发明内容
本发明的目的是以熊果酸为先导化合物，合成具有抗癌活性的熊果酸哌嗪类衍生物。
本发明的熊果酸哌嗪类衍生物为N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所示：
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I。
制备方法如下：
（1） 熊果酸与醋酸酐反应，生成3-O-乙酰基熊果酸；3-O-乙酰基熊果酸的结构式如式II所示；
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II。
（2）3-O-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与1-羟乙基乙氧基哌嗪反应得N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所示。
所述制备方法具体步骤如下：
（1）1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中，滴加入2-3重量份的醋酸酐，加入0.001-0.02重量份的DMAP，室温下搅拌16-18 h，反应结束后，用2 N HCl调节pH 3-4，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得白色粉末状的3-O-乙酰基熊果酸；
（2）1重量份3-O-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2Cl2中，逐滴加入1-2重量份的草酰氯，室温下搅拌反应36-48h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-O-乙酰基UA酰氯中间体的粗品，直接进入下一步反应；在上述中间体的粗品中加入20-30重量份的CH2Cl2，三乙胺调节溶液pH 8-9，加入2-3重量份的1-羟乙基乙氧基哌嗪，室温下搅拌反应3-5h，反应结束后，反应液中加5-10重量份的水，以2N HCl调节pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为中性，干燥；干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得白色粉末状N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪。
此外，N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪还可与NaOH发生水解反应，进一步生成衍生物，结构式如式IV所示：
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IV。
具体步骤如下：
称取1重量份的N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，溶于20-30重量份的CH3OH-THF（1：1.5 v：v）中，加入1-1.5重量份的4N NaOH，室温下搅拌反应3.5-4h，反应完全，向混合物中加入5-10重量份的水，2 N HCl调pH 3-4，减压蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得衍生物IV。
根据上述方法可以制得一系列熊果酸哌嗪类衍生物，制备方法如下，具体步骤同上：
（1）熊果酸与醋酸酐反应，生成3-O-乙酰基熊果酸；
（2）3-O-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与N-2-羟乙基哌嗪反应得衍生物Ⅴ。
（3）衍生物Ⅴ与NaOH发生水解反应，进一步生成衍生物Ⅵ。
其中所述衍生物Ⅴ、Ⅵ结构式如下：
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Ⅴ
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Ⅵ。
上述所合成的一系列熊果酸哌嗪类衍生物可用于抗肿瘤药物的制备。
本发明的优点在于，本发明对天然产物熊果酸进行结构改造，得到N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪（I）及其系列哌嗪类化合物（IV、V、VI），体外细胞增殖抑制实验表明，化合物I、IV和V对所测肿瘤细胞株HepG2、BGC823、SH-SY5Y、Hela的增殖抑制作用优于熊果酸，而对人胚肺成纤维细胞HELF的毒性作用则低于熊果酸。其中化合物Ｉ的效果最好。
具体实施例
以下为本发明的具体实施例子以及对比实施例可以进一步清楚地了解本发明，但是它们不是对本发明的限定：
实施例1
3-O乙酰基熊果酸（化合物II）的制备：
称取0.7062 g 熊果酸，加入30 ml吡啶，搅拌溶解后滴加入1.8 ml醋酸酐，加入少量的DMAP，室温下搅拌16 h，反应结束后，用2 N HCl调pH 3-4，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至中性，常压100℃干燥，干燥后的产物干法上样，柱层析纯化（石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯=3:1），无水乙醇热溶，冷却重结晶，得3-O乙酰基熊果酸。
性状：白色粉末；产率：86.17%；mp：286-288℃。
IR数据（KBr，cm-1）及其归属：υ：3293（O-H伸缩振动），2927(C-H伸缩振动)，1736（s，C=O伸缩振动），1370（UA A区特征吸收），1245 (s，C-O-C不对称伸缩振动) cm-1。
ESI-MS：m/z 497.5 [M-H]+，521.5[M+Na] +。
1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：5.23（t，1H，H-12，J=2.8Hz），4.49（t，1H，H-3，J=7.2Hz），2.17（d，1H，H-18，J=10.8Hz），2.04（s，3 H，CH3COO），1.06（s，3 H，CH3），0.97（s，3H, CH3），0.94（s，3 H，CH3），0.92（s，3H，CH3），0.82（d, 3 H，CH3，J=6.4Hz），0.78（s，3 H，CH3），0.76（s，3 H，CH3）。
实施例2
N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪（化合物I）的制备：
称取0.2837 g 3-O乙酰基熊果酸溶解于20 ml CH2Cl2中，分批次、逐滴加入草酰氯0.53 ml，室温下搅拌反应36 h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-O-乙酰基UA酰氯中间体的粗品，直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20 ml CH2Cl2，三乙胺调节溶液pH 8-9，加入1-羟乙基乙氧基哌嗪0.5703g，室温下搅拌反应4 h，反应结束后，反应液中加入10 ml蒸馏水，以2N HCl调pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为中性，干燥。柱层析纯化（氯仿:丙酮=3:1），无水乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪。
性状：白色粉末；产率：37.87%；mp：105-107℃。
IR数据(KBr，cm-1)及其归属：υ：3446（O-H伸缩振动），2945（C-H伸缩振动），1734（s，C=O伸缩振动），1633（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1370（UA A区特征吸收），1246（C-O-C不对称伸缩振动）cm-1。
LC-MS：m/z 656.1[M+H]+，677.6[M+Na] +。
1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：5.21（s，1H，H-12），4.48 (t，1H，J =4.0Hz，H-3)，3.71~3.61（m，8H，4×CH2），2.58（t，2H，J=5.2Hz，-N(CH2)2），2.48（br，4H，-N(CH2CH2)2），2.04（s, 3 H, CH3CO），1.06（s，3H，CH3），0.93（d, 3 H，CH3，J=6.0Hz），0.86~0.84（m, 9H，3×CH3），0.84（s, 3 H, CH3），0.73（s, 3 H, CH3）。
实施例3
N-[3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪（化合物VI）的制备：
称取I 0.3128g，溶于20ml CH3OH-THF（1：1.5 v：v）中，加入2.0ml 4N NaOH，室温下搅拌反应3.5 h，反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HCl调pH 3-4，减压蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化（氯仿:丙酮=1:1），乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪（VI）。
性状：白色粉末；产率：87.26%；mp：111-113℃。
IR数据(KBr，cm-1)及其归属：υ：3414（O-H伸缩振动），2925（C-H伸缩振动），1616（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1376（UA A区特征吸收）,1227（UA B区特征吸收）,cm-1。
LC-MS：m/z 613.6[M+H]+，635.6[M+Na] +。
1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：5.21（s，1H，H-12），3.71（t，2H，J=4.4Hz，CH2CH2OH），3.71~3.61（m，8H，4×CH2），2.58（t，4H，J=5.2Hz，-N(CH2)2），2.49（br，4H，-N(CH2CH2)2），1.05（s，3H，CH3），0.94~0.93（m，6 H，2×CH3），0.88~0.85（m, 9H，3×CH3），0.76（s, 3 H, CH3）。
实施例4
N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪（Ⅴ）的制备：
称取0.5014 g I溶解于20 ml CH2Cl2中，分批次、逐滴加入草酰氯0.61 ml，室温下搅拌反应36 h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-O-乙酰基UA酰氯中间体的粗品，直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20 ml CH2Cl2，三乙胺调节溶液pH 8-9，加入N-2-羟乙基哌嗪0.19g，室温下搅拌反应3 h，反应结束后，反应液中加入10 ml蒸馏水，以2N HCl调pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为中性，干燥。柱层析纯化（氯仿:丙酮=3:1），乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪（V）。
性状：白色粉末；收率：46.81%；mp：196-198℃。
IR数据（KBr，cm-1）及其归属：υ：3417（O-H伸缩振动），2943（C-H伸缩振动），1724（s，C=O伸缩振动），1595（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1368（UA A区特征吸收），1251（C-O-C不对称伸缩振动）cm-1。
LC-MS：m/z 611.6[M+H]+，633.6[M+Na] +。
1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：5.22（s，1H，H-12），4.48 (t，1H，J =6.0Hz，H-3)，3.63（t，2H，J=5.2Hz，CH2OH），3.22（t，1H，J=3.2Hz，H-3），2.55（t，2H，J=5.2Hz，-N(CH2)2），2.47（br，4H，-N(CH2CH2)2），2.04（s, 3 H, CH3CO），1.07（s，3 H，CH3），0.95（s，3H, CH3），0.93（d, 3 H，J=6.4Hz，CH3），0.91（s, 3H, CH3），0.86（d, 3H，J=6.4Hz，CH3），0.85（s, 3 H, CH3），0.75（s, 3 H, CH3）。
实施例5
衍生物（Ⅵ）的制备：
称取V 0.6128g，溶于25ml CH3OH-THF（1：1.5 v：v）中，加入4.0ml 4N NaOH，室温下搅拌反应4 h，反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HCl调pH3-4，减压蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化（氯仿:丙酮=1:1），乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[3β-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基) 哌嗪（Ⅵ）。
性状：白色粉末；产率：81.38%；mp：208-210℃。
IR数据（KBr，cm-1）及其归属：υ：3380（O-H伸缩振动），2926（C-H伸缩振动），1635（s，C=O伸缩振动，酰胺Ⅰ峰），1368（UA A区特征吸收）cm-1。
LC-MS：：m/z 570.0[M+H]+，591.5[M+Na] +。
1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：5.22（s，1H，H-12），3.63（t，2H，J=6.0Hz，CH2OH），3.22（t，1H，J=3.2Hz，H-3），2.55（t，2H，J=5.2Hz，-N(CH2)2），2.47（br，4H，-N(CH2CH2)2），2.17（t，1H，J=3.6Hz ，H-18），1.07（s，3H，CH3），0.98（s，3H，CH3），0.94（d, 3 H，CH3，J=6.0Hz），0.91（s，3H，CH3），0.87（d, 3 H，CH3，J=6.4Hz），0.77（s，3H，CH3），0.75（s，3H，CH3）。
实施例6
熊果酸（UA，Ⅲ）及其衍生物（化合物I、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ）的体外抗癌活性--MTT法检测药物对细胞的增殖抑制作用
(1)取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成5×104个/ml的细胞悬液。
(2)细胞悬液移入96孔板，每孔100ul，周围一圈用PBS填充，置37℃, 5% CO2培养箱中培养24 h。
(3)移去旧培养基，加入受试衍生物（用培养基将受试衍生物存储液稀释，设定不同作用浓度），每孔100ul，另设空白对照组、UA对照组（UA 60umol/L或20umol/L）和紫杉醇对照组（60 umol/L或20umol/L），每组设6个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100ul，再加入MTT溶液10ul，继续孵育4 h，终止培养。
(4)小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150ul DMSO，振荡10 min，于490 nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算细胞的增殖抑制率：抑制率（%）=（1-用药组平均OD值÷空白对照组平均OD值）×100%，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（IC50），结果见表1。
表1 熊果酸哌嗪类衍生物对不同肿瘤细胞的增值抑制作用
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IC50结果显示，所合成的UA哌嗪类衍生物对不同的肿瘤细胞均具有一定的增殖抑制作用，化合物I、Ⅳ、Ⅴ的抑制作用要优于UA，而且它对正常细胞的毒副作用略低于UA，说明化合物I、Ⅳ、Ⅴ具有较好的抗癌活性潜力，可作为抗癌候选药物进行进一步的研究。