一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法 【技术领域】
本发明涉及一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法。背景技术 孤雌生殖 (Parthenogenesis) 是指在没有精子参与的情况下， 由卵细胞直接发育 为一个胚胎的过程。 孤雌生殖是自然界正常的繁殖方式， 在昆虫较为普遍， 爬行类、 鱼类、 鸟 类动物也可见孤雌生殖现象， 但是哺乳动物的孤雌胚胎如果不经过基因校正修饰将无法出 生， 通常在胚胎种植后不久， 由于胚外组织发育不良， 无法形成正常的胎盘而夭折。虽然哺 乳动物孤雌生殖的胚胎无法发育到正常出生， 但是孤雌细胞与正常细胞形成的嵌合胚胎能 够活产。 小鼠的孤雌嵌合体试验 (Thomson， 1998)， 把孤雌细胞注入到正常受精的胚胎， 可以 观察到孤雌细胞整合到胚胎三个胚层的组织器官中， 并参与相应器官组织的发育。 1995 年， Nature Genetics 还报道了一个存在孤雌细胞嵌合的 14 岁小男孩， 他的皮肤中含有部分孤 雌来源的细胞， 外周血白细胞则完全由孤雌细胞构成， 核型表现为 46， XX(Strain， 1995)。 这 些现象说明了孤雌细胞能够参与到机体内器官的发育， 在部分器官还能明确发挥功能。
随着体外受精和胚胎培养技术的成熟， 在体外操作卵子和胚胎成为现实。在 IVF-ET 过程中， B 超引导下经阴道穿刺取卵及随后的短暂培养过程也偶然引起卵细胞被孤 雌激活的现象 (Muechler， 1989 ； Sultan， 1995 ； Chen， 2009)， 从而形成孤雌胚胎， 并进一步 从中分离孤雌胚胎干细胞系。 2007 年本实验室分离的世界上第一株纯合型人类孤雌胚胎干 细胞系 (parthenogenetic embryonicstem cells， pESCs) 即来自于 IVF 过程中的 1PN 胚胎 (Lin， 2007)。除了自然情况， 利用人工激活的方法也可以获得孤雌胚胎。有文章报道在未 受精的冷冻卵子中， 86.1％的卵子能够被人工激活， 激活的胚胎中又有 96.8％能够发育成 孤雌胚胎， 最终有 16.7％能够发育到囊胚阶段 (De Fried， 2008)。目前， 有许多物种利用人 工激活的方法得到孤雌囊胚， 并最终分离获得孤雌胚胎干细胞系， 如： 小鼠、 大鼠、 兔、 猪、 山 羊、 牛、 猴等 (Cibelli， 2006)。2007 年， 本实验室与其他一些研究组也先后利用人工孤雌激 活的方法获得了人类孤雌胚胎干细胞系 (Revazova， 2007， 2008 ； Lin， 2007 ； Mai， 2007)。
孤雌胚胎干细胞系是构建患者自身特异性多能干细胞的方法之一， pESCs 的遗传 物质 ( 包括细胞核和线粒体的基因组 ) 全部来自于卵细胞， 其 HLA 与供卵者完全匹配， 分化 后得到的功能细胞移植到供卵者体内， 相当于自体移植， 不会激起免疫排斥反应， 相当于育 龄女性患者的 “克隆” 。目前孤雌人工激活的方法多为阻止第二极体的排出， 从而维持细胞 的二倍体状态。这种情况下， 由于存在同源染色体之间的联会以及非姐妹染色单体之间遗 传物质的交换， 70.9％细胞系的 HLA 表现为杂合状态 (Kim， 2007)， 只能为供卵者或者 HLA 完 全匹配的人群服务。 另外一种人工激活的方式， 即联合应用 A23187 和 puromycin， 允许第二 极体的排出， 形成的单倍体在有丝分裂之前 DNA 复制一次恢复二倍体状态， 从而得到纯合 的孤雌胚胎干细胞系。如果在胚胎干细胞库中能够多储存这样常见 HLA 单倍型纯合甚至全 基因组纯合的细胞系， 有利于提高胚胎干细胞库的应用价值， 降低胚胎干细胞库需要的细 胞系数量。 并且由于 pESCs 来自于没有发育潜能的孤雌胚胎， 相对于破坏正常胚胎的 hESCs
而言， 伦理争议更少， 是胚胎干细胞库的重要细胞系来源。
导致孤雌胚胎发育缺陷的关键原因就在于基因组印记的异常， 由于缺乏父源性基 因组印记， 胚胎外组织不能正常发育， 孤雌胚胎最多能够存活到怀孕中期， 胚胎本身发育滞 缓， 但是形态正常。在小鼠嵌合体实验中观察到孤雌细胞能够整合到正常胚胎中参与各个 组织器官的发育， 但是在滋养外胚层和胚外内胚层等胚外组织中未见孤雌细胞， 而孤雄细 胞则基本富集在胚外组织中， 几乎不参与胚胎本身的发育， 提示印记状态会影响细胞的分 化命运。建系过程没有改变孤雌胚胎干细胞的印记状态， 其印记基因表达模式仍与孤雌胚 胎相似， 即表达母源性印记基因， 而父源性印记基因不表达。
孤雌胚胎干细胞未来临床应用最大的安全隐患在于其印记基因表达异常。 但是这 种印记异常如果被纠正， 就有可能安全应用。韩国科学家的实验给予了很好的提示。他们 通过基因修饰小部分发育关键的印记基因 (H19/Igf2 ； Dlk1-Gtl2) 能够改善孤雌胚胎的质 量甚至得到孤雌出生的小鼠 (Kono， 2004 ； Wu， 2006)。同样， 孤雌来源的造血干细胞能够重 建致死性照射后小鼠的造血系统， 达到稳定和有功能的造血干细胞移植 (Eckardt， 2007)， 而一个罕见的具有孤雌嵌合人类， 其外周血白细胞完全来自于孤雌细胞， 并能够发挥正常 功能 (Strain， 1995)。 因此， 尽管不能保证孤雌胚胎干细胞来源的所有组织器官都可以正常 发育， 但是至少在某些组织器官内能够其起作用。如果能够对孤雌胚胎干细胞来源的组织 进行遗传与功能分析证明它们是安全和有效的， 孤雌胚胎干细胞也可能代表一种有效的组 织替代治疗的细胞来源。 发明内容 本发明的目的在于提供一种获得孤雌胚胎干细胞系的方法， 它是从 1PN 胚胎中分 离得到的基因组纯合型孤雌胚胎干细胞。
与以往报道的人类胚胎干细胞不同， 本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系来源于 IVF 过程中的 1PN 胚胎， SNP 芯片分析发现其基因组 99％以上的区域表现为纯合。
该基因组纯合型孤雌胚胎干细胞系的具体获得方法可以是包括以下步骤 ：
1、 在胚胎受精 12 小时后观察， 选择单原核胚胎进一步培养至囊胚阶段 ；
2、 切取囊胚内细胞团， 接种至预先准备好的饲养层细胞上， 并采用抑制细胞分化 的干细胞培养基培养 ；
3、 将未分化的细胞进一步传代、 扩增、 冻存， 并进行孤雌特征以及干细胞特征的鉴 定。
本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系的孤雌来源以及全基因组的纯合状态是通过 HLA 分型、 STR 位点分析以及 SNP 芯片分析来证明的 ：
HLA 分型显示了孤雌胚胎干细胞的 HLA-A、 -B 和 -DR 位点是和供卵者半匹配的， 与 父方 HLA 完全不匹配 ( 图 1)。15 个 STR 位点和 Amelogenin 基因均表现为纯合， 且与供卵 者的等位基因半相合， 与父方的等位基因基本不相同 ( 图 2)。SNP 芯片总共分析了全基因 组 500,447 个 SNP 位点， 结果显示 99％以上的位点表现为纯合， 而异质性位点在基因组范围 内散在分布 ( 图 3)。
本发明所获得的孤雌胚胎干细胞系的印记基因分析包括父源性印记基因 SNRPN、 IPW、 KCNQ10T1、 PEG3、 IGF2， 母源性印记基因 NES55、 H19。其中 SNRPN、 IPW、 KCNQ10T1、 PEG3
均未检出， 而 IGF2 仅有微弱表达， 母源性印记基因 NES55、 H19 的表达比正常胚胎干细胞有 所增强 ( 图 4)。这些结果为 chHES-32 的孤雌来源提供了进一步的证据。
经过干细胞特征的鉴定， 该孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 表达干细胞特异性标记 ( 图 5) 以及多能性相关基因， 维持正常的二倍体核型 46， XX， 具有强的端粒酶活性 ( 图 6)， 能够在体内外向三个胚层的细胞分化 ( 图 7)。
本发明提供的这株从 1PN 胚胎中分离获得的基因组基本纯合型孤雌胚胎干细胞 系及其衍生物对于探讨父源性基因组和母源性基因组在遗传学和表观遗传学上对于发育 过程的影响具有重要的意义， 是研究印记基因在胚胎发育过程中生物学作用的重要工具。 此外， 该细胞系具有向三个胚层细胞分化的能力， 且 HLA 位点纯合， 诱导分化为特定的功能 细胞后用于 HLA 半相合患者的细胞替代治疗， 可以避免免疫排斥反应， 是干细胞库重要的 种子细胞来源， 具有广阔的应用前景。 附图说明 图 1 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 的 STR 检测情况 ： chHES-32 的 STR 位点表现 为纯合， 与供卵者半相合， 而与父方基本不一致。
图 2 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 的 SNP 分析结果。基因组范围内 99％以上的 区域表现为纯合， 不到 1％的区域为杂合， 且散在分布与基因组内。
图 3 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 与正常胚胎干细胞 chHES-35 的印记基因表 达情况 ： chHES-35 同时表达父源性和母源性印记基因， 而 chHES-32 仅表达母源性印记基因 (NES55、 H19)， 而不表达父源性印记基因 (SNRPN、 IPW、 KCNQ10T1、 PEG3、 IGF2)。
图 4 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 来源的孤雌胚胎形态及细胞特征标记染色鉴 定。A 为受精 12 小时观察 1PN 胚胎的光镜下形态 ； B 为 1PN 胚胎发育至第 6 天的囊胚形态 ； C 为 chHES-32 的未分化细胞形态 ； D 为碱性磷酸酶染色结果， 表现为强阳性 ； E-I 分别为干 细胞特异性标记 SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60、 TRA-1-81 和 OCT-4 免疫细胞化学染色结果， 均 显示为阳性。
图 5 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 的多能性相关基因、 端粒酶和核型的鉴定。A 为多能性相关基因 OCT-4， NANOG， REX-1， SOX2， LEFTY A， TDGF， FGF4， TERF1， THY1 和 DPPA2 的 PCR 检测结果 ； B 为端粒酶检测结果， 显示为高端粒酶活性 ； C 显示为正常的二倍体核 型 -46， XX。
图 6 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 体内外分化能力的鉴定。 A-C 为 chHES-32 细胞 体外分化 3 周后进行免疫细胞化学染色结果， 分别为 β-tubulin(A)， SMA(B)and AFP(C) ； D-I 为 chHES-32 细胞在 SCID 小鼠体内形成的畸胎瘤经切片 HE 染色结果， 可以发现有软骨 (D)， 骨 (E)， 脂肪组织 (F)， 神经上皮 (G)， 皮脂腺 (H) 和消化道上皮 (I) 等组织。
具体实施方式
实施例一 ： 基因组纯合型孤雌胚胎干细胞系的获得
一、 患者的知情同意
本实验严格遵守中华人民共和国卫生部的有关法规 ( 人类辅助生殖技术规范， 2003 年 )。实验经医院伦理委员会的批准， 全过程受伦理委员会的监督。捐赠剩余胚胎或配子供干细胞研究的 IVF 患者均被详细告知实验流程， 包括实验的目的、 意义、 配子或胚胎 的使用途径、 捐赠行为的自愿、 无偿原则、 研究者的保密、 无伤害原则等， 即通过完整充分的 说明和介绍， 对捐赠者有关询问的必要回答和解释， 使捐赠者全面了解捐赠行为的利与弊， 在完全知情的情况下， 自主、 自愿、 理性得做出负责任的决定。保证所有胚胎仅限于科研使 用， 严禁用于生殖目的。
二、 1PN 胚胎的培养
将取出的卵冠丘复合体置于 1ml 含有 10％母体血清的 B2 培养基中， 继续成熟培 养 4 ～ 6 小时等待授精。授精时按 5×10 个直线运动精子 /ml 的密度进行授精， 平均每 1ml 加入 2 ～ 3 个卵冠丘复合体。授精后 16 ～ 18 小时观察受精情况， 只观测到 1 个原核的胚 胎 (1PN) 被移入预先在培养箱中平衡过夜的 50ul G1.2 培养基微滴中， 其上覆盖有石蜡油 进行培养。第 3 天上午， 将发育的 6 ～ 8 细胞胚胎移到 50ul G2.2 培养基微滴中培养至囊 胚阶段用于胚胎干细胞的分离。
三、 孤雌胚胎干细胞系的建立和培养
囊胚被机械切割成两半， 含有内细胞团的一半将种植在经丝裂霉素 C 有丝分裂灭 活的人胚成纤维细胞 (human embryonic fibroblasts， hEFs， 密度为 5,000cells/cm2) 饲 养层上进一步培养， 培养基为 DFSR 培养基， 包括 ： 75％ DMEM/F12、 15％ KO-SR、 2mM 左旋谷氨 酰胺、 0.1mM β- 巯基乙醇、 1％非必需氨基酸和 50ng/ml bFGF。 隔天换液， 4 ～ 7 天后， 有平 铺生长的类胚胎干细胞团块长出， 机械挑取未分化部分， 分割成小块后种植于新的饲养层 上继续培养， 约 7 天传代一次。待胚胎干细胞扩增数代并且冻存足够量的早期细胞后， 转移 到添加 4ng/ml bFGF 的常规 DFSR 培养基中长期培养。 实施例二 ： 孤雌胚胎干细胞系的鉴定
一、 孤雌胚胎干细胞系的常规干细胞特性鉴定
1. 碱性磷酸酶 (AKP) 的检测
采用 Invitrogen 公司提供的 Fast Red Substrate Pack 试剂盒对未分化的 hESCs 克隆进行检测， 操作步骤按试剂盒提供的方法进行， 基本原理同 Gomoriα- 萘酚磷酸法， 即 碱性磷酸酶在碱性条件下将 α- 萘基磷酸水解出 α- 萘酚， 然后与固红 B 盐在酶活性部位 偶联形成棕红色不溶于水的盐。阳性染色结果为鲜红色。周边的 MEF 不着色， 为阴性对照。
2 细胞特异抗原的检测
多能性干细胞特异性抗原， 包括 ： SSEA-3、 SSEA-4、 TRA-1-60、 TRA-1-81、 OCT-4 ； 三胚层特异性标记， 包括 ： AFP( 内胚层 )、 β-tubulin( 外胚层 )、 SMA( 中胚层 )。均采用 间接免疫荧光法来检测， 步骤如下 ： 培养的 ES 克隆用 4％的多聚甲醛固定 20 分钟 ； 0.1％ Triton-X-100 透膜 10 分钟 ( 此步骤针对核内抗原 OCT-4， 其余为胞膜抗原不需要 ) ； 正常 山羊血清室温封闭 30 分钟 ； 相应的一抗 4℃孵育过夜 ； 加入 Alexa Flour 488- 连接二抗， 室温避光孵育 1 小时 ； DAPI 复染核 ； 荧光显微镜下观察检测结果并照相。
3 hESCs 的 G 显带核型分析
将 hESCs 转移至用 matrigel 铺皿、 hEFs- 条件培养基培养的无饲养层体系下进一 步扩增并且去除人饲养层细胞的污染。培养 3 天后， 在培养基中加入秋水仙碱 ( 终浓度为 80ng/ml)， 37℃处理 3.5 小时。用 0.05％胰蛋白酶 /0.53mM EDTA 消化收集细胞。按本实验 室常规方法制备好染色体涂片， Giemsa 溶液染色， 树胶封片， 在油镜下观察结果。每个样本
分析 5-10 个中期分裂相。
表1
表 1 为孤雌胚胎干细胞系 chHES-32 的 HLA 检测情况 ： chHES-32 的 HLA 位点表现 为纯合， 与供卵者半相合， 而与父方完全不一致。
4hESCs 多能性相关基因的检测
收集未分化的 hESCs 团块， 用 Trizol 抽提总 RNA， 用 Fermentas 公司提供的逆转录 试剂盒将 1ug RNA 反转录为 cDNA， 再以 cDNA 为模板进行 RT-PCR， 以检测其中多能性相关基 因 OCT3/4、 Nanog、 REX-1、 SOX2、 THY1、 TDGF1、 TERF1、 LEFTB、 DPPA2 和 FGF4 的表达， β-actin 为反应体系阳性对照。 PCR 反应条件 ： 95℃ 1 分 30 秒 ； 30 个循环 (94℃ 40 秒， 54℃ -64℃ 40 秒， 72℃ 40 秒 ) ； 72℃延伸 7 分钟。
5hESCs 分化潜能的检测
5.1 体内实验 - 畸胎瘤的制备 ：
收集未分化 hESCs 克隆， 约 1-2×106cells， 注射入 6-8 周龄雄性 SCID 小鼠的后肢 肌肉中， 观察畸胎瘤的形成情况。8-12 周后取出肿瘤， 常规石腊包埋切片后， HE 染色观察。
5.2 体外实验 - 拟胚体的制备 ：
将 hESCs 克隆机械切割成大小基本一致的团块， 收集 hESCs 团块于 60mm 细菌培养 皿中悬浮培养。培养基为 EB 培养基， 即不含 bFGF 的 DFSR 培养基， 每天换液， 悬浮培养 7 天 后， 接种到预先用 0.1％明胶处理的六孔板中贴壁培养 14 天， 然后进行三胚层标记的免疫 组化染色。
二、 本发明孤雌胚胎干细胞系及其衍生物的特异性鉴定
1 全基因组的单核苷酸多态性 (SNP) 分析
胚胎干细胞转移至 Matrigel 铺皿、 hEFs- 条件培养基培养的无饲养层体系下进 一步扩增， 同时去除人饲养层细胞的污染。0.05％胰酶消化收集细胞， 用 DNeasy Blood & Tissue kit 抽提全基因组 DNA。 我们采用 GeneChip Human Mapping SNP Array 5.0 对 2 个 正常受精 hESCs 系和 2 个 pESCs 系进行全基因组 SNP 分型分析， 根据全基因组 SNP 位点的 基因分型来帮助判断细胞系的来源。分析方法是 ： Y 染色体以外的所有染色体从着丝粒位 置开始， 每 1Mb 作为一个单位， 向染色体两端分区， 然后计算每个单位区间 SNP 的杂合频率 ( 杂合的 SNP 位点数 / 总的 SNP 位点数目 )。我们规定 ： 如果单个区间内 SNP 的杂合频率低 于 5％， 那么判定该区域为纯合， 反之， 如果杂合频率高于 5％， 则判定该区域为杂合。由于 chHES-8 核型为 46， XY， 其 X 染色体应该表现为纯合， 而芯片结果显示该 X 染色体有 0.5％ 的区域为杂合， 我们将这条染色体总的杂合频率作为 SNP 芯片的系统误差， 以此控制整个 基因分型分析的误差概率。
2 印记基因的 RT-PCR 检测
用 Trizol 抽提总 RNA， 用 Fermentas 公司提供的逆转录试剂盒将 1ug RNA 反转录 为 cDNA， 再以 cDNA 为模板进行 RT-PCR， 检测印记基因的表达， β-actin 为反应体系阳性对
照。PCR 反应条件 ： 95 ℃ 1 分 30 秒 ； 25-30 个循环 (95 ℃ 40 秒， 54 ℃ -64 ℃ 40 秒， 72 ℃ 40 秒)； 72℃延伸 7 分钟。
3DNA 指纹分析
胚胎干细胞转移至 Matrigel 铺皿、 hEFs- 条件培养基培养的无饲养层体系下 进一步扩增， 同时去除人饲养层细胞的污染。0.05 ％胰酶消化收集细胞， 用 DNeasyBlood & Tissue kit 抽提全基因组 DNA， 3130 基因分析仪进行 DNA 指纹分析。采用 16system， 总共分析 15 个 STR 位点以及 Amelogenin， 操作步骤参见试剂盒说明书。
4HLA 分型的检测
对胚胎干细胞均进行人类白细胞抗原 HLA-A、 -B、 -DR 位点的 DNA 分型。胚胎干细 胞转移至 Matrigel 铺皿、 hEFs- 条件培养基培养的无饲养层体系下进一步扩增， 同时去除 人饲养层细胞的污染。0.05％胰酶消化收集细胞， 用 DNeasy Blood & Tissue kit 抽提全 基因组 DNA。采用 Invitrogen 公司提供的 AB/DR SSP UniTray 进行 HLA 分型的检测， 运用 PCR-SSP 的方法， 具体步骤参见试剂盒说明书。