含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物及其制备方法.pdf

一类含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物及其制备方法，其属于生物有机合成领域。这种含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物是在萘酰亚胺母体上以取代基形式引入五元1，2，3－三唑环，通过硝基还原、重氮化反应、叠氮取代反应、Click Chemistry和氨基缩合反应对化合物进行设计合成，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性，对多种不同组织来源的肿瘤细胞(如人肺癌、神经胶质癌等)和多种不同来源的遗传变异细胞(如白血病细胞等)的正常生长具有较好的抑制作用。

1、   一类含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物，其特征在于该化合物的化学分子结构通式如下：

式中：
R₁为C₁-C₆烷基、或为H或苯环；
其中，R₅，R₆均同为甲基、乙基，或R₅+R₆为哌嗪环、吗啉环、硫代吗啉环，n＝2～4。

2、   据权利要求1所述的含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物，其特征是：所述抗肿瘤化合物分别为N-(N^/，N^/-二甲基胺乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二乙基胺乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-丁基苯基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-羟基乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-哌嗪基乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二甲基胺乙基)三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二乙基胺乙基)三唑基萘酰亚胺、N-丁基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-羟基乙基)三唑基萘酰亚胺或N-(2^/-哌嗪基乙基)三唑基萘酰亚胺。

3、   所述的含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物的制备方法，其特征是：以3-硝基-1，8萘酐为原料，在DMF溶剂中以Pd/C作催化剂，于室温，1.5MPa H₂下还原3个小时，得到一中间化合物；此中间化合物于0～5℃悬浮在浓HCl中加入1倍摩尔量的亚硝酸钠水溶液，半小时后加入1倍摩尔量的叠氮钠水溶液，反应1小时后，过滤得到另一中间化合物；此中间化合物通过“Click Chemistry”反应，即在CuSO₄和抗坏血酸钠存在下，于溶剂叔丁醇和水中加入苯乙炔或通入乙炔气，得到的产物与相应的伯胺在乙醇中回流3小时即可得到以上所述的含三唑环的萘酰亚胺化合物。

含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一类含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物及其制备方法，其属于生物有机合成领域。
背景技术
在芳环上引入含氮杂原子取代基的单萘酰亚胺类化合物具有良好的抗癌活性，其中活性最好的amonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-胺基-1，8-萘酰亚胺)(Malviya V K，Liu P Y，Alberts D S，et al.Am.J.Clin.Oncol.，1992，15：41-44.)和mitonafide(N-(β-二甲基氨基乙基)-3-硝基-1，8-萘酰亚胺)(Brana M.F，SantosA.，Roldan C.M.，et al.Eur.J.Med.Chem.Chim.Ther.，1981，16，207-212)已经进入二期临床试验。该类化合物能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，其作用机理是嵌插入DNA的碱基对之间，抑制DNA和RNA的合成，并能够抑制拓扑异构酶II，从而达到抑制肿瘤的目的。
由此可以得知，如果在芳环上5位引入具有良好生物活性的含氮基团，提高其对DNA的嵌插能力，从而提高其抗肿瘤活性。
发明内容
本发明所述的含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物主要在芳环体系上的5位引入五元三唑环，通过芳环取代基的形式设计合成了一类新型的含有1，2，3-三唑环类萘酰亚胺化合物。其目的是：通过链接反应(Click chemistry)设计合成了一类含有1，2，3-三唑环的萘酰亚胺化合物，试验证明其对体外肿瘤细胞生长的抑制能力。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物，其化学分子结构通式如下：

式(1)中：
R₁为C1-C6烷基、或或苯环。
其中，R₅，R₆均同为甲基、乙基，或R₅+R₆为哌嗪环、吗啉环、硫代吗啉环，n＝2～4。
所述抗肿瘤化合物分别为N-(N^/，N^/-二甲基胺乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二乙基胺乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-丁基苯基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-羟基乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-哌嗪基乙基)苯基三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二甲基胺乙基)三唑基萘酰亚胺、N-(N^/，N^/-二乙基胺乙基)三唑基萘酰亚胺、N-丁基三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-羟基乙基)三唑基萘酰亚胺、N-(2^/-哌嗪基乙基)三唑基萘酰亚胺。
所述的含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物的制备方法：以3-硝基-1，8萘酐为原料，在DMF溶剂中以Pd/C作催化剂于室温，1.5MPa H₂下还原3个小时，得到一中间化合物；此中间化合物于0～5℃悬浮在浓HCl中加入1倍摩尔量的亚硝酸钠水溶液，半小时后加入1倍摩尔量的叠氮钠水溶液，反应1小时后，过滤得到另一中间化合物；此中间化合物通过“Click Chemistry”反应，即在CuSO₄和抗坏血酸钠存在下，于溶剂叔丁醇和水中加入苯乙炔或通入乙炔气，得到的产物与相应的伯胺在乙醇中回流3小时即可得到以上所述的含三唑环的萘酰亚胺化合物。
下面介绍含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物合成路线：

式中R₁的定义与上文所述相同。
以3-硝基-1，8萘酐(化合物(2))为原料，依次经过步骤a(步骤a的反应条件：Pd/C催化剂，1.5MPa H₂，室温反应3小时)、步骤b(步骤b反应条件：HCl/NaNO₂，冰水浴下反应2小时后，滴加NaN₃溶液，在0～5℃下反应1小时)和步骤c(步骤c的反应条件：t-BuOH/H₂O，在CuSO₄和抗坏血酸钠存在下，加入苯乙炔，于室温下反应8小时。)得到化合物(3)。化合物(3)经步骤d(步骤d的反应条件：与H₂NR₁，在乙醇中回流3小时)得到目标化合物(4)。
另外以3-硝基-1，8萘酐(化合物(2))为原料，依次经过步骤a(步骤a的反应条件：Pd/C催化剂，1.5MPa H₂，室温反应3小时)、步骤b(步骤b反应条件：HCl/NaNO₂，冰水浴下反应2小时后，滴加NaN₃溶液，在0～5℃下反应1小时)和步骤e(步骤e的反应条件：t-BuOH/H₂O，在CuSO₄和抗坏血酸钠存在，通入乙炔气，于室温下反应8小时)得到化合物(5)。化合物(5)经步骤f(步骤f的反应条件：与H₂NR₁，在乙醇中回流3小时)得到目标化合物(6)。
下面说明含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物对肿瘤细胞体外抑制生长活性的实验方法：
(1)化合物对肿瘤细胞体外抑制生长活性采用四氮唑还原法对MOLT-4人白血病细胞株、U251人神经胶质瘤细胞株进行实验。方法是按不同肿瘤生长速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90μL/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后加入药液10μL/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。另设无细胞调零孔、如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48h后，加MTT(Sigma)液5mg/mL用生理盐水配制20L/孔；继续培养4h后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/1HCl)50μL/孔，于CO₂培养箱中过夜。然后用酶标仪测OD570值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：
肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。
(2)采用磺酰罗丹明B蛋白染色法对A-549人肺腺癌细胞株进行实验，方法是根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μL/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24h，再加药10μL/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/mL溶液100μL/孔，室温中染色15min，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μL/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定A值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：
肿瘤抑制率＝(A_540对照孔-A_540给药孔)/A_540对照孔×100％。
本发明的有益效果是：这种含三唑环萘酰亚胺抗肿瘤化合物是通过在萘酰亚胺母体上引入五元1，2，3-三唑环，以取代基形式来对化合物进行设计合成，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性，对多种不同组织来源的肿瘤细胞(如人肺癌、神经胶质癌等)和多种不同来源的遗传变异细胞(如白血病细胞等)的正常生长具有较好的抑制作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
N-(N^/，N^/-二甲基胺基乙基)-5-(4-苯基-[1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物1)的合成：

(1)在200ml高压釜中加入7.5g 3-硝基-1，8萘酐，0.5g Pd/C催化剂和DMF 50ml，排空6次，充入1.5MPa氢气，于室温下反应3小时，至氢气压力不再下降时停止反应。滤出Pd/C催化剂，将滤液倒入500ml冰水中，析出桔黄色沉淀，过滤，洗涤，烘干，得桔黄色固体5.7g，产率86.7％。熔点＞300℃

(2)在100ml双口瓶中，加入4.1g 3-胺基-1，8萘酐，30ml浓盐酸，用碎冰冷却20分钟。将1.2g NaNO2溶解在15ml水中，滴加入反应体系中，1小时内加完，继续反应1小时，温度不超过5℃。然后将1.1g NaN3溶解在10ml水中，滴加入反应体系，反应1小时，撤出碎冰浴。将反应液倒入300ml冰水中，析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，烘干，得到黄色固体4.0g，产率86.9％。IR(KBr，cm-1)：3050，2155，1770，1730，1601，1521。

(3)在100ml单口瓶中，加入2.0g(8.2mmol)3-叠氮-1，8萘酐，0.85g(8.2mmol)苯乙炔以及10ml t-BuOH和10ml水混合液，再加入88mg(0.4mmol)抗坏血酸钠和10mg(0.04mmol)CuSO4·5H20在室温下反应8小时，TLC跟踪反应至完全，将反应液倒入300ml冰水中，析出黄色沉淀，静置，过滤，洗涤，烘干的黄色固体2.65g，产率92.3％。熔点＞300℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：7.25(t，J1＝6.8Hz，J2＝7.2Hz，1H)，7.31(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.62(m，3H)，8.21(m，2H)，8.41(s，1H)，8.62(s，1H)，9.01(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₀H₁₁N₃O₃，计算值：341.0800，实测值：341.0789。

(4)在25ml单口瓶中，加入0.47g步骤(3)合成的产物和无水乙醇15ml，再加入N/，N/-二甲基乙二胺0.3ml。磁力搅拌，升温回流3小时，TLC跟踪反应至完全。过滤，所得固体经硅胶柱层析分离，得到目标产物(化合物1)0.47g，产率83％。熔点205.3～206.1℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：2.25(s，6H)，2.57(t，J1＝6.4Hz，J2＝6.8Hz，2H)，4.17(t，J1＝6.4Hz，J2＝6.8Hz，2H)，7.40(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，1H)，7.51(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.95(m，3H)，8.50(m，2H)，8.92(s，1H)，8.99(s，1H)，9.59(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₄H₂₁N₅O₂，计算值：411.1695，实测值：411.1703。
IR(KBr，cm-1)：2942，2775，1698，1662，1596，1477，1384，1338，1261，1238，1151，1043，883，781。
实施例2：
N-(N/，N/-二乙基胺基乙基)-5-(4-苯基-[1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物2)的合成：

除用N/，N/-二乙基乙二胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例1，得到目标化合物2，熔点191.1～192.3℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：0.97(t，J1＝6.8Hz，J2＝7.2Hz，6H)，2.50(m，4H)，2.68(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，2H)，4.12(t，J1＝6.8Hz，J2＝7.2Hz，2H)，7.42(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.2Hz，1H)，7.52(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.98(m，3H)，8.50(m，2H)，8.93(d，J＝2Hz，1H)，9.0(d，J＝2.4Hz，1H)，9.62(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₆H₂₅N₅O₂，计算值：439.2008，实测值：439.2001。
IR(KBr，cm-1)：2971，2803，1702，1664，1627，1517，1477，1380，1361，1290，1257，1203，1172，1050，881，765。
实施例3：
N-丁基-5-(4-苯基-[1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物3)的合成：

除用正丁胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例1，得到目标化合物3，熔点195.5～196.7℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：0.94(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，3H)，1.37(m，2H)，1.64(m，2H)，4.05(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.41(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.6Hz，1H)，7.52(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.97(m，3H)，8.51(m，2H)，8.93(d，J＝1.6Hz，1H)，9.0(d，J＝2.4Hz，1H)，9.62(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₄H₂₀N₄O₂，计算值：396.1586，实测值：396.1590。
IR(KBr，cm-1)：2950，1708，1669，1630，1510，1472，1378，1361，1293，1245，1201，1172，1055，883，780。
实施例4：
N-(2/-羟基乙基)-5-(4-苯基-[1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物4)的合成：

除用乙醇胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例1，得到目标化合物4，熔点257.3～258.6℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：3.61(d，J＝5.6Hz，2H)，4.20(d，J＝5.2Hz，2H)，4.92(s，1H)，7.42(t，J1＝6.8Hz，J2＝6.8Hz，1H)，7.53(t，J1＝6.4Hz，J2＝7.2Hz，2H)，7.97(m，3H)，8.52(m，2H)，8.93(s，1H)，9.00(s，1H)，9.60(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₂H₁₆N₄O₃，计算值：384.1222实测值：384.1230。
IR(KBr，cm-1)：3630，1710，1655，1600，1510，1450，1330，1230，1156，1112，1015，825。
实施例5：
N-(2/-哌嗪基乙基)-5-(4-苯基-[1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物5)的合成：

除用1-(2-氨基乙基)哌嗪替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例1，得到目标化合物5，熔点250.2～251.7℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：2.50(s，4H，NHCH₂NCH₂)，2.60(t，J1＝6.8Hz，J2＝7.2Hz，2H)，2.76(s，4H，NCH₂)，4.19(t，J1＝6.4Hz，J2＝6.4Hz，2H)，7.41(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，1H)，7.53(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz，2H)，7.96(m，3H)，8.52(m，2H)，8.95(s，1H)，9.01(s，1H)，9.63(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₆H₂₄N₆O₂，计算值：452.1961，实测值：452.1986。
IR(KBr，cm-1)：2919，1700，1662，1625，1590，1519，1436，1234，1149，1041，840。
实施例6：
N-(N/，N/-二甲基胺基乙基)-5-([1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物6)的合成

除用乙炔替代苯乙炔外，其它合成及提纯方法同实施例1，得到目标化合物6，熔点226.3～227.5℃。
H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：2.24(s，6H)，2.51(t，J1＝6.4Hz，J2＝6.8Hz，2H)，4.18(t，J1＝6.4Hz，J2＝6.8Hz，2H)，7.96(t，J1＝7.6Hz，J2＝8Hz，1H)，8.10(d，J＝1.2Hz，1H)，8.53(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，2H)，8.93(d，J＝2.4Hz，1H)，9.02(d，J＝2Hz，1H)，9.16(d，J＝1.2Hz，1H)。
HR-MS(m/z)：C₁₈H₁₇N₅O₂，计算值：335.1382，实测值：335.1382。
IR(KBr，cm-1)：2923，2815，2771，1700，1656，1627，1598，1471，1381，1292，1240，1174，1058，890，790。
实施例7：
N-(N/，N/-二乙基胺基乙基)-5-([1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物7)的合成：

除用N/，N/-二乙基乙二胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例6，得到目标化合物7，熔点200.5～201.5℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：0.97(t，J1＝7.2Hz，J2＝6.8Hz，6H)，2.56(s，4H)，2.68(s，2H)，4.13(t，J1＝7.2Hz，J2＝6.8Hz，2H)，7.95(t，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz，1H)，8.10(s，1H)，8.52(t，J1＝7.6Hz，J2＝6.4Hz，2H)，8.93(d，J＝2Hz，1H)，9.02(d，J＝2Hz，1H)，9.16(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₀H₂₁N₅O₂，计算值：363.1695，实测值：363.1701。
IR(KBr，cm-1)：2925，2811，2750，1711，1651，1616，1601，1462，1376，1276，1233，1168，1043，891，793。
实施例8：
N-丁基-5-([1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物8)的合成：

除用正丁胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例6，得到目标化合物8，熔点191.9～193.1℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：0.94(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.6Hz，3H)，1.37(m，2H)，1.64(m，2H)，4.05(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，2H)，7.94(t，J1＝8Hz，J2＝7.6Hz，1H)，8.10(s，1H)，8.50(m，2H)，8.89(d，J＝2Hz，1H)，8.99(d，J＝2Hz，1H)，9.15(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₁₈H₁₆N₄O₂，计算值：320.1273，实测值：320.1278。
IR(KBr，cm-1)：2930，2825，2750，1706，1655，1613，1601，1451，1376，1280，1233，1150，1052，890，795。
实施例9：
N-(2/-羟基乙基)-5-([1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物9)的合成：

除用乙醇胺替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例6，得到目标化合物9，熔点257.3～258.6℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：3.71(d，J＝5.6Hz，2H)，4.35(d，J＝5.2Hz，2H)，4.96(s，1H)，7.93(t，J1＝8Hz，J2＝7.6Hz，1H)，8.09(s，1H)，8.51(m，2H)，8.89(d，J＝2Hz，1H)，8.98(d，J＝2.4Hz，1H)，9.16(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₁₆H₁₂N₄O₃，计算值308.0909：实测值：308.0915。
IR(KBr，cm-1)：3660，1706，1651，1607，1518，1432，1330，1235，1152，1111，1012，821。
实施例10：
N-(2/-哌嗪基乙基)-5-([1，2，3]-三唑)-萘酰亚胺(化合物10)的合成：

除用1-(2-氨基乙基)哌嗪替代N/，N/-二甲基乙二胺外，其它合成及提纯方法同实施例6，得到目标化合物10，熔点250.2～251.7℃。
1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ(ppm)：2.53(s，4H，NHCH₂NCH₂)，2.65(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.2Hz，2H)，2.78(s，4H，NCH₂)，4.19(t，J1＝6.8Hz，J2＝7.2Hz，2H)，7.92(t，J1＝7.2Hz，J2＝7.6Hz，1H)，8.09(s，1H)，8.51(m，2H)，8.88(d，J＝2.4Hz，1H)，8.99(d，J＝2Hz，1H)，9.15(s，1H)。
HR-MS(m/z)：C₂₀H₂₀N₆O₂，计算值：376.1648，实测值：376.1645。
IR(KBr，cm-1)：2911，1705，1650，1610，1590，1510，1429，1229，1130，1050，833。
实施例11：
测定化合物的体外抑制肿瘤细胞生长活性：
用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对MOLT-4人白血病细胞和U251人神经胶质瘤细胞进行体外抑制试验。
四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：按不同肿瘤生长速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后加入药液10μl/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。另设无细胞调零孔、如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理盐水配制20μl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/1HCl)50μl/孔，于CO2培养箱中过夜。然后用酶标仪测OD570值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：
肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。
表1.化合物1-10对U251人神经胶质瘤细胞的生长抑制率

表2.化合物2和7对MOLT-4人白血病细胞的生长抑制率

用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法对A-549人肺腺癌细胞进行体外抑制试验。
磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法的具体操作如下：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定A值。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：
肿瘤抑制率＝(A540_对照孔-A540_给药孔)/A540_对照孔×100％。
表3：化合物2和7对A-549人肺腺癌细胞的生长抑制率

从以上数据可以看出，化合物具有显著的抑制肿瘤细胞活性。