《克伦特罗液相芯片探针的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克伦特罗液相芯片探针的制备方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN101962418A43申请公布日20110202CN101962418ACN101962418A21申请号201010281365822申请日20100915C08F12/08200601C08F8/32200601C08F8/30200601G01N33/53320060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号72发明人彭池方匡华陈伟刘丽强胥传来74专利代理机构北京华夏博通专利事务所11264代理人孙东风54发明名称克伦特罗液相芯片探针的制备方法57摘要本发明涉及免疫化学技术领域的一种克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其通过采用碳化二亚胺法，以对氨。
2、基苯甲酸、间氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸修饰羧基化聚苯乙烯荧光微球表面，再通过碳化二亚胺法将克伦特罗分子标记到荧光微球表面的方式，制成克伦特罗液相芯片探针。该克伦特罗液相芯片探针的制备方法简便操作，稳定性好，且产物具有优良的克伦特罗靶向性，可为克伦特罗的液相芯片测试技术开发提供了更为方便的途径。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页CN101962419A1/2页21一种克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于，该方法为1取羧基化聚苯乙烯荧光微球均匀分散于PH值为6070，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液中，经超声处理后，再加入过量新鲜配置。
3、的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺水溶液，在室温下暗处震荡孵育1560MIN，而后离心移去上清，加入过量001WT01WT的对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸溶液，室温下暗处孵育1530MIN后，再次离心移去上清，以PH值为7280，浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得初次活化后的荧光微球；2将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺的水溶液中，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育1530MIN，完成对荧光微球的再次活化，其后加入过量的含0011G/ML克伦特罗的磷酸盐缓冲溶。
4、液，室温下暗处震荡孵育12H，其后离心移去上清，以PH值为7280，浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得目标产物克伦特罗液相芯片探针。2根据权利要求1所述的克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于步骤1中，所述羧基化聚苯乙烯荧光微球是经水洗处理后，再被分散于PH值为6070、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液中的。3根据权利要求1所述的克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于步骤1中，所述超声处理的时间为15MIN，超声频率为20KHZ。4根据权利要求1所述的克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于所述克伦特罗液相芯片探针是被悬浮于贮存液中保藏的，所述贮存液为PH值为7。
5、280，浓度为005M02M的磷酸缓冲盐溶液，其含0110WT牛血清白蛋白、001005WT吐温20和01WT叠氮钠。5根据权利要求1、2或4所述的克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于所述磷酸缓冲盐溶液采用含08WTNACL的磷酸盐缓冲液。6根据权利要求1所述的克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于该方法具体为1取羧基化聚苯乙烯荧光微球，经过水洗，离心并去除上清液后，加入PH为6070，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液溶液中，漩涡混合1MIN，令该磷酸盐缓冲溶液中所含荧光微球的浓度为510325104个/L，然后超声15MIN，再加入过量新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐。
6、和50MG/ML水溶性碳二亚胺水溶液，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育3060MIN，而后离心移去上清，加入过量00101WT的对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸溶液，室温下暗处孵育1530MIN后，离心移去上清，以PH值为7280、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液中洗涤沉淀物两次，制得初次活化后的荧光微球；2将初次活化后的荧光微球加入过量含50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺的水溶液中，漩涡混合10S后，于室温下暗处震荡孵育1530MIN，完成对荧光微球的二次活化处理，而后向上述水溶液中加入过量的含0011G/ML克伦特罗的磷酸盐缓冲溶液形成混合反。
7、应体系，将该混合反应体系于室温下暗处震荡孵育12H后，离心移去上清，以PH值为7280、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物两次，即制得目标产物克伦特罗液相芯片探针，该目标产物悬浮于贮存液中保存，所述贮权利要求书CN101962418ACN101962419A2/2页3存液采用PH值为7280，浓度为005M02M的磷酸缓冲盐溶液，其含0110WT牛血清白蛋白、001005WT吐温20和00502WT叠氮钠。权利要求书CN101962418ACN101962419A1/6页4克伦特罗液相芯片探针的制备方法技术领域0001本发明涉及免疫化学技术领域的一种克伦特罗检测试剂的制备方法，尤其。
8、涉及一种克伦特罗液相芯片探针的制备方法。背景技术0002克伦特罗CLENBUTEROL，CL是一种合成的2受体激素，添加于饲料中后能提高几种家畜包括猪的瘦肉率，其作用机理在于，克伦特罗在家畜和人体内吸收好，猪食用后在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精。与其它兴奋剂相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克伦特罗的猪肉出现中毒。人食用猪肝或猪肺足够引起中毒。世界没有任何正规机构批准克伦特罗作为饲料添加剂用于动物促生长，我国于2002年开始禁止克伦特罗作为饲料添加剂用于动物促生长。对于动物食品中克伦特罗的残留，国内外多以色谱质谱联用法、酶联免疫法为主，。
9、色谱质谱联用法检测灵敏度高，但是对实验室仪器和人员要求高，检测方法复杂，检测通量较低，成本较高，实际中难以满足大量样本的检测需求。酶联免疫法检测成本较低，但是一般检测药物种类单一，检测线性范围窄。0003液相芯片技术是美国LUMINEX公司开发的一种多功能的分析平台。它将流式检测与芯片技术有机地结合在一起，在保持高通量检测的同时，将反应体系由液相固相反应改变为液相反应体系，对于确保高级结构之上的蛋白质相互作用尤为关键。液相芯片技术的载体是聚苯乙烯所制作的微珠，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，可产生100种不同比例颜色的微珠，每一种用于标记探针的微珠都带有一个独特的色彩编号。每一种微球采用不同。
10、探针标记，并将标记探针的微珠与待测物在液相中反应，反应产物通过液相芯片的检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通信道，通过两种激光检激发测，红色激光可定位微球的编码地址，绿色激光则激发待测样本的报告分子R澡红蛋白实现样本目标物的定量分析。液相芯片的检测模式可以实现检测目标物的多样性，对样品利用率高，检测速度快，可根据实际检测对象的需要对不同种类的探针进行组合，灵活性大。0004近年来，在液相芯片系统中实现了对小分子药物的检测。小分子药物液相芯片探针的制备工艺常见的方法为首先制备小分子半抗原与载体蛋白的偶联物，然后将这种偶联物与羧基化的荧光微球反应，从而得到该小分子的液相芯片探针。这种工艺采用载体。
11、蛋白为连接臂，由于载体蛋白与小分子偶联反应以及偶联物与微球的反应重复性较差，限制了其实际中的应用推广。发明内容0005本发明的目的在于提出一种克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其采用在液相芯片用的荧光微球表面标记克伦特罗分子的方式，构建出一种可特异性识别克伦特罗抗体的新型免疫分析固相界面，其可进一步开发应用于克伦特罗的液相芯片模式检测，从而克服了现有技术的不足。说明书CN101962418ACN101962419A2/6页50006为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案0007一种克伦特罗液相芯片探针的制备方法，其特征在于，该方法为00081取羧基化聚苯乙烯荧光微球均匀分散于PH值为607。
12、0，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液中，经超声处理后，再加入过量新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺水溶液，在室温下暗处震荡孵育1560MIN，而后离心移去上清，加入过量00101WT的对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸溶液，室温下暗处孵育1530MIN后，再次离心移去上清，以PH值为7280，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得初次活化后的荧光微球；00092将上述初次活化后的荧光微球加入过量新鲜配制的含50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺的水溶液中，均匀混合后，室温下暗处震荡孵育1530MIN，完成对荧。
13、光微球的再次活化，其后加入过量的含0011G/ML克伦特罗的磷酸盐缓冲溶液，室温下暗处震荡孵育12H，其后离心移去上清，以PH值为7280，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀物，制得目标产物克伦特罗液相芯片探针。0010进一步地讲，步骤1中，所述羧基化聚苯乙烯荧光微球是经水洗处理后，再被分散于PH值为6070、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液中的。0011步骤1中，所述超声处理的时间为15MIN，超声频率为20KHZ。0012所述克伦特罗液相芯片探针是被悬浮于贮存液中保藏的，所述贮存液为PH值为7280，浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液PBS，其含0110WT牛血清白蛋白、001。
14、005WT吐温20和01WT叠氮钠。0013所述磷酸缓冲盐溶液采用含08WTNACL的磷酸盐缓冲液。0014该方法具体为00151取羧基化聚苯乙烯荧光微球，经过水洗，离心并去除上清液后，加入PH为6070，含005M02M的磷酸盐缓冲溶液中，漩涡混合1MIN，令该磷酸盐缓冲溶液中所含荧光微球的浓度为510325104个/L，然后超声15MIN，再加入过量新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺水溶液，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育3060MIN，而后离心移去上清，加入过量00101WT的对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸溶液，室温下暗处孵育153。
15、0MIN后，离心移去上清，以PH值为7280、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液中洗涤沉淀物两次，制得初次活化后的荧光微球；00162将初次活化后的荧光微球加入过量含50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐和50MG/ML水溶性碳二亚胺的水溶液中，漩涡混合10S后，于室温下暗处震荡孵育1530MIN，完成对荧光微球的二次活化处理，而后向上述水溶液中加入过量的含0011G/ML克伦特罗的磷酸盐缓冲溶液形成混合反应体系，将该混合反应体系于室温下暗处震荡孵育12H后，离心移去上清，沉淀经以PH值为7280、浓度为005M02M的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，即制得目标产物克伦特罗液相芯片探针，该目标产物悬浮。
16、于贮存液中保存，所述贮存液采用PH值为7280，浓度为005M02M的磷酸缓冲盐溶液，其含0110WT牛血清白蛋白、001005WT吐温20和00502WT叠氮钠。0017本发明采用两步法在荧光微球表面标记克伦特罗，第一步采用水溶性碳化二亚胺法将微球表面的羧基与连接臂对位、间位或邻位的氨基苯甲酸的氨基偶联，第二步再同说明书CN101962418ACN101962419A3/6页6法将连接臂的羧基与克伦特罗分子的氨基偶联，每一步反应都是定向的，微球表面标记探针的量可以通过调节克伦特罗分子的浓度实现控制和重复。0018与现有技术相比，本发明的有益效果在于该克伦特罗液相芯片探针的制备方法简便操作，可。
17、控性强，重复性好，稳定性好，产率高，纯度高，且产物具有优良的克伦特罗靶向性，可为克伦特罗的液相芯片测试技术开发提供了更为方便的途径。附图说明0019以下结合附图及具体实施例对本发明的内容作进一步说明。0020图1是实施例1中克伦特罗液相芯片探针对克伦特罗零标准溶液的抑制反应曲线；0021图2是实施例2中克伦特罗液相芯片探针对克伦特罗零标准溶液的抑制反应曲线。具体实施方式0022实施例1该克伦特罗液相芯片探针的制备方法原理如下式所示00230024上式中，为羧基化微球，SULFONHS为氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐，EDC为水溶性碳二亚胺。0025该方法包括如下具体步骤00261荧光微球的表面修饰对氨。
18、基苯甲酸连接臂0027取5105个羧基化聚苯乙烯荧光微球，经过水洗，离心并去除上清液后，加入100L活化液01M磷酸盐缓冲溶液，PH60，漩涡混合1MIN，然后超声1MIN，加入新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐SULFONHS和水溶性碳二亚胺EDCHCL水溶液各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育15MIN，将活化后的微球离心移去上清，加入001WT的对氨基苯甲酸溶液05ML，室温下暗处孵育60MIN，离心移去上清，沉淀采用05ML磷酸盐缓冲溶液01M，PH72洗涤两次，制得表面修饰的荧光微球；00282荧光微球的表面标记克伦特罗分子0029向上述修饰后的荧光微球中加入5。
19、0MG/ML的SULFONHS和EDCHCL水溶液各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育20MIN，再次活化后，加入450L克伦特罗001G/ML，溶于01M，PH72磷酸盐缓冲溶液溶液，室温下暗处震荡孵育1H，离心移去说明书CN101962418ACN101962419A4/6页7上清，以01M，PH72的PBS溶液洗涤沉淀两次，制得目标克伦特罗液相芯片探针，该克伦特罗液相芯片探针悬浮于贮存液中保存，该贮存液为01M，PH72的PBS溶液，其含01WT牛血清白蛋白，001WTTWEEN，和02WT叠氮钠。0030以上所采用的磷酸缓冲盐溶液优选采用含08WTNACL的磷酸盐缓冲液。00。
20、31将所制备克伦特罗液相芯片探针稀释一系列浓度，在LUMINEX100IS22液相芯片系统的微球计数模式下测试浓度，然后将克伦特罗液相芯片探针稀释至约50个/L。吸取200L洗涤液001MPBS，PH72；含001TWEEN20，加入到96孔平底过滤板密理博中，抽滤系统密理博公司中真空抽干或者微孔板离心机中130G下离心20S，然后在2列微孔中，分别加入50L的克伦特罗零标准溶液和10NG/ML的标准溶液，再加入10L克伦特罗液相芯片探针亦即标记半抗原的荧光微球，以及40L的一系列稀释倍数生物素化克伦特罗抗体4G/ML，按不同行加入抗体稀释倍数分别为500、1000、2000、4000、800。
21、0和16000，置于微孔板振荡器中，37下避光孵育40MIN，真空抽干微孔中溶液，加入200L洗涤液，振荡10S，抽干，再重复洗涤两次；其后加入100L链亲和素藻红蛋白10G/ML，置于微孔板振荡器中，37下避光孵育15MIN，而后放置于液相芯片LUMINEX100IS22系统平台上，系统从每一孔中吸取偶联抗原的微球至少会读取100个。以所读取每种荧光微球的荧光中值对标准溶液浓度制作抑制反应曲线，结果显示10NG/ML克伦特罗标准溶液对该微球探针和抗体的结合反应抑制水平可高于70见图1，这表明该克伦特罗液相芯片探针对克伦特罗具有很高的灵敏度。0032而以该克伦特罗液相芯片探针对克伦特罗结构类似。
22、物沙丁胺醇、莱克多巴胺的交叉反应测试显示其较差反应率小于05，这进一步说明该克伦特罗探针具有很高的特异靶向性。0033实施例2该克伦特罗液相芯片探针的制备方法原理如下式所示00340035上式中，为羧基化微球，SULFONHS为氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐，EDC为水溶性碳二亚胺。0036该方法具体如下00371荧光微球的表面修饰间氨基苯甲酸连接臂0038取106个羧基化聚苯乙烯荧光微球，经过水洗，离心并去除上清液后，加入100L活化液005M磷酸盐缓冲溶液，PH65，漩涡混合1MIN，然后超声3MIN。加入新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐SULFONHS和水溶性碳二亚胺EDCHCL水。
23、溶液说明书CN101962418ACN101962419A5/6页8各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育20MIN，将活化后的微球离心移去上清，加入005WT的间氨基苯甲酸溶液05ML，室温下暗处孵育60MIN，离心移去上清，沉淀采用05ML磷酸盐缓冲溶液005M，PH76洗涤两次，制得表面修饰的荧光微球；00392荧光微球的表面标记克伦特罗分子0040向上述修饰后的荧光微球中加入50MG/ML的SULFONHS和EDCHCL水溶液各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育20MIN。再次活化后，加入450L克伦特罗01G/ML，溶于005M，PH76磷酸盐缓冲溶液，室温下暗处震。
24、荡孵育15H。离心移去上清，沉淀以05ML磷酸盐缓冲溶液005M，PH76洗涤两次，制得目标克伦特罗液相芯片探针，该克伦特罗液相芯片探针悬浮于贮存液中保存，该贮存液为005M，PH75的PBS溶液，其含05WT牛血清白蛋白，002WTTWEEN，和02WT叠氮钠。0041以上所采用的磷酸缓冲盐溶液优选采用含08WTNACL的磷酸盐缓冲液。0042该克伦特罗液相芯片探针在应用其操作与实施例1相似时，可检测到浓度在001NG/ML的克伦特罗分子如图2所示，灵敏度高，靶向性优良。0043实施例3该克伦特罗液相芯片探针的制备方法的原理如下式所示00440045上式中，为羧基化微球，SULFONHS为氮。
25、羟基琥珀酰亚胺磺酸盐，EDC为水溶性碳二亚胺。0046该方法包括如下步骤00471荧光微球的表面修饰邻氨基苯甲酸连接臂0048取25106个羧基化聚苯乙烯荧光微球，经过水洗，离心并去除上清液后，加入100L活化液001M磷酸盐缓冲溶液，PH70，漩涡混合1MIN，然后超声5MIN。加入新鲜配置的50MG/ML氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐SULFONHS和水溶性碳二亚胺EDCHCL水溶液各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育60MIN。将活化后的微球离心移去上清，加入01WT的邻氨基苯甲酸溶液05ML，室温下暗处孵育45MIN。离心移去上清，沉淀采用05ML磷酸盐缓冲溶液001M，PH80洗涤。
26、两次，制得表面修饰的荧光微球。00492荧光微球的表面标记克伦特罗分子0050向上述修饰后的荧光微球中，加入50MG/ML的SULFONHS和EDCHCL水溶液各10L，漩涡混合10S后，室温下暗处震荡孵育20MIN，再次活化后，加入450L克伦特罗1G/ML，溶于001M，PH80溶液，室温下暗处震荡孵育2H。离心移除上清，沉淀以05ML磷酸盐缓冲溶液001M，PH80磷酸盐缓冲液洗涤两次，制得克伦特罗液相芯片探针，该说明书CN101962418ACN101962419A6/6页9克伦特罗液相芯片探针悬浮于贮存液中保存，该贮存液为001M，PH80的PBS溶液，其含1WT牛血清白蛋白，005WTTWEEN，和02WT叠氮钠。该克伦特罗液相芯片探针的应用效果与实施例1、2相近。0051以上所采用的磷酸缓冲盐溶液优选采用含08WTNACL的磷酸盐缓冲液。0052以上实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。说明书CN101962418ACN101962419A1/1页10图1图2说明书附图CN101962418A。