一株高产原果胶酶的菌株及一种发酵提取果胶的方法 【技术领域】
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一株高产原果胶酶的菌株及采用该菌株发酵提取果胶的方法。
背景技术
果胶以原果胶、可溶性果胶、果胶酸等形式广泛分布于植物的果实、根茎及叶中。作为一种重要的食品添加剂，果胶在市场上非常缺乏，目前国际市场价格在17,000美元/吨左右。桔皮是桔子深加工等的副产物，是工业生产果胶的主要原料之一，其中含有约30％(占桔皮干重)的果胶。目前，从桔皮中提取果胶的方法主要有酸解法、微波法、离子交换树脂法、微生物法等几类。
酸解法为工业提取果胶最传统的方法。其原理是采用稀酸将果皮细胞中的非水溶性原果胶水解为水溶性果胶。该法具有快速、简单、成本较低等优点，果胶产率能达到26％以上，但提取过程中果胶分子会发生局部水解，降低了果胶相对分子质量，从而影响果胶收率和质量；果胶提取液黏度大导致过滤困难；生产过程中产生的废渣难以处理；同时因为酸的大量应用，对设备的腐蚀也较大。
微波法是利用高功率的电磁波穿透被提取介质内部维管束和细胞系统，由于吸收微波能，细胞内部温度迅速上升，细胞受到的内部压力超过细胞壁承受能力导致细胞破裂，从而细胞内有效成分自由流出，通过在较低的温度条件下萃取介质、溶解，进一步过滤并、分离，即可获得提取物。微波法提取法不仅具有简单、快速等优势，而且产量很高，几乎能够完全提取出果皮中的果胶。但能耗较大，也因为反应条件剧烈，造成后期固液难分离。
离子交换树脂法的工艺流程为：将处理过的柑橘皮脱水后粉碎，与离子交换树脂和水制成的浓浆液在搅拌下加热过滤，分离出不溶性的离子交换剂和废渣，得到含有果胶的滤液。用该法提取桔皮中的果胶，产率能够达到22％～23％，果胶的质量也较好，但同样采用了较高浓度的酸，对设备的腐蚀也较大。
微生物法的原理是利用微生物生长过程中分泌的原果胶酶将植物组织中原果胶分解为可溶的果胶，进而可以将发酵液过滤、浓缩并用沉淀剂将发酵液中的果胶沉淀提取出来。微生物法首先由日本人sakai等提出，其用一株产原果胶酶菌株Trichosporon penicillatum应用到桔皮果胶提取中，果胶产率能达到13.3％(与桔皮干重之比)。此后，JC Contreras Esquivel等人利用从Aspergillus kawachii IFO 4308培养基原果胶酶溶液提取桔皮果胶，产率达到17.7％(与桔皮干重之比)。采用微生物发酵法萃取的果胶分子量大、果胶的胶凝度高、质量稳定、提取液中果皮不破碎(易于固液分离)，无需进行热处理或酸处理，具有低消耗、低污染、产品质量稳定等一系列优点。但就目前的工艺来看，该法还存在产率不高的不足。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一株高产原果胶酶的黑曲霉菌株Aspergillusniger CD-01。
本发明涉及的黑曲霉菌株已于2009年3月4日提交保藏。保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 209036，分类命名为：黑曲霉CD-01，Aspergillusniger CD-01。
本发明的另一目的在于针对现有果胶提取技术存在的不足，提供一种生产成本低、产品质量好、产出高且副产品经济价值高的微生物发酵提取果胶的方法。
本发明的微生物发酵提取果胶的方法包括以下步骤：
1)斜面培养：将黑曲霉孢子接种至斜面培养基上，34-36℃下培养3-5天，用无菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子悬液并稀释至1.0-2.5×106个/mL，冷藏于4℃备用；
2)发酵：取当季无霉变的干桔皮按水料质量比为10-20∶1投入到蒸馏水中，静置25-35min，将pH值调至4.5-5.5，高压灭菌15-25min，冷却后按质量比加入0.1-0.2％的尿素，按质量比接种5-15％的黑曲霉孢子悬液，恒温摇床中培养24-48h，温度为34-36℃，转速为150-210r/min；
3)果胶提取：将培养液过滤或离心，将分离得到的发酵溶液采用2.4倍体积的95％乙醇进行沉淀提取，沉淀分离后用70％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥即得产品。
所述斜面培养最佳条件为：34-36℃下培养4天，接种用孢子悬液优选浓度为：1.0-2.5×106个/mL。
所述发酵步骤中最佳pH值为4.5-5.5，尿素的优选添加量为0.1-0.2％，黑曲霉孢子接种在无菌条件下进行，最佳接种量为5-15％。
所述发酵步骤中最佳培养条件为：恒温摇床中培养24-28h，温度为34-36℃，转速为150-210r/min。
所述滤液中存在的大量高活性果胶酶，久置会分解其中的果胶分子，影响果胶质量，因此在离心或过滤得到果胶溶液后，应立即加入乙醇进行沉淀。
与现有技术相比较，本发明具有以下优势：
1)成本较低：整个发酵提取过程条件温和，对设备要求不高且耗能低；此外桔皮原料不需破碎，发酵溶液固液分离更容易，因此与其他方法相比成本要低很多；
2)产率较高：本发明的果胶提取产率高达24.5％(与桔皮干重之比)，与现有的微生物提取果胶方法相比，产率大大提高，与传统果胶提取方法产率相当；
3)产品质量好：果胶产品分子量大，胶凝度高，质量稳定，各项指标均符合果胶标准QB 2484-2000；
4)副产品经济价值高：发酵液中除了果胶外还存在大量的原果胶酶和果胶酶，均有很高的经济价值，这是其他果胶提取方法所不具备的。
【具体实施方式】
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，本发明可以按发明内容所述的任一方式实施。
实施例1：
将黑曲霉孢子接种到斜面培养基上于35℃生长4天后，用无菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子悬液并稀释到1.75×106个/mL，冷藏于4℃备用。
取当季无霉变的干桔皮6.67g投入到装有100mL蒸馏水地250mL三角瓶中，静置30min，将pH值准确调至5.0，高压灭菌25min；冷却后在无菌条件下加入尿素0.14g，再加入黑曲霉孢子悬液10mL，孢子浓度为1.75×106个/mL；将接种后的摇瓶在恒温摇床中培养培养36h，设置温度为35℃，转速为180r/min；将培养液过滤或离心(取1mL用于产量测定)，取滤液用2.4倍体积的95％的乙醇对果胶进行沉淀、过滤，用20mL、70％的乙醇将果胶沉淀洗涤两次，将最后将得到的果胶沉淀冷冻干燥。采用硫酸咔唑法测定果胶含量，测得果胶产率为24.5％(与桔皮干重之比)。
实施例2：
将黑曲霉孢子接种到斜面培养基上于35℃生长4天后，用无菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子悬液并稀释到1.75×106个/mL，冷藏于4℃备用。
取当季无霉变的干桔皮6.67g投入到装有100mL蒸馏水的250mL三角瓶中，静置35min，将pH值准确调至5.5，高压灭菌20min；冷却后在无菌条件下加入尿素0.15g，再加入黑曲霉孢子悬液10mL，孢子浓度为1.75×106个/mL；将接种后的摇瓶在恒温摇床中培养培养32h，设置温度为36℃，转速为150r/min；将培养液过滤或离心(取1mL用于产量测定)，取滤液用2.4倍体积的95％的乙醇对果胶进行沉淀、过滤，用20mL、70％的乙醇将果胶沉淀洗涤两次，将最后将得到的果胶沉淀冷冻干燥。采用硫酸咔唑法测定果胶含量，测得果胶产率为22.8％(与桔皮干重之比)。
实施例3：
将黑曲霉孢子接种到斜面培养基上于35℃生长4天后，用无菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子悬液并稀释到1.75×106个/mL，冷藏于4℃备用。
取当季无霉变的干桔皮6.67g投入到装有100mL蒸馏水的250mL三角瓶中，静置25min，将pH值准确调至4.5，高压灭菌15min；冷却后在无菌条件下加入尿素0.14g，再加入黑曲霉孢子悬液10mL，孢子浓度为1.7×106个/mL；将接种后的摇瓶在恒温摇床中培养培养40h，设置温度为34℃，转速为200r/min；将培养液过滤或离心(取1mL用于产量测定)，取滤液用2.4倍体积的95％的乙醇对果胶进行沉淀、过滤，用20mL、70％的乙醇将果胶沉淀洗涤两次，将最后将得到的果胶沉淀冷冻干燥。采用硫酸咔唑法测定果胶含量，测得果胶产率为23.1％(与桔皮干重之比)。