一种同时提取马尾松针叶总 RNA 和基因组 DNA 的方法 【技术领域】
本发明属于分子生物学领域， 涉及马尾松针叶总 RNA 和基因组 DNA 同时提取的方法。 背景技术
马尾松是我国南方重要的用材树种， 其常规育种取得了较大进展， 但其分子育种 一直进展缓慢， 开展马尾松分子水平上的基础性技术开发很有必要。
高效提取植物总 RNA 和基因组 DNA 是进行 Northern 印迹、 3′ -RACE、 5′ -RACE 以 及高质量 cDNA 文库构建和 Southern 杂交、 PCR 扩增的首要条件。虽然现在已有各种商品 化的试剂盒分离植物总 RNA 和基因组 DNA， 但试剂盒只是针对总 RNA 或基因组 DNA， 分开单 独提取， 且价格昂贵， 对于富含多糖、 多酚类次生代谢物等植物也难以满足实验要求。当研 究材料少或者珍贵稀有物种材料时， 如果能从材料中同时提取总 RNA 和基因组 DNA， 不仅简 化了实验步骤， 节省植物材料， 又降低实验成本和缩短时间， 具有重要的现实意义。
马尾松属于松科松亚属针叶树种， 体内含有十分丰富的多糖多酚类次生代谢物， 严重影响到总 RNA 和基因组 DNA 的提取效果。目前虽有对松树总 RNA 和基因组 DNA 分别进 行提取的方法研究的一些报道， 但针对总 RNA 和基因组 DNA 同时提取的方法相关研究尚未 见报道。因此， 建立一种马尾松针叶总 RNA 和基因组 DNA 同时提取的方法具有重要意义。 发明内容
针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种可以同时提取马尾松针叶总 RNA 和基因组 DNA 的方法。
本发明提供的同时提取马尾松针叶总 RNA 和基因组 DNA 的方法， 包括以下几个步 骤：
1、 总 RNA 的提取
用液氮研磨马尾松室内组培苗， 之后转移到预热的 5ml CTAB 缓冲液中 ； 该缓冲液 含有 2％ (w/v)CTAB、 2％ (w/v)PVP、 100mM Tris-HCl(pH8.0)、 25mM EDTA、 2M NaCl、 0.5g/L 亚 精胺， 使用前加入 2％ (v/v)β- 巯基乙醇 ； 水浴加热， 用氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提两次， LiCl 4℃沉淀过夜， 上清转移到新管 ( 记溶液 1) ； 沉淀用 500μl SDS 缓冲液溶解， 500μl 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1[v/v]) 抽提一次， 乙醇沉淀， 干燥后加水溶解。 浓度及纯度检测。 SDS 缓冲液含有 1.0M NaCl、 0.5％ (w/v)SDS、 10mM Tris-HCl(pH8.0)、 1mM EDTA(pH8.0) ；
2、 基因组 DNA 的提取
用 5ml 异丙醇沉淀第 1 步中的溶液 1， 离心后向沉淀中加入 500μl SDS 缓冲液溶 解， 500μl 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提一次， 乙醇沉淀， 最后用 70％ (v/v) 酒精洗涤 2 次， 干燥后加水溶解。浓度及纯度检测。
本发明采用了不同于其他植物总 RNA 和基因组 DNA 提取的方法， 即将总 RNA 提取 和基因组 DNA 提取结合起来同时进行。避免了分开单独进行的繁琐， 提高材料利用的效率。RNA 提取中， 加了 LiCl 需要 4℃过夜， 沉淀时间短， 将影响到 RNA 的产率。 抽提方法也不同于 其他植物抽提方法， 仅采用氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提， 省去了对环境污染严重的酚。DNA 提取中， 用 RNA 沉淀后留下的上清液提取基因组 DNA。LiCl 沉淀时间长， DNA 中混有的 RNA 量少， 纯度高， 相反， LiCl 沉淀时间短， DNA 中混有较多的 RNA， 降低其纯度。另外， DNA 抽提 仅用氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提一次即可， 避免抽提过程中 DNA 大量损失。
因此采用此发明的同时提取总 RNA 和基因组 DNA 的技术有如下优点 ： 节省材料、 缩 短提取时间、 降低实验成本、 提取的效果好、 RNA 和 DNA 纯度高。 附图说明
图 1 提取的马尾松针叶总 RNA。
图 2 提取的马尾松针叶基因组 DNA。
图 3、 图 4 是总 RNA 用于 RT-PCR 扩增。
图 5 基因组 DNA 用于 SSR 扩增。 具体实施方式 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例
1、 总 RNA 提取
(1) 取 5ml CTAB 提取缓冲液于 10ml 离心管中， 65℃预热 5-10min， 水浴前加 2％的 β- 巯基乙醇 ；
(2) 研钵用液氮预冷， 取大约 0.5g 马尾松幼苗， 充分研磨后， 用勺子将材料送进离 心管。涡旋 30s， 65℃水浴 15min( 每隔 5min 颠倒一次 ) ；
(3) 室温 12000rpm 离心 10min ；
(4) 取上清于新离心管中， 加入 5ml 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1)， 涡旋， 充分混匀 ；
(5) 室温 12000rpm 离心 10min ；
(6) 重复上述两步骤， 然后加入 1/4 体积 10M LiCl， 混匀后， 4 ℃过夜， 第二天于 4℃， 12000rpm 离心 20min ；
(7) 上清转移到新的 10mL 离心管内， 用于 DNA 的提取 ( 记溶液 1) ； 向沉淀中加入 500μl SDS 缓冲液溶解， 然后转入 1.5ml 离心管内 ；
(8) 加入 500μl 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1)， 涡旋， 充分混匀， 4 ℃， 12000rpm 离心 10min， 取上清 ；
(9) 加入 1ml 无水乙醇， 置于 -70℃， 沉淀 30min ；
(10)4℃， 12000rpm 离心 15min， 倒掉上清， 室温干燥 10min， 加入 40-60μl DEPC 水 溶解 RNA。浓度及纯度检测， -20℃保存备用 ( 图 1)。图中 1、 2 泳道是以室内组培苗为材料 提取的马尾松针叶总 RNA 的电泳结果 ； 3、 4 泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松 针叶总 RNA 的电泳结果。图 1 结果表明， 本方法既适合马尾松室内组培苗、 也适合室外当年 生的马尾松针叶为材料， 提取总 RNA， 且 RNA 条带清晰， 纯度好。
2、 基因组 DNA 提取
(11) 将上述步骤 (7) 得到的溶液 1 中加入 5ml 异丙醇， 混匀， 冰上放置 10min， 4℃，
12000rpm 离心 10min， 倒掉上清 ；
(12) 加入 500μl SDS 缓冲液溶解沉淀， 然后转入 1.5ml 离心管内 ；
(13) 加入 500μl 氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1)， 涡旋， 充分混匀， 4 ℃， 12000rpm 离心 10min， 取上清 ；
(14) 加入 1ml 无水乙醇， 置于 -70℃， 30min ；
(15)4℃， 12000rpm 离心 15min， 倒掉上清， 用预冷的 70％酒精洗涤 2-3 次， 室温干 燥 10min， 加入适量无菌水 (40-60μ1) 溶解 DNA。浓度及纯度检测， -20℃保存备用 ( 图 2)。 图中 1、 2 泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶基因组 DNA 的电泳结果 ； 3、 4 泳道 是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松基因组 DNA 的电泳结果。图 2 结果表明， 本方法 既适合马尾松室内组培苗、 也适合室外当年生的针叶为材料， 提取基因组 DNA， 且 DNA 条带 清晰， 质量较好。
3、 总 RNA 用于 RT-PCR 扩增
第一步 ： cDNA 第一条链合成
(1) 将下列试剂短暂涡旋， 离心后， 放置冰上， PCR 管置于冰上
(2) 向 PCR 管中依次加入 ：
总 RNA 4μl
Oligo(dT)18 引物 1μl
5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
DEPC 水 7μl
混匀后， 放入 65℃水浴加热 5min， 取出后立即置于冰上冷却。
(3) 然后向管内依次加入 ：
5 倍第一条链缓冲液 4μl
RNase 抑制剂 (20u/μL) 1μl
dNTP(10mM) 2μl
M-MLV 反转录酶 (200u/μL) 1μl
(4) 短暂涡旋、 离心后， 放入 PCR 仪中， 42℃ 60min， 然后 70℃ 5min。反映结束后， 得到的产物即为 cDNA 第一条链 ( 图 3)。图中 M 泳道是 Marker 的电泳结果 ； 1、 2 泳道是以 室内组培苗为材料提取的马尾松针叶总 RNA， 反转录合成的 cDNA 第一条链的电泳结果 ； 3、 4 泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松针叶总 RNA， 反转录合成的 cDNA 第一条链 的电泳结果。图 3 结果表明， 本方法提取的马尾松室内组培苗、 室外当年生的马尾松针叶总 RNA， 均适合作为反转录的模板， 合成 cDNA 第一条链。cDNA 大小范围在 0.75-4kb， 表明 RNA 质量好， 反转录效率高。
第二步 ： RT-PCR 扩增
(5) 向 PCR 管内依次加入下列试剂 ：
短暂涡旋、 离心后， 放入 PCR 仪中， PCR 反应程序如下 ：(6) 取 5μl RT-PCR 产物， 进行 0.8％ (w/v) 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 图 4)。图中 M 泳道是 Marker 的电泳结果 ； 1、 2 泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶总 RNA， 反转 录合成的 cDNA 第一条链为模板， 进行 RT-PCR 的电泳结果 ； 3、 4 泳道是以室外当年生针叶为 材料提取的马尾松针叶总 RNA， 反转录合成的 cDNA 第一条链为模板， 进行 RT-PCR 的电泳结 果。图 4 结果表明， 本方法提取的马尾松室内组培苗、 室外当年生的马尾松针叶总 RNA， 都 适合作为反转录模板， 合成 cDNA 第一条链， 进行 RT-PCR 研究。RT-PCR 目的条带清晰， 效果 好。
4、 基因组 DNA 用于 SSR 扩增
首先将提取的 DNA 取出 1μl， 稀释 50 倍， 然后取 1μl 作为 PCR 模板。
向 PCR 管内依次加入下列试剂 ：
短暂涡旋、 离心后， 放入 PCR 仪中， PCR 反应程序 ：取 1μlPCR 产物， 进行 8％ (w/v) 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ( 图 5)。图中 M 泳道 是 Marker 的电泳结果 ； 1、 2 泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松基因组 DNA 为模板， 进行 SSR 扩增的电泳结果 ； 3、 4 泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松基因组 DNA 为模板， 进行 SSR 扩增的电泳结果。图 5 结果表明， 本方法提取的马尾松室内组培苗、 室外 当年生马尾松基因组 DNA， 均可用于 SSR 扩增， 电泳条带清晰， 效果较好。