34(1H，m)，1.87-1.97(2H，m)，1.78-1.85(2H，m)，1.62-1.72(1H，m)，1.26-1.45(66H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)。13C-NMR(125MHz，C5D5N)δ173.2(s)，101.5(d)，76.7(d)，73.0(d)，72.5(d)，71.6(d)，71.0(d)，70.3(d)，68.7(t)，62.7(t)，51.4(d)，36.8(t)，34.4(t)，32.1(t)，30.4(t)，30.2(t)，30.03(t)，30.00(t)，29.93(t)，29.87(t)，29.81(t)，29.76(t)，29.6(t)，26.5(t)，26.4(t)，22.9(t)，14.3(q)。
药理实验[药理实验1]KRN 7000对人体外周血-衍生的APC的作用
本实验用来研究KRN7000(化合物No.14，本发明的代表性糖苷化合物)对从人体外周血中制备的APCS的作用。这些从人体外周血中衍生的APCS(主要包括树突细胞)主要根据Hsu等的方法(上文)制备。简单地说，将人体外周血在菲可帕克上铺层，在2,000rpm下离心35分钟得到单核细胞组分。将部分该单核细胞组分混悬于补加5％灭活的人体AB血清的PBS(游离Ca++，Mg++)中。将得到的溶液在50％珀可上铺层，然后在3,000rpm下离心20分钟得到高密度组分。将该高密度组分用覆盖人体丙种球蛋白的皿选淘(panned)除去其中的FcR+细胞(即，除去单核细胞的组分)。使得到的组分与抗-CD3单克隆抗体、抗-CD21单克隆抗体和抗-CD56单克隆抗体反应。洗涤后，将得到的溶液用覆盖抗鼠IgG抗体的皿选淘除去与以上抗体反应的细胞(即，T细胞、B细胞和NK细胞)。将如此得到的细胞组分(即，从中除去单核细胞、T细胞、B细胞和NK细胞的组分)在补加5％灭活的人体AB血清的RPMI 1640培养基中，在一溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)和KRN7000(最后浓度：100ng/mL)存在下培养40小时。洗涤后，得到的细胞被提供用作APC。
另一方面，将作为效应器细胞的CD4+T细胞用人体CD4+T细胞-富集柱从剩余的以上制备的单核细胞组分中提纯出，再在补加5％灭活的人体AB血清的RPMI 1640培养基中培养直至能够与该APCS一起使用。
将以上制备的APCS(5×104细胞/孔)和效应器细胞(1×105细胞/孔)都加入到96孔平底平板的孔中，然后进行自体MLR测试。在6天培养过程的最后12小时期间，向每个孔中加入氚-胸苷(3H-TdR)(0.5μCi/孔)，然后收集细胞。用液体闪烁计数器测定孔中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图1。在图1中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的APCS。
如图1中所示，当将CD4+T细胞、溶媒-预处理的APC(V-APC)和KRN7000-预处理的APC(KRN-APC)各自单独
培养时，每种情况下，细胞都没有吸收或吸收可忽略量的3H-TdR。相反地，当将以上制备的T细胞与V-APC混合时，发现明显的3H-TdR吸收。当将T细胞与KRN-APC混合时，发现非常显著的3H-TdR吸收。这些结果表明KRN-APC比V-APC具有较显著的自体MLR增强作用。因此，KRN7000对从人体外周血中制备的APC具有激活作用(即，呈递抗原功能增强作用)。[药理实验2]KRN 7000对人体脐带血-衍生的APC的作用
按以下方法制备从人体脐带血(CD1c阳性细胞；CD1c+细胞)中衍生的APCS。即，将人体脐带血在Lymphoprep上铺层，在1500rpm下离心20分钟得到单核细胞组分。将部分该单核细胞组分用补加2％灭活的FBS和1mM EDTA的PBS洗涤两次，将FcR用人体丙种球蛋白阻断。使该溶液与抗-CD1c抗体反应，再用补加2％FBS和1mM EDTA的PBS洗涤两次。使该溶液再与抗小鼠IgG微珠反应，用补加2％FBS和1mM EDTA的PBS洗涤，然后混悬于补加0.5％BSA和5mM EDTA的PBS中。用预先用补加0.5％BSA和5mM EDTA的PBS洗涤过的MiniMACS磁柱从该混悬液中得到CD1c+细胞。将得到的CD1c+细胞混悬于补加10％灭活的人体AB血清的RPMI 1640培养基中，调节其密度至1×106细胞/mL。将该细胞混悬液加入到24孔平板的孔中(2mL/孔)，然后向每个孔中加入一溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)或KRN7000(最后浓度：100ng/mL)。孵育3天后，将平板洗涤3次，用作APCS。
用人体CD4+T细胞-富集柱将CD4+T细胞从剩余的以上制备的单核细胞组分中提纯出来。将得到的T细胞混悬于补加10％灭活的人体AB血清的RPMI 1640培养基中，调节其密度至1×106细胞/孔。将该混悬液加入到24-孔平板的孔中(2mL/孔)，培养3天。将如此获得的T细胞作为效应器细胞用于自体MLR测试中。另一方面，从正常志愿者中收集外周血，用人体CD4+T细胞-富集柱将CD4+T细胞从中提纯出来。将如此获得的T细胞作为效应器细胞用于异源MLR测试中。将效应器细胞(1×105细胞/50mL/孔)和刺激物细胞(0、1000、10000细胞/50mL/孔)都加入到96孔平底平板的孔中，将该平板孵育。为进行异源MLR测试，将该平板孵育4天，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。20小时后，收获细胞，用液体闪烁计数器测定孔中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图2。
为进行自体MLR测试，将该平板孵育7天，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。8小时后，收获细胞，用液体闪烁计数器测定孔中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图3。在图2和3中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的APCS(CD1c+细胞)。
如图2中所示，用溶媒刺激的CD1c+细胞(APCs；V-APC)以依赖于V-APC数量的方式促进吸收3H-TdR(增殖的异源T细胞)，而用KRN7000刺激的CD1c+细胞(APCs；KRN-APC)显示出比V-APC更强的促进异源T细胞-增殖的作用。
如图3中所示，当用自体T细胞作为效应器细胞时，用溶媒刺激的CD1c+细胞(V-APC)很难刺激自体T细胞的增殖，即使向孔中加入APCs的量是10000细胞/孔；然而，用KRN7000处理的CD1c+细胞(KRN-APC)明显以依赖于APCs数量的方式刺激自体T细胞的增殖，其与异源T细胞的情况类似。[药理实验3]α-和β-半乳糖苷神经酰胺及α-和β-葡糖神经酰胺对鼠脾脏-衍生的APC的作用
主要根据Clowley，M等的方法(上文)从鼠脾脏中制备富含树突细胞的APCs。简单地说，是从BDF1小鼠中取出脾脏。用100U/mL胶原酶处理后，将脾脏用镊子解剖分成细胞悬液和组织碎片。将组织碎片混悬于400U/mL胶原酶溶液中。在CO2培养箱中培养20分钟后，用内注射器将该混悬液通过不锈钢筛得到细胞混悬液。将两组细胞混悬液合并，离心。用高密度BSA将该细胞混悬液进行密度梯度离心得到低密度细胞组分。将该细胞组分置于60mm皿中，培养2小时。除去漂浮细胞，该过程重复3次。将补加10％灭活的FBS的RPMI1640培养基加到皿中，再向其中加入以下任一种物质：KRN7000(化合物No.14)、AGL583(KRN7000的β-端基异构体)、AGL517(化合物No.3)、AGL564(AGL517的β-端基异构体)、AGL563(化合物No.4)、AGL562(AGL563的β-端基异构体)和溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)，最后浓度为100ng/mL。培养过夜后，收集非贴壁细胞，得到的细胞作为APCs备用。
另一方面，将BDF1小鼠脾脏细胞用含有NH4Cl和Tris-HCl的红细胞溶解缓冲液处理以便溶解红细胞，将得到的脾脏细胞混悬于补加10％灭活的FBS的RPMI 1640培养基中。将该脾脏细胞接种到100mm皿中，在CO2培养箱中培养2小时。然后回收非贴壁细胞，作为效应器细胞备用。
将以上制备的APCs(1×103、3.3×103或1×104细胞/孔)和效应器细胞(2.5×105细胞/孔)加入到96孔平板的孔中进行同源MLR测试。培养1天后，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。16小时后，收获细胞。用液体闪烁计数器测定细胞中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图4。
图4中，“V-APC”、“KRN-APC”、“583-APC”、“517-APC” 、“564-APC”、“563-APC”和“562-APC”指分别用溶媒、KRN7000、AGL-583、AGL-517、AGL-564、AGL-563和AGL-562预处理的APCs。
如图4中所示，用α-半乳糖苷神经酰胺如KRN-APC和517-APV预处理的APCs显示出显著的同源MLR增强作用，而用β-半乳糖苷神经酰胺如583-APC和564-APC预处理的APCs没有显示任何这种作用。用α-葡糖神经酰胺如563-APC预处理的APCs也显示出显著的同源MLR增强作用，而用β-葡糖苷神经酰胺如562-APC预处理的APCS没有显示任何这种作用。[药理实验4]使用用KRN7000预处理的鼠脾脏-衍生的APCS的APC疗法
为研究用KRN7000激活的鼠脾脏-衍生的APCs对移植上肿瘤细胞的鼠的抗肿瘤作用，采用BDF1小鼠(6周龄，雌性)进行实验。所有实验每组用6只小鼠。将鼠T细胞淋巴瘤EL-4细胞以1×105细胞/小鼠的剂量水平静脉注射给每只小鼠(注射日：第0日)。第一天，将按药理实验3中相同方法制备的溶媒-预处理的APCs(V-APC)和KRN7000-预处理(100ng/mL)的APCs(KRN-APC)以5×105细胞/小鼠的剂量水平各自静脉注射给小鼠。作为阳性对照，在第1、5和9天，将KRN7000以100μg/kg的剂量静脉注射给小鼠。检查每只小鼠每天的生存迹象以确定其存活期。结果见图5。
如图5中所示，当注射V-APC时，没发现生存期的延长。但是，当注射KRN-APC时，发现存活期明显增加，50％KRN-APC-注射的小鼠完全治愈。当以100μg/kg的剂量静脉注射3次KRN7000时，发现存活期明显增加，但是，发现其作用的潜能比仅注射一次KRN-APC时要弱。[药理实验5]KRN 7000对鼠骨髓-衍生的树突细胞的呈递抗原功能的增强作用
根据作了一些改变(Yamaguchi Y.等，Stem Cells，1977：15：144-153)的Inaba，K.等的方法(上文)，制备从鼠骨髓中衍生的富含树突细胞的APCs。简单地说，制备来自BALB/c小鼠中的骨髓细胞。用NH4Cl溶液将红细胞溶解后，用人体丙种球蛋白覆盖的皿淘选出FcR+细胞。将获得的细胞混悬于补加10％FCS的RPMI培养基中，在10ng/mL小鼠rGM-CSF和10ng/mL人体rTGF-β存在下以5×105细胞/孔(1ml/孔，24-孔平板)培养6天。每2天，将每孔用巴氏滴管简单洗涤，然后吸出约75％的培养基，再补加1mL含有以上要素的新制培养基。培养6天后，回收非贴壁细胞，用人体丙种球蛋白覆盖的皿从中淘选出FcR+细胞。将此制备的细胞在补加10ng/mL小鼠rGM-CSF和10ng/mL人体rTNF-α的培养基中再培养2天。在此培养过程中，向培养基中加入溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)或KRN7000(最后浓度：100ng/mL)。收集该细胞，洗涤3次得到APCs，备用。另一方面，用T细胞富集柱(R&D)从BALB/c鼠脾脏中制备作为效应器细胞的T细胞。将T细胞加入到96孔平板的孔中(3×105细胞/孔)，再向其中加入以上制备的APCs进行同源MLR测试(分别为3×104、1×104、3×103和1×103细胞/孔)。培养2天后，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/mL)。6小时后，收获细胞，用液体闪烁计数器测定细胞中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图6。图6中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的APCs。
如图6中所示，用KRN7000刺激的、鼠骨髓衍生的APCs(KRN-APC)比用溶媒刺激的APCs(V-APC)显示出显著的同源MLR增强作用。[药理实验6]使用用KRN7000预处理的鼠骨髓-衍生的APCS的APC疗法
进行本实验是为研究用KRN7000激活的鼠骨髓-衍生的APCs对移植上肿瘤细胞的小鼠的抗肿瘤作用。所有实验采用CDF1小鼠(6周龄，雌性)，分成5只小鼠为一组的组别。将鼠结肠腺癌结肠26细胞以2×106细胞/小鼠的剂量水平移植到每只鼠脾脏内(接种日：第0日)。第一天，将按药理实验5中相同方法制备的溶媒-预处理的APCs(V-APC)和KRN7000-预处理(100ng/mL)的APCs(KRN-APC)以8×105细胞/小鼠的剂量水平各自静脉注射给小鼠。作为阳性对照，在第1、5和9天将KRN7000以100μg/kg的剂量静脉注射给小鼠。第十四天，从每只小鼠中取出肝脏，称重。结果(5只鼠的肝脏重量的平均值和标准差)见图7。在此，没有被移植肿瘤细胞的小鼠的肝脏约为1g。因此，通过从被移植肿瘤的小鼠的肝脏重量中减去1g来确定实际肿瘤的重量。
如图7中所示，当注射V-APC时，发现很小的抑制肿瘤生长的作用；但是，当注射KRN-APC时，观察到明显的抑制肿瘤生长的作用，并且裸眼观察到5只鼠中有3只肝脏上没有肿瘤结。当以100μg/kg的剂量静脉注射3次KRN7000时，观察到明显的抑制肿瘤生长的作用，它与注射一次KRN-APC时的作用相同。[药理实验7]KRN 7000对鼠表皮-衍生的APSC的呈递抗原功能的增强作用
主要根据Witmer-Pack，M等的方法(上文)从鼠耳郭制备富含朗格汉斯细胞的APCs。简单地说，将BALB/cih鼠的耳郭表皮剥成前后表皮片，将各表皮片浸入到37℃补加1％胰蛋白酶的Hanks氏溶液中30分钟至1小时。将得到的表皮片置于筛上，在补加10％FCS的Hanks氏溶液中上下振摇。收集从表皮片上脱离的细胞，然后以106细胞/mL混悬于补加10％FCS的RPMI溶液中。加入溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)或KRN7000(最后浓度：100ng/mL)后，在37℃、5％CO2下培养该细胞3天。然后，收集没有粘附在皿上的细胞，并涂层在Lymtholite-M上。在1400rpm下离心10分钟，收集低密度细胞，用RPMI洗涤2次，得到APCs，备用。
按药理实验3中所述相同的方法从BALB/c小鼠中制备作为效应器细胞的脾脏细胞。将如此得到的效应器细胞加入到96孔平板的孔中(2.5×105细胞/孔)，再向其中加入APCs进行同源MLR测试(分别为4×104、4/3×104和4/9×104细胞/孔)。培养2天后，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/mL)。6小时后，收获细胞，用液体闪烁计数器测定细胞中吸收的3H-TdR的量。结果(3孔的平均值和标准差)见图8。图8中，“V-APC”和“KRN-APC”指分别用溶媒和KRN7000预处理的APCs。
如图8中所示，用KRN刺激的鼠表皮衍生的APCs(KRN-APCs)比用溶媒刺激的APCs(V-APCs)显示出显著的同源MLR增强作用。[药理实验8]使用用KRN7000和肿瘤抗原预处理的鼠脾脏-衍生的APCs的APC疗法
采用被分成6只小鼠为一组的BDF1小鼠(6周齿，雌性)进行本实验。将鼠黑素瘤B16细胞以1.5×106细胞/小鼠的剂量水平皮下移植到每只鼠中(移植日：第0日)。按药理实验3中相同方法制备几种类型的预处理的APCs，其中APCs分别用下列物质预处理：溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)(V-APC)、溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)和B16-肿瘤细胞溶胞产物两者(V-T-APC)、KRN7000(最后浓度：100ng/mL)(KRN-APC)以及KRN7000(最后浓度：100ng/mL)和B16-肿瘤细胞溶胞产物两者(KRN-T-APC)。第一天，将每个预处理的APCs以5×105细胞/小鼠的剂量静脉注射给小鼠。作为阳性对照，在第1、5和9天将KRN7000以100μg/kg的剂量静脉注射给小鼠。测定每只小鼠中皮下肿瘤的体积。结果(6只小鼠的肿瘤体积的平均值)见图9。
如图9中所示，当注射V-APCs和V-T-APCs时，发现很小或没有抑制肿瘤生长的作用。相反地，当注射一次KRN-APCs时，观察到抑制肿瘤生长的作用，它与以100μg/kg的相同剂量静脉注射3次KRN7000时的作用相同。值得注意的是：注射一次KRN-T-APC比注射一次KRN-APC或以100μg/kg的剂量静脉注射3次KRN7000产生更显著的抑制肿瘤生长的作用。[药理实验9]KRN 7000对人体外周血-衍生的APCs的作用
通过珀可密度-梯度离心从人体外周血单核细胞中制备单核细胞组分。将该单核细胞组分在有或无GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)存在下培养，向其中同时加入溶媒(v；DMSO，0.1％)或者KRN7000(KRN；100ng/mL)。培养3天后，收集细胞，用培养基洗涤3次得到V-APC、KRN-APC、V-APC-GM和KRN-APC-GM(其中“GM”指在GM-CSF和IL-4存在下培养的APCs)，然后作为APCs，备用。使用作为效应器细胞的人体外周血衍生的FcR-细胞进行异源MLR测试。
如图10中所示，所有APCs都以依赖于APCs数量的方式增强异源MLR的反应，但是，KRN-APC和KRN-APC-GM分别比V-APC和V-APC-GM显示出对效应器细胞的增殖明显更强的刺激作用。另外，还发现KRN-APC-GM的作用比KRN-APC更强。推测通过加入20000细胞/孔量的KRN-APC-GM而抑制效应器细胞的增殖是由于效应器细胞的过度生长的结果。[药理实验10]KRN 7000对人体外周血-衍生的APC的作用
进行以下实验是为研究长期培养的APC的作用。通过珀可密度-梯度离心从人体外周血单核细胞中制备单核细胞组分。将该单核细胞组分在GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)存在下培养，向其中同时加入溶媒(v；0.1％DMSO)或者KRN7000(KRN；100ng/mL)。培养7天后，回收细胞，用培养基洗涤3次分别得到V-APC-GM和KRN-APC-GM，然后作为APCs，备用。使用作为效应器细胞的人体外周血衍生的FcR-细胞进行自体MLR测试。
如图11中所示，V-APC-GM不刺激效应器细胞的增殖，但是，KRN-APC-GM却以依赖于APCs数量的方式增强自体MLR的反应。[药理实验11]KRN 7000对人体外周血-衍生的APC的作用
进行以下实验是为研究长期培养的APC的作用。通过珀可密度-梯度离心从人体外周血单核细胞中制备单核细胞组分。将该单核细胞组分在GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)存在下，用或不用按Bender等的方法(Bender A.等，1996，J.Immunol.Method.，196，121)制备的单核细胞条件培养基(MCM)培养。同时向该组分中加入溶媒(v；0.1％DMSO)或者KRN7000(KRN；100ng/mL)。培养11天后，回收细胞，用培养基洗涤3次分别得到V-APC-GM(MCM-)、KRN-APC-GM(MCM-)、V-APC-GM(MCM+)和KRN-APC-GM(MCM+)，作为APCs，备用。使用作为效应器细胞的人体外周血衍生的FcR-细胞进行自体MLR测试。
如图12中所示，V-APC-GM(MCM-)不刺激效应器细胞的增殖，但是，KRN-APC-GM(MCM-)却以依赖于APCs数量的方式增强自体MLR的反应。V-APC-GM(MCM+)和KRN-APC-GM(MCM+)两者都以依赖于APCs数量的方式增强自体MLR的反应。KRN-APC-GM(MCM+)的作用比V-APC-GM(MCM+)的作用强。
从以上药理实验9、10和11的结果中发现：KRN7000可以以不同方法激活来自人体外周血中的APCs。[药理实验12]KRN 7000对人体脐带血-衍生的APC的作用
通过珀可密度-梯度离心从人体脐带血单核细胞中制备单核细胞组分。将该单核细胞组分在GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)存在下培养，同时向其中加入溶媒(v；0.1％DMSO)或者KRN7000(KRN；100ng/mL)。培养3天后，回收细胞，用培养基洗涤3次分别得到V-APC-GM和KRN-APC-GM，作为APCs，备用。使用作为反应细胞的人体脐带血衍生的FcR-细胞进行自体MLR测试。
如图13中所示，V-APC-GM不刺激效应器细胞的增殖，但是，KRN-APC-GM却以依赖于APCs数量的方式增强自体MLR的反应。推测通过加入20,000细胞/孔量的KRN-APC-GM而抑制效应器细胞的增殖是由于效应器细胞的过度生长的结果。
结果表明：KRN7000可以以不同方法激活人体脐带血衍生的APCs。[药理实验13]α-半乳糖苷神经酰胺对鼠脾脏-衍生的APC的作用
为确定除KRN7000外本发明的α-半乳糖苷神经酰胺衍生物也具有APC-激活作用，进行以下药理实验。
按药理实验3所述相同的方法从鼠脾脏中制备富含树突细胞的APCs。简单地说，是将该APCs用任一种最后浓度为100ng/mL的物质处理：KRN7000(本发明化合物No.14)、AGL512(本发明化合物No.10)、AGL525(本发明化合物No.16)、AGL506(本发明化合物No.1)、AGL514(本发明化合物No.2)、AGL571(本发明化合物No.5)和溶媒(DMSO，最后浓度：0.1％)。将每一此处理的APCs(1×104细胞/孔)和效应器细胞(2.5×105细胞/孔)加入到96孔平板的孔中，然后进行同源MLR测试。培养2天后，向每个孔中加入3H-TdR(0.5μCi/孔)。8小时后，收获细胞。用液体闪烁计数器测定细胞中吸收的3H-TdR的量。结果见图14。
图14中，“V-APC”、“KRN-APC”、“512-APC”、“525-APC”、“506-APC”、“514-APC”和“571-APV”指分别用溶媒、KRN7000、AGL-512、AGL-525、AGL-506、AGL-514和AGL-571预处理的APCs。
如图14中所示，用α-半乳糖苷神经酰胺衍生物预处理的APCs显示出显著的同源MLR增强作用。
结果表明：除KRN7000外，本发明的化合物(α-半乳糖苷神经酰胺和α-葡糖神经酰胺)也具有激活鼠脾脏衍生的富含树突细胞的APCs的作用(即，APC功能增强作用)。