猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法.pdf

1、10申请公布号CN101948515A43申请公布日20110119CN101948515ACN101948515A21申请号201010278518322申请日20100910C07K14/08200601C12N15/40200601C12N15/63200601G01N33/569200601G01N33/54320060171申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市卫岗1号72发明人刘婷婷李玉峰姜平74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人张素卿54发明名称猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法57摘要本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表

2、达和ELISA抗体的检测方法，属于高新生物技术领域。以纯化的PRRSV重组NSP7蛋白作为包被抗原，通过一系列反应条件优化，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬PRV和猪2型圆环病毒阳性血清反应呈阴性，该方法特异性良好，具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPRO试剂盒符合率分别为为933和90。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血清抗体的流行病学调查。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明

3、书6页序列表1页附图2页CN101948517A1/1页21猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7重组蛋白，是通过以下方法表达获得的11NSP7基因的扩增、克隆和鉴定设计两对引物，上游引物P1CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，下游引物P2TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；分别引入NOTI和BAMHI酶切位点，以PRRSV的CDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆至PET28A载体，获得重组质粒PET28ANSP7；12NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒PET28ANSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素

4、抗性培养皿，37过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37过夜振荡培养；第二天取1的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0406时，加入终浓度15MMOL/LIPTG，诱导4H诱导表达基因工程重组菌500ML，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100ML菌液加入5MLPBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照INVITROGEN公司NINTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获NSP7重组蛋白。2用权利要求1所述NSP7蛋白建立的ELISA检测方法，包括1用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2牛血清白蛋白BSA封闭；2对待检血清用PBS进行1100稀释后，每孔加

5、入稀释后的待检血清100微升，37作用1小时，PBST洗涤5次；2对酶标二抗用PBS进行120000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗，37作用05小时，PBST洗涤5次；3加入底物TMB进行显色，37显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；4于450NM波长测定OD值，经统计学分析，得到OD450平均值X和标准差SD；5结果判定血清样品S/PX3SD者判为阳性，S/PX2SD者判为阴性，介于两者判为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。权利要求书CN101948515ACN101948517A1/6页3猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法一技术领域0001

6、本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体检测方法的建立属于生物技术高科技领域，专用于检测猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染情况和猪群中弱毒疫苗免疫后的抗体变化情况。二、背景技术0002国内外有关PRRS血清抗体的诊断方法有免疫过氧化物酶单层试验IPMA、间接荧光抗体试验IFA、血清中和试验SN、酶联免疫吸附试验ELISA、乳胶凝集实验LAT等8，9。其中以ELISA因具有高度的敏感性和特异性，适用于大规模的检测，方便易行，操作过程及结果判定易于标准化应用等优点应用最为广泛。0003到目前为止，PRRSV抗体检测的ELISA方法均以综合处理的结构蛋白或全病毒作为包被抗原。2

7、009年，ELIZABETHBROWN等10试验以非结构蛋白作为包被抗原检测I型和II型PRRSV抗体。研究发现NSP1、NSP2和NSP7具有较好的免疫原性，并研究了针对不同非结构蛋白的抗体产生规律，建立了以重组非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8作为包被抗原的间接ELISA检测方法。其中NSP7抗体在感染后14天可以检测到并持续至202天以后，与IDEXX抗体消长曲线类似。I型和II型NSP7抗体检测结果与IDEXXHERDCHEKPRRS2XRELISA的符合率分别为983和993。从而证明PRRSV非结构蛋白NSP7在抗体检测中也有较好的应用前景。三、发明内容00

8、04技术问题本发明的目的是用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白进行表达，然后对表达蛋白进行纯化后建立ELISA检测方法。0005技术方案本发明的实施方案如下0006猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建立，其特征在于，用原核系统表达的NSP7蛋白具有表达量高，经亲和层析纯化后纯度高，完全可以作为包被抗原建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA方法。用表达蛋白建立的ELISA方法与其他ELISA方法进行比较，具有高度的敏感性和特异性，具有发展为商品化试剂盒的前景。0007猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建，是通过以下方法

9、构建而成的000811NSP7基因的扩增、克隆和鉴定0009设计两对引物，0010上游引物P1CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，0011下游引物P2TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；0012分别引入NOTI和BAMHI酶切位点，以PRRSV的CDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆如PET28A载体，获得重组质粒说明书CN101948515ACN101948517A2/6页4PET28ANSP7；001312NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒PET28ANSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗

10、性培养皿，37过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37过夜振荡培养；第二天取1的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0406时，按终浓度15MMOL/LIPTG和诱导4H诱导表达基因工程重组菌500ML，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100ML菌液加入5MLPBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照INVITROGEN公司NINTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获蛋白。0014用所述NSP7蛋白建立的ELISA方法，包括00151用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2BSA封闭；00162对待检血清用PBS进行1100稀释后，每孔加入稀释后的待检血清1

11、00微升，37作用1小时，PBST洗涤5次；00172对酶标二抗用PBS进行120000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗，37作用05小时，PBST洗涤5次；00183加入底物TMB进行显色，37显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；00194于450NM波长测定OD值，经统计学分析，得到OD450平均值X和标准差SD；00205结果判定血清样品S/PX3SD者判为阳性，S/PX2SD者判为阴性，介于两者判为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。0021有益效果0022本发明在国内首次提出了用原核系统表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构蛋白，对该非结构蛋白进行纯化后建立

12、检测针对NSP7蛋白抗体。用该表达蛋白建立的检测方法，可以区分猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗和野毒的感染。同时由于猪体内针对非结构蛋白的抗体产生较早，因此可以用来进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的早期诊断。0023试验证明，本发明应用原核表达系统构建的ELISA试剂盒具有很好的敏感性和特异性。该ELISA方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬PRV和猪2型圆环病毒阳性血清反应呈阴性，说明此方法特异性良好。批内和批间试验结果变异系数均值分别为584和621，表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，该方法检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPRO试剂盒符合率分

13、别为为933和90。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血清抗体的流行病学调查。四、附图说明0024图1NSP7基因扩增结果0025泳道1DNA分子量标准D2000；泳道2NSP7基因的PCR扩增0026图2重组质粒PET28ANSP7的双酶切鉴定0027泳道1DNA分子量标准1KBLADDER；泳道2PET28ANSP7的NOTI和BAMHI酶切0028图3表达产物的SDSPAGE分析0029泳道1PET28ANSP7/BL21的IPTG诱导结果0030泳道2低分子量蛋白标准品0031图4纯化的重组蛋白SDSPAGE分析说明书CN101948515AC

14、N101948517A3/6页50032泳道16洗脱缓冲液中纯化的重组蛋白的不同组分0033图5重组NSP7的WESTERNBLOT鉴定A0034泳道1含PET28ANSP7重组质粒的细菌；泳道2含PET28A空载体的细菌0035图6重组NSP7的WESTERNBLOT鉴定B0036泳道1含PET28ANSP7重组质粒的细菌；泳道2含PET28A空载体的细菌五、具体实施方式003712PRRSVNSP7全长基因的PCR扩增及PET28ANSP7质粒的构建0038121引物的设计0039根据GENBANK收录的PRRSVSY0608株NSP7基因序列GENBANK登录号EU144079并参考文献

15、报道，设计两对引物，引物序列如下上游引物P1CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，下游引物P2TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA，分别引入NOTI和BAMHI酶切位点下划线部分。0040122目的基因的扩增0041以PRRSVCDNA产物作为PCR模板扩增PRRSVNSP7的全基因。PCR体系为模板20L，25MMMG215L，25MMDNTP2L，10PCRBUFFER25L，引物P3和P4均为10PMOL/L各1L，TAQDNA聚合酶5U/L02L，最后用灭菌双蒸水补至25L。PCR反应条件为94预变性2MIN；9445S，5245S，7245S，

16、共进行34个循环；最后72延伸10MIN。PCR产物经凝胶电泳后切胶回收纯化。0042123PCR产物与原核表达载体的酶切处理0043酶切反应体系为20L。PCR回收产物10L，10HBUFFER2L，01BSA2L，01TRITONX1002L，NOTI05L，补充无菌双蒸水至反应总体系20L，37水浴3H。载体酶切体系为PET28A10L，10HBUFFER2L，01BSA2L，01TRITONX1002L，NOTI05L，补充无菌双蒸水至总体积20L。对PCR产物和载体进行NOTI酶切后经凝胶电泳后切胶回收，对回收的PCR产物和载体建立BAMHI酶切体系，体系如下酶切回收产物10L，10

17、KBUFFER2L，BAMHI05L，用无菌双蒸水补充总体积至20L，37水浴3H。凝胶电泳后回收PCR产物和载体。0044124酶切产物的回收与纯化0045取回收的PCR产物和载体建立连接反应体系，反应总体系10L。反应体系如下NSP7基因75L，PET28A1L，T4DNA连接05L，10T4DNA连接酶BUFFER1L，16连接过夜。0046125转化感受态大肠杆菌DH50047感受态大肠杆菌DH5购自NEB公司的制备以及连接产物的转化。连接产物涂布于含50G/ML卡那霉素的抗性平板上，37温箱中培养1624H。0048126碱裂解法提取质粒DNA0049接种于含500G/ML的卡那霉素

18、的LB试管中过夜培养，应用常规的碱裂解法提取质粒。取15ML菌液，12000RPM离心30S，沉淀菌体；完全弃去上清后加入3000L4预冷的溶液I50MMOL/L葡萄糖；250MMOL/LTRISCL，PH80；100MMOL/LEDTA重悬细菌；加入新配制的溶液II3000L02MOL/LNAOH；10SDS，快速颠倒离心管5说明书CN101948515ACN101948517A4/6页6次，室温作用5MIN；加入2250L用冰预冷的溶液III50MOL/L乙酸钾600ML，冰乙酸115ML，水285ML，盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，置冰上5MIN；412000RPM离

19、心5MIN，将上清移至新的离心管中；加入等体积的酚氯仿11，颠倒混匀后置室温5MIN，12000RPM离心5MIN；取上清到新的离心管，加入08倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN；12000RPM离心10MIN，弃上清，用70乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加入30L的TEPH80或双蒸水溶解；加入1LRNASEA10MG/ML，37作用30MIN此步可在酚氯仿抽提之前完成；1的琼脂糖凝胶电泳分析。0050127重组质粒的酶切鉴定0051利用NOTI/BAMHI酶切位点将PRRSVNSP7基因片段插入到表达载体PET28A中，通过双酶切鉴定有无插入片段及插入片段大小。酶切反应体系如下BUFF

20、ER3L，疑似阳性质粒4L，BAMHI1L，NOTI1L，用双蒸水补充总体积至20L。酶切反应在05ML的EPPENDORF管中进行，37水浴3H，其中BUFFER为01BSA和10KBUFFER体积比11混合而成。酶切结束后1琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。0052128PRRSVNSP7基因的序列测定0053经双酶切鉴定为阳性的重组质粒PET28ANSP7，将其转化新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5，涂布含有卡那霉素的LB抗性平板，37过夜培养至出现单菌落，挑取单菌落接种含有卡那霉素的LB液体培养基，37过夜振摇培养后送交上海英骏有限公司进行测序。005413融合蛋白的表达，纯化

21、及抗原性鉴定0055131大肠杆菌BL21感受态细胞的制备和转化0056在LB平板上挑取BL21的单个菌落接种于30MLLB液体培养基中，200RPM过夜振荡培养；次日按2的体积接种于新的LB培养基中，200RPM震荡培养34H至OD6000305；将细菌转移至15ML的灭菌离心管中，每管10ML，冰上孵育30MIN；412000RPM离心30S；完全弃去上清，用10ML01MOL/L冰冷的CACL2重悬细菌，冰上孵育10MIN；412000RPM离心30S；完全弃上清，用100L01MOL/L冰冷的CACL2重悬细菌，放置4冰箱24H内备用。取阳性重组质粒10L加入到1000L新鲜制备的大肠

22、杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30MIN；然后置42水浴中热休克90S，迅速置冰中冷却12MIN；每管加入室温LB培养基8000L，37200RPM震荡培养45MIN；12000RPM离心30S沉淀细菌，弃去大部分上清，残留约1000L上清重悬菌体，然后涂布于500G/ML氨苄青霉素抗性平板上，37培养1624H。0057132重组蛋白表达条件的优化0058分别挑取含质粒PET28ANSP7和PET28A的散在单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37过夜振摇培养。00591取过夜培养的菌液10L接种于3ML含有卡那霉素50G/ML的LB液体培养基中，37200RPM振荡培养3H左

23、右，使OD600达到0610，取100L样品于无菌EPPENDORF管中作为诱导前对照；00602向上述菌液中加入终浓度为15MMOL/L的IPTG进行重组蛋白的诱导表达，并在加入IPTG后第1、2、3、4、5H分别取样100L；0061348000RPM离心5MIN收集诱导表达的细菌，PBSPH72重悬，如此反复洗涤2次；说明书CN101948515ACN101948517A5/6页700624完全弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀；00635将菌液反复冻融3次；00646超声波裂解细菌功率选用200W，在冰盒上操作，超声裂解5S，停顿10S，直至菌液变得清澈；0065748000RPM离心1

24、0MIN，分别收集上清与沉淀将沉淀用与上清等体积的PBS重悬，上清与沉淀悬浮液各取100L备用。0066133SDSPAGE电泳分析0067取沉淀和上清用等量2上样缓冲液重悬每个沉淀，煮沸5MIN，然后进行SDSPAGE电泳。0068134重组蛋白的大量表达0069按终浓度15MMOL/LIPTG和诱导4H诱导表达基因工程重组菌500ML，离心收集菌体，按每100ML菌液加入5MLPBS重悬菌体沉淀，20保存备用。0070135重组蛋白的亲和层析纯化0071按照INVITROGEN公司NINTA试剂盒操作说明进行。0072136重组蛋白的WESTERNBLOT鉴定0073将SDSPAGE胶上的

25、蛋白质条带转印到NC膜上，然后进行WESTERNBLOT鉴定。半干转印30MIN，取下NC膜，丽春红染色2MIN，10脱脂乳封闭34H，多克隆血清作用2H，用PBST洗涤三次，10MIN/次；羊抗鼠IGGHRP二抗作用1H，用PBST洗涤三次，10MIN/次，将显色液A、B等体积混合，铺满印有蛋白的一面，用保鲜膜包好NC膜，蛋白面紧贴X光片，置暗盒中曝光30S，取出后依次显影、洗涤、定影。最后用清水冲洗胶片，晾干保存。007414间接ELISA试验最佳条件的选择0075141重组PET28ANSP7蛋白最佳包被浓度和抗体最佳稀释度的确定0076采用棋盘法测定，以PH96的磷酸盐缓冲液将抗原纯化

26、后的重组PET28ANSP7蛋白分别稀释至终浓度为05，10，20，40，60和80G/ML，37作用2H包被。然后用含005吐温80的005MOL/LPBS简称PBST，PH为72洗5MIN3次。加入含1牛血清白蛋白BSA的PBST，200L/孔，372H封闭，洗涤后加入1100、1200、1400、1800稀释的PRRSV标准阳性血清和标准阳性血清，100L/孔，371H，洗涤后加入120000稀释的酶标抗体HRPSPA，100L/孔，371H，洗涤后加入TMB底物溶液，100L/孔，3710MIN。加入2M的H2SO450L/孔终止反应，于酶标仪OD450读数，每个稀释度重复一次，取其平

27、均值。以阳性血清OD值达到并接近10，P/N值较大的所在孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。0077142封闭液的选择0078以最适抗原浓度372H包被酶标板，洗涤后，分别用含1BSA、5脱脂乳和2明胶的PBST200L/孔37封闭2H，阳性血清按1100进行稀释，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的封闭液。0079143封闭时间的选择0080以最适抗原浓度372H包被酶标板，洗涤后，用合适的封闭液200L/孔，分成3组，分别为37封闭1H，372H，373H。封闭后，阳性血清按本章141确定稀释倍数，进行ELISA测定，其它步骤同本章

28、141。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择说明书CN101948515ACN101948517A6/6页8合适的封闭时间。0081144待检血清作用时间的选择0082酶标板按选择的条件包被、封闭后，加入待检血清，37分别作用05、1、15和2H，进行ELISA测定，其它步骤同本章143。比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的血清作用时间。0083145酶标抗体工作浓度的选择0084待检血清按本章144确定的时间作用后，将酶标抗体分15000、110000、115000和120000稀释，100L/孔，其它步骤同本章144，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD

29、值和P/N值，以选择合适的酶标抗体工作浓度。0085146酶标抗体作用时间的选择0086将酶标抗体按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37分别作用05，1和15H，其他步骤同本章145，进行ELISA测定，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的酶标抗体作用时间。0087147底物最佳显色时间的选择0088酶标抗体按确定好的时间作用、洗涤、加入底物后，37分别作用5、10和15MIN，用2MH2SO450L/孔终止后读数，比较各组阴、阳性血清的OD值和P/N值，以选择合适的底物显色时间。0089148临界值确定0090取50份PRRSV阴性猪血清1100稀释，加入到酶标条上，37作用1

30、小时，PBST洗涤5次；每孔加入100微升120000稀释的二抗，37作用05小时，PBST洗涤5次；加入100微升底物TMB进行显色，37显色作用10分钟，然后用2M的硫酸终止；450NM波长测定OD值。这些血清数据经统计学分析，得到OD450平均值X和标准SD。根据统计学原理，样品S/P值X3SD者判为阳性，S/P值X2SD者判为阴性，介于两者之间者判为可疑。009115特异性试验0092分别取猪瘟病毒张长龙严宝英等，2009、口蹄疫病毒张长龙严宝英等，2009、圆环病毒邓位喜、高洪等，2007和脑心肌炎病毒EMCV韩研妍、李玉峰等，2007阳性血清，按1100稀释后应用NSP7建立的间接

31、ELISA方法进行测定，同时设立标准阴、阳性血清对照。009316与商品化ELISA试剂盒检测符合率0094取30份临床血清，应用本发明建立的ELISA方法检测，同时与商品化IDEXX试剂盒和韩国JENO公司的VDPRO试剂盒检测结果进行比较。分析比较三种检测结果的差异。0095猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7表达蛋白ELISA方法的建立。应用表达的NSP7蛋白建立的ELISA方法具有很好的敏感性和特异性，该抗原与猪瘟病毒张长龙严宝英等，2009、口蹄疫病毒张长龙严宝英等，2009、圆环病毒邓位喜、高洪等，2007和脑心肌炎病毒EMCV韩研妍、李玉峰等，2007阳性血清反应呈阴性，说明此方法特异性良好。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为584和621，表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，该方法检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPRO试剂盒符合率分别为为933和90。说明书CN101948515ACN101948517A1/1页9序列表序列表CN101948515ACN101948517A1/2页10图1图2图3图4图5说明书附图CN101948515ACN101948517A2/2页11图6说明书附图CN101948515A