化合物双大花旋覆花内酯甲及其制备方法和应用.pdf

本发明属于医药技术领域，具体为一种化合物双大花旋覆花内酯甲及其制备方法和应用。该化合物从旋覆花中提取分离获得。经实验研究表明，该化合物对多种人肿瘤细胞具有良好的抑制活性。因此，该化合物可用于制备抗肿瘤药物。

1、   化合物双大花旋覆花内酯甲，其特征在于从旋覆花中提取分离获得，其化合物结构式如下：


2、   如权利要求1所述化合物双大花旋覆花内酯甲的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将旋覆花地上部分干燥，粉碎，以80％--95％乙醇室温浸泡提取3-4次；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释，然后，先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位。二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100∶1～1∶1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有双大花旋覆花内酯甲的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得双大花旋覆花内酯甲。

3、   一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有如权利要求1所述的化合物双大花旋覆花内酯甲，以及药学上可以接受的载体。

化合物双大花旋覆花内酯甲及其制备方法和应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种化合物双大花旋覆花内酯甲及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一。中国卫生部日前公布2006年城乡居民主要死亡原因。统计显示，恶性肿瘤已成为首要死因。可见肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤的主要治疗手段之一。目前，虽然开发出了几十种抗肿瘤药物，有效的延长了患者的生命或者提高了患者的生存质量。其中有些抗肿瘤的药物治疗疗效非常显著，如药物治疗小儿急性白血病等。但肿瘤的药物研究和开发还面临巨大挑战，如抗肿瘤药物多为细胞毒药物，其副作用明显，限制了这些药物疗效的发挥。著名肿瘤病因学家、中国工程院院士程书钧认为：当今医学对于肿瘤的防治依然处于初级阶段。中药有几千年的人体毒性实验的基础，也许中药会在抗肿瘤方面走在世界的前列。从天然产物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性的先导化合物一直是新药研究的热点。
旋覆花属(Inula L.)植物是菊科(Compositae)中的一属，全世界约有100种，分别于亚洲、欧洲和非洲，以地中海地区为主。我国有20余种，本属多种植物常供药用，如土木香(I.helenium)可作为健胃、利尿、祛痰和驱虫药；大花旋覆花(I.britannica)具有消痰、下气、软坚、行水等功效。倍半萜类化合物是本属植物的特征性成分。研究表明，该属植物中的倍半萜类化合物具有驱虫杀虫、抗菌抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。
旋覆花(Inula japonica)又名金佛花，金佛草(江浙)，六月菊(河北)。多年生草本。根状茎短，横走或斜生，有多少粗壮的须根。分布在我国北部、东北部、中部、东部、四川、广东等地。我国通称的旋覆花应是此种，供药用。根及叶治刀伤、疔毒，煎服可平喘镇咳；花是健胃祛痰药，也治疗胸中痞闷、胃部膨胀、嗳气、咳嗽、呕逆等(《江苏省药材志》)。我们对采自安徽毫州的旋覆花的地上部分进行了系统的化学成分研究，以期从其中分离得到具有良好的抗肿瘤活性的天然产物。
发明内容
本发明的目的在于提出化合物双大花旋覆花内酯甲及其制备方法和应用。
本发明进一步还提供一组以此化合物为活性成分的，用于治疗肿瘤的药物组合物。
本发明所说的双大花旋覆花内酯甲(Inulanolide A)从植物旋覆花中提取分离获得，其化学结构式为：

从旋覆花(生长于安徽毫州)中提取该化合物的步骤如下：将旋覆花地上部分干燥，粉碎，以80％--95％乙醇室温浸泡提取3-4次；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释，然后，先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位。二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100∶1～1∶1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有双大花旋覆花内酯甲的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得双大花旋覆花内酯甲。
双大花旋覆花内酯甲(Inulanolide A)为白色无定形粉末，溶于甲醇，ESI/MS给出准分子离子峰m/z 597[M+H]⁺，结合碳谱、DEPT谱和氢谱确定分子式为C₃₄H₄₄O₉。该化合物的光谱数据与文献(Jin，H.Z.；Lee，D.；Lee，J.H.；Lee，K.Planta Med.2006，72，40-45)报道基本一致，故确定其为InulanolideA，命名为双大花旋覆花内酯甲。
本发明提出的抗肿瘤药物组合物含有治疗有效量的双大花旋覆花内酯甲，以及一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
将旋覆花(Inula japonica)地上部分20kg干燥，粉碎，以95％乙醇室温浸泡提取3次，分别为24、12、12小时；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释后先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位。二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100∶0～2∶1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有双大花旋覆花内酯甲的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得双大花旋覆花内酯甲1.15g。
实施例2
将旋覆花(Inula japonica)地上部分100kg干燥，粉碎，以95％乙醇室温浸泡提取4次，分别为24、24、12、12小时；合并提取液，提取液减压浓缩成流浸膏，加水稀释后先以石油醚萃取，再以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集二氯甲烷部位。二氯甲烷部位应用硅胶柱色谱，以体积比为100∶0～1∶1的二氯甲烷/甲醇系统梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有双大花旋覆花内酯甲的流分，再经葡聚糖凝胶柱色谱，以体积比为1∶1的二氯甲烷/甲醇洗脱，最后经液相色谱制备，得双大花旋覆花内酯甲8.08g。
实施例3
双大花旋覆花内酯甲                        5g
乳糖                                      85g
玉米淀粉                                  25g
硬脂酸镁                                  5g
                                          制成1000片
制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润制成软材，把湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入硬脂酸镁，再过筛，然后将混合物压片，每片重120mg，活性成分含量为5mg。
实施例4：
取双大花旋覆花内酯甲10g，药用淀粉90g，用95％醇湿法制粒，整粒，装1#胶囊，每粒100mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2005年版胶囊剂项下的规定。
实施例5：
取双大花旋覆花内酯甲2.5g，加入丙二醇和乙醇各200ml，搅拌使溶解，加注射用水稀释至10000ml，过0.22μm的微孔滤膜，灌封，20ml/支，流通蒸汽灭菌30min，检验、包装，得注射液。
实施例6：双大花旋覆花内酯甲的细胞毒活性实验
1、实验材料
1.1、受试样品
双大花旋覆花内酯甲(Inulanolide A)用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。
1.2、细胞株
A549(人肺癌细胞)
LOVO(人肠癌细胞)
6T-CEM(人T细胞白血病细胞)
MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)
1.3、培养液
RPMI1640+15％NBS+双抗
1.4、其他材料
全自动酶标仪：型号：WellscanMK-2，生产厂商：Labsystems
进口96孔培养板等。
2、试验方法
MTT法：96孔板每孔加入浓度为4～6×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μl/孔，设双复孔，37℃，5％CO₂作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。
3、试验结果
结果见表1，结果显示，双大花旋覆花内酯甲对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人T细胞白血病细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，双大花旋覆花内酯甲Inulanolide A有很好的抗肿瘤作用。因此，该化合物可用于制备抗肿瘤药物。
实施例7：双大花旋覆花内酯甲对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验
1、实验材料
1.1受试样品
双大花旋覆花内酯甲用少量吐温-80助溶后用0.5％CMC配成溶液。
1.2动物
品系：昆明种小鼠
来源：第二军医大学实验动物中心提供。
合格证号：沪动合证字107号
体重：18-20g
性别：雌性。
1.3移植性肿瘤
小鼠S180肉瘤，由上海医药工业研究院传代维持。
2、实验方法
取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组，分为对照组，环磷酰胺组(CTX组，20mg/kg，ip×7)、给药(5mg/kg)组，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称动物体重后解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

3、实验结果
双大花旋覆花内酯甲Inulanolide A有显著的抑瘤作用。实验结果见表2。
因此，该化合物可以用于制备抗肿瘤药物。