同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 的三重实时荧光定量 PCR 方法 及试剂盒 【技术领域】
本发明涉及医学分子生物检测技术。特别是一种可同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 的 三重实时荧光定量 PCR 方法及试剂盒。可应用于移植后病人或其他免疫抑制状态下病人血 清或其他样品中三种病毒载量的同时监测。技术背景
器官移植是现代医学的标志性学科之一。自 1959 年首例肾移植成功以来目前世 界上已有 70 多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生， 而且这个数字还在以每年近 5 万 的速度增加。截至 2003 年， 我国累计完成肾脏移植 5 万多例， 现在每年完成超过 5000 例， 数量仅次于美国位居世界第二位。中国约有 100 多万尿毒症患者， 每年还有近 12 万的新增 病人。对这些患者， 肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存活， 始终是 肾移植成功与否的主要问题。 感染是器官移植手术后重要的并发症之一， 也是造成器官移植失败的重要原因。 在移植早期， 感染造成的死亡率达 40％ -78％。随着新的免疫抑制药物的出现及其联合应 用， 使单一药物用量有所下降， 从而使感染引起的移植早期死亡率显著下降。尽管如此， 在 导致器官移植受者死亡的原因中， 感染仍居首位， 其中病毒感染占很大的比例。 移植后病毒 感染早期可能没有明显的临床表现， 对移植肾的损伤也不易被发现， 感染后期却会影响移 植肾的功能。 同时， 不同的病毒感染， 往往需要不同的治疗方案才能奏效， 因此， 尽早诊断和 预防病毒感染， 同时进行病毒载量与感染情况的不断监测， 对降低肾移植后病毒感染的危 害有很大的临床意义。
巨细胞病毒 (Cytomegalovirus CMV)， EB 病毒， Epstein-Barr virus(EBV) 以及 BK 病毒 BK(polyomavirus BKV) 是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感 染情况下， 也会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检 测。最常用的为免疫学方法和定量 PCR 方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染 情况， 病人要想了解这三种病毒的感染情况， 至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明， 这三种病毒存在共感染的情况， 如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法， 将会使检 测过程变得方便、 快速。
实时荧光定量 PCR 技术 (Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction， Real Time PCR) 以其快速、 灵敏、 特异、 重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之 一， 广泛的应用在各种病毒上。特别是 Taqman 探针技术， 应用更加广泛。在移植相关病毒 检测领域目前已经有成熟的 CMV， BKV， EBV 病毒 Taqman 探针定量 PCR 检测试剂盒， 均能够准 确迅速的检测病毒的载量。然而如前所述， 这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。
多重荧光定量 PCR 技术是在荧光定量 PCR 基础上发展起来的一个新技术， 它强调 在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量 PCR 技术应用于 病毒诊断检测领域。在移植后病毒检测方面， Kaoru Wada 等用多重定量 PCR 技术， 同时检
测 27 例造血干细胞病人和 19 例肝移植病人全血样品中的 HHV-6 病毒， CMV 以及 EBV 病毒 共计 303 份样品， 结果显示多重 PCR 体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。 YasuhitoFunahashi 等用多重定量 PCR 技术同时检测 BKV 病毒、 JCV 病毒以及腺病毒， 同样 取得良好结果。这些结果都说明了多重 PCR 技术用于病毒检测可靠性。但是到目前为止， 尚无报道有同时检测 CMV 病毒， EBV 病毒以及 BKV 病毒的试剂盒。 发明内容 本发明的目的在于提供一种能同时检测 CMV 病毒， EBV 病毒以及 BKV 病毒的多重 定量 Taqman PCR 方法， 同时基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于人全血或尿液 标本的检测。
一种同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 的三重实时荧光定量 PCR 方法， 其特征在于， 所述 实时荧光定量 PCR 的反应体系中同时采用以下三套引物及探针 ：
CMV-FP ： ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，
CMV-RP ： GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，
CMV- 探针 ： CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1 ；
EBV-FP ： GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，
EBV-RP ： ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，
EBV- 探针 ： CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1 ；
BKV-FP ： AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，
BKV-RP ： TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，
BKV- 探针 ： A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；
CMV- 探针， EBV- 探针和 BKV- 探针的 5’ 端标记的荧光素不同， 分别为 FAM， HEX 和 ROX。
所述实时荧光定量 PCR 的体系如下 ：
2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix ： 12.5ul， 5uM CMV-FP ： 0.5ul， 5uM CMV-RP0.5ul， uM CMV- 探针 1ul， 5uM EBV-FP 0.5ul， 5uM EBV-RP 0.5ul， 5uM EBV- 探 针 1ul， 5uMBKV-FP 0.5ul， 5uM BKV-RP 0.5ul， 5uM BKV- 探针 1ul， 待测模板 1 ～ 3ul， 补充 双蒸水至 25ul。
所述实时荧光定量 PCR 的反应程序如下 ：
Step 1 95℃ 15min，
Step 2 94℃ 60s，
Step 3 60℃ 60s，
Step 4 读数， Go to step 2 for 40 个循环。
同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 病毒的三重实时荧光定量 PCR 试剂盒， 其特征在于包 括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针 ：
CMV-FP ： ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，
CMV-RP ： GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，
CMV- 探针 ： CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1 ；
EBV-FP ： GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，
EBV-RP ： ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT， EBV- 探针 ： CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1 ； BKV-FP ： AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA， BKV-RP ： TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA， BKV- 探针 ： A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ； CMV- 探针， EBV- 探针和 BKV- 探针的 5’ 端标记的荧光素不同， 分别为 FAM， HEX 和ROX。 还包括 EBV、 BKV 和 CMV 病毒基因的三种病毒， 每种病毒分别 6 个浓度梯度的 18 个 标准品。
所述标准品的浓度梯度分别为 1×106 拷贝 /ul， 1×105 拷贝 /ul， 1×104 拷贝 /ul， 1×103 拷贝 /ul， 1×102 拷贝 /ul， 1×101 拷贝 /ul。
还包括病毒 DNA 提取试剂。
还包括实时荧光定量 PCR 扩增所需的 PCR 缓冲液、 Taq 酶， dNIPs。
所述引物、 荧光探针、 PCR 缓冲液、 Taq 酶和 dNIPs 混合呈 PCR 预混液。
本发明根据三种病毒的基因组序列特征， 分别设计三种病毒的特异性引物和探 针， 探针分别用三种不同荧光素标。 经试验证明， 三套探针引物同时扩增待测模板或人工配 置的验证标准品， 都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量， 且互不干扰。
根据设计得到的三套引物及荧光探针， 本发明提供了实时荧光定量 PCR 方法和试 剂盒， 并提供了优化的 PCR 体系和程序。当然本领域技术人员根据实时荧光定量 PCR 的一 般要求可以调整 PCR 体系和程序， 也同样能够实现检测的目的。
在本发明提供的试剂盒的一种优选实施方式中， 在试剂盒中装入包括含有 EBV、 BKV 和 CMV 三种病毒模板的呈浓度梯度的 6 份标准品， 用于制备标准曲线。
为了更进一步提高试剂盒的方便程度， 在制备的一些试剂盒中， 装入病毒 DNA 提 取试剂， 实时荧光定量 PCR 所需的缓冲液， Taq 酶， dNTPs 等试剂。
在一个优选实施例中， 优选将引物， 探针， 缓冲液， Taq 酶， dNTPs 等试剂按比例混 合制成预混液， 用于检测时， 加入待测模板即可。
附图说明
图 1 单重扩增系统与三重扩增系统扩增三种病毒标准品建立的标准曲线 具体实施方式
实施例 1 三种病毒引物以及 Taqman 探针的设计和体系优化
根 据 NCBI 公 布 的 CMV、 EBV 和 BKV 病 毒 基 因 组 序 列， 使 用 Primer Express 3(Applied Biosystems) 以及 Primer Premier 5(Premier Biosoft International) 引物 设计软件， 所设计引物以及探针序列如表 1 所示 ：
表 1 所设计的检测引物和荧光标记
三种引物扩增片段分别如 Seq ID No.1 ～ 3 所示
表 1 中标记于 Taqman 探针两端的 HEX， BHQ1， ROX， BHQ2 和 FAM 是本领域常用的 Taqman 探针的荧光标记物和淬灭基团， 其全称如下 ：
以上引物探针由上海生物工程有限公司合成。
实施例 2. 三种病毒基因序列的克隆
定量 PCR 绝对定量的基础是构建标准曲线， 根据所设计 Taqman 探针引物的序列， 在其两端设计 PCR 引物， 以 ATCC( 美国标准生物品收藏中心 )CMV 质粒、 BKV 病毒， BKV 病毒 标准质粒为模板， 进行扩增， 将扩增产物克隆到 T 载体上， 进行转化并鉴定。最终得到克隆 有目标序列的质粒标准品。再将其进行定量稀释， 构建成标准曲线。具体操作步骤如下 ： 1 目标序列克隆引物的设计
根据 Genebank 中三种病毒的基因组序列， 结合已经设计的 Taqman 探针引物序列， 使用 Primer Premier 6 软件， 设计三个病毒的克隆引物， 其序列如下表 2 ：
2 目标基因 PCR 扩增 以 ATCC 标准质粒为模板， 用以上三对引物分别对目标序列进行扩增， 扩增体系如下：
PCR 扩增条件如下 ： 95 ℃预变性 15min ； 94 ℃变性 30s， 53 ℃退火 30s， 72 ℃延伸 60s， 扩增 30 个循环 ； 72℃延伸 10min。(MJ research PTC-200)
3 将目标基因克隆到 T-easy Vector 上
将 PCR 产 物 进 行 凝 胶 分 离， 并 从 凝 胶 中 回 收 特 定 的 PCR 产 物， 并将其连接到 Promega 公司的 pGEM-T Easy Vectors 上， 所有步骤按照说明书进行。
用连接产物转化感受态的 DH5a 菌 ( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )， 并进 行蓝白斑筛选。阳性菌落首先进行 PCR 检测， PCR 检测阳性的样品送往上海生工进行质粒 DNA 测序进一步确认阳性菌落。测序结果如 Seq ID No.4 ～ 6 所示。
4 标准品的构建
培养细菌， 用 TIANGEN 公司大量质粒提取试剂盒提取质粒， 所有步骤按照说明书 进行。用 pH 8.0 的 TE 缓冲液 ( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ) 溶解质粒， 用分光 光度计对其进行浓度精确定量。
根据测定浓度将其稀释成每微升 1×108 个拷贝浓度的储存液。并进行 10 倍梯度 稀释到每微升 10 个拷贝。
实施例 3. 标准曲线以及多重荧光实时定量 PCR(Triplex Real-time PCR) 体系建 立
将构建的三种质粒标准品分别稀释成 1000000 拷贝 /ul， 100000 拷贝 /ul， 10000 拷贝 /ul， 1000 拷贝 /ul， 100 拷贝 /ul， 作为扩增模板， 分别建立多重扩增体系和单个扩增体 系， 体系配比如下 ：
三重体系 ：
单个体系 ：
扩增反应条件均为 ：荧 光 定 量 PCR 仪 器 为 ： MJ Research Chromo 4， 分 析 软 件， Opticon Monitor Version 2.03， MJ Research
结果 ： 如表 3 以及图 1 所示， 每个基因的标准品同一浓度在单重扩增体系和多重 扩增体系中的 Ct 值基本上一致， 说明各个扩增之间没有干扰， 从扩增结果图 ( 图 1) 可以看 出， 不管是多重扩增还是单重扩增， 扩增结果的线性都非常好， 线性系数均大于 0.99， 说明 设计的引物探针以及扩增体系， 可以很好的扩增目标基因。
表3： 单个扩增系统与三重扩增系统 ct 值比较
实施例 4 三种基因同时扩增干扰分析， 检测体系重复性分析
配制以下病毒质粒样品混合液进行测试 ：
1#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应 ；
2#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应 ；
3#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
4#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
5#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
6#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应 ；
7#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应 ；
8#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
9#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
10#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
采用实施例 3 的三重体系对混合配制的样品进行扩增， 每个样品测试 10 个重复 样， 测定完成后， 计算结果的准确性以及变异系数 cv％。
结果如表 4 所示， 在三重体系中， 各样品回收率均在 90％ -110％之间， 测定的变异 系数均小于 15％。在含有人基因组 DNA 的样品中 ( 样品 8#， 9#， 10#)， 扩增结果的回收率和 变异系数与没有混入的没有差别， 说明人基因组 DNA 对所设计的引物探针的特异扩增没有 干扰。
表4： 三重体系中不同浓度组合的回收率以及变异系数
实施例 5 试剂盒的制备
试剂盒主要包括以下组分及其制备方法 ：
1# 含有引物及荧光探针， Taq 酶， dNTP 以及其他扩增需要的预混体系， 制备方 法为 ： 将设计和选择好的探针引物混入 2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix(Qiagen 公司货号 ： 204745) 中， 各引物探针的终浓度为 0.2uM， 混合均匀 -20℃保存。使 用时加入反应体系 20ul。
2# 含有三种病毒的质粒标准品， 每种病毒质粒 6 个不同的浓度， 浓度分别， 1×106 拷贝 /ul， 1×105 拷贝 /ul， 1×104 拷贝 /ul， 1×103 拷贝 /ul， 1×102 拷贝 /ul， 1×101 拷贝 /ul ； 制备方法为 ： 将三种质粒按照需要的浓度用无菌水稀释， -20℃保存。
3# 阴性对照， 不含任何模板 DNA 的水溶液 ；
4# 病毒 DNA 提取试剂 ： 采用 QIAGEN 公司生产的 QIAamp DNA Blood Mini Kit 中 的试剂。
实施例 6 用试剂盒扩增临床样品
收集 5 例肾移植的病人的血清样品， 用试剂盒检测样品的三种病毒的载量， 其检 测方法为 ：
1DNA 提取 ： 首先用病毒 DNA 提取试剂盒提取病毒 DNA， 最终溶解在 50ul 洗脱液中。
2 扩增体系设立 ： 每次扩增， 6 个标准曲线点设复孔， 共 12 管， 阴性对照孔 1 孔， 其 他根据样品数量， 每管取 1# 预混试剂的 20ul， 标准曲线孔每孔加入标准品 5ul， 阴性对照孔 加阴性对照 5ul， 样品孔中加入提取的 DNA5ul， 混合好放入机器。
3 曲线扩增 ： 设定以下扩增条件进行扩增反应。
扩增反应条件均为 ：
4 根据标准曲线计算样品中三种病毒的浓度， 5 例病人的病毒浓度测定结果如下。 与采用现有的三种试剂盒 (Qiagen HCMV DNA， 达安基因 EBV kit， 北京同昕 BKV kit) 分别 进行 PCR 扩增定量的结果基本一致。
本发明涉及医学分子生物检测技术。特别是一种可同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 的 三重实时荧光定量 PCR 方法及试剂盒。可应用于移植后病人或其他免疫抑制状态下病人血 清或其他样品中三种病毒载量的同时监测。技术背景
器官移植是现代医学的标志性学科之一。自 1959 年首例肾移植成功以来目前世 界上已有 70 多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生， 而且这个数字还在以每年近 5 万 的速度增加。截至 2003 年， 我国累计完成肾脏移植 5 万多例， 现在每年完成超过 5000 例， 数量仅次于美国位居世界第二位。中国约有 100 多万尿毒症患者， 每年还有近 12 万的新增 病人。对这些患者， 肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存活， 始终是 肾移植成功与否的主要问题。 感染是器官移植手术后重要的并发症之一， 也是造成器官移植失败的重要原因。 在移植早期， 感染造成的死亡率达 40％ -78％。随着新的免疫抑制药物的出现及其联合应 用， 使单一药物用量有所下降， 从而使感染引起的移植早期死亡率显著下降。尽管如此， 在 导致器官移植受者死亡的原因中， 感染仍居首位， 其中病毒感染占很大的比例。 移植后病毒 感染早期可能没有明显的临床表现， 对移植肾的损伤也不易被发现， 感染后期却会影响移 植肾的功能。 同时， 不同的病毒感染， 往往需要不同的治疗方案才能奏效， 因此， 尽早诊断和 预防病毒感染， 同时进行病毒载量与感染情况的不断监测， 对降低肾移植后病毒感染的危 害有很大的临床意义。
巨细胞病毒 (Cytomegalovirus CMV)， EB 病毒， Epstein-Barr virus(EBV) 以及 BK 病毒 BK(polyomavirus BKV) 是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感 染情况下， 也会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检 测。最常用的为免疫学方法和定量 PCR 方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染 情况， 病人要想了解这三种病毒的感染情况， 至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明， 这三种病毒存在共感染的情况， 如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法， 将会使检 测过程变得方便、 快速。
实时荧光定量 PCR 技术 (Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction， Real Time PCR) 以其快速、 灵敏、 特异、 重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之 一， 广泛的应用在各种病毒上。特别是 Taqman 探针技术， 应用更加广泛。在移植相关病毒 检测领域目前已经有成熟的 CMV， BKV， EBV 病毒 Taqman 探针定量 PCR 检测试剂盒， 均能够准 确迅速的检测病毒的载量。然而如前所述， 这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。
多重荧光定量 PCR 技术是在荧光定量 PCR 基础上发展起来的一个新技术， 它强调 在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量 PCR 技术应用于 病毒诊断检测领域。在移植后病毒检测方面， Kaoru Wada 等用多重定量 PCR 技术， 同时检
巨细胞病毒 (Cytomegalovirus CMV)， EB 病毒， Epstein-Barr virus(EBV) 以及 BK 病毒 BK(polyomavirus BKV) 是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感 染情况下， 也会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检 测。最常用的为免疫学方法和定量 PCR 方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染 情况， 病人要想了解这三种病毒的感染情况， 至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明， 这三种病毒存在共感染的情况， 如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法， 将会使检 测过程变得方便、 快速。
实时荧光定量 PCR 技术 (Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction， Real Time PCR) 以其快速、 灵敏、 特异、 重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之 一， 广泛的应用在各种病毒上。特别是 Taqman 探针技术， 应用更加广泛。在移植相关病毒 检测领域目前已经有成熟的 CMV， BKV， EBV 病毒 Taqman 探针定量 PCR 检测试剂盒， 均能够准 确迅速的检测病毒的载量。然而如前所述， 这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。
多重荧光定量 PCR 技术是在荧光定量 PCR 基础上发展起来的一个新技术， 它强调 在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量 PCR 技术应用于 病毒诊断检测领域。在移植后病毒检测方面， Kaoru Wada 等用多重定量 PCR 技术， 同时检
测 27 例造血干细胞病人和 19 例肝移植病人全血样品中的 HHV-6 病毒， CMV 以及 EBV 病毒 共计 303 份样品， 结果显示多重 PCR 体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。 YasuhitoFunahashi 等用多重定量 PCR 技术同时检测 BKV 病毒、 JCV 病毒以及腺病毒， 同样 取得良好结果。这些结果都说明了多重 PCR 技术用于病毒检测可靠性。但是到目前为止， 尚无报道有同时检测 CMV 病毒， EBV 病毒以及 BKV 病毒的试剂盒。 发明内容 本发明的目的在于提供一种能同时检测 CMV 病毒， EBV 病毒以及 BKV 病毒的多重 定量 Taqman PCR 方法， 同时基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于人全血或尿液 标本的检测。
一种同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 的三重实时荧光定量 PCR 方法， 其特征在于， 所述 实时荧光定量 PCR 的反应体系中同时采用以下三套引物及探针 ：
CMV-FP ： ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，
CMV-RP ： GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，
CMV- 探针 ： CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1 ；
EBV-FP ： GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，
EBV-RP ： ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，
EBV- 探针 ： CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1 ；
BKV-FP ： AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，
BKV-RP ： TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，
BKV- 探针 ： A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；
CMV- 探针， EBV- 探针和 BKV- 探针的 5’ 端标记的荧光素不同， 分别为 FAM， HEX 和 ROX。
所述实时荧光定量 PCR 的体系如下 ：
2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix ： 12.5ul， 5uM CMV-FP ： 0.5ul， 5uM CMV-RP0.5ul， uM CMV- 探针 1ul， 5uM EBV-FP 0.5ul， 5uM EBV-RP 0.5ul， 5uM EBV- 探 针 1ul， 5uMBKV-FP 0.5ul， 5uM BKV-RP 0.5ul， 5uM BKV- 探针 1ul， 待测模板 1 ～ 3ul， 补充 双蒸水至 25ul。
所述实时荧光定量 PCR 的反应程序如下 ：
Step 1 95℃ 15min，
Step 2 94℃ 60s，
Step 3 60℃ 60s，
Step 4 读数， Go to step 2 for 40 个循环。
同时检测人 EBV、 BKV 和 CMV 病毒的三重实时荧光定量 PCR 试剂盒， 其特征在于包 括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针 ：
CMV-FP ： ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，
CMV-RP ： GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，
CMV- 探针 ： CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1 ；
EBV-FP ： GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，
EBV-RP ： ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT， EBV- 探针 ： CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1 ； BKV-FP ： AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA， BKV-RP ： TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA， BKV- 探针 ： A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ； CMV- 探针， EBV- 探针和 BKV- 探针的 5’ 端标记的荧光素不同， 分别为 FAM， HEX 和ROX。 还包括 EBV、 BKV 和 CMV 病毒基因的三种病毒， 每种病毒分别 6 个浓度梯度的 18 个 标准品。
所述标准品的浓度梯度分别为 1×106 拷贝 /ul， 1×105 拷贝 /ul， 1×104 拷贝 /ul， 1×103 拷贝 /ul， 1×102 拷贝 /ul， 1×101 拷贝 /ul。
还包括病毒 DNA 提取试剂。
还包括实时荧光定量 PCR 扩增所需的 PCR 缓冲液、 Taq 酶， dNIPs。
所述引物、 荧光探针、 PCR 缓冲液、 Taq 酶和 dNIPs 混合呈 PCR 预混液。
本发明根据三种病毒的基因组序列特征， 分别设计三种病毒的特异性引物和探 针， 探针分别用三种不同荧光素标。 经试验证明， 三套探针引物同时扩增待测模板或人工配 置的验证标准品， 都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量， 且互不干扰。
根据设计得到的三套引物及荧光探针， 本发明提供了实时荧光定量 PCR 方法和试 剂盒， 并提供了优化的 PCR 体系和程序。当然本领域技术人员根据实时荧光定量 PCR 的一 般要求可以调整 PCR 体系和程序， 也同样能够实现检测的目的。
在本发明提供的试剂盒的一种优选实施方式中， 在试剂盒中装入包括含有 EBV、 BKV 和 CMV 三种病毒模板的呈浓度梯度的 6 份标准品， 用于制备标准曲线。
为了更进一步提高试剂盒的方便程度， 在制备的一些试剂盒中， 装入病毒 DNA 提 取试剂， 实时荧光定量 PCR 所需的缓冲液， Taq 酶， dNTPs 等试剂。
在一个优选实施例中， 优选将引物， 探针， 缓冲液， Taq 酶， dNTPs 等试剂按比例混 合制成预混液， 用于检测时， 加入待测模板即可。
附图说明
图 1 单重扩增系统与三重扩增系统扩增三种病毒标准品建立的标准曲线 具体实施方式
实施例 1 三种病毒引物以及 Taqman 探针的设计和体系优化
根 据 NCBI 公 布 的 CMV、 EBV 和 BKV 病 毒 基 因 组 序 列， 使 用 Primer Express 3(Applied Biosystems) 以及 Primer Premier 5(Premier Biosoft International) 引物 设计软件， 所设计引物以及探针序列如表 1 所示 ：
表 1 所设计的检测引物和荧光标记
三种引物扩增片段分别如 Seq ID No.1 ～ 3 所示
表 1 中标记于 Taqman 探针两端的 HEX， BHQ1， ROX， BHQ2 和 FAM 是本领域常用的 Taqman 探针的荧光标记物和淬灭基团， 其全称如下 ：
以上引物探针由上海生物工程有限公司合成。
实施例 2. 三种病毒基因序列的克隆
定量 PCR 绝对定量的基础是构建标准曲线， 根据所设计 Taqman 探针引物的序列， 在其两端设计 PCR 引物， 以 ATCC( 美国标准生物品收藏中心 )CMV 质粒、 BKV 病毒， BKV 病毒 标准质粒为模板， 进行扩增， 将扩增产物克隆到 T 载体上， 进行转化并鉴定。最终得到克隆 有目标序列的质粒标准品。再将其进行定量稀释， 构建成标准曲线。具体操作步骤如下 ： 1 目标序列克隆引物的设计
根据 Genebank 中三种病毒的基因组序列， 结合已经设计的 Taqman 探针引物序列， 使用 Primer Premier 6 软件， 设计三个病毒的克隆引物， 其序列如下表 2 ：
2 目标基因 PCR 扩增 以 ATCC 标准质粒为模板， 用以上三对引物分别对目标序列进行扩增， 扩增体系如下：
PCR 扩增条件如下 ： 95 ℃预变性 15min ； 94 ℃变性 30s， 53 ℃退火 30s， 72 ℃延伸 60s， 扩增 30 个循环 ； 72℃延伸 10min。(MJ research PTC-200)
3 将目标基因克隆到 T-easy Vector 上
将 PCR 产 物 进 行 凝 胶 分 离， 并 从 凝 胶 中 回 收 特 定 的 PCR 产 物， 并将其连接到 Promega 公司的 pGEM-T Easy Vectors 上， 所有步骤按照说明书进行。
用连接产物转化感受态的 DH5a 菌 ( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 )， 并进 行蓝白斑筛选。阳性菌落首先进行 PCR 检测， PCR 检测阳性的样品送往上海生工进行质粒 DNA 测序进一步确认阳性菌落。测序结果如 Seq ID No.4 ～ 6 所示。
4 标准品的构建
培养细菌， 用 TIANGEN 公司大量质粒提取试剂盒提取质粒， 所有步骤按照说明书 进行。用 pH 8.0 的 TE 缓冲液 ( 购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ) 溶解质粒， 用分光 光度计对其进行浓度精确定量。
根据测定浓度将其稀释成每微升 1×108 个拷贝浓度的储存液。并进行 10 倍梯度 稀释到每微升 10 个拷贝。
实施例 3. 标准曲线以及多重荧光实时定量 PCR(Triplex Real-time PCR) 体系建 立
将构建的三种质粒标准品分别稀释成 1000000 拷贝 /ul， 100000 拷贝 /ul， 10000 拷贝 /ul， 1000 拷贝 /ul， 100 拷贝 /ul， 作为扩增模板， 分别建立多重扩增体系和单个扩增体 系， 体系配比如下 ：
三重体系 ：
单个体系 ：
扩增反应条件均为 ：荧 光 定 量 PCR 仪 器 为 ： MJ Research Chromo 4， 分 析 软 件， Opticon Monitor Version 2.03， MJ Research
结果 ： 如表 3 以及图 1 所示， 每个基因的标准品同一浓度在单重扩增体系和多重 扩增体系中的 Ct 值基本上一致， 说明各个扩增之间没有干扰， 从扩增结果图 ( 图 1) 可以看 出， 不管是多重扩增还是单重扩增， 扩增结果的线性都非常好， 线性系数均大于 0.99， 说明 设计的引物探针以及扩增体系， 可以很好的扩增目标基因。
表3： 单个扩增系统与三重扩增系统 ct 值比较
实施例 4 三种基因同时扩增干扰分析， 检测体系重复性分析
配制以下病毒质粒样品混合液进行测试 ：
1#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应 ；
2#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应 ；
3#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
4#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
5#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应 ；
6#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应 ；
7#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应 ；
8#CMV 5000 拷贝 / 反应， EBV10000 拷贝 / 反应， BKV200 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
9#CMV 200 拷贝 / 反应， EBV5000 拷贝 / 反应， BKV10000 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
10#CMV 10000 拷贝 / 反应， EBV200 拷贝 / 反应， BKV5000 拷贝 / 反应， 混合于含有 200ng/ml 人基因组 DNA 的溶液里 ；
采用实施例 3 的三重体系对混合配制的样品进行扩增， 每个样品测试 10 个重复 样， 测定完成后， 计算结果的准确性以及变异系数 cv％。
结果如表 4 所示， 在三重体系中， 各样品回收率均在 90％ -110％之间， 测定的变异 系数均小于 15％。在含有人基因组 DNA 的样品中 ( 样品 8#， 9#， 10#)， 扩增结果的回收率和 变异系数与没有混入的没有差别， 说明人基因组 DNA 对所设计的引物探针的特异扩增没有 干扰。
表4： 三重体系中不同浓度组合的回收率以及变异系数
实施例 5 试剂盒的制备
试剂盒主要包括以下组分及其制备方法 ：
1# 含有引物及荧光探针， Taq 酶， dNTP 以及其他扩增需要的预混体系， 制备方 法为 ： 将设计和选择好的探针引物混入 2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix(Qiagen 公司货号 ： 204745) 中， 各引物探针的终浓度为 0.2uM， 混合均匀 -20℃保存。使 用时加入反应体系 20ul。
2# 含有三种病毒的质粒标准品， 每种病毒质粒 6 个不同的浓度， 浓度分别， 1×106 拷贝 /ul， 1×105 拷贝 /ul， 1×104 拷贝 /ul， 1×103 拷贝 /ul， 1×102 拷贝 /ul， 1×101 拷贝 /ul ； 制备方法为 ： 将三种质粒按照需要的浓度用无菌水稀释， -20℃保存。
3# 阴性对照， 不含任何模板 DNA 的水溶液 ；
4# 病毒 DNA 提取试剂 ： 采用 QIAGEN 公司生产的 QIAamp DNA Blood Mini Kit 中 的试剂。
实施例 6 用试剂盒扩增临床样品
收集 5 例肾移植的病人的血清样品， 用试剂盒检测样品的三种病毒的载量， 其检 测方法为 ：
1DNA 提取 ： 首先用病毒 DNA 提取试剂盒提取病毒 DNA， 最终溶解在 50ul 洗脱液中。
2 扩增体系设立 ： 每次扩增， 6 个标准曲线点设复孔， 共 12 管， 阴性对照孔 1 孔， 其 他根据样品数量， 每管取 1# 预混试剂的 20ul， 标准曲线孔每孔加入标准品 5ul， 阴性对照孔 加阴性对照 5ul， 样品孔中加入提取的 DNA5ul， 混合好放入机器。
3 曲线扩增 ： 设定以下扩增条件进行扩增反应。
扩增反应条件均为 ：
4 根据标准曲线计算样品中三种病毒的浓度， 5 例病人的病毒浓度测定结果如下。 与采用现有的三种试剂盒 (Qiagen HCMV DNA， 达安基因 EBV kit， 北京同昕 BKV kit) 分别 进行 PCR 扩增定量的结果基本一致。
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