一种多吡啶钌金属配合物及其制备方法和用途技术领域
本发明涉及化学领域，具体涉及金属配位化合物。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类由18～25个核苷酸组成，并且参与基因调控的内源性RNA
分子。miRNA通过与靶基因互补配对，在翻译水平调控基因的表达。其广泛表达于各种组织
和器官，在细胞的增殖和凋亡、器官形成、发育等生命过程中发挥着重要的作用miRNA。不同
发育阶段、不同组织中miRNA的表达水平有着显著差异。近年来有科学家研究发现，很多疾
病的发生与miRNA的表达水平息息相关，如2015年Shu&Liu等发现胃癌患者外周血中miR-
185表达显著上调，并推断miR-185很可能作为潜在的胃癌诊断的生物标记物。因此，miRNA
作为对疾病预测及诊断的新型生物标记物受到了科研工作者广泛的关注，对不同物种中
miRNA表达进行识别对预防和诊断相关疾病具有重要意义。
检测miRNA最常用的方法有灵敏度高的qRT-PCR(实时荧光定量PCR)特异性强的
northern blot(诺瑟杂交法)，高效快速的microarrays(基因芯片)，但这些方法需经过逆
转录过程来识别，过程复杂，成本高且耗时。近年来所报道RCA(滚环扩增法)，LAMP(环介导
等温扩增法)及LCR(连接酶链式反应)等方法虽然在一定程度上提高了识别灵敏度，但仍未
克服耗时长且高成本等缺点。
多吡啶钌金属配合物作为一种高效的荧光淬灭剂，在荧光光谱学原理作用下，基
于多吡啶钌金属配合物常被应用于一些荧光光谱学实验当中，但大部分基于多吡啶钌金属
配合物应用于核酸分子探针以及DNA光裂解方面，尚未见报道多吡啶钌金属配合物用于
miRNA检测方面的研究。
基于上述结构，多吡啶钌金属配合物因其较大的极性，使得此类化合物具有较好
的水溶性。选用多吡啶钌金属配合物源于其具有许多优势，金属钌配合物是六配位八面体
结构，化学性质稳定，不易发生配体取代；配合物的光化学和光物理信息丰富；有机配体通
过引入金属钌不仅保留了有机配体的活性，并且提高了其溶解度；结构复杂多样性更有利
于针对复杂的生物体系设计合成特异性强的小分子探针。目前，多吡啶钌金属配合物作为
荧光探针识别miRNA的研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多吡啶钌金属配合物，该金属配位化合物
具有良好的水溶性，可检测胃癌患者外周血中高表达的miRNA。
本发明解决上述问题的技术方案是：
一种多吡啶钌金属配合物，该金属配合物的结构为下式(Ⅰ)所示，该配合物的核磁
共振氢谱数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.68(dd,J1＝8.4,J2＝9.2Hz,2H),8.93(dd,J1
＝8.4,J2＝8.8Hz,4H),8.53(d,J＝3.6Hz,1H),8.36(d,J＝5.6Hz,1H),8.29(d,J＝5.6Hz,
1H),8.24(t,J＝7.6Hz,2H),8.17(d,J＝9.2Hz,2H),8.12(d,J＝6.0Hz,1H),8.09(m,2H),
7.83(d,J＝5.2Hz,2H),7.74(m,2H),7.62(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(m,1H),7.41(dd,J1＝
8.0,J2＝8.0Hz,2H)。
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本发明所述的多吡啶钌金属配合物的分子式为Ru(bpy)2(thtp)Cl2，式中的bpy为
2’,2-联吡啶，thtp为配体3-噻吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-邻菲咯啉。上述多吡啶钌金
属配合物在常温下为橙红色固体粉末，具有较好的水溶性和水稳定性。
本发明所述的多吡啶钌金属配合物采用本领域常用的制备方法，如将配体3-噻
吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-邻菲咯啉与前体Ru(bpy)2Cl2反应得到。本发明人推荐的方
法，由以下步骤组成：
(1)将2-氰基噻吩溶解在体积浓度为95％的乙醇中，加入大大过量的水合肼
(80％)，反应得到配体thtp；
(2)将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮加热溶于无水乙醇中，再向其中加入2-噻吩甲酰
胺腙，反应得到黄色沉淀为配体thtp；
(3)称RuCl3·3H2O，2’,2-联吡啶，氯化锂溶解于DMF中，氩气保护下120℃回流8h。
反应完全后冷却至室温，加入50ml丙酮冷冻过夜。溶液抽滤，沉淀用冰水洗至滴下来的水几
乎没有颜色，得紫黑色固体Ru(bpy)2Cl2为前体；
(4)将前体溶于乙醇：水＝3:1(v:v)的混合体系中，加入1.1倍摩尔量的配体，升温
至90℃反应12h，然后冷却至室温，旋蒸大部分溶剂，将产物溶于乙腈用中性氧化铝
(200mesh)柱分离即可得到所述橙红色固体Ru(bpy)2(thtp)Cl2。
本发明的所述的多吡啶钌金属配合物具有检测胃癌患者外周血中高表达
microRNA的性能。检测原理如下：配合物首先通过静电、π-π堆积和(或)氢键作用等非共价
键作用与probe-DNA(带有荧光标记物质的miRNA的逆转录DNA，简称为P-DNA)结合形成复合
体系并产生荧光淬灭现象。在加入miRNA后，miRNA与P-DNA通过碱基互补配对的作用形成结
构稳定的杂化双链DNA/RNA。由于杂化双链螺旋骨架的保护作用，使得杂化双链与配合物的
相互作用明显弱于P-DNA单链与配合物之间的作用，使得配合物与之分离开来，体系的荧光
也随着PET机制消失而复苏，实现了对miRNA的检测。
本发明的所述的多吡啶钌金属配合物可以用于检测胃癌患者外周血中高表达
miR-185，具体检测方法包括以下步骤：
(1)金属配合物与probe-DNA结合荧光淬灭能力
用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将
化合物溶解在100μM Tris-HCl缓冲溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液为滴定液。取P-
DNA待滴定液2mL于常量荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光
强度的变化(激发波长＝480nm，发射波长＝518nm)直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率
QE用公式1.1计算。
QE＝(1-FM/F0)×100％ (1.1)
其中F0为P-DNA初始荧光强度；FM是加入钌配合物后体系荧光淬灭达到饱和时的荧
光强度。
配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验亦采用此方法完成。
(2)复合体系与miRNA结合荧光复苏能力
复合体系检测时间确定：在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液(10μM)加入到
荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中浓度达到25nM，监测荧光强度随时间的
变化，确定体系荧光复苏检测miRNA的最佳时间。
荧光复苏效率的测定：以复合体系的最佳检测时间为标准，记录复合体系荧光强
度随miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率RE用公式1.2计
算。
RE＝FT/FM-1 (1.2)
其中FT为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。
检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection，
LOD)。
LOD＝3σ/S (2.3)
其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明产物原料价格低廉，容易获取；
(2)本发明产物合成方法的反应步骤较少，时间短，合成过程中溶剂无需特殊处
理；产率达65％以上；
(3)本发明所述的多吡啶钌金属配合物中金属钌的引入显著增强了金属配合物的
水溶性，为进一步的活性研究提供了前提条件，结构中金属配合物的配体对miRNA识别能力
具有较大的影响。实验结果证明，本发明所述的多吡啶钌金属配合物对胃癌患者外周血中
高表达的miR-185具有良好的检测作用。
附图说明
图1是本发明所述多吡啶钌金属配合物的低分辨质谱和核磁共振氢谱图。
图2是本发明所述多吡啶钌金属配合物浓度与荧光标记的P-DNA的荧光强度变化
曲线图。
图3是本发明所述多吡啶钌金属配合物形成的复合体系与miRNA(25nM)在不同时
间的荧光强度变化曲线图。
图4是本发明所述多吡啶钌金属配合物形成的复合体系与miRNA在不同浓度的存
在下的荧光强度变化曲线图。
图5是本发明所述多吡啶钌金属配合物对miR-185特异性识别作用的结果图。
具体实施方式
实施例1
1、多吡啶钌金属配合物的制备
步骤一、将2-氰基噻吩(0.5g，4.58mmol)溶解在体积浓度为95％的乙醇中，加入大
大过量的水合肼(80％)2ml，反应24h得到2-噻吩甲酰胺腙。
步骤二、将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮(0.28g，1.35mmol)加热溶于无水乙醇中，再
向其中加入2-噻吩甲酰胺腙(0.19g，1.35mmol)，回流2h，反应得到黄色沉淀为配体thtp。其
结果如下：ESI-MS：m/z＝315[M+1]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ9.75(dd,J1＝1.6,J2＝2.0Hz,
1H),9.63(dd,J1＝J2＝1.6Hz,1H),9.42(dd,J1＝2.0,J2＝1.6Hz,1H),9.37(dd,J1＝J2＝
1.6Hz,1H),8.46(dd,J1＝J2＝1.2Hz,1H),7.91(m,2H),7.72(dd,J1＝0.8,J2＝1.2Hz,1H),
7.34(dd,J1＝3.6,J2＝4.0Hz,1H)；
步骤三、称RuCl3·3H2O(1.56g，6mmol)，2’,2-联吡啶(1.87g，12mmol)，氯化锂
(1.68g，28mmol)溶解于DMF中，氩气保护下120℃回流8h。反应完全后冷却至室温，加入50ml
丙酮冷冻过夜。溶液抽滤，沉淀用冰水洗至滴下来的水几乎没有颜色，得紫黑色固体Ru
(bpy)2Cl2为前体。
步骤四、将前体(0.20g，0.38mmol)溶于乙醇：水＝3:1(v:v)的混合体系中，加入
1.1倍摩尔量的配体thtp(0.13g，0.42mmol)，升温至90℃反应12h，然后冷却至室温，旋蒸大
部分溶剂，将产物溶于乙腈用中性氧化铝(200mesh)柱分离即可得到所述橙红色固体Ru
(bpy)2(thtp)Cl2(经测算产率：65％)。
2、多吡啶钌金属配合物的鉴定
通过下述ESI-MS和核磁共振氢谱分析鉴定，上述步骤所得到的橙红色固体为本发
明所述的多吡啶钌金属配合物，其分子式为Ru(bpy)2(thtp)Cl2，式中的式中的bpy为2’,2-
联吡啶，thtp为3-噻吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-邻菲咯啉。鉴定结果如下：
(1)ESI-MS分析理论值:m/z 365([M-2Cl]2+)；计算值:m/z 364.9([M-2Cl]2+)。
(2)核磁共振氢谱：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.68(dd,J1＝8.4,J2＝9.2Hz,2H),
8.93(dd,J1＝8.4,J2＝8.8Hz,4H),8.53(d,J＝3.6Hz,1H),8.36(d,J＝5.6Hz,1H),8.29(d,J
＝5.6Hz,1H),8.24(t,J＝7.6Hz,2H),8.17(d,J＝9.2Hz,2H),8.12(d,J＝6.0Hz,1H),8.09
(m,2H),7.83(d,J＝5.2Hz,2H),7.74(m,2H),7.62(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(m,1H),7.41(dd,
J1＝8.0,J2＝8.0Hz,2H)。
实施例2
本实施例采用实施例1中得到的多吡啶钌金属配合物对miR-185识别作用进行研
究。
本发明所述的金属配合物溶解性：在25℃条件下，该金属配合物可配置成1mM的溶
液。
(1)通过miRBase数据库确认miR-185的成熟序列，人工合成作为待检序列，即
target miRNA(简称为T)。考虑到RNA相对的不稳定性，我们将T-RNA各自对应的互补链置换
成其互补DNA(complementary DNA，cDNA)，并对cDNA序列利用FAM进行荧光标记，可得Probe
DNA。并利用左边一个碱基、中间一个碱基以及完全不匹配的miRNA作为干扰序列。具体实验
方案与之前的检测miR-185相同，仅改变检测的miRNA序列。结果见图5，T1，T2，T3序列如下，
分别的荧光复苏RE值为0.3,0.1,0.08。)考察该金属配合物能否选择性识别miR-185。
miR-185:
Probe DNA序列互补链(P-DNA)：5’-TCA GGA ACT GCC TTT CTC TCC A-FAM-3’
Target RNA序列(T)：5’-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3’
One base pair mutated miR-185(T1)左边一个碱基:
5'-U1G2A3A4G5A6G7A8A9A10G11G12C13A14G15U16U17C18C19U20G21A22-3'
One base pair mutated miR-185(T2)中间一个碱基:
5'-U1G2G3A4G5A6G7A8A9A10U11G12C13A14G15U16U17C18C19U20G21A22-3'
Scrambled non-specific RNA(T3)完全错配:
5'-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3'
(2)本发明所述多吡啶钌金属配合物检测miR-185
(a)配制金属配合物水溶液
将金属配合物溶于蒸馏水中配制成浓度为1mM的溶液并用无菌过滤器对溶液进行
除菌，密封保存待用。
(b)检测的步骤
(I)金属配合物与probe-DNA结合荧光淬灭能力
用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将
化合物溶解在100μM Tris-HCl缓冲溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液为滴定液。取P-
DNA待滴定液2mL于常量荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光
强度的变化(激发波长＝480nm，发射波长＝518nm)直到荧光淬灭达到饱和。荧光淬灭效率
QE用公式1.1计算。
QE＝(1-FM/F0)×100％ (1.1)
其中F0为P-DNA初始荧光强度；FM是加入钌配合物后体系荧光淬灭达到饱和时的荧
光强度。
配体和金属离子结合P-DNA的荧光淬灭实验采用此方法完成。
(II)复合体系与miRNA结合荧光复苏能力
复合体系检测时间确定：在上述实验基础上，将稀释后的miRNA溶液(10μM)加入到
荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使miRNA在体系中浓度达到25nM，监测荧光强度随时间的
变化，确定体系荧光复苏检测miRNA的最佳时间。
荧光复苏效率的测定：以复合体系的检测时间为标准，记录复合体系荧光强度随
miRNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和。荧光复苏效率RE用公式1.2计算。
RE＝FT/FM-1 (1.2)
其中FT为加入miRNA后复苏达到饱和时的荧光强度。
检测限的计算：用公式1.3计算复合体系对miRNA的检测限(Limit of Detection，
LOD)。
LOD＝3σ/S (2.3)
其中σ为未加入miRNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率。
(5)实验结果
多吡啶钌金属配合物对target miRNA逆转录的荧光标记DNA(P-DNA)的荧光淬灭
能力(见图2)，形成的复合体系对miR-185的检测时间为1min(见图3)；荧光复苏率(RE)为
0.70；检测限为0.85nM(见图4)。该结果表明本发明所述的多吡啶钌金属配合物对胃癌病人
外周血中过表达的miR-185具有较好的检测作用。
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