猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法.pdf

猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 蛋白的表达及检测方法
    一 . 技术领域
     本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 蛋白的表达和 ELISA 抗体检测方法的建立 属于生物技术高科技领域， 专用于检测猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染情况和猪群 中弱毒疫苗免疫后的抗体变化情况。 二、 背景技术
     国内外有关 PRRS 血清抗体的诊断方法有免疫过氧化物酶单层试验 (IPMA)、 间接 荧光抗体试验 (IFA)、 血清中和试验 (SN)、 酶联免疫吸附试验 (ELISA)、 乳胶凝集实验 (LAT) [8， 9] 等 。 其中以 ELISA 因具有高度的敏感性和特异性， 适用于大规模的检测， 方便易行， 操作 过程及结果判定易于标准化应用等优点应用最为广泛。
     到目前为止， PRRSV 抗体检测的 ELISA 方法均以综合处理的结构蛋白或全病毒作 为包被抗原。2009 年， Elizabeth Brown 等 [10] 试验以非结构蛋白作为包被抗原检测 I 型和 II 型 PRRSV 抗体。研究发现 NSP1、 NSP2 和 NSP7 具有较好的免疫原性， 并研究了针对不同非 结构蛋白的抗体产生规律， 建立了以重组非结构蛋白 NSP1、 NSP2、 NSP4、 NSP7 和 NSP8 作为 包被抗原的间接 ELISA 检测方法。其中 NSP7 抗体在感染后 14 天可以检测到并持续至 202 天以后， 与 IDEXX 抗体消长曲线类似。I 型和 II 型 NSP7 抗体检测结果与 IDEXX HerdChek PRRS 2XR ELISA 的符合率分别为 98.3％和 99.3％。从而证明 PRRSV 非结构蛋白 NSP7 在抗 体检测中也有较好的应用前景。 三、 发明内容
     技术问题本发明的目的是用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 蛋白 进行表达， 然后对表达蛋白进行纯化后建立 ELISA 检测方法。
     技术方案本发明的实施方案如下 ：
     猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 蛋白的表达和 ELISA 检测方法的建立， 其特征在 于， 用原核系统表达的 NSP7 蛋白具有表达量高， 经亲和层析纯化后纯度高， 完全可以作为 包被抗原建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的 ELISA 方法。用表达蛋白建立的 ELISA 方法与其他 ELISA 方法进行比较， 具有高度的敏感性和特异性， 具有发展为商品化试剂盒 的前景。
     猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 蛋白的表达和 ELISA 检测方法的建， 是通过以下方 法构建而成的 ：
     1.1NSP7 基因的扩增、 克隆和鉴定
     设计两对引物，
     上游引物 P 1 ： CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，
     下游引物 P2 ： TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA ；
     分别引入 Not I 和 BamH I 酶切位点， 以 PRRSV 的 cDNA 产物为模板进行 PCR 扩 增， 获得 NSP7 蛋白目的基因条带， 将扩增的目的条带克隆如 pET-28a 载体， 获得重组质粒pET-28a-NSP7 ；
     1.2NSP7 蛋白的表达和纯化将重组质粒 pET-28a-NSP7 转化入大肠杆菌 BL21 中， 涂 布氨苄青霉素抗性培养皿， 37℃过夜培养 ； 挑取单个菌落接种 3 毫升 LB 培养基， 37℃过夜振 荡培养 ； 第二天取 1％的过夜培养物接种新鲜 LB 培养基， 当细菌浓度 OD600 达到 0.4 ～ 0.6 时， 按终浓度 1.5mmol/L IPTG 和诱导 4h 诱导表达基因工程重组菌 500ml， 离心收集菌体， 诱 导后的细菌按每 100mL 菌液加入 5mL PBS 重悬菌体沉淀， 经超声裂解后， 按按照 Invitrogen 公司 Ni-NTA 试剂盒说明书进行亲和层析纯化， 收获蛋白。
     用所述 NSP7 蛋白建立的 ELISA 方法， 包括 ：
     1) 用权利要求 1 所述的重组 NSP7 蛋白包被 ELISA 板， 2％ BSA 封闭 ；
     2) 对待检血清用 PBS 进行 1 ∶ 100 稀释后， 每孔加入稀释后的待检血清 100 微升， 37℃作用 1 小时， PBST 洗涤 5 次 ；
     2) 对酶标二抗用 PBS 进行 1 ∶ 20000 稀释后， 每孔加入 100 微升稀释的酶标二抗， 37℃作用 0.5 小时， PBST 洗涤 5 次 ；
     3) 加入底物 TMB 进行显色， 37℃显色作用 10 分钟， 然后用 50 微升 2M 的硫酸终止 ；
     4) 于 450nm 波长测定 OD 值， 经统计学分析， 得到 OD450 平均值 X 和标准差 SD ； 5) 结果判定血清样品 S/P ≥ X+3SD 者判为阳性， S/P ≤ X+2SD 者判为阴性， 介于两 者判为可疑， S 待检样品的 OD 值， P 阳性对照的 OD 值。
     有益效果
     本发明在国内首次提出了用原核系统表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构蛋 白， 对该非结构蛋白进行纯化后建立检测针对 NSP7 蛋白抗体。用该表达蛋白建立的检测方 法， 可以区分猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗和野毒的感染。同时由于猪体内针对非结构蛋 白的抗体产生较早， 因此可以用来进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的早期诊断。
     试验证明， 本发明应用原核表达系统构建的 ELISA 试剂盒具有很好的敏感性和特 异性。该 ELISA 方法与猪瘟、 猪口蹄疫、 猪脑心肌炎、 猪伪狂犬 (PRV) 和猪 2 型圆环病毒阳 性血清反应呈阴性， 说明此方法特异性良好。批内和批间试验结果变异系数均值分别为 5.84％和 6.21％， 表明本方法具有较好的特异性和重复性。 应用本方法对 30 份血清样品进 行检测， 该方法检测结果与 IDEXX 和韩国 JENO 公司的 VDPro 试剂盒符合率分别为为 93.3％ 和 90％。表明本实验建立的间接 ELISA 方法具有较高的敏感性， 适于大规模检测 PRRSV 血 清抗体的流行病学调查。
     四、 附图说明
     图 1NSP7 基因扩增结果
     泳道 1 ： DNA 分子量标准 D2000 ； 泳道 2 ： NSP7 基因的 PCR 扩增
     图 2 重组质粒 pET-28a-NSP7 的双酶切鉴定
     泳道 1 ： DNA 分子量标准 1Kb ladder ； 泳道 2 ： pET-28a-NSP7 的 NotI 和 BamHI 酶切
     图 3 表达产物的 SDS-PAGE 分析
     泳道 1 ： pET-28a-NSP7/BL21 的 IPTG 诱导结果
     泳道 2 ： 低分子量蛋白标准品
     图 4 纯化的重组蛋白 SDS-PAGE 分析泳道 1-6 ： 洗脱缓冲液中纯化的重组蛋白的不同组分 图 5 重组 NSP7 的 Westernblot 鉴定 A 泳道 1 ： 含 pET-28a-NSP7 重组质粒的细菌 ； 泳道 2 ： 含 pET-28a 空载体的细菌 图 6 重组 NSP7 的 Western blot 鉴定 B 泳道 1 ： 含 pET-28a-NSP7 重组质粒的细菌 ； 泳道 2 ： 含 pET-28a 空载体的细菌五、 具体实施方式 ：
     1.2PRRSV NSP7 全长基因的 PCR 扩增及 pET-28a-NSP7 质粒的构建
     1.2.1 引物的设计
     根 据 GenBank 收 录 的 PRRSV SY0608 株 NSP7 基 因 序 列 (GenBank 登 录 号 EU144079) 并 参 考 文 献 报 道， 设 计 两 对 引 物， 引物序列如下： 上 游 引 物 P1 ： CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC， 下 游 引 物 P2 ： TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA， 分别引 入 Not I 和 BamHI 酶切位点 ( 下划线部分 )。
     1.2.2 目的基因的扩增
     以 PRRSV cDNA 产物作为 PCR 模板扩增 PRRSV NSP7 的全基因。PCR 体系为模板 2.0μL， 25mM Mg2+1.5μL， 2.5mM dNTP 2μL， 10×PCR Buffer 2.5μL， 引物 P3 和 P4( 均为 10pmol/μL) 各 1μL， Taq DNA 聚合酶 (5U/μL)0.2μL， 最后用灭菌双蒸水补至 25μL。 PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 2min ； 94℃ 45s， 52℃ 45s， 72℃ 45s， 共进行 34 个循环 ； 最后 72℃ 延伸 10min。PCR 产物经凝胶电泳后切胶回收纯化。
     1.2.3PCR 产物与原核表达载体的酶切处理
     酶 切 反 应 体 系 为 20μL。PCR 回 收 产 物 10μL， 10×H buffer 2μL， 0.1 ％ BSA 2μL， 0.1％ Triton-X-1002μL， Not I 0.5μL， 补充无菌双蒸水至反应总体系 20μL， 37℃ 水浴 3h。载体酶切体系为 pET-28a 10μL， 10×H buffer 2μL， 0.1 ％ BSA 2μL， 0.1 ％ TritonX-1002μL， Not I0.5μL， 补充无菌双蒸水至总体积 20μL。对 PCR 产物和载体进行 Not I 酶切后经凝胶电泳后切胶回收， 对回收的 PCR 产物和载体建立 BamH I 酶切体系， 体系 如下 ： 酶切回收产物 10μL， 10×K buffer 2μL， BamH I 0.5μL， 用无菌双蒸水补充总体积 至 20μL， 37℃水浴 3h。凝胶电泳后回收 PCR 产物和载体。
     1.2.4 酶切产物的回收与纯化
     取回收的 PCR 产物和载体建立连接反应体系， 反应总体系 10μL。反应体系如下 ： NSP7 基因 7.5μL， pET-28a 1μL， T4DNA 连接 0.5μL， 10×T4DNA 连接酶 Buffer1μL， 16℃ 连接过夜。
     1.2.5 转化感受态大肠杆菌 DH5α
     感受态大肠杆菌 DH5α( 购自 NEB 公司 ) 的制备以及连接产物的转化。连接产物 涂布于含 50μg/mL 卡那霉素的抗性平板上， 37℃温箱中培养 16-24h。
     1.2.6 碱裂解法提取质粒 DNA
     接种于含 50.0μg/mL 的卡那霉素的 LB 试管中过夜培养， 应用常规的碱裂解法 提取质粒。取 1.5mL 菌液， 12000rpm 离心 30s， 沉淀菌体 ； 完全弃去上清后加入 300.0μL 4 ℃预冷的溶液 I(50mmol/L 葡萄糖 ； 25.0mmol/L Tris-Cl， pH8.0 ； 10.0mmol/L EDTA) 重 悬细菌 ； 加入新配制的溶液 II 300.0μL(0.2mol/LNaOH ； 1.0 ％ SDS)， 快速颠倒离心管 5次， 室温作用 5min ； 加入 225.0μL 用冰预冷的溶液 III(5.0mol/L 乙酸钾 60.0mL， 冰乙酸 11.5mL， 水 28.5mL)， 盖紧管口， 将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块， 置冰上 5min ； 4℃ 12000rpm 离心 5min， 将上清移至新的离心管中 ； 加入等体积的酚∶氯仿 (1 ∶ 1)， 颠倒 混匀后置室温 5min， 12000rpm 离心 5min ； 取上清到新的离心管， 加入 0.8 倍体积的异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min ； 12000rpm 离心 10min， 弃上清， 用 70％乙醇洗涤沉淀一次， 干燥， 加入 30μL 的 TE(pH8.0) 或双蒸水溶解 ； 加入 1μLRNaseA(10mg/mL)， 37℃作用 30min( 此 步可在酚∶氯仿抽提之前完成 ) ； 1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
     1.2.7 重组质粒的酶切鉴定
     利用 Not I/BamH I 酶切位点将 PRRSV NSP7 基因片段插入到表达载体 pET-28a 中， 通过双酶切鉴定有无插入片段及插入片段大小。 酶切反应体系如下 ： Buffer3μL， 疑似阳性 质粒 4μL， BamH I 1μL， Not I 1μL， 用双蒸水补充总体积至 20μL。酶切反应在 0.5ml 的 Eppendorf 管中进行， 37℃水浴 3h， 其中 Buffer 为 0.1％ BSA 和 10×KBuffer 体积比 1 ∶ 1 混合而成。酶切结束后 1％琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统下观察并拍照记录。
     1.2.8PRRSV NSP7 基因的序列测定
     经双酶切鉴定为阳性的重组质粒 pET-28a-NSP7， 将其转化新鲜制备的感受态大肠 杆菌 DH5α， 涂布含有卡那霉素的 LB 抗性平板， 37℃过夜培养至出现单菌落， 挑取单菌落接 种含有卡那霉素的 LB 液体培养基， 37℃过夜振摇培养后送交上海英骏有限公司进行测序。 1.3 融合蛋白的表达， 纯化及抗原性鉴定
     1.3.1 大肠杆菌 BL-21 感受态细胞的制备和转化
     在 LB 平 板 上 挑 取 BL-21 的 单 个 菌 落 接 种 于 3.0mL LB 液 体 培 养 基 中， 200rpm 过夜振荡培养 ； 次日按 2 ％的体积接种于新的 LB 培养基中， 200rpm 震荡培养 3 ～ 4h 至 OD600 ≈ 0.3 ～ 0.5 ； 将细菌转移至 1.5mL 的灭菌离心管中， 每管 1.0mL， 冰上孵育 30min ； 4℃ 12000rpm 离心 30s ； 完全弃去上清， 用 1.0mL 0.1mol/L 冰冷的 CaCl2 重悬细菌， 冰上孵 育 10min ； 4℃ 12000rpm 离心 30s ； 完全弃上清， 用 100μL 0.1mol/L 冰冷的 CaCl2 重悬细菌， 放置 4℃冰箱 24h 内备用。取阳性重组质粒 1.0μL 加入到 100.0μL 新鲜制备的大肠杆菌 感受态细胞中， 轻轻混匀， 冰上孵育 30min ； 然后置 42℃水浴中热休克 90s， 迅速置冰中冷却 1 ～ 2min ； 每管加入室温 LB 培养基 800.0μL， 37℃ 200rpm 震荡培养 45min ； 12000rpm 离心 30s 沉淀细菌， 弃去大部分上清， 残留约 100.0μL 上清重悬菌体， 然后涂布于 50.0μg/mL 氨 苄青霉素抗性平板上， 37℃培养 16 ～ 24h。
     1.3.2 重组蛋白表达条件的优化
     分别挑取含质粒 pET-28a-NSP7 和 pET-28a 的散在单菌落接种于含有卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37℃过夜振摇培养。
     (1) 取过夜培养的菌液 10μL 接种于 3mL 含有卡那霉素 (50μg/ml) 的 LB 液体 培养基中， 37 ℃ 200rpm 振荡培养 3h 左右， 使 OD600 达到 0.6 ～ 1.0， 取 100μL 样品于无菌 Eppendorf 管中作为诱导前对照 ；
     (2) 向上述菌液中加入终浓度为 1.5mmol/L 的 IPTG 进行重组蛋白的诱导表达， 并 在加入 IPTG 后第 1、 2、 3、 4、 5h 分别取样 100μL ；
     (3)4℃ 8000rpm 离心 5min 收集诱导表达的细菌， PBS(pH 7.2) 重悬， 如此反复洗 涤2次；
     (4) 完全弃上清， 用适量 PBS 重悬细菌沉淀 ；
     (5) 将菌液反复冻融 3 次 ；
     (6) 超声波裂解细菌 ： 功率选用 200W， 在冰盒上操作， 超声裂解 5s， 停顿 10s， 直至 菌液变得清澈 ；
     (7)4℃ 8000rpm 离心 10min， 分别收集上清与沉淀 ： 将沉淀用与上清等体积的 PBS 重悬， 上清与沉淀悬浮液各取 100μL 备用。
     1.3.3SDS-PAGE 电泳分析
     取 沉 淀 和 上 清 用 等 量 2× 上 样 缓 冲 液 重 悬 每 个 沉 淀， 煮 沸 5min， 然后进行 SDS-PAGE 电泳。
     1.3.4 重组蛋白的大量表达
     按终浓度 1.5mmol/L IPTG 和诱导 4h 诱导表达基因工程重组菌 500ml， 离心收集菌 体， 按每 100mL 菌液加入 5mL PBS 重悬菌体沉淀， -20℃保存备用。
     1.3.5 重组蛋白的亲和层析纯化
     按照 Invitrogen 公司 Ni-NTA 试剂盒操作说明进行。
     1.3.6 重组蛋白的 Western blot 鉴定 将 SDS-PAGE 胶上的蛋白质条带转印到 NC 膜上， 然后进行 Western-blot 鉴定。半 干转印 30min， 取下 NC 膜， 丽春红染色 2min， 10％脱脂乳封闭 3-4h， 多克隆血清作用 2h， 用 PBST 洗涤三次， 10min/ 次 ； 羊抗鼠 IgG-HRP 二抗作用 1h， 用 PBST 洗涤三次， 10min/ 次， 将显 色液 A、 B 等体积混合， 铺满印有蛋白的一面， 用保鲜膜包好 NC 膜， 蛋白面紧贴 X 光片， 置暗 盒中曝光 30s， 取出后依次显影、 洗涤、 定影。最后用清水冲洗胶片， 晾干保存。
     1.4 间接 ELISA 试验最佳条件的选择
     1.4.1 重组 pET28a-NSP7 蛋白最佳包被浓度和抗体最佳稀释度的确定
     采用棋盘法测定， 以 pH9.6 的磷酸盐缓冲液将抗原纯化后的重组 pET28a-NSP7 蛋白分别稀释至终浓度为 0.5， 1.0， 2.0， 4.0， 6.0 和 8.0μg/ml， 37 ℃作用 2h 包被。然后 用含 0.05 ％吐温 80 的 0.05moL/LPBS( 简称 PBST， pH 为 7.2) 洗 5min×3 次。加入含 1 ％ 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 的 PBST， 200μL/ 孔， 37 ℃ 2h 封 闭， 洗 涤 后 加 入 1 ∶ 100、 1 ∶ 200、 1 ∶ 400、 1 ∶ 800 稀释的 PRRSV 标准阳性血清和标准阳性血清， 100μL/ 孔， 37℃ 1h， 洗涤后 加入 1 ∶ 20000 稀释的酶标抗体 HRP-SPA， 100μL/ 孔， 37℃ 1h， 洗涤后加入 TMB 底物溶液， 100μL/ 孔， 37℃ 10min。加入 2M 的 H2SO450μL/ 孔终止反应， 于酶标仪 OD450 读数， 每个稀 释度重复一次， 取其平均值。以阳性血清 OD 值达到并接近 1.0， P/N 值较大的所在孔的抗原 浓度和血清稀释度作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。
     1.4.2 封闭液的选择
     以最适抗原浓度 37℃ 2h 包被酶标板， 洗涤后， 分别用含 1％ BSA、 5％脱脂乳和 2％ 明胶的 PBST 200μL/ 孔 37℃封闭 2h， 阳性血清按 1 ∶ 100 进行稀释， 进行 ELISA 测定， 比 较各组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选择合适的封闭液。
     1.4.3 封闭时间的选择
     以最适抗原浓度 37℃ 2h 包被酶标板， 洗涤后， 用合适的封闭液 200μL/ 孔， 分成 3 组， 分别为 37℃封闭 1h， 37℃ 2h， 37℃ 3h。封闭后， 阳性血清按本章 1.4.1 确定稀释倍数， 进行 ELISA 测定， 其它步骤同本章 1.4.1。比较各组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选择
     合适的封闭时间。
     1.4.4 待检血清作用时间的选择
     酶标板按选择的条件包被、 封闭后， 加入待检血清， 37 ℃分别作用 0.5、 1、 1.5 和 2h， 进行 ELISA 测定， 其它步骤同本章 1.4.3。比较各组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选 择合适的血清作用时间。
     1.4.5 酶标抗体工作浓度的选择
     待检血清按本章 1.4.4 确定的时间作用后， 将酶标抗体分 1 ∶ 5000、 1 ∶ 10000、 1 ∶ 15000 和 1 ∶ 20000 稀释， 100μL/ 孔， 其它步骤同本章 1.4.4， 进行 ELISA 测定， 比较各 组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选择合适的酶标抗体工作浓度。
     1.4.6 酶标抗体作用时间的选择
     将酶标抗体按确定好的稀释倍数加入酶标板后， 37℃分别作用 0.5， 1 和 1.5h， 其 他步骤同本章 1.4.5， 进行 ELISA 测定， 比较各组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选择合适 的酶标抗体作用时间。
     1.4.7 底物最佳显色时间的选择
     酶标抗体按确定好的时间作用、 洗涤、 加入底物后， 37℃分别作用 5、 10 和 15min， 用 2M H2SO450μL/ 孔终止后读数， 比较各组阴、 阳性血清的 OD 值和 P/N 值， 以选择合适的底 物显色时间。
     1.4.8 临界值确定
     取 50 份 PRRSV 阴性猪血清 1 ∶ 100 稀释， 加入到酶标条上， 37℃作用 1 小时， PBST 洗涤 5 次 ； 每孔加入 100 微升 1 ∶ 20000 稀释的二抗， 37℃作用 0.5 小时， PBST 洗涤 5 次 ； 加入 100 微升底物 TMB 进行显色， 37℃显色作用 10 分钟， 然后用 2M 的硫酸终止 ； 450nm 波 长测定 OD 值。这些血清数据经统计学分析， 得到 OD450 平均值 X 和标准 SD。根据统计学原 理， 样品 S/P 值≥ X+3SD 者判为阳性， S/P 值≤ X+2SD 者判为阴性， 介于两者之间者判为可 疑。
     1.5 特异性试验
     分别取猪瘟病毒 ( 张长龙严宝英等， 2009)、 口蹄疫病毒 ( 张长龙严宝英等， 2009)、 圆环病毒 ( 邓位喜、 高洪等， 2007) 和脑心肌炎病毒 (EMCV)( 韩研妍、 李玉峰等， 2007) 阳性 血清， 按 1 ∶ 100 稀释后应用 NSP7 建立的间接 ELISA 方法进行测定， 同时设立标准阴、 阳性 血清对照。
     1.6 与商品化 ELISA 试剂盒检测符合率
     取 30 份临床血清， 应用本发明建立的 ELISA 方法检测， 同时与商品化 IDEXX 试剂 盒和韩国 JENO 公司的 VDPro 试剂盒检测结果进行比较。分析比较三种检测结果的差异。
     猪繁殖与呼吸综合征病毒 NSP7 表达蛋白 ELISA 方法的建立。应用表达的 NSP7 蛋 白建立的 ELISA 方法具有很好的敏感性和特异性， 该抗原与猪瘟病毒 ( 张长龙严宝英等， 2009)、 口蹄疫病毒 ( 张长龙严宝英等， 2009)、 圆环病毒 ( 邓位喜、 高洪等， 2007) 和脑心肌炎 病毒 (EMCV)( 韩研妍、 李玉峰等， 2007) 阳性血清反应呈阴性， 说明此方法特异性良好。批 内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为 5.84％和 6.21％， 表明本方法具有较好的 特异性和重复性。应用本方法对 30 份血清样品进行检测， 该方法检测结果与 IDEXX 和韩国 JENO 公司的 VDPro 试剂盒符合率分别为为 93.3％和 90％。8101948515 A CN 101948517序列 序列表表1/1 页