环庚烷并吡啶类化合物、其制备方法、用途及包含此类化合物的药物组合物.pdf

摘要
申请专利号：	CN200710039447.X	申请日：	2007.04.12
公开号：	CN101284828A	公开日：	2008.10.15
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07D 401/12申请日:20070412授权公告日:20110427终止日期:20120412\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D401/12(2006.01); C07D409/12(2006.01); A61K31/4436(2006.01); A61K31/4439(2006.01); A61P25/28(2006.01); A61P9/00(2006.01)	主分类号：	C07D401/12
申请人：	中国科学院上海药物研究所
发明人：	蒋华良; 沈旭; 柳红; 姚志艺; 黎陈静; 周宇; 陈凯先
地址：	201203上海市浦东新区张江高科技园区祖冲之路555号
优先权：
专利代理机构：	北京金信立方知识产权代理有限公司	代理人：	朱梅;徐志明
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内容摘要

本发明提供一种如式I所示的环庚烷并吡啶类化合物，及其药学上可接受的盐。本发明还涉及该环庚烷并吡啶类化合物的制备方法及该环庚烷并吡啶类化合物、其组合物在制备治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心脑血管疾病的药物中的应用。本发明的化合物可作为α、β、γ－分泌酶激动剂或/和抑制剂，通过激动或抑制酶活性，阻止β淀粉样蛋白产生，可以有效地治疗和/或预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心脑血管疾病。

权利要求书

1.   一种具有如下通式I的化合物：

其中：
X为O、S或NH；
Y为O、S、NH或CH₂；
Z为O或S；
m和n分别为0-3的整数；
R₁和R₂各自独立地选自氢、直链或支链的饱和或不饱和C₁-C₆烃基、氰基、硝基、氨基、氨基甲基、脒基、氨甲酰基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基、C₁-C₄酰基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；
R₃和R₄各自独立地选自苯基、取代苯基、萘基、联苯基、5-7元杂环，其中所述的取代苯基包括1～4个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基取代基；
R₁、R₂和R₄可以相同或不同，但其中至少一个为非氢原子；
R₁～R₄中所述的芳香基是苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环；其中的取代苯基为包括1～4个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基的取代基；
所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并含有一个或多个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基、C₁-C₄酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与母核中的苯基并合。

2.   根据权利要求1所述的化合物，其中，
R₃为噻吩-2-基或吡咯-2-基；
X、Y、Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

3.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为噻吩-2-基；X为S或O；
Z、Y、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

4.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为噻吩-2-基；X为S；Z为O；Y为O或NH；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

5.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为噻吩-2-基；X为NH；Z为O；Y为O或NH；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

6.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为吡咯-2-基；X为S；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

7.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为吡咯-2-基；X为O；Z为O；Y为O、NH或S；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

8.   根据权利要求2所述的化合物，其中，
R₃为吡咯-2-基；X为O或NH；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

9.   根据权利要求1所述的化合物，其中，
R₃为苯基或取代苯基；
X、Y、Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

10.   根据权利要求1所述的化合物，其中，
R₃为芳香杂环基；
X、Y、Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同权利要求1。

11.   根据权利要求1所述的化合物，其特征是，该化合物为：
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(苯乙基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(苯乙基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(S)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；或
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。

12.   根据权利要求1～11任一项所述化合物，其特征是，所述化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸形成酯后再与无机碱形成钠盐、钾盐、钙盐、铝盐和铵盐；或与有机碱形成甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸形成对应的无机酸盐，与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸形成对应的有机酸盐。

13.   权利要求1～11任一项的通式I的化合物的制备方法，

其中，X、Y、Z、m、n、R₁、R₂、R₃和R₄如权利要求1所述，
其步骤包括：
(1)起始物芳醛R₃CHO与化合物II缩合得化合物III

(2)化合物III与环庚酮在碱存在的条件下环合，纯化得吡啶-2(1H)-酮衍生物IV；

(3)吡啶-2(1H)-酮衍生物IV与如下卤化物反应，卤化物中X₁为卤原子，纯化得通式I化合物

14.   根据权利要求13所述的制备方法，其中步骤(1)和步骤(2)所用的溶剂选自THF、Et₂O、DMF、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚和二氧六环；所用的碱选自包括吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶、二异丙基乙胺的有机碱和包括碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾的无机碱；步骤(3)中所用的溶剂选自乙醇、甲醇、乙酸乙酯和四氢呋喃。

15.   根据权利要求13所述的制备方法，其中步骤(1)、(2)、(3)所述纯化采用的方法选自柱层析和重结晶。

16.   一种用于治疗和预防由β-分泌酶调控的疾病的药物组合物，包含治疗有效量的式I化合物或药学上可接受的盐及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

17.   根据权利要求16所述的药物组合物，其中式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分占该组合物总重量比1-99％。

18.   根据权利要求16所述的药物组合物，其制剂配方的单位剂量中包含0.05mg-200mg式I化合物。

19.   根据权利要求16所述的药物组合物，其制剂配方的单位剂量中包含0.1mg-100mg式I化合物。

20.   权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐作为α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动剂或抑制剂的用途。

21.   权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐作为α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动剂或抑制剂的实验模型工具药的用途。

22.   权利要求1所述化合物在制备用于治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心血脑管疾病的药物中的应用。

说明书

环庚烷并吡啶类化合物、其制备方法、用途及包含此类化合物的药物组合物
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及新型的环庚烷并吡啶类化合物、其制备方法、用途及包含此类化合物的药物组合物。
背景技术
在顽固性痴呆病例中，50-70％为阿尔茨海默氏病(Alzheimer′sDisease，AD)。它是大脑的一种退行性病变，多有脑萎缩，尤其是大脑额叶皮层的萎缩。一般男性在65岁、女性在55岁以后发病。发病早期只是注意力不集中、记忆力衰退，慢慢发展到思想贫乏、行为幼稚、情绪不稳、计算力差、不理解别人的话，最后则卧床不起，完全丧失生活能力。随着社会人口的老龄化，目前AD发病率已呈上升趋势，据统计，当今世界有5000多万老年人患有不同程度的痴呆病。在美国，目前患有AD人数已逾400万人，每年直接或间接用于治疗老年性痴呆疾病的花费已达90亿美元。随着我国已进入老年化社会，现在老年性痴呆症问题在我国也同样是社会所面临的不可回避的突出问题之一。因此寻找治疗AD的良药已受到各国尤其是发达国家的高度重视，成为当务之急。从20世纪70年代起，人们即开始研制治疗AD的药物，起初，研究方向主要集中在乙酰胆碱与AD的关系；80年代，主要是研究胆碱酯酶抑制剂对AD的影响。但是胆碱能神经功能下降是较后期的变化，因此从理论上说，用胆碱酯酶抑制剂不能从较早阶段发挥对AD的治疗作用。90年代，研究不仅有乙酰胆碱受体激动剂，还包括了雌激素、消炎药、影响自由基代谢的药物及抑制淀粉样蛋白沉积的药物。目前，市售的一些用于治疗AD的药物几乎都只能是缓解AD的一些症状，暂时改善AD病人的记忆力和注意力。因此，到目前为止，AD的临床治疗仍然是一个亟待攻破的世界性难题。
引起AD患者痴呆的原因是由于人脑某些区域中因高水平的“老年斑，，和“神经纤维紊乱”而造成的神经元细胞的死亡。“β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常产生和沉积”被认为是导致神经元损伤和丢失的主要原因之一。
Aβ是由淀粉蛋白前体APP(Amyloid precursor protein)被β和γ-分泌酶催化水解而成。Aβ含有39-42个氨基酸残基。研究结果显示Aβ的产生是AD发病早期的最为关键的因素。在AD发病早期，Aβ₄₂的过量产生会直接引发其病理上的层叠，而过量的Aβ₄₂很难被清除，所以在一些聚集因素的作用下Aβ₄₂会沉积下来。理论上，只要阻断APP的表达即可避免Aβ的生成进而可以达到治疗AD的目的。然而，由于APP本身以及APP的非Aβ片段具有其它一些重要的生理功能，而且在实际操作过程中阻断一个特定的靶基因的转录是相当困难的，所以人们把攻克治疗AD的难题建立在如何阻止APP的水解而不是阻断APP的表达上。APP的催化水解可沿两条主要途径进行：α-分泌酶途径和β-分泌酶途径。在正常情况下(α-分泌酶途径)，APP被α-分泌酶在Aβ序列内部催化水解成可溶性的APP片段α-APPs和C83肽，结果阻止了Aβ的生成；在非正常情况下(β-分泌酶途径)，APP被β-分泌酶在Aβ的N-端切割催化水解成可溶性的APP片段β-APPs和C99肽，后者则被γ-分泌酶在Aβ的C-端切割代谢为完整的Aβ。由此可见，β-分泌酶是产生Aβ的限速酶，是APP被催化水解成Aβ的先决条件。
阿尔茨海默病(AD)是引起老年人痴呆的最常见原因，发生的主要标志是脑血管内形成不可溶解的β-淀粉样蛋白(Aβ肽)，这是一种从β-淀粉样蛋白前体(APP)裂解产生的39-43个氨基酸多肽，其主要形态为Aβ40和Aβ42。
APP淀粉肽序列中有α、β、γ三个酶切点，能通过多种蛋白水解机制对APP进行剪切。其中α分泌酶酶切点位于Aβ第16位赖氨酸-第17位亮氨酸之间。该位点肽键水解可产生可溶性多肽，降低Aβ肽的形成。β-分泌酶是一种跨膜天冬氨酸蛋白酶，它在β-淀粉肽的产生过程中起重要作用。β-分泌酶在γ-分泌酶配合下水解APP即可生成Aβ肽，从而引发阿尔茨海默病及其相关并发症。
在APP淀粉肽的生成中，α-分泌酶是有利于阻止Aβ肽生成的。而β-分泌酶在γ-分泌酶的共同作用下，才生成Aβ肽。因此，激活α-分泌酶或/及抑制β-分泌酶或/及γ-分泌酶活性，就可以有效阻止Aβ肽的生成，从而防止阿尔茨海默病的发生。因此，可以选择α、β、γ-分泌酶作为单一或共同靶标，进行阿尔茨海默病及其相关并发症的药物研究。
发明内容
本发明者基于α、β、γ-分泌酶的三维结构设计了各种激动剂/多重激动剂和抑制剂/多重抑制剂，它们可直接作用于分泌酶，参与调控β淀粉样蛋白生成的关键步骤，降低脑内β淀粉样蛋白水平从而发挥药效作用。
因此，本发明的一个目的是提供一种新型的环庚烷并吡啶类化合物及其药学上可接受的盐。
本发明的另一个目的是提供所述环庚烷并吡啶类化合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供所述化合物作为α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动剂或抑制剂的用途。
本发明的再一个目的是提供所述化合物作为α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动剂或抑制剂的实验模型工具药的用途。
本发明的还有一个目的是提供所述化合物在制备治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心脑血管疾病的药物上的应用。
本发明的还有一个目的是提供含所述化合物的药物组合物。
为了达到上述目的，本发明提供了一种具有如下通式I的化合物：

其中：
X为O、S或NH；
Y为O、S、NH或CH₂；
Z为O或S；
m和n分别为0-3的整数；
R₁和R₂各自独立地选自氢、直链或支链的饱和或不饱和C₁-C₆烃基、氰基、硝基、氨基、氨基甲基、脒基、氨甲酰基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基、C₁-C₄酰基、C₃-C₇环烃基、苄基、芳香基或5-7元杂环基；
R₃和R₄各自独立地选自苯基、取代苯基、萘基、联苯基、5-7元杂环，其中所述的取代苯基包括1～4个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基取代基；
R₁、R₂和R₄可以相同或不同，但其中至少一个为非氢原子；
R₁～R₄中所述的芳香基是苯基、取代苯基、萘基或联苯基、5-7元芳杂环；其中的取代苯基为包括1～4个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基和C₁-C₄酰基的取代基；
所述的5-7元杂环基含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并含有一个或多个选自卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C₁-C₄烷氧基、巯基、C₁-C₄酰基和芳香基的取代基，所述的5-7元杂环基可与母核中的苯基并合。
进一步的，本发明通式I化合物一个优选实施方案中，R₃为噻吩-2-基或吡咯-2-基；X、Y、Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的另一个优选实施方案中，R₃为噻吩-2-基；X为S或O；
Z、Y、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的又一个优选实施方案中，R₃为噻吩-2-基；X为S；Z为O；Y为O或NH；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第四个优选实施方案中，R₃为噻吩-2-基；X为NH；Z为O；Y为O或NH；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第五个优选实施方案中，R₃为吡咯-2-基；X为S；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第六个优选实施方案中，R₃为吡咯-2-基；X为O；Z为O；Y为O、NH或S；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第七个优选实施方案中，R₃为吡咯-2-基；X为O或NH；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第八个优选实施方案中，R₃为苯基或取代苯基；X为S；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第九个优选实施方案中，R₃为苯基或取代苯基；X为O；Z为O；Y为O、NH或S；
m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第十个优选实施方案中，R₃为苯基或取代苯基；X为O或NH；Y为O或NH；
Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明结构式I所示化合物的第十一个优选实施方案中，R₃为芳香杂环基；
X、Y、Z、m、n、R₁、R₂和R₄的定义同上述化合物I。
本发明的具体优选实施方案选自下列化合物：
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(苯乙基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(苯乙基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}N-(4-氟苯基)乙酰胺；
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}N-苯基-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}N-苯基-3-甲基丁酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺；
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(S)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺；
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。
本发明提供的结构式I所示化合物可与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐和铵盐；或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等；或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明还提供式I化合物的制备方法，

其中，X、Y、Z、m、n、R₁、R₂、R₃和R₄的定义如前所述，
所述方法包括如下步骤：
(1)起始物芳醛R₃CHO与化合物II缩合得化合物III：

(2)化合物III与环庚酮在碱存在的条件下环合，纯化得吡啶-2(1H)-酮衍生物IV：

(3)吡啶-2(1H)-酮衍生物IV与如下卤化物反应，卤化物中X₁为卤原子，纯化得I化合物

上述步骤(1)和步骤(2)中所用的溶剂选自THF、Et₂O、DMF、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚和二氧六环，所用的碱选自包括吡啶、三乙胺、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、二异丙基乙胺的有机碱和包括碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾的无机碱；步骤(3)中所用的溶剂选自乙醇、甲醇、乙酸乙酯和四氢呋喃。
步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)所得产物可分别进行提纯，得到纯产物后再进行下一步反应。
其中纯化的方法选自柱层析和重结晶。
本发明更进一步提供用于治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心血脑管疾病的药物组合物，包含治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
上文所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂如琼脂碳酸钙、碳酸氢钠等。
本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。该药用组合物也可以包含矫味剂、香味剂等。式I化合物与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的理想比例是，式I化合物作为活性成分占该组合物总重量比1-99％，较好为1-60％，更好为1-20％，最好为1-10％；其余部分为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
制剂的单位剂量中可包含0.05mg-200mg式I化合物或其药学上可接受的盐，较佳为包含0.1mg-100mg式I化合物或其药学上可接受的盐。
如上所述的结构式I的化合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经口、鼻、皮肤、肺吸入、或者非胃肠道等途径给药。最佳优选为口服。优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性给药，或分次给药。不管用何种给药方法，个体人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
本发明进一步提供式I化合物作为α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动剂或抑制剂的用途。
本发明还进一步提供式I化合物在制备用于治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心血脑管疾病的药物上的应用。
附图说明
图1为化合物ZY37分子水平激动曲线；
图2为化合物ZY37细胞水平β-分泌酶活性激动曲线；
图3为化合物ZY37激动Aβ1-40生成曲线。
具体实施方式
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除非另有说明外，都是以质量为说明依据的。
样品的分析数据由以下仪器测定：熔点用上海精密科学仪器有限公司生产的X-4型熔点仪测定，温度未经校正；核磁共振由GEMINI-300型、Bruker AMX-400型和INVOA-600型核磁共振仪测定，TMS为内标，化学位移单位为ppm，耦合常数单位为Hz；质谱由FinniganMAT-711型，MAT-95和LCQ-DECA型质谱仪测定。
柱层析用硅胶200-300目(青岛海洋化工厂生产)；TLC硅胶板为烟台化工厂生产的HSGF-254型薄层层析预制板；石油醚沸程为60-90℃；采用紫外灯，碘缸显色。实验中所用试剂及溶剂均按反应具体情况处理。
实施例1
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺的制备
在50mL圆底烧瓶中，加入噻吩-2-甲醛112mg，硫代氰乙酰胺100mg，并加入10mL无水乙醇和0.5mL三乙胺，加热搅拌反应1-6h。用二氯甲烷(4×10mL)提取，并用饱和NaHCO₃洗涤，MgSO₄干燥过夜。柱层析分离，得黄色粉末状固体2-氰基-3-噻吩硫代烯丙酰胺121mg。(化合物III)
在反应瓶中，将97mg(0.5mmol)2-氰基3-噻吩硫代烯丙酰胺溶于15mL无水乙醇中，加入环庚酮59mg(0.6mmol)、1mL干燥无水哌啶。回流反应，用二氯甲烷(4×15mL)提取，饱和NaCl洗涤至近中性，MgSO₄干燥过夜，柱层析分离，得黄色固体3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2(1H)-硫酮57mg。(化合物IV)
在反应瓶中，加入0.01mol 2，6-二乙苯胺、1.7g(0.015mol)氯乙酰氯、2.76g(0.015mol)K₂CO₃、20mL THF，45℃反应1h，加入20mL二氯甲烷提取，干燥，柱层析分离得灰白色固体氯乙酰2，6-二乙基苯胺。(化合物V)
在反应瓶中，加入上述化合物IV硫酮30mg、化合物V氯化物34mg、K₂CO₃100mg、THF 20mL，加热到50℃，加入KI 5mg，剧烈搅拌反应3.5h。用二氯甲烷(4×15mL)提取，干燥，柱层析分离得白色固体，即得化合物I：2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺21mg。
Mp 218-221℃(dec.)，IR(KBr)：3428，1659，1534cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.08(t，6H，CH₃)，1.60(d，2H，CH₂)，1.75(d，2H，CH₂)，1.86(d，2H，CH₂)，2.52(q，4H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.12(s，2H，CH₂)，7.10(d，2H，Ar H)，7.17(m，1H，Ar H)，7.9(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，8.48(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，475.1752；found，475.1763。
实施例2
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺的制备
用2，6-二甲苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺，总产率13.2％。
Mp223-226℃(dec.)，IR(KBr)：3426，1667，1518cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.17(t，6H，CH₃)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.10(d，2H，Ar H)，7.17(m，1H，Ar H)，7.9(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，8.48(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcdforM⁺，447.1439；found，447.1444。
实施例3
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺的制备
用2，6-二氯苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺，总产率14.6％。
Mp235-239℃(dec.)，IR(KBr)：3411，1650，1522cm^-1 ¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.10(d，2H，Ar H)，7.17(m，1H，Ar H)，7.9(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，ArH)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd for M⁺，487.0347；found，487.0355。
实施例4
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺的制备
用2，6-二氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺，总产率10.2％。
Mp237-239℃(dec.)，IR(KBr)：3428，1636，1513cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.09(d，2H，ArH)，7.17(m，1H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，455.0938；found，455.0943。
实施例5
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺的制备
用2，6-二异丙基苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺，总产率14.4％。
Mp213-216℃(dec.)，IR(KBr)：3429，1636，1524cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.10(s，12H，CH₃)，1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，2.98(m，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.10(d，2H，Ar H)，7.17(m，1H，Ar H)，7.9(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，503.2065；found，503.2067。
实施例6
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺的制备
用2-氰基苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺，总产率11.6％。
Mp243-247℃(dec.)，IR(KBr)：3428，1653，1527cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH²)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.09(d，2H，ArH)，7.17(m，1H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.20(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，444.1079；found，444.1088。
实施例7
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺的制备
用苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺，总产率12.6％。
Mp224-226℃(dec.)，IR(KBr)：3426，1633，1528cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，7.06(d，2H，ArH)，7.17(m，1H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.24(m，2H，Ar H)，7.06(d，2H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcdforM⁺，419.1126；found，419.1132。
实施例8
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺的制备
在反应瓶中，加入1.49g(0.01mol)2-羟基苯胺及20mL THF，在-10℃搅拌15分钟，
滴加0.85g(0.0075mol)氯乙酰氯的20mLTHF溶液，3h滴完，继续反应2h。蒸去大部分溶剂，加入20mL二氯甲烷提取，饱和NaCl液洗涤，MgSO₄干燥，柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝1/4，体积比)得灰白色固体，即：N-(2-羟基苯基)氯乙酰胺1.93g，收率约为85.8％。
用N-(2-羟基苯基)乙酰胺代替N-(2，6-二乙基苯基)氯乙酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺，总产率10.8％。
Mp239-244℃(dec.)，IR(KBr)：3461，1663，1535cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，6.85(m，H，ArH)，6.92(m，1H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.16(d，2H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.06(d，2H，Ar H)，7.56(m，1H，ArH)，8.58(s，br，1H，OH)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，435.1075；found，435.1081。
实施例9
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺的制备
用4-羟基苯胺代替2-羟基苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1及实施例8，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺，总产率11.3％。
Mp243-246℃(dec.)，IR(KBr)：3451，1669，1536cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.62(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，6.85(m，H，ArH)，6.92(d，2H，ArH)，7.46(d，2H，ArH)，7.09(m，1H，Ar H)，7.56(m，1H，Ar H)，8.40(s，br，1H，OH)，9.16(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcdforM⁺，435.1075；found，435.1078。
实施例10
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-苯乙基)乙酰胺的制备
用2-苯乙胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-苯乙基)乙酰胺，总产率12.6％。
Mp220-226℃(dec.)，IR(KBr)：3413，1650，1518cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，4H，CH₂)，1.78(t，2H，CH₂)，2.62(t，2H，CH₂)，2.76(t，2H，CH₂)，2.95(t，2H，CH₂)，3.51(q，2H，CH₂)，3.84(s，2H，CH₂)，7.06(d，2H，Ar H)，7.17(m，1H，Ar H)，7.09(m，1H，Ar H)，7.14(m，2H，ArH)，7.56(m，1H，Ar H)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，447.1439；found，447.11443。
实施例11
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺的制备
用2，5-二乙氧苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺，总产率12.6％。
Mp244-229℃(dec.)，IR(KBr)：3432，1668，1554cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.12(t，3H，CH₂)，1.18(t，3H，CH₂)，1.58(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.82(m，2H，CH₂)，2.60(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，3.92(q，2H，CH₂)，3.96(q，2H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，6.58(m，1H，Ar H)，6.78(d，1H，Ar H)，7.16(d，2H，Ar H)，7.56(m，1H，ArH)，8.05(d，1H，ArH)，9.14(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，507.1650；found，507.1658。
实施例12
2-{[3-氰基-4-(2-吡咯基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(2-吡咯基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙苯基)乙酰胺，总产率11.5％。
Mp223-225℃(dec.)，IR(KBr)：3427，1649，1510cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.08(t，6H，CH₃)，1.60(m，2H，CH₂)，1.82(q，4H，CH₂)，2.52(q，4H，CH₂)，2.80(q，4H，CH₂)，4.10(s，2H，CH₂)，6.40(m，2H，ArH)，7.10(d，2H，ArH)，7.20(m，1H，ArH)，7.9(m，1H，ArH)，9.40(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，458.2140；found，458.2145。
实施例13
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺的制备
用4-氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺，总产率11.2％。
Mp235-238℃(dec.)，IR(KBr)：3426，1652，1527cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.64(t，2H，CH₂)，2.97(t，2H，CH₂)，4.00(s，2H，CH₂)，7.00(d，2H，ArH)，7.18(m，2H，ArH)，7.44(m，2H，ArH)，7.58(m，H，ArH)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，437.1032；found，437.1036。
实施例14
2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺的制备
用2-氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到标题化合物2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氟苯基)乙酰胺，总产率11.8％。
Mp233-236℃(dec.)，IR(KBr)：3421，1656，1520cm^-1，¹HNMR(CDCl₃)ppm：1.60(m，2H，CH₂)，1.75(m，2H，CH₂)，1.86(m，2H，CH₂)，2.74(t，2H，CH₂)，3.20(t，2H，CH₂)，4.00(s，2H，CH₂)，7.10(d，1H，ArH)，7.18(m，1H，ArH)，7.24(m，3H，ArH)，7.42(m，2H，ArH)，7.58(m，1H，ArH)，9.12(s，br，1H，NH)，HRMS(SCI)m/z calcd forM⁺，437.1032；found，437.1038。
实施例15
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2，6二甲苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二甲苯基)乙酰胺。
实施例16
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2，6-二氯苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氯苯基)乙酰胺。
实施例17
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2，6-二氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二氟苯基)乙酰胺。
实施例18
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2，6-二异丙基苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二异丙苯基)乙酰胺。
实施例19
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2-氰基苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-氰基苯基)乙酰胺。
实施例20
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基乙酰胺。
实施例21
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺的制备
在反应瓶中，加入1.49g(0.01mol)2-羟基苯胺及20mL THF，在-10℃搅拌15分钟，
滴加0.85g(0.0075mol)氯乙酰氯的20mL THF溶液，反应2h。加入20mL二氯甲烷提取，干燥，柱层析分离得灰白色固体，即：N-(2-羟基苯基)氯乙酰胺1.93g，收率约为85.8％。
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，N-(2-羟基苯基)乙酰胺代替N-(2，6-二乙基苯基)氯乙酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)乙酰胺。
实施例22
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，4-羟基苯胺代替2-羟基苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1及实施例21，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)乙酰胺。
实施例23
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-苯乙基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2-苯乙胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-苯乙基)乙酰胺。
实施例24
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2，5-二乙氧苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，5-二乙氧苯基)乙酰胺。
实施例25
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，4-氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺。
实施例26
2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺的制备
用2-吡咯甲醛代替2-噻吩甲醛，2-氟苯胺代替2，6-二乙苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到标题化合物2-{[3-氰基-4-(吡咯-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-氟苯基)乙酰胺。
实施例27
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺的制备
将D-缬氨酸(1.1g，10mmol)、溴化钠(1.84g，20mmol)溶于2.5mL98％硫酸中，在0-35℃下，往其中滴加饱和亚硝酸钠溶液5mL，反应过夜。用二氯甲烷(4×15mL)提取，干燥，柱层析分离，得白色半固体(R)-2-溴-3-甲基丁酸1.32g(72.9％)，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.11(q，6H)，2.25(m，1H)，4.09(d，1H)，10.35(b，1H)。
将草酰氯(0.31g，2.4mmol)溶于5mL二氯甲烷中，滴加到8mL溶有(R)-2-溴-3-甲基丁酸(0.2g，1.1mmol)的二氯甲烷中，反应48小时，蒸干溶剂，得到(R)-2-溴-3-甲基叔丁酰氯0.2g(92.0％)。将(R)-2-溴-3-甲基丁酰氯(0.2g，1.0mmol)溶于10mL二氯甲烷中，滴加到10mL溶有苯胺(93mg，1.0mmol)的二氯甲烷中，反应2小时，饱和NaCl液洗涤，MgSO₄干燥，柱层析分离得白色半固体(R)-2-溴-3-甲基-N-苯基丁酰胺1.7g(66.4％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.15(q，6H)，2.54(m，1H)，4.12(d，1H)，7.10(m，1H)，7.18(m，2H)，7.54(m，2H)，8.98(s，1H)。
用(R)-2-溴-3-甲基-N-苯基丁酰胺代替氯乙酰2，6-二乙基苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1，得到目标化合物(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺。
实施例28
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺的制备
用L-缬氨酸代替D-缬氨酸，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-苯基-3-甲基丁酰胺。
实施例29
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用2，6-二乙基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例30
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用L-缬氨酸代替D-缬氨酸，用2，6-二乙基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2，6-二乙基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例31
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用4-羟基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例32
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用L-缬氨酸代替D-缬氨酸，用4-羟基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(4-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例33
(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用2-羟基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例34
(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺的制备
用D-缬氨酸代替L-缬氨酸，用2-羟基苯胺代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-(2-羟基苯基)-3-甲基丁酰胺。
实施例35
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(S)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺的制备
用S-苯甘氨醇代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(S)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。
实施例36
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺的制备
用L-缬氨酸代替D-缬氨酸，用S-苯甘氨醇代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。
实施例37
(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺的制备
用R-苯甘氨醇代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(2S)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。
实施例38
(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8，9-五氢环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺的制备
用L-缬氨酸代替D-缬氨酸，用R-苯甘氨醇代替苯胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例27，得到目标化合物(2R)-2-{[3-氰基-4-(噻吩-2-基)-5，6，7，8-环庚烷并吡啶-2-基]硫基-}-N-[(R)-2-氨基-2-苯乙醇-2-基]-3-甲基丁酰胺。
实施例39
环庚烷并吡啶类化合物对β-分泌酶抑制活性的筛选及IC₅₀值的确定
筛选原理：
基本原理是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer FRET)。多肽底物上合成有两个荧光基团：一个荧光供体(罗丹明衍生物)及该供体的淬灭受体。这两个基团之间的距离使得在光激发状态下，荧光供体(D)的能量被受体(A)特异性地淬灭，该量子现象称为共振能量转移。经过蛋白酶切割后，该荧光团从淬灭基团上分离，恢复其本身的全部荧光。因此，一个低荧光的多肽底物经过酶切割反应以后成为高荧光的物质，而且荧光强度的增加与多肽水解的程度呈线性相关。
实验材料和仪器：
β-分泌酶荧光共振能量转移测定试剂盒BACE1(β-secretase)FRET Assay Kit，Red(购自Invitrogen)。
该试剂盒包括：
β-分泌酶(BACE1)：保存于50mM Tris(pH 7.5)，10％甘油中；
β-分泌酶底物75μM：Rh-EVNLDAEFK-Quencher，保存于50mM重碳酸铵中；
β-分泌酶反应终止液：2.5M醋酸钠；
β-分泌酶反应缓冲液：50mM醋酸钠(pH4.5)；
β-分泌酶产物标准：Rh-EVNL，保存于50mM重碳酸铵；
黑色384孔板(购自BMG公司)；
酶标仪(Genios，购自TECAN公司)。
实验方法：
1、试剂的准备
1.1 3×β-分泌酶(1.0单位/毫升)
用反应缓冲液稀释试剂盒中β-分泌酶(192单位/毫升)至终浓度为1.0单位/毫升。
1.2 3×β-分泌酶底物(750nM)
用反应缓冲液稀释试剂盒中β-分泌酶底物(75μM)至终浓度为750nM。
1.3 3×待检测化合物缓冲液
用反应缓冲液稀释化合物到所需浓度。
2、实验设计(见下表)。

测活反应对照实验试剂酶+待检测化合物酶反应不加酶反应 DMSO反应 β-分泌酶反应缓冲液 10μL 20μL 3×β-分泌酶底物(750nM)10μL 10μL 10μL 10μL 3×待检测化合物缓冲液10μL 10μL 3×β-分泌酶 (1.0单位/毫升)10μL 10μL 10μL β-分泌酶反应终止液10μL 10μL 10μL 10μL 总体积40μL 40μL 40μL 40μL

2.1化合物活性测定实验
3×β-分泌酶，3×β-分泌酶底物(750nM)和3×待检测化合物缓冲液各10μL，混匀，待其在室温反应60min后，加入10μLβ-分泌酶反应终止液终止反应，然后测其在535nm波长激发下585nm处的荧光强度。
2.2对照实验
酶反应：3×β-分泌酶，3×β-分泌酶底物(750nM)和β-分泌酶反应缓冲液各10μL，混匀，待其在室温反应60min后，加入10μLβ-分泌酶反应终止液终止反应。
不加酶反应：3×β-分泌酶底物(750nM)10μL和β-分泌酶反应缓冲液20μL，混匀，待其在室温反应60min后，加入10μLβ-分泌酶反应终止液终止反应。
DMSO对照反应：3×β-分泌酶，3×β-分泌酶底物(750nM)和稀释有DMSO的β-分泌酶反应缓冲液(DMSO浓度与3×待检测化合物缓冲液中DMSO浓度相同)各10μL，混匀，待其在室温反应60min后，加入10μLβ-分泌酶反应终止液终止反应。
2.3IC₅₀值测定实验
将待检测化合物稀释成不同浓度，依2.1进行反应，所有实验均设置复孔。
实验结果：部分化合物的IC₅₀值分别如下表所示：

实施例40
环庚烷并吡啶类化合物对β-分泌酶激动活性的筛选及EC₅₀值的确定。
在分子水平上，对专利中待测化合物进行筛选，其中筛选到化合物ZY37对β-分泌酶有良好的激动效果，其EC₅₀为3.39×10^-8M，激动曲线如图1所示。
细胞水平筛选
在分子水平筛选到化合物ZY37，对β-分泌酶有良好的激动效果，在细胞水平上进一步对其活性进行了验证：
细胞水平β-分泌酶测活
检测方法：选用CHO2B7细胞(已经稳转APP695wt)，接种24小时后加化合物孵育，化合物浓度为10^-4M到10^-11M，使用1‰DMSO作为负对照。加药24小时后收取样品，反复冻融6次裂解细胞，然后测定细胞裂解液的浓度，再采用前述的β-分泌酶测活方法进行细胞裂解液的β-分泌酶活性测定。
结果：化合物ZY37在细胞水平对β-分泌酶的EC₅₀＝1.56×10^-6M，激动曲线如图2所示。
细胞水平Aβ1-40含量测定
检测方法：选用CHO2B7细胞(已经稳转APP695wt)，接种24小时后加化合物孵育，化合物浓度为10^-6M到10^-11M，使用1‰DMSO作为空白对照。加药24小时后收取样品，分析分泌型Aβ1-40的含量。利用ELISA原理，购买Biosource公司的Aβ1-40含量测定试剂盒进行定量Aβ1-40的检测。
结果：化合物ZY37在细胞水平上，确实能使Aβ1-40的含量增加，进行浓度梯度检测后，测得ZY37激动Aβ1-40生成的EC₅₀＝7.14×10^-9M，激动曲线如图3所示。
产业上利用的可能性
本发明的环庚烷并吡啶类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点。
本发明的环庚烷并吡啶类化合物在计算机虚拟筛选以及β-分泌酶结合实验中，显示激活/抑制酶活性的作用，可以有效地治疗和预防阿尔茨海默病、儿童智力低下症、健忘症及其他心血脑管疾病。在生物传感技术Biacore 3000研究本发明的环庚烷并吡啶类化合物与β-分泌酶相互作用的模型上，观察到所有化合物在10^-7-10^-5M浓度范围内对此模型均有作用。
本发明的化合物毒性很低。
因此，本发明的化合物可用于制备治疗和预防由分泌酶调节紊乱所致疾病的药物，也可作为测定α、β、γ-分泌酶的单一或多重激动酶/抑制酶活性的工具药。