双端酰胺型水凝胶剂 【技术领域】
本发明涉及一种具有新颖的化学结构和组成的水凝胶剂， 以及基于该水凝胶剂的水凝胶。 背景技术 低分子凝胶因子通过由分子间作用所引起的自组装形成凝胶并捕获三维网络中 的溶剂分子 ( 例如， 参见非专利文献 1)。
由于低分子凝胶因子 (gelator) 可被设计， 故人们希望将其应用到各个领域比如 分离膜、 传感器、 催化剂、 电子材料以及生物材料 ( 例如， 参见非专利文献 2)。
我们已经合成了具有新颖结构的在 3-、 4- 和 5- 位具有较长的烷氧基链的苯甲酰 胺衍生物 ( 参见专利文献 1)， 并且发现该合成的化合物的一部分可将有机溶剂凝胶化。进 一步地， 我们发现， 该凝胶化依赖于它们的化学结构 ( 参见专利文献 2)。
然而， 对于生物材料应用来说， 与其中有机溶剂被凝胶化的有机凝胶相比， 人们显 然更期待其中水被凝胶化的水凝胶。目前关于低分子水凝胶的报道并不多 ( 例如， 参见非 专利文献 3)。 进一步地， 如果获得的水凝胶用作生物材料， 那么人们希望水凝胶本身具有生 物相容性。考虑到该点的报道也并不多。
我们已经合成了具有低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 分子的 3， 4， 5- 长烷氧基链苯甲酰胺衍 生物。我们已经公开了这些化合物可用于给予医用材料等生物相容性 ( 参见专利文献 3)， 以及这些化合物可将有机溶剂凝胶化 ( 参见专利文献 4)。除了这些之外， 我们进一步发现 这些化合物可形成水凝胶 ( 参见专利文献 5、 6)。然而， 为了根据目的和用途优化水凝胶的 物理性能或制备方法， 希望开发新颖的水凝胶剂。
随着近年来干细胞研究的进步， 水凝胶在细胞培养中的应用已引起人们很大的关 注 ( 例如， 参见非专利文献 4)。在细胞培养中， 水凝胶必须在细胞培养的温度下形成。特别 地， 在低于或接近于室温的温度处为溶液状态 ( 溶胶 (sol)) 但在细胞培养温度处为凝胶的 水凝胶是极为有用的， 这是因为在细胞培养后， 可通过降低温度来收集经培养的细胞 ( 例 如， 参见专利文献 7)。相反， 为了保存细胞， 在室温至细胞培养温度附近处为液体状态 ( 溶 胶 ) 但在细胞保存温度处为凝胶的水凝胶是优选的。人们希望水凝胶的性能可如上所述的 那样被控制。
专利文献
专利文献 1 ： JP2001-122889A
专利文献 2 ： JP2004-262809A
专利文献 3 ： JP2005-232061A
专利文献 4 ： JP2005-232278A
专利文献 5 ： JP2007-217551A
专利文献 6 ： JP2009-84272A
专利文献 7 ： JP1994-141851A
非专利文献 非专利文献 1 ： Chem.Rev.， 1997， 97 卷， 第 3133-3159 页 非专利文献 2 ： Angew.Chem.Int.Ed.， 2000， 39 卷， 第 2263-2266 页 非专利文献 3 ： Chem.Rev.， 2004， 104 卷， 第 1201-1217 页 非专利文献 4 ： Nature， 2009， 462 卷， 第 433-441 页。发明内容 技术问题
本发明的目的是提供具有新颖的化学结构和组成的水凝胶剂， 以及基于该水凝胶 剂的水凝胶。
解决问题的方案
本发明人已经合成了如式 (0) 所示的具有低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 和长链烷氧基部 分的苯甲酰胺衍生物， 并且发现它们形成了水凝胶 (JP2009-84272A)。
在本发明中， 发明人单独地新合成了如式 (1) 所示的化合物， 该化合物在低聚 - 或 聚 ( 乙二醇 ) 的两终端处具有苯甲酰胺部分， 并且检测到形成了水凝胶。结果是， 发明人发 现该化合物的性能完全不同于如式 (0) 所示的化合物的性能。进一步地， 发明人发现， 凝胶 化温度和凝胶强度可通过混合这两种类型的化合物来控制。基于该发现， 本发明被完成。
其中 k1 代表 0 至 4 的整数 ； m1 代表 1 至 100 的整数 ； 以及 n1 代表 1 至 6 的整数 ； R1 代表经由氧原子结合的碳原子数为 8-22 的烃基 ； R2 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数 为 1-22 的烃基 ； R3 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数为 1-22 的烃基 ； 并且 R2 和 R3 不同 时为 H。
其中 X 代表 OH 或 NH2 ； k2 代表 0 ； m2 代表 10 至 100 的整数 ； 以及 n2 代表 2 ； R4 和 R6 代表经由氧原子结合的碳原子数为 12-18 的烃基 ； R5 代表经由氧原子结合的碳原子数为 1-18 的烃基 ； 并且 R4 和 R5 代表不同的烃基。
更具体地说， 本发明提供如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物、 包含该衍生物的水凝 胶剂， 以及包含该水凝胶剂和水的水凝胶。
其中 k1 代表 0 至 4 的整数 ； m1 代表 1 至 100 的整数 ； 以及 n1 代表 1 至 6 的整数 ； R1 代表经由氧原子结合的碳原子数为 8-22 的烃基 ； R2 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数 为 1-22 的烃基 ； R3 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数为 1-22 个的烃基 ； 并且 R2 和 R3 不 同时为 H。
进一步地， 本发明提供一种包含如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (2) 所示 的苯甲酰胺衍生物的水凝胶剂 ：
其中 X 代表 OH 或 NH2 ； k2 代表 0 至 4 的整数 ； m2 代表 1 至 100 的整数 ； 以及 n2 代 表 1 至 6 的整数 ； R4 代表经由氧原子结合的碳原子数为 8-22 的烃基 ； R5 代表 H 或经由氧原 子结合的碳原子数为 1-22 的烃基 ； R6 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数为 1-22 的烃基 ； 并且 R5 和 R6 不同时为 H，
而且， 本发明还提供包含该水凝胶剂和水的水凝胶。
进一步地， 本发明提供如式 (3) 所示的苯甲酰胺衍生物 ：
其中 k1 代表 0 至 4 的整数 ； m1 代表 7 至 100 的整数 ； 以及 n1 代表 2 至 6 的整数 ；R1 和 R3 代表经由氧原子结合的碳原子数为 12-18 的烃基 ； 以及 R2 代表 H 或经由氧原子结合 的碳原子数为 1-18 的烃基，
而且， 本发明还提供含有该衍生物的水凝胶剂、 以及包含该水凝胶剂和水的水凝 胶。
本发明还提供包含如式 (3) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (4) 所示的苯甲酰胺衍 生物的水凝胶剂 ：其中 X 代表 OH 或 NH2 ； k2 代表 0 至 4 的整数 ； m2 代表 7 至 100 的整数 ； 以及 n2 代 表 2 至 6 的整数 ； R4 和 R6 代表经由氧原子结合的碳原子数为 12-18 的烃基 ； R5 代表 H 或经 由氧原子结合的碳原子数为 1-18 的烃基，
而且， 本发明进一步提供包含该水凝胶剂和水的水凝胶。
进一步地， 本发明提供包含如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 包含如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (2) 所示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 包含如式 (3) 所 示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 或包含如式 (3) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (4) 所示的 苯甲酰胺衍生物的水凝胶， 其中由升温引起的溶胶至凝胶转变温度为 10℃以上、 且 40℃以 下； 并且还提供一种使用该水凝胶的细胞培养方法。
特别地， 本发明提供包含如式 (5) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (6) 所示的苯甲 酰胺衍生物的水凝胶剂 ； 以及包含该水凝胶剂和水的水凝胶， 该水凝胶具有 10℃以上、 且 40℃以下， 优选 20℃以上、 且 35℃以下的由升温引起的溶胶至凝胶转变温度 ； 以及使用该 水凝胶的细胞培养方法。
其中 k1 为 0 ； m1 为 42 至 45 ； n1 为 2 ； R1 为 OC14H49 ； R2 为 OCH3 ； 以及 R3 为 OC14H49。
其中 X 为 OH ； k2 为 0 ； m2 为 42 至 45 ； n2 为 2 ； R4 为 OC14H49 ； R5 为 OCH3 ； 以及 R6 为OC14H49。
进一步地， 本发明提供包含如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 包含如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (2) 所示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 包含如式 (3) 所 示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶 ； 或包含如式 (3) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (4) 所示的苯甲酰胺衍生物的水凝胶， 其中由降温引起的溶胶至凝胶转变温度为 -5℃以上且 35℃以 下； 并且还提供使用该水凝胶的细胞保存方法。
特别地， 本发明提供包含如式 (7) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (8) 所示的苯甲 酰胺衍生物的水凝胶剂 ； 和包含该水凝胶剂和水的水凝胶， 该水凝胶具有 -5℃以上且 35℃ 以下、 优选 0℃以上且 20℃以下的由降温引起的溶胶至凝胶转变温度 ； 以及使用该水凝胶 的细胞培养方法。
其中 k1 为 0 ； m1 为 29 至 32 ； n1 为 2 ； R1 为 OC14H49 ； R2 为 OCH3 ； 以及 R3 为 OC14H49。
其中 X 为 OH ； k2 为 0 ； m2 为 29 至 32 ； n2 为 2 ； R4 为 OC14H49 ； R5 为 OCH3 ； 以及 R6 为OC14H49。 本发明的有益效果
本发明将新的各种分子作为可自组装成水凝胶的局部结构添加至具有低聚 - 或 聚 ( 乙二醇 ) 的化合物中， 并且本发明适于三维细胞培养等。
附图说明
图 1 所示为实施例 1 中获得的水凝胶剂的流变性测定结果。
图 2 所示为实施例 3 中获得的水凝胶剂的流变性测定结果。
图 3 所示为实施例 5 中获得的水凝胶剂的流变性测定结果。
图 4 所示为实施例 3 和实施例 5 中获得的水凝胶剂的混合物 ( 水凝胶剂含量 ： 20wt％ ) 的流变性测定结果。
图 5 所示为实施例 3 和实施例 5 获得的水凝胶剂的混合物 ( 水凝胶剂含量 ： 10wt％ ) 的流变性测定结果。
图 6 所示为实施例 3 和实施例 5 获得的水凝胶剂的混合物 ( 水凝胶剂含量 ： 5wt％ ) 的流变性测定结果。
图 7 所示为通过与实施例 7 中相同的合成方法获得的水凝胶剂的流变性测定结 果， 该水凝胶剂包含混合比为约 0.48 ∶ 1 的如式 (1) 所示的化合物和如式 (2) 所示的化合物。 图 8 所示为通过与实施例 11 中相同的合成方法获得的水凝胶剂的流变性测定结 果， 该水凝胶剂包含混合比为约 0.16 ∶ 1 的如式 (1) 所示的化合物和如式 (2) 所示的化合 物。
图 9 所示为通过与实施例 11 中相同的合成方法获得的水凝胶剂的流变性测定结 果， 该水凝胶剂包含混合比为约 0.45 ∶ 1 的如式 (1) 所示的化合物和如式 (2) 所示的化合 物。
具体实施方式
本发明涉及如式 (9) 所示的苯甲酰胺衍生物。
其中 k1 代表 0 至 4 的整数 ； m1 代表 1 至 100 的整数， 优选 7 至 100 ； 以及 n1 代表 1 至 6， 优选 2 至 6 ； R1 代表经由氧原子结合的碳原子数为 8-22、 优选为 12 至 18 的烃基 ； R2 代表 H 或经由氧原子结合的碳原子数为 1-22、 优选为 1 至 18 的烃基 ； R3 代表 H 或经由氧原 子结合的碳原子数为 1-22、 优选为 1 至 18 的烃基 ； 并且， R2 和 R3 不同时为 H。进一步地， 优 选 R1 和 R3 代表经由氧原子结合的碳原子数为 12 至 18 的烃基 ； 以及 R2 代表 H 或经由氧原 子结合的碳原子数为 1 至 18 的烃基。
此处， 在两端处具有苯甲酰胺基并且如式 (1)、 式 (3)、 式 (5)、 式 (7) 或式 (9) 所 示的化合物也称为 “双端酰胺型化合物” 或 “双端酰胺型衍生物” ， 并且仅在一端处具有苯甲 酰胺基并且如式 (2)、 式 (4)、 式 (6) 或式 (8) 所示的化合物也称为 “单端酰胺型化合物” 或 “单端酰胺型衍生物” 。
注意， 考虑到在室温附近形成水凝胶， m1 优选为 7 以上 ； R1 的碳原子数优选为 12 至 18 个 ； 以及 R2 和 R3 各自的碳原子数优选为 18 个以下。考虑到合成工艺， n1 优选为 2 以 上。
例如， 如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物可通过如下方式获得 ： 具有烃基的苯甲酸 衍生物经由氧原子与在两端处具有氨基的低聚 - 和聚 ( 乙二醇 ) 的衍生物发生酰胺缩合。 在该缩合中， 可使用缩合剂比如碳化二亚胺衍生物。此外， 还使用酸酐、 酰基氯以及苯甲酸 衍生物的活化酯。
此时， 可根据在两端处具有氨基的低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 的衍生物的合成方法调 整 k1 和 n1。此外， 根据初始材料或反应条件， 可制造在两端处具有苯甲酰胺基的化合物和 仅在一端处具有苯甲酰胺基的化合物作为混合物。即使在该情况中， 可视需要使用已知的 分馏方法比如高性能液体色谱法来从该混合物中分离上述两种物质之一或者获得上述两 种物质之一的比例被增加的混合物。
两端具有氨基的低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 的衍生物通过如下方式获得 ： 顺序甲苯磺 酰化或甲磺酰化市售的低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 的两端， 对甲苯磺酰基或甲磺酰基进行碘化 处理， 将碘基转变为邻苯二甲酰亚胺， 并用联氨脱保护。可选地， 可通过如下方式获得类似 的化合物 ： 在甲苯磺酰化或甲磺酰化之后， 对甲苯磺酰基或苯磺酰基进行叠氮 (azidated) 处理， 然后对其进行还原。 特别地， 甲磺酰化的乙二醇低聚物或聚合物更易获得两端处具有 氨基的化合物 (J.Am.Chem.Soc.， 2009， 第 131 卷， 第 2110-2112 页 )。
进一步地， 在不能从市场上购得的具有某一长度的低聚或聚 ( 乙二醇 ) 的情况中， 化合物可通过如下方式获得 ： 保护市售的低聚或聚 ( 乙二醇 ) 的一端， 将其另一端甲苯磺酰 化， 与其它低聚或聚 ( 乙二醇 ) 缩合以提供所需长度， 然后进行脱保护和缩合 (J.Org.Chem， 2004， 第 69 卷， 第 639-647 页 )。将制得的化合物在两端进行顺序甲苯磺酰化或甲磺酰化， 对甲苯磺酰基或甲磺酰基进行碘化处理， 将碘基转变为邻苯二甲酰亚胺， 并用联氨脱保护 (Biochemistry， 1980， 第 19 卷， 第 4595-4600 页 )， 从而获得两端处具有氨基的化合物。
具有相同的经由氧原子结合到 3-、 4- 以及 5- 位的烃基的苯甲酸衍生物通过醚化 3， 4， 5- 三羟基苯甲酸酯并水解该酯获得。
在 5- 位具有氢并具有相同的经由氧原子结合到 3- 位和 4- 位的烃基的苯甲酸通 过同时醚化用作初始材料的 3， 4- 二羟基苯甲酸酯的 3- 位和 4- 位并水解该酯获得。进一 步地， 例如， 具有不同的经由氧原子结合到 3- 位和 4- 位的烃基的苯甲酸衍生物通过如下方 式获得 ： 利用 3- 位与 4- 位之间反应性的差异， 更具体地说， 选择性地醚化 4- 位， 接着醚化 具有不同于 4- 位的烃基的 3- 位， 然后水解该酯。 例如， 具有不同于经由氧原子结合到 3- 位和 4- 位烃基的 5- 位烃基的苯甲酸衍生 物通过如下方式获得 ： 保护 3， 4， 5- 三羟基苯甲酸酯的 3- 位和 4- 位， 选择性地将硼酸衍生 物交联到 3- 位和 4- 位上， 醚化 5- 位， 脱保护硼酸衍生物， 使用如上所述相同的方法醚化 3- 位和 4- 位， 接着水解该酯。
在 4- 位具有氢并具有经由氧原子结合到 3- 位和 5- 位的烃基的苯甲酸衍生物通 过同时醚化用作初始材料的 3， 5- 二羟基苯甲酸酯的 3- 位和 5- 位并接着水解该酯来获得。 进一步地， 例如， 具有不同的经由氧原子结合到 3- 位和 5- 位的烃基的苯甲酸衍生物通过如 下方式获得 ： 通过提供低于当量的烃类试剂进行醚化， 分离羟基中的一个被醚化的苯甲酸 衍生物， 用不同的烃类试剂醚化其余的烃基， 接着水解该酯。
例如， 与经由氧原子结合到 3- 位和 5- 位烃基的苯甲酸衍生物不同， 具有 4- 位烃 基的苯甲酸衍生物通过如下方式获得 ： 利用 3， 4， 5- 三羟基苯甲酸酯的 4- 位反应性的差异， 更具体地说， 首先醚化 4- 位， 然后以如上所述相同的方式醚化 3- 位和 5- 位， 接着水解该 酯。
如式 (1) 所述的双端酰胺型化合物可单独用作水凝胶剂。可选地， 例如， 其可与如 式 (2) 所示的单端酰胺型化合物以混合物的形式用作水凝胶剂 ( 下面也称为 “混合水凝胶 剂” )。注意， 在混合物的情况中， 如式 (2) 所示的苯甲酰胺衍生物可以与如式 (1) 所示的苯 甲酰胺衍生物相同的合成路线被合成 ； 然而， 这两种苯甲酰胺衍生物可分别合成再混合。 可 选地， 如果在前者或后者的合成过程中获得这两者的混合物， 那么可使用该混合物。
混合水凝胶可通过以任意混合比混合如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物进行制备。然而， 为获得混合双端型酰胺化合物的显著效果，
混合水凝胶剂优选包含混合比大于 1 ∶ 8 的双端酰胺型衍生物和单端酰胺型衍生物。
水凝胶可通过如下方式制备 ： 在水中悬浮包含作为活化成分的如式 (1) 所示的苯 甲酰胺衍生物的水凝胶剂、 或包含作为活化成分的如式 (1) 所示的苯甲酰胺衍生物和如式 (2) 所示的苯甲酰胺衍生物的混合物的水凝胶剂， 接着将悬浮液直接加热到水凝胶的使用 温度， 或者一旦将悬浮液加热到水凝胶剂溶解的温度就冷却至室温， 或进一步加热到更高 的温度， 或进一步冷却到更低的温度。用于制备水凝胶的方法不限于这些。
考虑到水凝胶的形成以及成本， 水凝胶中水凝胶剂的比例优选在 0.5-25wt％的范 围内。进一步地， 水凝胶中水的比例优选在 75-99.5wt％的范围内。进一步地， 除了水凝胶 剂和水， 还可添加其它组分比如防腐剂， 只要没有对水凝胶的形成产生显著影响即可。
通过控制如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物与如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 的混合比， 可控制凝胶化的转变温度。例如， 可通过添加双端酰胺型化合物以获得约 1 ∶ 8 混合的混合物 ( 单端酰胺∶双端酰胺＝ 89 ∶ 11) 来将包含混合比为约 1 ∶ 3( 单端酰胺∶ 双端酰胺＝ 67 ∶ 33) 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ NH2， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的混合水凝胶的 52℃的凝胶转变温度降低到 10wt％浓度处的 40℃ ( 实施例 6)。
进一步地， 由降温引起的凝胶化的转变温度可通过降低水凝胶剂的浓度来降低。 例如， 在包含混合比为 0.48 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 2( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 29 至 32， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合 物 2( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 29 至 32， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的混 合水凝胶剂中， 凝胶转变温度 ( 在低温一侧处的凝胶， 在高温一侧处的溶胶 ) 可由 8wt％浓 度处的 52℃降低到 2wt％浓度处的 32℃ ( 实施例 8)。
进一步地， 由升温引起的凝胶化的转变温度可通过增加水凝胶剂的浓度来获得。 例如， 在包含混合比为 0.45 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的水凝 胶剂中， 凝胶转变温度 ( 在低温一侧处为溶胶， 在高温一侧处为凝胶 ) 可由 8wt％浓度处的 41℃降低到 15wt％浓度处的 23℃ ( 实施例 12)。
同样地， 具有预期凝胶转变温度的水凝胶可通过恰当地改变双端酰胺型化合物与 单端酰胺型化合物的混合比以及水凝胶剂的浓度来获得。
本发明提供的水凝胶可用于培养并保存细胞。此处使用的 “细胞” 是指 “分离的单 个细胞” ， “细胞团” ， “由细胞构成的组织的一部分” ， “由细胞构成的组织” 等。
细胞可在水凝胶上培养， 其中水凝胶在细胞培养温度处形成。 可选地， 如果水凝胶 以处于较低温度处的溶胶状态存在， 那么可在水凝胶内培养细胞。 更具体地说， 在溶胶状态 中播种细胞并且在细胞培养温度处形成水凝胶。 在该方法中， 细胞在水凝胶中进行培养。 如 果细胞在水凝胶上培养， 那么培养的细胞可通过从表面除去它们进行分离和收集。 相反， 如 果细胞在水凝胶内培养， 那么可通过降低温度以将水凝胶恢复为溶胶状态来分离并收集培 养的细胞。
例如， 可选择混合水凝胶剂中的如式 (5) 所示的双端酰胺型化合物与如式 (6) 所示的单端酰胺型化合物的混合比以及水凝胶中的水凝胶剂与水的混合比， 以使由升温引起 的溶胶至凝胶转变温度接近于室温 (25℃ )。通过使用水凝胶可实现下述细胞培养方法。
更具体地说， 例如， 包含混合比为 0.45 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 和如式 (2) 所示 的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以 及 R5 ＝ OCH3) 的水凝胶剂在 15wt％浓度处的凝胶转变温度为接近 23℃。水凝胶剂以适于 培养动物细胞的高温一侧 (37℃ ) 处的凝胶状态存在以及以适于收集细胞的低温一侧处的 溶胶状态存在 ( 实施例 12)。
为保存细胞， 使用通过降低温度由溶胶转变至凝胶的水凝胶剂。例如， 细胞可通 过如下方式保存 ： 将溶胶状态的水凝胶剂溶液倒到细胞上并降低温度以形成水凝胶， 或者 在软水凝胶 (soft hydrogel) 中混合细胞， 或者在室温到细胞培养温度处为溶胶状态 (sol state) 的凝胶中播种细胞， 然后降低温度以形成水凝胶。在水凝胶下保存的细胞可通过物 理除去水凝胶或用细胞培养介质稀释水凝胶来收集。 在水凝胶内保存的细胞可通过用细胞 培养介质稀释水凝胶来收集或者通过升高温度以将水凝胶转变为溶胶状态来收集。
例如， 混合水凝胶剂中的如式 (7) 所示的双端酰胺型化合物与如式 (8) 所示的单 端酰胺型化合物的混合比以及水凝胶中的水凝胶剂与水的混合比可被选择以使由降温引 起的溶胶至凝胶转变温度接近于室温 (25℃ )。通过使用水凝胶可实现下述细胞保存方法。
更具体地说， 例如， 包含混合比为 0.48 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 29 至 32， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 和如式 (2) 所示 的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 29 至 32， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的水凝胶剂在 2wt％浓度下， 在 37℃处为溶胶状态并且在 30℃以下处为凝胶状 态。于是， 可实现在 30℃以下的凝胶中保存细胞并在 37℃的细胞培养温度处收集细胞的细 胞保存方法 ( 实施例 8)。
如下将进一步具体说明本发明， 但本发明不限于如下说明。
注意， 下文中， EDC·HCl 是可溶于水的碳化二亚胺盐酸盐的缩写， HOBt 是 1- 羟基 苯并三唑水合物的缩写以及 PEG 是聚乙二醇的缩写。
实施例
< 实施例 1>
( 如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 29 至 32， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的合成 )
分子量为 1540 的 PEG 被用作初始材料。根据文献 (J.Am.Chem.Soc， 2009， 第 131 卷， 第 2110-2112 页 ) 所述的方法对 PEG 两端处的两个羟基进行甲磺酰化， 接着进行叠氮 处理。对该叠氮化物进行还原以获得分子量为 1540 的 PEG- 二胺 (80.0g， 52.0mmol)。将 PEG- 二胺溶于二氯甲烷 (350ml) 中， 然后添加三乙胺以将 pH 调节为 6。向该溶液中逐滴 添加酰基氯 (65.0g， 109mmol) 的二氯甲烷溶液 (350ml)( 根据文献 (Bioorg.Med.Chem.， 2002， 第 10 卷， 第 4013-4022 页 ) 所述的方法， 通过 3， 5- 二 ( 四癸氧基 )-4- 甲氧基苯甲酸 (Bioorg.Med.Chem.， 2002， 第 10 卷， 第 4013-4022 页 ) 与亚硫酰氯之间的反应获得 )， 持续 20 分钟。进一步添加三乙胺并在室温下进一步搅拌 2 小时， 同时保持 pH 接近于 9。用 1N 盐酸、 碳酸氢钠饱和水溶液和卤水洗涤反应溶液， 接着用硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂并用活性炭 (activated charcoal) 进一步处理残留物以获得预期化合物 (116.7g， 产率 ： 84％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.02(4H， s， 2， 6-H)， 6.92(2H， br-t， NH)， 4.02(8H， t， J ＝ 6.6Hz， 3， 5-OCH2)， 3.84(6H， s， 4-OCH3)， 3.70 ～ 3.55( ～ 128H， m， CH2OCH2)， 1.80(8H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz， 3， 5-OCCH2)， 1.44(8H， 五重峰， J ＝ 7.2Hz， 3， 5-OC2CH2)， 1.36 ～ 1.22(80H， m， 3， 5-OC3C10H20)， 0.86(12H， t， J ＝ 6.8Hz， 3， 5-OC13CH3)。
< 实施例 2>
( 实施例 1 中获得的双端酰胺型化合物的流变性测定 )
为了分析实施例 1 中获得的双端酰胺型化合物的溶胶 - 凝胶转变性能， 对试样的 水溶液的粘弹性进行测定。将试样的浓度调节为 5wt％， 10wt％， 15wt％以及 20wt％。在充 分搅拌后， 将试样的水溶液保存在冷藏柜中。通过使用 ARES-G2( 日本 TA Instruments 制 造 ) 进行流变性测定。使用平行板 (50mm) 并将频率设置为 1Hz。在以 3℃ /min 的升温率 将试样的水溶液的温度从 0℃升高至 80℃的同时进行测定。
结果如图 1 所示。在图中， G′表示储存模量 (storage modulus)， G″表示损耗模 量。G′＞ G″表示凝胶状态 ； G′＜ G″表示溶胶状态 ； 并且 G′＝ G″表示凝胶转变点。 结果发现， 实施例 1 中获得的水凝胶剂在至少 5wt％以上的较宽浓度范围处形成 水凝胶。 水凝胶剂在 5wt％浓度、 48℃以上的温度处形成凝胶， 并且水凝胶剂在其它的浓度、 更宽的温度范围内形成水凝胶。
< 实施例 3>
( 如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的合成 )
分子量为 2000 的 PEG 被用作初始材料。根据文献 (J.Am.Chem.Soc， 2009， 第 131 卷， 第 2110-2112 页 ) 所述的方法对 PEG 两端处的两个羟基进行甲磺酰化， 接着进行叠氮 处理。对该叠氮化物进行还原以获得分子量为 2000 的 PEG- 二胺 (80.0g， 40.0mmol)。将 PEG- 二胺溶于二氯甲烷 (350ml) 中， 然后添加三乙胺以将 pH 调节为 6。向该溶液中逐滴添 加酰基氯 (50.0g， 84.1mmol) 的二氯甲烷溶液 (350ml)( 根据文献 (Org.Lett.， 2004， 第6 卷， 第 4171-4174 页 ) 所述的方法， 通过 3， 5- 二 ( 四癸氧基 )-4- 甲氧基苯甲酸与亚硫酰氯 之间的反应获得 )， 持续 20 分钟。进一步添加三乙胺并在室温下搅拌该混合物 2 小时， 同 时保持 pH 接近于 9。用 1N 盐酸、 碳酸氢钠饱和水溶液和卤水洗涤反应溶液， 接着用硫酸钠 干燥。在真空中除去溶剂并用活性炭进一步处理残留物以获得预期化合物 (101.2g， 产率 ： 81％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.01(4H， s， 2， 6-H)， 6.80(2H， br-t， NH)， 4.02(8H， t， J ＝ 6.6Hz， 3， 5-OCH2)， 3.84(6H， s， 4-OCH3)， 3.70 ～ 3.50( ～ 180H， m， CH2OCH2)， 1.79(8H， 五重峰， J ＝ 7.2Hz， 3， 5-OCCH2)， 1.44(8H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz， 3， 5-OC2CH2)， 1.38 ～ 1.20(80H， m， 3， 5-OC3C10H20)， 0.87(12H， t， J ＝ 6.8Hz， 3， 5-OC13CH3)。
< 实施例 4>
( 实施例 3 中获得的化合物的流变性测定 )
为了分析实施例 3 中获得的化合物的溶胶 - 凝胶转变性能， 对试样的水溶液的粘 弹性进行测定。将试样的浓度调节为 5wt％， 10wt％， 15wt％以及 20wt％。用与实施例 2 中
相同的方式进行流变性测定。结果如图 2 所示。
结果发现， 实施例 3 中获得的化合物 ( 水凝胶剂 ) 在至少 5wt％以上的较宽浓度范 围以及在较宽的温度范围处形成水凝胶。
< 实施例 5>
( 包含如式 (2) 所示的化合物 ( 其中 X ＝ NH2， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 和如式 (1) 所示的化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的组合物的合成 )
在室温下向酰基氯 (52.4g， 88.1mmol) 的二氯甲烷溶液 (525ml)( 根据文献 (Org. Lett.， 2004， 第 6 卷， 第 4171-4174 页 ) 所述的方法， 通过 3， 5- 二 ( 四癸氧基 )-4- 甲氧基 苯甲酸与亚硫酰氯之间的反应获得 ) 中添加 N- 羟基琥珀酰亚胺 (10.2g， 88.6mmol) 并搅拌 2 小时。在真空中除去溶剂之后， 获得活性酯 (75.2g)。
将 未 提 纯 的 活 性 酯 (59.3g) 直 接 溶 于 吡 啶 (350ml) 中 并 与 分 子 量 为 2000 的 PEG- 二胺 (88.0g， 44.0mmol) 的吡啶溶液 (400ml) 混合， 所述吡啶溶液根据文献 (J.Am. Chem.Soc， 2009， 第 131 卷， 第 2110-2112 页 ) 所述的方法将用作初始材料的分子量为 2000 的 PEG 的两端处的两个羟基进行甲磺酰化， 并进行叠氮处理和还原来获得。进一步地， 添加 二甲基胺吡啶 (528mg， 4.32mmol) 并在 4℃处搅拌 2 小时， 接着进一步在室温下搅拌 2 小时。 在冰块冷却下将反应混合物注入 1N 的盐酸 (1000ml) 中并用氯仿萃取。用 1N 盐 酸和卤水洗涤有机层并用硫酸钠干燥。在真空中除去溶剂并将残留物溶于甲醇中， 然后用 己烷洗涤。蒸发甲醇以获得预期的组合物 (43.9g)。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.02(2H， s， 2， 6-H)， 6.92(1H， br-t， NH)， 4.02(4H， t， J ＝ 6.6Hz， 3， 5-OCH2)， 3.84(3H， s， 4-OCH3)， 3.70 ～ 3.50( ～ 180H， m， CH2OCH2)， 1.80(4H， 五重峰， J ＝ 7.2Hz， 3， 5-OCCH2)， 1.44(4H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz， 3， 5-OC2CH2)， 1.38 ～ 1.20(40H， m， 3， 5-OC3C10H20)， 0.86(6H， t， J ＝ 6.8Hz， 3， 5-OC13CH3)。
根 据 HPLC 分 析 ( 柱 子 ： DAISO PAK SP-200-5-C4-P， 柱子的温度 ： 40 ℃， 溶剂 ： 70-99％的乙腈水溶液， 0.1％ TFA， 线性浓度梯度， 流速 ： 1.0ml/min) 的结果发现， 该产品是 包含摩尔比为约 8 ∶ 1 的如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ NH2， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 和如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的组合物。
< 实施例 6>
( 实施例 5 中获得的组合物、 以及该组合物与实施例 3 中获得双端酰胺型化合物的 混合物的流变性测定 )
为了分析实施例 5 中获得的组合物的溶胶 - 凝胶转变性能， 对试样的水溶液的粘 弹性进行测定。将试样的浓度调节为 5wt％， 10wt％， 15wt％以及 20wt％。用与实施例 2 中 相同的方式进行流变性测定。结果如图 3 所示。
结果发现， 实施例 5 中获得的组合物 ( 水凝胶剂 ) 在至少 5wt％以上的较宽浓度范 围处形成水凝胶。在所有的情况中， 水凝胶通过升温由溶胶转变为凝胶。凝胶转变点根据 浓度而改变并从 66℃降低到 52℃， 44℃以及 41℃。
类似地， 测定实施例 3 中获得的化合物、 实施例 5 中获得的组合物、 以及它们的混 合物的粘弹性。 制备以 0 ∶ 4、 1 ∶ 3、 2 ∶ 2、 3 ∶ 1 以及 4 ∶ 0 的混合比包含实施例 3 中的化
合物与实施例 5 中的组合物的试样， 并将它们的总浓度设置为 5wt％、 10wt％以及 20wt％。 结果如图 4 至图 6 所示。
结果发现， 混合水凝胶剂显示出不同于单种水凝胶剂的温度依赖性。 特别地， 对实 施例 5 中获得的水凝胶剂的凝胶转变温度进行如下讨论。例如， 实施例 5 中获得的水凝胶 剂的溶胶至凝胶转变温度在 10wt％的浓度处为 52℃， 该温度可通过混合 25％的实施例 3 中 获得的水凝胶剂降低到 40℃。结果发现， 通过混合水凝胶剂可控制凝胶形成温度。进一步 地， 与 G’ 相关的凝胶强度也可通过改变混合比来控制。
< 实施例 7>
( 包含如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 29 至 32， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 和如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 29 至 32， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的组合物的合成 )
将分子量为 1540 的 PEG(3.08g， 2.00mmol) 溶于吡啶 (10ml) 中， 接着添加对甲苯 磺酰氯 (0.76g， 4.00mmol) 并在室温下搅拌 2 小时。在反应完成后， 添加氯仿 (100ml) 并用 1M HCl(100ml) 进行中和。用 4％的 NaHCO3 水溶液和卤水洗涤溶液。用无水硫酸钠干燥有 机相。在过滤后， 在真空中除去溶剂。通过硅胶柱层析 ( 氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1) 提纯残留 物以获得分子量为 1540 的单甲苯磺酰化的 PEG(3.346g， 1.95mmol， 98％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.80(2H， d， J ＝ 8.4Hz， TsO 的 2， 6-H)， 7.34(2H， d， J ＝ 8.0Hz， Ts 的 3， 5-H)， 4.16(2H， t， J ＝ 5.0Hz， CH2OTs)， 3.83 ～ 3.45( ～ 138H， m， OCH2×69)， 2.45(3H， s， Ts 的 4-CH3)。
将分子量为 1540 的单甲苯磺酰化的 PEG(3.346g， 1.95mmol) 溶于乙腈 (15ml) 中， 接着添加叠氮化钠 (0.1904g， 2.93mmol) 并回流 32 小时。在反应完成后， 将溶液冷却至室 温并添加水 (20ml)。 添加二氯甲烷并萃取有机相， 接着用无水硫酸钠干燥。 在过滤后， 在真 空中除去溶剂以获得分子量为 1540 的单叠氮化的 PEG(2.889g， 1.82mmol， 93％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 3.83 ～ 3.45( ～ 138H， m， OCH2×69)， 3.39(2H， t， J ＝ 5.0Hz， CH2N3).
将分子量为 1540 的单叠氮化的 PEG(2.889g， 1.82mmol) 溶于甲醇 (100ml) 中， 添 加催化量的二氧化铂并在室温、 H2 下搅拌 2 小时。 在反应完成后， 在赛力特硅藻土 (Celite) 上除去二氧化铂。在真空中除去溶剂以获得分子量为 1540 的单氨基化的 PEG(2.351g， 1.51mmol， 83％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 3.83 ～ 3.45( ～ 138H， m， OCH2×69)， 2.86(2H， t， J ＝ 5.2Hz， CH2N)。
将 3， 5- 二 ( 四癸氧基 )-4- 甲氧基苯甲酸 (0.173g， 0.300mmol) 溶于二氯甲烷 (5ml) 中， 接着添加 HOBt(0.0504g， 0.360mmol) 和 EDC· HCl(0.0690g， 0.360mmol) 并在室温 下搅拌 1 小时。通过使用滴液漏斗向二氯甲烷溶液中逐滴添加分子量为 1540 的单氨基化 PEG 衍生物 (0.490g， 0.314mmol) 的二氯甲烷溶液 (5ml)， 接着进一步搅拌 1 小时。在反应 完成后， 用 4％的 NaHCO3 水溶液和卤水洗涤溶液。用无水硫酸钠干燥有机相。在过滤后， 在 真空中除去溶剂。通过预备的硅胶薄层色谱法 ( 氯仿∶甲醇＝ 9 ∶ 1) 提纯残留物以获得 产品 (0.370g， 0.175mmol， 58％ )( 作为如式 (2) 所示的单种化合物被计算 )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.04(2H， s， 2， 6-H)， 6.97(1H， br-t， NH)， 4.03(4H， t， J ＝6.6Hz， 3， 5-OCH2)， 3.85(3H， s， 4-OCH3)， 3.71 ～ 3.50( ～ 128H， m， CH2OCH2)， 1.81(4H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz， 3， 5-OCCH2)， 1.46(4H， 五重峰， J ＝ 7.2Hz， 3， 5-OC2CH2)， 1.36 ～ 1.22(40H， m， 3， 5-OC3C10H20)， 0.88(6H， t， J ＝ 6.8Hz， 3， 5-OC13CH3)。
通过使用设置为如下条件的 ShimadzuAXIMA CFR plus 对产品进行 MALDI-TOF/MS 测定 ： 氮激光器 (337nm)， 反射模式， 阳离子检测， 累积次数 ： 500 次， 电离辅助剂 ： 碘化钠的 丙酮溶液 (1mg/ml)， 基质 ： 地蒽酚氯仿溶液 (10mg/ml)， 试样浓度 ： 1mg/ml( 氯仿溶液 )， 扫 描范围 ： m/z 1-5000。
除了具有与对应于如式 (2) 所示化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 29 至 32， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的分子量为 1540 的初始 PEG 相似的分子量分布的 化合物的峰之外， 还检测到另一分子量大于 557 并且分子量分布与如式 (1) 所示的化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 29 至 32， n1 ＝ 2， R， 1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 类似的化合物的 峰。可确认产生了双端酰胺型衍生物。
在许多进行的分析中， 单端酰胺型衍生物的峰高与双端酰胺型衍生物的峰高的比 例为约 5 ∶ 1。
< 实施例 8>
( 通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的组合物的流变性测定 )
对通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的组合物进行 HPLC 分析 ( 柱子 ： DAISO PAK SP-200-5-C4-P， 柱子的温度 ： 40℃， 溶剂 ： 70-99％的乙腈水溶液， 0.1％ TFA， 线 性浓度梯度， 流速 ： 1.0ml/min)。结果是， 包含混合比为 0.48 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰 胺型化合物和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物的组合物被获得。为了分析该组合物的溶 胶 - 凝胶转变， 对试样的水溶液的粘弹性进行测定。将组合物的浓度调节为 1wt％， 2wt％， 8wt％和 15wt％。在充分搅拌以获得均一溶液后， 将试样的水溶液保存在冷藏柜中。通过 AR-G2( 日本 TAInstrument 制造 ) 进行测定。在以 3℃ /min 的升温率将试样的水溶液的温 度从 0℃升高至 80℃的同时进行测定。结果如图 7 所示。
结果发现， 水凝胶剂在至少 2wt％以上的较宽浓度范围以及较宽温度范围处形成 水凝胶。特别地， 溶液在 2wt％的浓度处， 在 37℃这一通常用于动物细胞培养的温度处为溶 胶状态， 并且在 30℃以下的温度处转变为凝胶。水凝胶具有适于保存细胞的温度性能。
< 实施例 9>
( 通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的组合物在保存肝细胞上的效果 )
使用通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的水凝胶剂以及与实施例 8 中进 行流变性测定所用同一批次的试样进行肝细胞保存的研究。
将大鼠肝细胞 (6×105 个细胞 ) 封入 (enclosed) 包含 2w/v％浓度的水凝胶剂 ( 在 100ml 的水中具有 2g 的水凝胶剂 ) 和细胞培养介质的水凝胶中， 接着将其置于 Eppendorf 试管中并在冰箱中保存一夜。第二天， 收集细胞， 在 24 孔平板中播种并在用于肝细胞的介 质中培养。每天更换介质。在除去培养上清液 (supernatant) 之后， 添加 1ml 的新鲜介质 并培养 3 天。将细胞超声粉碎并测定 DNA 的量。结果是， 没有水凝胶剂的对照样的 DNA 的 量为 14.7±2.6μg/ml， 而具有水凝胶剂的试样的 DNA 的量为 17.4±1.5μg/ml。由于 DNA 的量随细胞数成比例增加， 故可以证实水凝胶可用于保存肝细胞。
< 实施例 10>( 通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的组合物在保存软骨细胞上的效果) 使用通过与实施例 7 中所述相同的合成方法获得的水凝胶剂以及与实施例 8 中进 行流变性测定所用同一批次的试样进行软骨细胞保存的研究。
将大鼠软骨细胞 (1.2×106 个细胞 ) 封入 (enclosed) 包含 2w/v％浓度的水凝胶 剂和细胞培养介质的水凝胶中， 接着将其置于 Eppendorf 试管中并在冰箱中保存一夜。第 二天， 收集细胞， 在 24 孔平板中播种并在用于软骨细胞的介质中培养。以每周两次的频率 更换介质。通过吸气法 (aspiration) 除去培养上清液 (supernatant) 之后， 添加 1ml 的新 鲜介质并培养 3 周。在最后一天， 通过吸气法除去培养液， 接着用 0.5ml 的 PBS(-) 洗涤细 胞。通过 1ml 的蛋白酶 ( 菠萝蛋白酶 ) 溶液在 60℃处将细胞酶分解 30 分钟。测定经处理 的溶液中的 DNA 的量。结果是， 没有水凝胶剂的对照样的 DNA 的量为 10.5±0.0μg/ml， 而 具有水凝胶剂的试样的 DNA 的量为 17.8±1.7μg/ml。 由于 DNA 的量随细胞数成比例增加， 故可以证实水凝胶可用于保存软骨细胞。
< 实施例 11>
( 包含如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R4 ＝ OCH3) 和如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 的组合物的合成 )
将分子量为 2000 的 PEG(4.00g， 2.00mmol) 溶于吡啶 (10ml) 中， 接着添加对甲苯 磺酰氯 (0.76g， 4.00mmol) 并在室温下搅拌 3 小时。在反应完成后， 添加氯仿 (100ml) 并用 1M HCl(100ml) 进行中和。用 4％的 NaHCO3 水溶液和卤水洗涤溶液。用无水硫酸钠干燥有 机相。在过滤后， 在真空中除去溶剂。通过硅胶柱层析 ( 氯仿∶甲醇＝ 10 ∶ 1) 提纯残留 物以获得分子量为 2000 的单甲苯磺酰化的 PEG(4.140g， 1.92mmol， 96％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.79(2H， d， J ＝ 8.0Hz， TsO 的 2， 6-H)， 7.34(2H， d， J ＝ 8.0Hz， Ts 的 3， 5-H)， 4.16(2H， t， J ＝ 5.2Hz， CH2OTs)， 3.83 ～ 3.45( ～ 178H， m， OCH2×89)， 2.45(3H， s， Ts 的 4-CH3)。
将分子量为 2000 的单甲苯磺酰化的 PEG(4.140g， 1.92mmol) 溶于乙腈 (20ml) 中， 接着添加叠氮化钠 (0.195g， 3.00mmol) 并回流 32 小时。在反应完成后， 将溶液冷却至室温 并添加水 (20ml)。 添加二氯甲烷并萃取有机相， 接着用无水硫酸钠干燥。 在过滤后， 在真空 中除去溶剂以获得分子量为 2000 的单叠氮化的 PEG(3.280g， 1.62mmol， 84％ )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 3.83 ～ 3.45( ～ 178H， m， OCH2×89)， 3.39(2H， t， J ＝ 5.2Hz， CH2N3)。
将分子量为 2000 的单叠氮化的 PEG(1.537g， 0.759mmol) 溶于吡啶 (5ml) 中， 添加 三苯基膦 (0.394g， 1.50mmol) 并在室温下搅拌 2 小时。在反应完成后， 添加 28％的 NH4OH 水溶液 (10ml) 并静置 2 小时。在真空中除去溶剂以获得分子量为 2000 的单氨基化的 PEG 产品。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 3.83 ～ 3.45( ～ 178H， m， OCH2×89)， 2.86(2H， t， J ＝ 5.2Hz， CH2N)。
将 3， 5- 二 ( 四癸氧基 )-4- 甲氧基苯甲酸 (0.202g， 0.350mmol) 溶于二氯甲烷 (5ml) 中， 接着添加 HOBt(0.060g， 0.420mmol) 和 EDC·HCl(0.081g， 0.420mmol) 并在室温
下搅拌 1 小时。通过使用滴液漏斗向二氯甲烷溶液中逐滴添加分子量为 2000 的单氨基化 PEG 衍生物 ( 过量的未经提纯的产品 ) 的二氯甲烷溶液 (5ml)， 接着进一步搅拌 1 小时。在 反应完成后， 用 4％的 NaHCO3 水溶液和卤水洗涤溶液。用无水硫酸钠干燥有机相。在过滤 后， 在真空中除去溶剂。通过预备的硅胶薄层色谱法 ( 氯仿∶甲醇＝ 9 ∶ 1) 提纯残留物以 获得产品 (0.439g， 0.172mmol， 49％ )( 作为如式 (2) 所示的单种化合物被计算 )。 1
H-NMR(CDCl3)δ ＝ 7.03(2H， s， 2， 6-H)， 6.89(1H， br-t， NH)， 4.03(4H， t， J ＝ 6.6Hz， 3， 5-OCH2)， 3.85(3H， s， 4-OCH3)， 3.71 ～ 3.50( ～ 180H， m， CH2OCH2)， 1.81(4H， 五重峰， J ＝ 7.2Hz， 3， 5-OCCH2)， 1.46(4H， 五重峰， J ＝ 7.6Hz， 3， 5-OC2CH2)， 1.36 ～ 1.22(40H， m， 3， 5-OC3C10H20)， 0.88(6H， t， J ＝ 6.8Hz， 3， 5-OC13CH3)。
在与实施例 7 中所用相同的条件下对产品进行 MALDI-TOF/MS 测定。
除了具有与分子量为 2000 的初始 PEG 相似的分子量分布、 与如式 (2) 所示的单 端酰胺化合物 ( 其中 X ＝ OH， k2 ＝ 0， m2 ＝ 42 至 45， n2 ＝ 2， R4 ＝ R6 ＝ OC14H29 以及 R5 ＝ OCH3) 的分子量分布相当的化合物的峰之外， 还检测到另一分子量大于 557 并且分子量分布 与如式 (1) 所示的化合物 ( 其中 k1 ＝ 0， m1 ＝ 42 至 45， n1 ＝ 2， R， 1 ＝ R3 ＝ OC14H29 以及 R2 ＝ OCH3) 类似的化合物的峰。可确认产生了双端酰胺型化合物。
在许多进行的分析中， 单端酰胺型衍生物的峰高与双端酰胺型衍生物的峰高的比 例为约 4 ∶ 1。
< 实施例 12>
( 通过使用与实施例 11 中所述相同的合成方法获得的组合物的流变性测定 )
对通过使用与实施例 11 中所述相同的合成方法获得的组合物进行 HPLC 分析 ( 柱子 ： DAISO PAK SP-200-5-C4-P， 柱子的温度 ： 40℃， 溶剂 ： 70-99％的乙腈水溶液， 0.1％ TFA， 线性浓度梯度， 流速 ： 1.0ml/min)。结果是， 获得了包含混合比为 0.16 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物和如式 (2) 所示的单端酰胺型化合物的组合物 1。为了分析组 合物 1 的溶胶 - 凝胶转变， 对试样的水溶液的粘弹性进行测定。将组合物 1 的浓度调节为 1wt％， 2wt％， 8wt％和 15wt％。 在充分搅拌以获得均一溶液后， 将试样的水溶液保存在冷藏 柜中。通过使用与实施例 8 中所用相同的方法进行流变性测定。结果如图 8 所示。
类似地， 获得了包含混合比为 0.45 ∶ 1 的如式 (1) 所示的双端酰胺型化合物和如 式 (2) 所示的单端酰胺型化合物的组合物 2。为了分析组合物 2 的溶胶 - 凝胶转变， 对试样 的水溶液的粘弹性进行测定。将组合物 2 的浓度调节为 1wt％， 2wt％， 8wt％和 15wt％。在 充分搅拌以获得均一溶液后， 将试样的水溶液保存在冷藏柜中。通过使用与实施例 8 中所 用相同的方法进行流变性测定。结果如图 9 所示。
结果证实， 可通过改变单端酰胺型衍生物与双端酰胺型衍生物的混合比来控制凝 胶转变温度， 这对应于实施例 6 中的通过混合比进行凝胶转变温度控制的结果。特别地， 包 含混合比为 0.45 ∶ 1 的如式 (1) 所示的化合物和如式 (2) 所示的化合物的组合物 2(15wt％ 的浓度 ) 的凝胶转变温度为约 23℃。由此证实， 组合物 2 提供了理想的水凝胶用于细胞培 养载体， 其在 37℃这一通常用于培养动物细胞的温度处为凝胶状态， 并且在用于收集细胞 的较低温度处转变为溶胶状态。
工业应用
本发明提供的水凝胶具有已知为生物相容的低聚 - 或聚 ( 乙二醇 ) 分子， 本发明的水凝胶可用于三维细胞培养、 细胞和蛋白质的分离 / 提纯以及蛋白质药学制品的可控释 放等。