人乳头瘤 58 型病毒 E7 蛋白的线性抗原表位最小基序肽 技术领域 本发明属于生物医药与生物检测技术领域， 具体涉及与妇女宫颈癌发生密切相关 的高危型人乳头瘤病毒 （HPV） 58 型 E7 致癌蛋白的全部线性 B 细胞表位 （B cell epitope, BCE, 或称抗原决定簇） 及其最小基序肽， 以及这些表位基序肽的应用。
背景技术 人乳头状瘤病毒 （human papillomavirus, HPV） 是可感染女性生殖道等上皮组织 的一组病毒总称。 已清楚超过 100 种以上的 HPV 病毒都编码 6 个 E1、 E2、 E4 ～ E7 早期蛋白 和 2 个 L1 和 L2 后期蛋白 （Stanley MA. Human papillomavirus vaccines. Rev Med Virol, 16: 139-149, 2006） ， 其中持续感染可导致妇女子宫颈癌等高危型 HPV（如 HPV16 和 HPV18 等） 编码的 E7 蛋白已被证明具有强致癌性。因此， 高危型 HPV 的 E7 蛋白是目前研制宫颈癌 免疫治疗的重要靶点之一 （Preville X, et al. Cancer Res,65: 641-649, 2005） 。
HPV58 也是紧随 16 和 18 型之后的高危型 HPV 病毒之一 （Lungu O，et al. Obstet Gynecol, 47: 337-342 , 1995） 。最近的研究资料表明 HPV58 型在我国江西、 上海、 河北、 北京、 香港和台湾等地区等子宫颈癌患者中的检出阳性率也相当高 （Lin QQ, et al. Int J Cancer, 75: 484-485, 1998; Huang S, et al. Int J Cancer, 70: 408-411, 1997; Cai HB, et al. Oncol, 76: 157-161, 2009; Zhao R, et al. Br J Cancer, 101: 1635-1640, 2009; Lai HC, et al. Int J Cancer, 84: 553-557, 1999; Chan PK, et al. J Med Virol, 59: 232-238, 1999; Bao YP, et al. Int J STD AIDS, 19: 106-111, 2008） ， 有的地区检出率高于 HPV18 型， 甚至与 HPV16 的相当 （李洁等 . 中华实验和临床病 毒学杂志， 10: 50-55, 1996; 刘宝印等 . 中华实验和临床病毒学杂志， 10: 118-121, 1996） 。
很显然， 靶蛋白上线性抗原表位 （BCE） 的扫描作图定位是研制特异肽疫苗和特异 检测肽抗原的基础。但是， 以往的 E6 和 E7 表位研究都主要集中于 HPV16 和 HPV18 （Dillner J, et al. Int J Cancer, 45: 529-535, 1990; Bleul C, et al. J Clin Microbiol, 29: 1579-1588, 1991; Gao L, et al. J Gen Virol, 75: 157-164, 1994） ， 而 HPV58 型 E7 蛋白线性表位鉴定一直未有开展。
因此， 基于上述 HPV58 型在我国妇女中的高流行性和这一病毒型表位鉴定的缺 失， 以及为了研制具我国自主知识产权的 HPV 治疗性嵌合肽 （组合细胞毒性 T 细胞表位和 BCEs） 疫苗和可特异检测 HPV58 型病毒的诊断试剂盒， 我们用大肠杆菌表达 HPV58 型 E7 蛋 白并制备了兔抗重组 E6 蛋白抗血清， 结合采用申请人改良的生物合成肽策略 （Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009） ， 对 HPV58 型 E7 蛋白进行了线性表位完整且精细的扫描作图定位。
发明内容 本发明的目的在于提供人乳头瘤病毒 （HPV） 58 型 E7 蛋白的抗原表位最小基序肽， 并提供含有所述最小基序肽的短肽， 同时提供所述基序肽含所述短肽的应用。
本发明提供的人乳头瘤 58 型病毒 E7 蛋白上最小基序肽， 具有 SED. ID No.1 所示 5-8 氨基酸序列， 记为 HPV58E7 ； 或者具有 SED. ID No.2 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E712-15 ； 或者具有 SED. ID No.3 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E718-23 ； 或者具有 SED. ID No.4 所示 21-27 氨基酸序列， 记为 HPV58E7 ； 或者具有 SED. ID No.5 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E731-35 ； 或者具有 SED. ID No.6 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E736-40 ； 或者具有 SED. ID No.7 所示 43-49 氨基酸序列， 记为 HPV58E7 ； 或者具有 SED. ID No.8 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E794-98。
本发明提供的分别含有上述最小表位基序肽的短肽， 具有 SEQ. ID No.9 所示氨基 酸序列， 记为 HPV58E7-1， 其序列中带下标的 X 编号为特定氨基酸残基， 在化学合成或融合 表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.10 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-2， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 C 端 X 残基 ； 具有 SEQ. ID No.11 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-3， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.12 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-4， 其序列中带下标的 X 编号为特
定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.13 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-5， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.14 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-6， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.15 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-7， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基 ； 具有 SEQ. ID No.16 所示氨基酸序列， 记为 HPV58E7-8， 其序列中带下标的 X 编号为特 定氨基酸残基， 在化学合成或融合表达最小基序或含最小基序 8 肽的场合， 可删除或不删 除和用其他残基替代 X 编号残基。
本发明提供的人乳头瘤病毒 （HPV） 58 型 E7 蛋白上申请人第一次鉴定的八个 BCE 肽的最小基序， 以及它们可化学合成或与 GST 载体蛋白融合表达的含各 BCE 最小基序 8 肽 或长于 8 肽抗原。前者可单个或组合用作设计研制治疗性 HPV 多表位疫苗的抗原肽， 后 者 8 肽或其融合蛋白可用于普查正常妇女或子宫颈癌患者血清中是否存在抗 HPV58E7 抗 体的检测抗原。特别是， HPV58E7-5 表位最小基序 31-35（SSDED） 和 E7-7 表位最小基序 43-49 (DGQAQPA) 与高危型 HPV33E7 蛋白中的氨基酸 31-35 和 42-48l 两段序列 100％保守， 因此含这二个最小基序肽的 HPV58 多表位肽疫苗对 HPV33 病毒感染也将产生交叉免疫保护作用， 也可用作检测 HPV33 感染的标志性抗原肽 （同时并用 HPV58E7 其他 6 个表位肽， 以感染血清 不识别为依据） 。
本发明的内容进一步具体描述如下 ： 1、HPV58 型病毒基因组克隆 （Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991） 购自日本 Matsukura T 博士。用常规 PCR 方法从 购得的 HPV58 型病毒基因组中扩增出编码 HPV58 型 E7 的全长 cDNA, 然后重组插入 pRSET C 融合表达质粒， 进而纯化在大肠杆菌中热诱导表达的重组 E7 蛋白， 最后主动免疫新西兰白 兔获得兔抗 HPV58E7 蛋白抗血清。
2、 先前申请人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的 pXXGST-1 融合表达质粒 （Xu et al. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009） ， 其大分子蛋白载体是 截断的由 188 个氨基酸残基组成的谷胱甘肽转移酶 （glutathione S-transferases,GST， GST188） 。因此， 首先运用 DNA 重组技术 （经化学合成编码 DNA 正负链片段， 退火重组插入表 达质粒， 转化大肠杆菌 BL21（DE3） 宿主菌， 重组克隆测序验证插入片段 DNA 序列， 以及热诱 1-98 导表达目的 GST-15 肽融合蛋白等步骤） ， 表达了跨越 E7 蛋白 序列相互重叠 9 个氨基酸 残基的系列 15 肽 (P1-P14)-GST 和 1 个 14 肽 (P15)-GST 融合蛋白。结果在表达短肽融合 蛋白 (P1-P15) 转印硝酸纤维素膜上后， 用兔抗 HPV58E7 蛋白多抗进行全表位扫描作图， 分 别鉴定出 E7 蛋白上不包括免疫前正兔对照血清也识别的一个 P13 表位肽的九个印迹反应 阳性 BCE 表位肽 (P1-P8 和 P15)（图 1） 。
3、 进一步构建表达了以 GST188 为载体的跨越 E7 的 P11-15、 P27-21、 P313-27、 P419-33、 P525-39、 P631-45、 P737-51 和 P1585-98 序列相互重叠 7 个残基的系列融合表达 8 肽 （编号 P16 ～ P66） ， 继而用兔抗 E7 多抗对上述八个表位肽进行最小基序鉴定 （P7 表位肽最小基序鉴定后 表明 P8 表位肽共享此基序， 故不再合成它的系列八肽） ， 结果根据各表位肽印迹反应阳性的 8 肽之间共同的氨基酸序列， 确定 P1、 P2、 P3、 P3-P4( 共享 ) 和 P7-P8( 共享 ) 的 BCE 最小 5-8 12-15 18-23 基序分别是 NPTL 、 ILDLH 、 EPTDLF 、 DLFCYEQ21-27 和 DGQAQPA43-49， P5-P6 表位肽的系 列 8 肽中共产生 9 个连续的阳性印迹反应带 （P43-P51） ， 提示它们代表的肽段 25-45 中存在 2 个 BCE， 但无法确定它们的最小基序。为此反过来依据前 （P43-P47） 和后 (P46-P51)6 个印 迹阳性肽段合成可能的最小基序肽 , 如与 GST188 融合表达的短肽 DSSDED、 SSDED、 SDED 和 DED（在它们的 N 端前连接 3 个丙氨酸残基 AAA， 编号 P72-P75） ， 结果抗重组 E7 抗血清识别 P72 和 P73 短肽， 由此确定它们的第一个最小基序被确定为 SSDED31-35 （P5-P6 共享） ， 用同样 36-40 的策略合成 P76-P80 最小基序短肽， 最终第二个最小基序被确定为 EIGLD （P6） 。P15 系 列 8 肽的 P66 印迹阳性肽的最小基序鉴定， 则通过在 P66 肽 N 端开始逐一删除 1 个残基合 成与 GST188 融合的 5 个短肽 （P67-P71， P71 的 3 肽 N 端连接 3 个 AAA） ， 用抗重组 E7 多抗的 94-98 印迹鉴定表明其最小基序为 SCAQQ （图 2） 。
以上 HPV58 型 E7 蛋白八个 BCE 肽最小基序的鉴定表明， 本发明所述的 HPV58 型 E7 蛋白八个抗原表位最小基序和 / 或扩展的 8 肽可作为制备包含 B 细胞抗原表位肽的治疗性 多价 HPV58 肽疫苗候选肽段， 它们与 GST188 等载体融合表达的单独或组合表位肽可用作 HPV58 型病毒感染检测试剂盒中的标志性抗原肽段。附图说明 图 1 HPV58/E7 线性抗原表位扫描定位的 SDS-PAGE 分析 (A) 和免疫印迹 (B-C) 图。 其中 ： 1, 预染蛋白分子量标准 ； 2-16, 诱导的跨越 E7 蛋白全序列相互重叠 9 aa 的系列 GST-15 肽 (P1-P15) 融合蛋白 （A） ； 用1： 500 稀释度兔抗重组 E7 抗血清的免疫印迹结果 , 箭头分别指示印迹阳性 15 肽融合蛋白 （B） ； 用 1:500 稀释度免疫前兔血清作为对照的免疫 印迹结果， 箭头指示印迹阳性 15 肽融合蛋白 （C） 。
图 2 HPV58/E7 表位肽 P15/P66 最小基序鉴定的印迹图。其中 ,1, 预染蛋白分 子量标准 ； 2-12 表达的 P61-P71 融合蛋白 (A)， 箭头分别指示与兔抗重组 E7 蛋白抗血清产 生印迹反应的条带 ； 图表中阴影部分显示印迹阳性肽 （P66-P69） 共有最小基序氨基酸序列 （B） 。
具体实施方式
本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范 围， 该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 均按照常规条件以及 [ 美 ]J. 萨姆布鲁克和 D.W. 拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版 “分 子克隆 ： 实验室手册” （科学出版社， 2002） 和 [ 美 ]E. 哈洛和 D. 莱恩编著沈关心等翻译的 “抗体技术实验指南” （科学出版社， 2002） 中所述的步骤， 或按照生产销售商建议的条件进 行。 实施例 1 ：人乳头瘤病毒 58 型 （HPV58） E7 蛋白线性 BCE 扫描作图 材料和方法 ： 1. HPV58 基因克隆 （pLink322/HPV58 质粒） 购自日本 Matsukura T 博士。pRSET C 质 粒购自美国 Invitrogen 公司。 热诱导表达质粒 pXXGST-1 由本专利发明人构建 ( 专利申请 号 ：200710173305.2)。大肠杆菌 BL21 （DE3） 菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保 藏。
2. 限制性内切酶 EcoR I、 BamH I、 Sal I、 Taq 酶和 T4 DNA 连接酶购自日本 TaKaRa Biotechnology 公司， 预染蛋白分子量标准和辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗 （IgG /HRP） 上海生工生物技术服务公司。 ECL 化学发光显色试剂盒购自 GE Healthcare UK 公司。 0.2μm 硝酸纤维素膜购自 Whatman Gmbh Hahnestr 公司。 6 × His 单抗购自上海睿星生物技术有 限公司。
3. QIAprep spin miniprep Kit 质粒抽提试剂盒、 QIAquick PCR 产物纯化试剂盒 和 quick 凝胶回收试剂盒购自德国 QIAGEN 公司。
4. 新西兰白兔购自上海 BK 实验动物有限公司。
5. 两端分别为 BamH I 和 Sal I 粘性末端， 中间为各 6/8-15 肽编码 DNA 序列加 TAA 终止密码子的正负链 DNA 片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
6. 抗 HPV58E7 蛋白抗血清制备依据 HPV58 病毒 E6 基因序列公开信息 （Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427, 1991） 和参照文献方法 （宋力雯等 . 人卵透明带蛋白 ZP3a 和 ZP3b 肽段的免疫原性及其抗血清体 外抑制人精子 - 半透明带结合 . 生理学报， 57 ： 682-688, 2005） 。制备过程摘要如下 ： 从 pLink322/HPV58 质粒中 PCR 扩增出两端为 BamH I 和 EcoR I 的全长 E7 编码基因 ； 双酶切
后重组插入 pRSET C 质粒， 重组质粒经 DNA 测序验证后转化大肠杆菌宿主菌 ； 诱导表达的重 组含 6 × His 标签 E7 蛋白用 6 × His 单抗鉴定后， 用纯化的重组 E7 蛋白免疫新西兰白 兔， 加强免疫二次后抽取血清备用。
人乳头瘤病毒 58 型 （HPV58） E7 蛋白线性抗原表位扫描作图的具体步骤如下 ： 1. 依据 HPV58 型 E7 基因序列公开信息， 设计跨越 E71 － 98 全序列的系列相互重叠 9 个 氨基酸残基的 15 肽 (P1-P15) 编码 DNA 正负链片段 （正链 5’ - 端加 5’ -gatcc,3’ - 端加 taag-3’ ； 负链 5’ - 端加 5’ -tcgactta， 3’ - 端加 g-3’ ） ， 外送 DNA 合成。
2. 将 1 或 2 个 OD 的互补正负链片段用 ddH2O 溶解成 20 mmol/ml 储存液 （根据 DNA 合成报告单数据） ； 各取 10 ml 储存液和 20 ddH2O 于 1.5 ml Eppendorf 管中， 94℃水浴加热 5 min, 自然降至室温后， 在 15 ml 反应体积中吸入 2 ml 退火片段、 1 ml 约 200 ng/ml 经 BamH I 和 Sal I 双酶切的 pXXGST-1 质粒、 1 ml T4 DNA 连接酶和其 1.5 ml 缓冲液， 连接过 夜； 连接液转化感受态 BL21（DE3） 宿主菌， 涂布含 Amp 的 LB 平板上， 于 37℃培养过夜 ； 第 二天挑取氨苄 LB 平板上长出的单克隆转接 3 ml LB 培养液诱导表达， 以由 pXXGST-2 表达 的 GST188 蛋白为对照， 各表达的 GST188-15 肽 （P1-P15） 融合蛋白经 15％ SDS-PAGE 分析确 认 （与对照蛋白电泳迁移率相差约 2 个 kDa） ， 挑取各重组克隆外送进行 DNA 测序 ； 3．将插入片段测序结果正确的克隆接种加入 Amp 的 3 ml LB 培养液中， 于 30℃振荡 培养过夜， 翌日晨按 1/50 比例转接新鲜含 Amp 的 LB 培养液中， 30℃振荡培养 2 ～ 3 h 至 菌体浓度达到 0.6 ～ 0.8 OD 后， 调高温度至 42℃热诱导 4 h， 离心收集菌体， 加上样裂解 液煮沸 5 min 备用 ； 4. 将诱导的细菌总蛋白样品同时走 15％ SDS-PAGE， 电泳结束后， 一块凝胶用考马斯 亮蓝染色， 二块凝胶进行硝酸纤维素膜电 (100 mA) 转移 2 h， 用丽春红染色转印迹膜 2 min， 在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记， 用水冲洗掉丽春红染色 ； 5. 印迹膜用 PBS 缓冲液反复洗涤四次， 用 5％脱脂奶粉封闭过夜， PBS 缓冲液洗涤四 次， 分别在 8 ～ 10 ml 反应液中加入 30 ml 一抗兔抗重组 E7 血清或正兔血清， 室温反应 2 h， PBS 缓冲液洗涤后加入 5 ml 二抗羊抗兔 IgG /HRP（1: 2000 稀释） ， 室温反应 1 h，用 PBS 缓冲液洗涤后进行 ECL 化学发光显色后曝光于 X 光胶片 （图 1B-C） 。
6. 依据用抗 E7 血清 （图 1B） 和正兔血清 （图 1C） 印迹结果， 排除正兔血清也能识 别的 P13， 确定 HPV58 型 E7 蛋白上存在 P1-P8 和 P15 共九个线性 BCE 肽。
实施例 2 ：人乳头瘤病毒 58 型 （HPV58） E7 蛋白 P15 表位肽最小基序鉴定 材料和方法 ： 见实施例 1 相应部分。
P15 表位肽最小基序鉴定的具体步骤如下 ： 1. 依据实施例 1 中 E7 蛋白抗原表位扫描定位结果， 以 E7-8 表位肽 P15 为例实施其最 小基序鉴定。设计跨越 P15 表位肽的 14 肽序列相互重叠 7 个氨基酸残基的系列 8 肽编码 DNA 正负链片段 （正链 5’ - 端加 5’ -gatcc,3’ - 端加 taag-3’ ； 负链 5’ - 端加 5’ -tcgactta， 3’ - 端加 g-3’ ） ， 外送 DNA 合成。在鉴定出 P60-P66 系列 8 肽中唯一印迹阳性 P66 肽后， 设 计合成从其 N 端起逐一删除 1 个残基的短肽 （3-7 肽， 编号 P67-P71） 编码 DNA 正负链片段。
2-4 操作步骤同实施例 1 中的 2-4 步骤。
5．印迹膜用 PBS 缓冲液反复洗涤四次， 用 5％脱脂奶粉封闭过夜， PBS 缓冲液洗涤四次， 分别在 8 ～ 10 ml 反应液中加入 30 ml 一抗兔抗人重组 E7 血清 (1:200 稀释 )， 室 温反应 2 h， PBS 缓冲液洗涤后加入 5 ml 二抗羊抗人 IgG /HRP（1: 2000 稀释） ， 室温反应 1 h，用 PBS 缓冲液洗涤后进行 ECL 化学发光显色 （图 2A） 。
6. 依据 4 个印迹阳性连续片段 （P66 ～ P69） 共有残基序列 （图 2B, Lane 7-10） ， 确定其表位最小基序为 SCAQQ。
尽管本发明描述了 HPV58/E7 致癌性蛋白共 8 个抗原表位最小基序， 以及可单独和 / 或组合用含最小基序的 8 肽或 8 肽融合蛋白研制治疗性 HPV58 多表位疫苗， 或可单独和 / 或组合用作检测人 HPV58 型感染的抗原肽 （或化学合成或融合表达） ， 但有一点对于相关领 域研究技术人员来说是显而易见的， 即在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 可对本发 明的表位肽基序和扩展的含最小基序 8 肽融合蛋白作各种变化改动。因此， 所附权利要求 覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。