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本发明的特征在于包含中间链球菌溶素(ILY)蛋白结构域4的肽及其片段，以及这些肽在使癌细胞对基于抗体的抗癌治疗敏感化中的用途。CD59受体活性与对治疗性抗体降低的敏感性有关。期望地，ILY结构域4多肽的给予足以抑制CD59受体活性，同时避免与全长ILY有关的一般毒性。

1.  一种基本上纯的多肽，包含ILY结构域4多肽。

2.  根据权利要求1所述的基本上纯的多肽，其中，所述ILY结构域4多肽包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列、或其片段，其中，所述片段具有ILY结构域4活性。

3.  根据权利要求2所述的基本上纯的多肽，其中，所述片段的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸。

4.  根据权利要求2所述的基本上纯的多肽，其中，所述片段的长度为少于531、500、400、300、200、100、50、40、30、20、或10个氨基酸。

5.  根据权利要求1-4中任一项所述的基本上纯的多肽，其中，所述基本上纯的多肽是融合蛋白。

6.  根据权利要求1所述的基本上纯的多肽，其中，所述ILY结构域4多肽包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列。

7.  一种药物组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的基本上纯的多肽以及治疗性抗体。

8.  根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述治疗性抗体选自由利妥昔单抗、MT201、17-1A、赫赛汀、阿仑单抗、lym-1、贝伐单抗、西妥昔单抗、以及IL-2受体α-定向单克隆抗体组成的组。

9.  一种用于在需要其的患者体内治疗增生性疾病的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-6中任一项所述的基本上纯的ILY结构域4多肽和治疗性抗体，其中，所述ILY结构域4多肽和所述治疗性抗体是同时、或在彼此的14天内给予的，给予的量一起足以治疗所述增生性疾病。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中，所述治疗性抗体选自由利妥昔单抗、MT201、17-1A、赫赛汀、阿仑单抗、lym-1、贝伐单抗、西妥昔单抗、以及IL-2受体α-定向单克隆抗体组成的组。

11.  根据权利要求10所述的方法，其中，所述ILY结构域4多肽和所述治疗性抗体同时给予。

12.  根据权利要求11所述的方法，其中，所述ILY结构域4多肽和所述治疗性抗体一起配制。

13.  根据权利要求9所述的方法，其中，所述ILY结构域4多肽包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列、或其片段，其中，所述片段具有ILY结构域4活性。

14.  根据权利要求9所述的方法，其中，所述增生性疾病的特征在于表达CD59的赘生细胞。

用于治疗增生性疾病的方法和组合物
技术领域
本发明涉及增生性疾病的治疗。
背景技术
癌症是一种疾病，其特点在于异常细胞的无节制生长。癌细胞已克服了在正常细胞(其具有有限的寿命)中施加的对无限生长的屏障。随着癌细胞的生长持续进行，遗传改变可以持续存在直到癌细胞已将其自身显现为追随更具攻击性的生长表型。如果不加以治疗，则通过淋巴系统或血流，可能接着发生转移，即癌细胞扩散到身体的更远区域，破坏健康的组织。
CD59是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的膜蛋白，其在一些癌细胞中过表达。通过结合于补体蛋白C8和C9以及防止C9并入和聚合，CD59活性抑制补体的膜攻击复合物(MAC)的形成。补体是一种用于抗体介导的癌细胞溶解的主要介质。CD59的上调节和高表达被认为是对抗体介导的肿瘤治疗的抗性，包括对用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的抗CD20嵌合MAb利妥昔单抗(rituximab)的抗性的主要原因之一。
中间链球菌溶素(streptococcus intermedius intermedilysin，ILY)是一种胆固醇依赖性细胞溶素，其由中间链球菌(SI)分泌，长期被怀疑在传染病的发病机制中起重要作用。SI，一种革兰氏阳性菌，可以在口腔和内部器官中，尤其是在大脑和肝脏中引起化脓性感染。在大脑和肝脏中由于SI的感染可以导致脓肿。ILY属于胆固醇依赖性细胞溶素家族，作为由肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)分泌的肺炎球菌溶血素，并且仅对人红细胞而不对其他动物红细胞显示特异性溶血活性。
发明内容
在一个方面，本发明的特征在于一种基本上纯的多肽，其包括ILY结构域4多肽。
在另一个方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包括基本上纯的ILY结构域4多肽和治疗性抗体。
在另一个方面，本发明的特征在于一种用于在需要其的患者(例如人)体内治疗增生性疾病(例如，特征在于表达CD59的赘生细胞的增生性疾病)的方法，其中通过给予该患者基本上纯的ILY结构域4多肽和治疗性抗体。可以同时给予ILY结构域4多肽和治疗性抗体、或彼此在14天内给予，所给予的量一起足以治疗增生性疾病。在这个方面，可以一起或分开地配制ILY结构域4多肽和治疗性抗体。
在上述的任何方面，基本上纯的ILY结构域4多肽可以包括选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列、或其片段。在这个方面，片段的长度可以是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个、或更多的氨基酸。片段的长度可以少于531、500、400、300、200、100、50、40、30、20、10个、或更少的氨基酸。
在上述的任何方面，治疗性抗体可以是，例如，利妥昔单抗、MT201、17-1A、赫赛汀(herceptin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、lym-1、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、或针对IL-2受体α的单克隆抗体。
“患者”是指任何哺乳动物，例如，人、小鼠、猪、马、狗、猫或大鼠。
“中间链球菌溶素(intermedilysin)”或“ILY”是指一种多肽，其具有中间链球菌溶素多肽的活性。ILY可以纯化自中间链球菌，或可以重组地产生。对应于ILY的核酸序列的示例性Genbank登录号是AB029317，以及对应于ILY的多肽序列的示例性Genbank登录号是BAE16324。ILY还指一种多肽，其与ILY多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的百分比序列同一性。另外和可替换地，ILY被定义为由在高严格条件下杂交于ILY的核酸的核酸编码的多肽。ILY可以分离自任何中间链球菌菌株(例如，菌株1208-1、UNS35、UNS46、以及ATCC27335)。
“ILY多肽的结构域4”或“ILY结构域4多肽”是指一种蛋白质，该蛋白质包含具有ILY结构域4多肽的活性的ILY片段。该定义特别排除了Genbank登录号为BAE16324的全长ILY蛋白。这个术语用来包括这样的蛋白质，其包含肽序列GALTLNHDGAFVARFYVYWEELGHDADGYETIRSRSWSGNGYNRGAHYSTTLRFKGNVRNIRVKVLGATGLAWEPWRLIYSKNDLPLVPQRNISTWGTTLHPQFEDKVVKDNTD(SEQ ID NO：1)或RNIRVKVLGATGLAWEPWRLIYSKNDLPLVPQRNISTWGTTLHPQFEDKVVKDNTD(SEQ ID NO：2)、或具有ILY结构域4活性的片段。ILY结构域4多肽还指与SEQ ID NO：1或2具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的百分比序列同一性的多肽。另外和可替换地，ILY结构域4多肽被定义为由在高严格条件下杂交于ILY结构域4多肽的核酸的核酸编码的多肽。这些术语还用来包括在ILY结构域4多肽中的氨基酸残基的任何保守取代。术语“保守取代”是指氨基酸残基被化学上类似的残基替换，例如，疏水残基用另外的疏水残基替换、带电残基用另外的带电残基替换等。用于非极性R基团的保守取代的实例是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、以及色氨酸。用于极性但不带电R基团的取代的实例是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、或谷氨酰胺。用于带负电R基团的取代的实例是天门冬氨酸或谷氨酸。用于带正电R基团的取代的实例是赖氨酸、精氨酸、或组氨酸。此外，术语ILY结构域4多肽包括用非天然氨基酸进行的保守取代。该术语明确地排除全长ILY。
“片段”是指多肽的一部分，其包含，优选地，全长参比多肽(reference polypeptide)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多。片段可以包含至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、或114个氨基酸或更多。
“ILY结构域4活性”是指拮抗人CD59但在本文描述的溶解测定中并不直接引起人红血细胞(RBC)的显著溶解的肽的活性。
“拮抗人CD59”是指降低人CD59与补体蛋白C8和C9的结合，导致增加的补体的膜攻击复合物(MAC)的形成。
如本文描述的，“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指多于两个的天然或非天然氨基酸的任何链，不考虑翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)，其构成全部或部分的天然产生或非天然产生的多肽或肽。
如在本文中所使用的，天然氨基酸是具有L-构型的天然α-氨基酸，如通常在天然蛋白质中出现的那些。非天然氨基酸是指这样的氨基酸，其通常并不在蛋白质中出现，例如，具有L构型的天然α-氨基酸的差向异构体，也就是具有非天然D-构型的氨基酸、或其(D，L)-同分异构体混合物；或这样的氨基酸的同系物，例如，β-氨基酸、α，β-氨基酸、α，α-二取代氨基酸、或其中氨基酸侧链被缩短一个或两个亚甲基基团或被加长至多达10个碳原子的α-氨基酸，如在直链中具有5至10个(包括10个)碳原子的α-氨基链烷酸，未取代或取代的芳族(α-芳基或α-芳基低级烷基)，例如，取代的苯丙氨酸或苯甘氨酸。
如在本文中所使用的，“本发明的肽”是指线性化合物，其包括ILY结构域4多肽的氨基酸序列并且仅包含通过肽键连接并为未受保护形式的天然氨基酸。
本发明还提供了本发明的肽的衍生物。这样的衍生物可以是线性或环形的，并且包括具有非天然氨基酸的肽。本发明的衍生物还包括这样的分子，其中，通过取代、化学、酶促或其他适当方式，本发明的肽被另一种原子或部分(包括另一种肽或蛋白质)非共价或优选共价地修饰。对于如上所述的本发明的肽来说，上述的部分可以是“外来的”，因为它是非天然氨基酸，或因为一个或多个天然氨基酸被另一个天然或非天然氨基酸替换。本发明还涵盖这样的轭合物(或结合物)，其包含共价连接于另一种肽或蛋白质的本发明的肽或衍生物。另一个部分的连接可以涉及连接物(或连接子，linker)或间隔物(或间隔子，spacer)，例如，氨基酸或肽连接物。本发明的衍生物还包括这样的肽，其中一个、一些、或所有潜在的反应活性基团(例如，氨基、羧基、巯基、或羟基基团)为受保护的形式。
衍生本发明的肽的原子或部分可以用于分析目的，例如，便于本发明的肽的检测，有利于肽的制备或纯化，或改善与本发明的目的有关的肽的性能。这样的性能包括结合于人CD59或适用于体内给予的适合性，尤其是相对于酶降解的可溶性或稳定性。本发明的衍生物包括本发明的肽与另一个化学部分的共价或聚集轭合物(aggregative conjugate)、显示和本发明的非衍生肽基本上相同活性的衍生物、以及“拟肽类小分子”，其被仿照设计以类似本发明的氨基酸中任一个的三维结构。这样的模拟物的实例是逆反肽(retro-inverso peptide)(Chorev et al.，Acc.Chem.Res.26：266-273，1993)。已知药物活性化合物的模拟物的设计，对于基于“先导”化合物的药物设计是一种已知的方式。这可能是所期望的，例如，在“初始”活性化合物难以合成或合成昂贵的情况下，或在它不适合于特定给予模式的情况下，例如，对于口服组合物，肽被认为是不合适的活性剂，因为它们倾向于被消化道中的蛋白酶快速降解。
在上述一般定义内的衍生物的另外的实例包括：
(I)环肽或衍生物，包括具有二硫桥、硫醚桥、或内酰胺的化合物。通常，包含二硫键的环状衍生物将包含两个半胱氨酸，其可以是L-半胱氨酸或D-半胱氨酸。有利地，N端氨基酸和C端氨基酸均为半胱氨酸。在这样的衍生物中，作为半胱氨酸的替代方式，可以使用青霉胺(β，β-二甲基-半胱氨酸)。含硫醚桥的肽是可获得的，例如，从这样的起始化合物，其在一端具有游离半胱氨酸残基并在另一端具有含溴结构单元(例如，溴-乙酸)。可以通过半胱氨酸侧链的选择性脱保护在固相上实施环化。环状内酰胺可以形成在，例如，谷氨酸的γ-羧基基团和赖氨酸的-ε氨基基团之间。作为谷氨酸的一种替代，可以使用天门冬氨酸。作为赖氨酸的一种替代，可以采用鸟氨酸或二氨基丁酸。而且，可以在C端的天门冬氨酸或谷氨酸的侧链和N端氨基酸的α-氨基基团之间形成内酰胺。这种方式可以扩展到β-氨基酸(例如，β-丙氨酸)。可替换地，可以用侧链氮原子之间的烯基链(alkenedyl chain)来束缚(或限制)在N端或C端的谷氨酰胺残基(Phelan et al.，J.Amer.Chem.Soc.119：455-460，1997)。
(II)本发明的肽，其通过取代被修饰。在一个实施例中，用另一个天然或非天然氨基酸，例如，用相应的D-类似物或模拟物，替换一个或多个，优选一个或两个氨基酸。例如，在含Phe或Tyr的肽中，Phe或Tyr可以用另一个结构单元(building block)，例如，另一个蛋白氨基酸(proteinogenic amino acid)、或结构相关类似物替换。特定的修饰是使得保持肽中的构象。例如，一个氨基酸可以用α，α-二取代氨基酸残基(例如，α-氨基异丁酸、1-氨基-环丙烷-1-羧酸、1-氨基-环戊烷-1-羧酸、1-氨基-环己烷-1-羧酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、以及1-氨基-环庚烷-1-羧酸)替换。
(III)用酶、荧光标记、化学发光标记、金属螯合物、顺磁性颗粒、生物素等可检测地标记的本发明的肽。在这样的衍生物中，本发明的肽，直接或通过间隔物或连接物基团，例如，(肽的)亲水间隔物，结合于轭合伴侣(或结合伴侣，conjugation partner)。有利地，肽连接于N或C端氨基酸。例如，经由丝氨酸残基或四聚体Ser-Gly-Ser-Gly，生物素可以连接于本发明的肽的N端。
(IV)在潜在反应活性侧基处携带一个或多个保护基团，如氨基保护基团如乙酰基、或羧基保护基团的本发明的肽。例如，本发明的化合物的C端羧基基团可以以羧酰胺(carboxamide)官能团的形式存在。适宜的保护基团在本技术领域中是公知的。可以引入这样的基团，例如，用于增强化合物相对于蛋白降解的稳定性。
本发明的肽的“衍生物”还指这样一种化合物，其包含肽或通常不是肽的一部分的另外的化学部分的修饰。可以通过使肽的靶向氨基酸残基与有机衍生剂(其能够与所选的侧链或末端残基进行反应)发生反应而将修饰引入分子中。以下描述衍生方法。
半胱氨酰基残基最通常与α-卤代乙酸酯(以及相应的胺)进行反应，如氯乙酸或氯乙酰胺，获得羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。半胱氨酰基残基还可以通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸酯(盐)、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应来进行衍生。
组氨酰基残基通常通过在pH 5.5-7.0下与二乙基焦碳酸酯反应进行衍生，因为这种试剂对于组氨酰基侧链是相对特异的。对溴苯酰甲基溴也是有用的；所述反应优选在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。
使赖氨酰基(lysinyl)和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行的衍生具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。用于衍生含α-氨基的残基的其他适宜试剂包括亚氨基酯如皮考啉基亚氨基甲酯(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲(O-methylissurea)；2，4-戊二酮；以及转氨酶催化的与乙醛酸酯(盐)的反应。
通过与一种或若干种常规试剂的反应来修饰精氨酰基残基，其中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮、以及茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应，这是由于胍官能团的高pK_a。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基基团进行反应。
通过与碳二亚胺(R’--N--C--N--R’)如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺的反应来选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。还可以通过与铵离子的反应，将天冬氨酰基和谷氨酰基残基转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常被脱去酰氨基，形成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可替换地，这些残基在弱酸性条件下被脱去酰氨基。这些残基的任一种形式均在本发明的范围内。
可以将多肽或其衍生物融合或连接于另一种蛋白质或肽，例如，作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合多肽。其他常用的融合多肽包括但不限于麦芽糖-结合蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白A、聚组氨酸、以及纤维素-结合蛋白。
肽的“拟肽类小分子”是指这样的小分子，其呈现和肽本身基本上相同的ILY结构域4活性。
“基本上纯的多肽”是指这样的多肽或肽，其已与天然伴随它的成分分离。通常，当多肽按重量计为至少60％没有其天然相关的蛋白质和天然有机分子时，则该多肽是基本上纯的。优选地，多肽是按重量计为至少75％、更优选至少90％、以及最优选至少99％纯的ILY结构域4多肽。可以例如通过提取自天然来源(例如，成纤维细胞、神经元细胞、或淋巴细胞)、通过表达编码ILY结构域4多肽的重组核酸、或通过化学合成多肽，而获得基本上纯的ILY结构域4多肽。可以通过任何适当的方法来测量纯度，例如，通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析。
当蛋白质从那些在其自然状态下伴随它的污染物分离时，该蛋白质基本上没有天然相关成分。因此，化学合成或在不同于蛋白质天然起源细胞的细胞系统中产生的蛋白质将基本上没有其天然相关成分。因此，基本上纯的多肽包括那些来源于真核细胞生物但在大肠杆菌或其他原核生物中合成的多肽。
可以容易地通过已知方法来计算两个核酸或多肽序列的“百分比序列同一性”，包括但不限于那些在Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，Academic Press，1987；Sequence Analysis  Primer，Gribskov，andDevereux，eds.，M.Stockton Press，New York，1991；以及Carillo andLipman，SIAM J.Applied Math.48：1073，1988中所描述的方法。
在可公开获得的计算机程序中可获得确定同一性的方法。确定在两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux et al.，Nucleic Acids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN、以及FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403，1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一性。可以从NCBI和其他来源公开获得BLAST程序(BLAST Manual，Altschul，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894)。可以在URL进行搜索，如：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/unfinishedgenome.html；或http://www.tigr.org/cgi-bin/BlastSearch/blast.cgi。通过将同源性程度分配给各种取代、缺失、以及其他修饰，这些软件程序对类似序列进行匹配。保守取代通常包括在以下基团中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
“杂交”是指在各种严格条件下形成包含互补配对核苷碱基序列、或其部分的双链复合物。(参见，例如，Wahl.and Berger，MethodsEnzymol.152：399(1987)；Kimmel，Methods Enzymol.152：507(1987))
“在高严格条件下杂交”是指在严格盐浓度、严格温度的条件下，或在有甲酰胺存在的条件下。例如，严格盐浓度通常是小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，并且最优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。可以在没有有机溶剂(例如，甲酰胺)存在的情况下获得低严格杂交，而在有至少约35％甲酰胺、并且最优选至少约50％甲酰胺存在的情况下则可以获得高严格杂交。严格温度条件通常包括至少约30℃的温度，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃。变化另外的参数，如杂交时间、洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及包括或不包括载体DNA，是本领域技术人员熟知的。根据需要，通过组合这些不同条件而实现各种水平的严格性。在一种优选实施方式中，在30℃下在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠、以及1％SDS中进行杂交。在一种更优选的实施方式中，在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺、以及100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中进行杂交。在一种最优选的实施方式中，在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺、以及200μg/ml ssDNA中进行杂交。对于本领域技术人员来说，这些条件的有用变化将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤在严格性方面也会变化。可以通过盐浓度和通过温度来限定洗涤严格性条件。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过增加温度来增加洗涤严格性。例如，用于洗涤步骤的严格盐浓度优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃的温度，更优选至少约42℃，并且最优选至少约68℃。在一种优选实施方式中，在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠、以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。在一种更优选的实施方式中，在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠、以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。在一种最优选的实施方式中，在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠、以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。对于本领域技术人员来说，这些条件的另外的变化将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的并且描述于例如，Benton and Davis(Science 196：180(1977))；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：3961(1975))；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York(2001))；Berger and Kimmel(Guide toMolecular Cloning Techniques，Academic Press，New York，(1987))；以及Sambrook et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。优选地，在生理条件下进行杂交。通常，互补核苷碱基(nucleobases)经由互补核苷碱基之间的氢键结合进行杂交，其中氢键结合可以是Watson-Crick(沃森-克里克)、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键进行配对的互补核苷碱基。
“治疗性抗体”是指配制以治疗增生性疾病的包含抗体或抗体衍生物的药物组合物。
附图说明
图1A是曲线图，其示出了当用ILY处理时红细胞(RBC)的溶解百分比。hCD59RB^+/-小鼠的RBC，但不是野生型(WT)小鼠的RBC，对体外ILY介导的溶解是高度敏感的，其水平相当于人RBC的水平。
图1B是曲线图，其示出了由ILY(45ng ILY/g体重)尾静脉注射导致的在hCD59RBC^+/-中的溶血的诱导。血液收集自小鼠尾静脉并测量血细胞比容值(如先前所描述的)。
图1C是照片，其示出了在收集自5只hCD59RBC^+/-小鼠的样品中的可见溶血，但在收集自5只WT小鼠的样品中则没有。在ILY注射(45ng/g体重)10分钟以后，在细胞比容管中对获自小鼠尾静脉(vein tail)的样品进行处理。
图1D是照片，其示出了在给予ILY(45ng ILY/g体重)5小时和1天以后，在hCD59RBC^+/-小鼠但不是在WT小鼠中的血红蛋白尿。在代谢笼中收集尿(如先前所描述的)。
图2A是曲线图，其示出了ILY介导的溶血百分比。为了评估人血清相对于ILY介导的血清溶血的保护作用，将连续稀释的ILY加入用来自不同物种的1至8倍稀释的血清孵育(如先前所描述的)的人RBC中。
图2B是曲线图，其示出了ILY介导的溶血百分比，作为洗脱部分(洗脱馏分，eluted fraction)与来自ILY柱的流过部分(flow-through)的功能比较(functional comparison)。对洗脱部分(三角形)和来自ILY柱的流过部分(长方形)进行渗析并浓缩至等于来自加载到ILY柱上的人血清(十字形)的量的体积。用于溶血测定的ILY浓度为1.6x10^-9M。该数据表示重复三次的实验。
图2C是蛋白质印迹，其示出了ILY-结合蛋白与人血清的分离。泳道被装载如下：1：0.8μl人血清；2：0.8μl来自装填在ILY-结合柱上的人血清的流过部分；3：10μg来自装填在ILY柱上的人血清的洗脱部分的蛋白质；4：0.8μl小鼠血清；5：0.8μl来自装填在ILY结合柱上的小鼠血清的流过部分；6：10μg来自装填在ILY柱上的小鼠血清的洗脱部分的蛋白质。箭头表示切割用于蛋白质测序的条带。
图2D是表格。其示出了蛋白质测序信息。
图3A是蛋白质印迹，其示出了用G蛋白柱进一步分离ILY-结合人IgG。泳道被装载如下：1：蛋白质标记；2：10μl洗脱自ILY柱的部分；3：20μl在用G蛋白柱进一步纯化以后的洗脱部分；4：20μl来自用G蛋白柱进一步纯化的流过部分。通过渗析和浓缩，使用于泳道2、3、以及4的样品具有相同的体积。泳道2、泳道3、以及泳道4的每个样品的总初始体积是相等的。
图3B是曲线图，其示出了具有人ILY结合IgG的抑制效应的ILY介导的溶血百分比。通过渗析和浓缩，使来自ILY柱的洗脱部分的体积(十字形)、来自用G蛋白柱进一步纯化后的洗脱液的体积(长方形)、以及来自用G蛋白柱进一步纯化后的流过部分的体积(三角形)相等。用于溶血测定的ILY浓度为1.6x10^-9M。该数据表示重复三次的实验。
图3C是曲线图，其示出了在没有小鼠ILY-结合IgG的抑制效应的情况下，ILY介导的溶血百分比。装填在ILY-结合柱上的小鼠和人血清的体积是相等的。通过渗析和浓缩，使来自小鼠血清的洗脱部分(长方形)的总体积、来自小鼠血清(十字形)的流过部分、以及来自人血清(三角形)的洗脱部分相等。ILY浓度为1.6x10^-9M。
图3D是曲线图，其示出了ILY结合至人ILY-结合的Fab区。200ng ILY用来涂布每个孔。
图4A是示意图，其示出了不同的ILY片段。指示了在每个片段中存在的结构域(结构域1-4)。ILY结构域1、2、3以及4由具有不同阴影的正方形表示。
图4B是用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，其示出了利用HIS柱纯化自细菌表达系统的重组ILY。
图5A是柱状图，其示出了利用指定ILY片段处理的细胞的溶解百分比。
图5B是曲线图，其示出了作为指定ILY片段浓度的函数的溶解百分比。在暴露于ILY(1.2x10^-9M)之前，人红细胞在室温下用mILY3和mILY4预孵育30分钟。在没有用ILY片段预孵育的细胞中，该浓度足以诱导100％细胞溶解。
图6是曲线图，其示出了在hCD59RBC转基因小鼠红细胞中作为mILY3浓度的函数的溶血百分比。用不同浓度的mILY3预孵育抗体敏化的ThCD59RBC和野生型RBC并暴露于人补体。在hCD59RBC红细胞中对人补体介导的溶血增加的敏感性与mILY3的浓度相关联。
图7是曲线图，其示出了作为细胞数的函数的荧光强度。阴影曲线表示单独用第二FITC抗体(FITC二抗)染色的RAMOS细胞。白色曲线表示用抗-人CD59抗体和FITC轭合二抗染色的细胞。用指定浓度的利妥昔单抗和10％血清处理细胞。
图8A是柱状图，其示出了在用指定浓度的mILY3和51.2μg利妥昔单抗预孵育的RAMOS细胞中，作为mILY3肽浓度的函数的细胞死亡百分比。
图8B是一系列显微照片，其示出了在包含RAMOS细胞的样品中用台盼蓝染色的细胞，其中RAMOS细胞用指定浓度的mILY3、10g利妥昔单抗、以及10％热灭活胎牛血清加以处理。
具体实施方式
总体地，本发明的特征在于包含中间链球菌溶素(ILY)蛋白的结构域4的肽片段以及这些片段用来使癌细胞对基于抗体的抗癌治疗敏感化的用途。CD59受体活性已与对治疗性抗体降低的敏感性有关。ILY结构域4多肽的给予足以抑制CD59受体活性，同时避免与全长ILY有关的一般毒性。
I.给予方法
根据本发明的治疗可以单独或连同另一种疗法进行，并且可以在家中、医生办公室、诊所、医院门诊部、或医院提供。治疗可选地开始于医院以便医生可以密切观察治疗效果并进行任何需要的调整，或它可以基于门诊病人开始。治疗的持续时间取决于要治疗的疾病或障碍的类型、患者的年龄和状态、患者疾病的阶段和类型、以及患者对治疗的反应。另外，具有形成增生性疾病的更大危险的人可以接受治疗以抑制或延迟症状的发作。
用于各种实施方式的给予途径包括但不限于局部途径、透皮途径、经颅途径、鼻道途径、以及全身性给予(如，静脉内途径、肌内途径、皮下途径、吸入、直肠途径、含服、阴道途径、腹膜内途径、关节内途径、眼途径、耳途径、或口服给予)。如在本文中所使用的，“全身性给予”是指所有给予的非皮肤途径，并且特别排除给予的局部和透皮途径。
剂量
本发明的肽的剂量取决于若干因素，包括：给予方法、要治疗的疾病、疾病的严重性、要治疗还是要预防疾病、以及待治疗者的年龄、体重、以及健康状态。另外，关于特定患者的药物基因组学(基因型对治疗的药物动力学、药效学或功效分布的影响)信息可以影响所使用的剂量。
可以不需要连续每天给予本发明的肽。治疗方案可以需要若干周期，其间不给予药物，或可以在急性炎症期间根据需要提供治疗。
如上所述，本发明的肽可以以片剂、胶囊剂、酏剂或糖浆剂的形式口服给予，或以栓剂的形式直肠给予。还可以以泡沫、洗剂、滴剂、霜剂、软膏剂、软化剂、或凝胶剂的形式局部给予所述肽。可以合适地进行肠胃外给予化合物，例如，以盐水溶液的形式或其中化合物被并入脂质体中的形式。
II.适应症(indications)
本发明的组合物和方法可用于治疗特征在于不期望的人CD59活性的任何疾病，包括以下陈述的那些疾病。
本发明的化合物和方法可用于治疗癌症和特征在于过增生细胞的其他疾病(增生性疾病)。在这些实施方式中，可将ILY结构域4多肽直接给予至表达CD59的瘤形成、或全身地给予至患有瘤形成的主体。优选地，ILY结构域4多肽和抗肿瘤治疗性抗体一起给予。
在一种单独的实施方式中，可以将ILY结构域4多肽给予诊断患有增生性紊乱(其特征不在于CD59的细胞表面表达)的患者。这里，ILY结构域4多肽连同抗肿瘤治疗性抗体一起给予以防止对基于治疗性抗体的治疗的抗性。
可以单独或连同另一种疗法(例如，外科手术、放射疗法、化疗、免疫疗法、抗血管生成疗法、或基因疗法)进行治疗。治疗的持续时间取决于要治疗的疾病或紊乱的类型、患者的年龄和状态、患者疾病的阶段和类型、以及患者对治疗的反应。可以以断断续续的周期(on-and-offcycles)给予治疗，其包括休息期以使患者身体有机会从任何目前不可预见的副作用恢复。期望地，本发明的方法和组合物比其他方法和组合物更有效。“更有效”是指一种方法、组合物、或试剂盒和另一种方法、组合物、或试剂盒相比呈现更大的功效，毒性更小、更安全、更方便、更好耐受、或更便宜、或提供更大的治疗满意度。
癌症包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性原粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病、以及实体瘤如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、以及视网膜母细胞瘤)。
III.抗肿瘤治疗性抗体
本发明特征在于通过连同治疗性抗体给予ILY结构域4多肽来治疗增生性疾病。ILY结构域4多肽的给予使由抗体疗法靶向的细胞对补体介导的细胞溶解敏感。用于本发明的方法的治疗性抗体的实例列在表1中。
表1：应用于癌症治疗的有关抗体

除了以上所列的抗体和适应症外，本发明特征还在于ILY结构域4多肽连同通过抑制人CD59活性而得到增强的任何治疗的共同给予。
IV.实验结果
中间链球菌(SI)是正常人口腔微生物菌群的一部分并且可以引起肝和脑脓肿。SI分泌的ILY特异性地结合和溶解CD59阳性(positive)人细胞。我们的结果表明，人血清，但不是来自任何其他所试验物种的血清，可以中和ILY的溶解功能。我们已鉴定了纯化自人血清的ILY-结合人免疫球蛋白(IgG)，其在体外和体内对ILY介导的溶血呈现功能抑制效应。
利用借助于抗CD59抗体FACS分析和RT-PCR，已在脂肪细胞表面上检测到在蛋白质和mRNA水平的CD59表达。CD59还在精细胞中被高度表达并且已被怀疑在雄性生殖力方面起重要作用。小鼠CD59表达的缺乏导致雄性生殖力的逐渐丧失，这表明CD59在雄性生殖中的作用。
CD59还在各种癌细胞如前列腺癌、乳腺癌、胃腺瘤、肠型胃癌、以及B细胞淋巴瘤中被高度表达。在赘生细胞中CD59的更高表达水平与对某些化疗药物的细胞抗性有关。我们已证实，ILY特异性地结合于人CD59并溶解在细胞表面上表达人CD59的人细胞。我们发现，人类形成特异性免疫力以保护细胞免受ILY介导的细胞溶解。
1.实验模型
我们使用了包含His-标记ILY的质粒来表达并利用His结合纯化试剂盒(His Bind Purification Kit)(Novagen)从细菌纯化重组ILY。为了表明hCD59是人RBC中ILY的仅有受体，我们已用hCD59RBC进行了体外和体内实验。
对于体外研究，我们证实，hCD59在hCD59RBC转基因小鼠的RBC中的表达使得hCD59RBC^+/-mRBC对ILY介导的溶解高度敏感。这种溶解相当于人RBC的ILY介导的溶解的水平(图1A)。WT mRBC对ILY介导的溶解具有抗性。对于体内研究，通过尾静脉注射，我们给予不同剂量的ILY。在ILY的三种不同剂量(95、47、30ng/g体重)的情况下，hCD59RBC转基因小鼠的ILY-诱导细胞死亡百分比分别为100％(15/15动物)、50％(8/16动物)以及0％(0/6动物)。基于上述数据，我们认为在我们的体内实验中，95ng ILY/g体重的剂量为致死剂量(LD₁₀₀)。
甚至在最高水平的治疗(3000ng ILY/g体重)下，在来自WT小鼠的RBC中没有观测到细胞死亡(0/6动物)。注射45ng ILY/g体重会在hCD59RBC^+/-小鼠中诱导大量溶血，但在WT小鼠中则没有，如由降低的红细胞比容值、可见溶血以及血红蛋白尿所证明的。图1B表明，在ILY注射以后的10分钟、1天、以及4天，和WT小鼠相比，在hCD59RBC^+/-小鼠中显著降低的红细胞比容值。在ILY注射以后10分钟，在5只hCD59RBC^+/-小鼠中发现可见溶血，但在5只WT小鼠中则没有(图1C)。当在ILY注射以后的5小时和1天收集时，在来自hCD59RBC^+/-小鼠的尿中发现可见血红蛋白尿(hemogloabinuria)，但在WT小鼠中则没有(图1D)。
2.人血清中的抑制剂中和ILY的溶解作用
由于SI(1)是正常人口腔微生物菌群的一部分，(2)可以引起肝和脑脓肿，以及(3)分泌ILY(该ILY特异性地溶解人细胞，这是由于在它们的表面存在hCD59)，所以我们提出，人类可以形成某些免疫防御，其可以防止ILY介导的细胞溶解和致病性SI感染。为了试验该假说，我们用人RBC进行溶血测定。用不同浓度的ILY和来自不同物种的在PBS中的1至8倍稀释(1to 8dilution)的血清对人RBC进行孵育。图2A表明，人血清，而不是来自其他11个动物物种的血清，显著阻断ILY介导的人RBC溶解。
为了从人血清分离抑制剂，我们使用了ILY-结合琼脂糖柱。通过溶血测定，我们证实了，洗脱部分而不是人血清的流过部分具有保护人RBC免受ILY介导的溶血的功能活性(图2B)。在SDS-PAGE凝胶上分离结合于ILY的特异性蛋白(图2C)并分离用于蛋白质测序。我们在人和小鼠血清的ILY洗脱部分中发现IgG。仅在人血清的ILY洗脱部分中发现MAC-2BP蛋白(图2D)。
3.ILY抑制剂的分离以及它们的保护作用
为了从MAC-2BP和SP40分离人IgG或小鼠IgG，我们进一步用G蛋白柱纯化来自ILY-结合柱的洗脱部分，其中G蛋白柱结合于IgG(图3B)。我们利用溶血测定来测试来自人血清并经ILY柱和G蛋白柱纯化的洗脱部分的功能活性。图3B表明，来自G蛋白柱(蛋白G柱)的洗脱部分具有类似于来自ILY柱的洗脱部分的功能活性。我们已从1ml的每个物种的血清，纯化了大约300μg的ILY-结合人IgG或小鼠IgG。通常，在人血清中平均有12mg/ml总人IgG。因此，2.5％的总人IgG可以结合于ILY。仅来自人血清而不是来自小鼠血清的ILY-结合IgG在保护hRBC免受ILY介导的溶血方面具有功能活性(图3B)。ILY-结合小鼠IgG并不具有相对于ILY介导溶解的任何保护活性(图3C)。
2.5％的小鼠IgG(其特异性地结合于ILY)为何不阻断ILY介导细胞溶解的可能解释如下。首先，SI是仅在人类而不是在小鼠和其他动物中的正常微生物菌群的一部分。因此，可以将人免疫系统暴露于ILY并产生对于ILY的功能结构域特异的抗体，其中功能结构域包括结构域4(用于hCD59的结合位点)。其次，可以存在ILY与针对溶细胞毒素的抗体的交叉反应性，其中溶细胞毒素由其他革兰氏阳性菌产生，包括在梭菌属(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、李斯特菌属(Listeria)、以及芽孢杆菌属(Bacillus)范围内的物种，其是人类和其他动物中的正常微生物菌群。该毒素家族(包括ILY)的成员在原始序列水平方面呈现40-80％的相似性。人类和其他动物可以产生对于各种各样的这些毒素特异的抗体。这些抗体可以与ILY的不同区域进行交叉反应，但不中和ILY功能。
为了进一步确定上述ILY-结合人IgG分子的哪一部分结合于ILY，200ng ILY用来涂布96孔板中的孔，接着用来自装填在ILY-结合柱上的人血清的连续稀释的洗脱液进行孵育。饱和量的二抗(羊抗-人IgG Fab或Fc片段HRP抗体)用来在用连续稀释的人血清洗脱液预孵育ILY涂布孔以后，检测在孔中的自由结合位点。图3D表明，抗-人Fc二抗比抗-人Fab二抗具有显著更多的自由结合位点。该结果表明，其中ILY-结合人IgG结合于ILY的位点可以驻留在Fab区。此外，利用ELISA，我们证明了ILY并不结合于人IgG的Fc区。在该方法中，ILY用来涂布96孔板中的孔，用不同浓度的商购人Fc片段孵育孔，然后利用抗-人Fc片段HRP抗体来检测Fc片段结合。该结果进一步支持以下结论：通过Fab区，ILY-结合人IgG结合于ILY。
为了确定ILY-结合人IgG的体内效应，我们首先通过静脉内(IV)注射不同剂量的ILY-结合人IgG来治疗hCD59RBC^+/-小鼠。15分钟后，我们对这些小鼠注射285ng ILY/g体重(在未治疗hCD59RBC^+/-小鼠中，3倍致死剂量(LD)的ILY)。我们发现，用1和0.75μg ILY-结合人IgG/g体重预治疗的hCD59RBC^+/-小鼠的存活百分比分别为89％(8/9)和62.5％(5/8)。这个结果证实，ILY-结合人IgG体内阻断ILY功能，并且表明抗-ILY抗体可用于治疗SI传染病。
4.修饰的重组ILY的功能活性
我们生成了一组修饰的重组ILY片段(mILY1-4)。将编码这些片段的序列克隆入表达载体中以使该片段被融合于His标签(图4A)。mILY1片段在ILY的N端缺失大约80个氨基酸。
mILY2片段在ILY的N端缺失大约200个氨基酸。这些蛋白质被表达在大肠杆菌表达系统中并进一步通过His柱加以纯化(图4B)。
在上述人RBC溶解测定中测试这些片段。mILY1片段保留和全长ILY类似的溶解活性。mILY2片段保留小于1％的全长ILY的溶解活性。甚至在10³倍更大浓度下，mILY3和mILY4片段也不诱导RBC的溶解(图5A)。
为了测试是否mILY3或mILY4可以阻断全长ILY的溶解作用，用不同浓度的mILY3或mILY4预孵育人红细胞，接着用全长ILY进行孵育。在预孵育以后，mILY3片段阻断ILY介导的溶解(图5B)。这些数据表明，mILY3(包含整个结构域4)可保持结合于人CD59的功能特性。
图6表明，用ThCD59RBC对ILY3的预孵育会增加hCD59RBC转基因小鼠红细胞对补体介导溶血的敏感性。该结果证实了ILY3可以阻断hCD59功能。
5.利用在RAMOS膜中hCD59的过表达来生成利妥昔单抗抗性的RAMOS细胞系
通过按照Takei等开发的程序(Leuk Res 30，625-31(2006))，我们建立了利妥昔单抗抗性的RAMOS细胞系，其过表达人CD59。在体外，RAMOS，一种B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系，被重复暴露于补体(人血清)和逐步增加浓度的利妥昔单抗。通过流式细胞仪分析了CD59在这些抗性细胞上的表达。对逐步增加浓度的利妥昔单抗(0.2、0.8、3.2、12.8以及51.2μg/ml)和10％人血清抗性的RAMOS细胞会逐渐表达增加水平的人CD59(图7)。
6.在利妥昔单抗抗性的RAMOS细胞中，mILY3降低对利妥昔单抗的抗性
为了测试衍生自ILY的结构域4的肽是否可以抑制hCD59功能和促进利妥昔单抗对癌症的治疗，我们用对51.2μg/ml利妥昔单抗抗性的细胞(其表达最高水平的人CD59)孵育mILY3。用不同浓度的mILY3(SEQ ID NO：1)、10μg/ml利妥昔单抗、以及10％人血清处理对51.2μg/ml利妥昔单抗抗性的RAMOS细胞1小时，然后利用台盼蓝(一种用于确定死亡细胞的标准方法)来确定细胞死亡(图8B)。
和未用mILY3处理的细胞相比，用不同剂量的mILY3处理的RAMOS细胞呈现显著增加的细胞死亡(％)(图8A和8B)。mILY3的IL₅₀计算为33nM。这些数据表明，mILY3(SEQ ID NO：1)，其衍生自ILY结构域4，可体外在利妥昔单抗抗性细胞中降低利妥昔单抗抗性(图2A和2B)。显著地，单独用不同浓度的mILY3处理RAMOS细胞并不诱导细胞死亡(图8)，这表明mILY3单独对这些细胞不具有毒性作用。
其他实施方式
对于本领域技术人员来说，本发明所描述的方法和组合物的各种改进和变化将是明显的，而不偏离本发明的范围和精神。虽然已结合特定优选实施方式描述了本发明，但应当明了，要求保护的本发明不应不适当地局限于这样的具体实施方式。事实上，用于实现本发明的所述方式的各种改进，其对于医药、免疫学、药理学、内分泌学领域、或相关领域的技术人员来说是明显的，也在本发明的范围内。
在本说明书中提及的所有出版物以引用方式结合于本文，其程度如同每个独立出版物特定和单个地以引用方式结合的程度一样。