一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU、 新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 及其基因和应用 【技术领域】
本发明涉及基因工程领域， 具体地， 本发明涉及一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU、 新型 耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 及其基因和应用。背景技术
β- 葡聚糖是植物细胞壁的主要组成成分， 属结构性非淀粉多糖 (Non-starch polysaccharides， NSP)， 广泛存在于禾谷类 ( 大麦、 燕麦、 黑麦和小麦等 ) 的糊粉层和胚乳 细胞壁中。β- 葡聚糖通常是饲料中的抗营养因子及在啤酒酿造过程中会降低啤酒的品质 及产率。
β- 葡聚糖酶 (β-Glucanase， E.C 3.2.1.73) 可水解 β- 糖苷键而形成葡萄糖聚 合物等小分子物质， 属于半纤维素水解酶。由于 β- 葡聚糖酶的作用特点， 该酶可广泛应用 于啤酒酿造、 饲料等行业， 具有十分广阔的应用前景。
改革开放以来， 我国的饲料工业得到迅速发展。据统计， 2010 年， 中国饲料总产量 达到 1.57 亿吨， 比上年提高 5.9％。 在饲料产量快速增长的同时， 饲料原料的短缺问题日益 严重， 预计 2010 年到 2020 年我国饲料用粮将缺乏 2.4 ～ 8.3×107 吨能量饲料， 因此， 非常 规饲料原料如大麦、 小麦、 棕榈粕等的应用成为解决短缺问题的有效途径， 但由于这些原料 中 β- 葡聚糖等抗营养因子含量较高， 单胃动物不能分泌内源性 β- 葡聚糖酶， 无法消化利 用 β- 葡聚糖， 再加上 β- 葡聚糖的存在会造成较高的黏稠性， 影响其它营养物质的消化吸 收， 因此 β- 葡聚糖成为饲料中一种主要的抗营养因子， 严重影响了这些原料的使用。
β- 葡聚糖是由 β-1， 3 和 β-1， 4 混合的糖苷键连接形成的葡聚糖聚合物， 分为水 溶性和水不溶性两种， 其中与蛋白质结合的 β- 葡聚糖大都不溶于水。水溶性的 β- 葡聚 糖所占的比例较大， 可与水形成粘稠状物质， 而且 β- 葡聚糖浓度愈高， 粘度越大。
高浓度 β- 葡聚糖会形成网状结构， 吸收其周围的水分子， 从而降低了周围环境 的物理特性。 β- 葡聚糖是表层带负电荷的表面活性物质， 在溶液中极易与带相反电荷的养 分物质结合， 从而影响养分的吸收。此外， β- 葡聚糖还能吸附 Ca2+、 Zn2+、 Na+ 等金属离子以 及有机质， 造成这些物质的代谢受阻。
研究表明 ： β- 葡聚糖， 尤其是水溶性 β- 葡聚糖具有很强的抗营养作用， 即使饲 料中含有少量的 β- 葡聚糖， 也能对畜禽 ( 主要是单胃动物 ) 的营养吸收具有很强的阻碍 作用， 其结果可造成畜禽营养性下痢， 动物生长和饲料利用率降低， 蛋鸡采食量、 蛋重和产 蛋率下降。由于畜禽均不能分泌 β- 葡聚糖酶， 因此对这类物质的转化需要添加外源酶制 剂。
β- 葡聚糖的抗营养作用主要表现在以下几个方面 ：
(1) 增大动物胃肠道食糜粘性
麦类饲料中含有的葡聚糖类物质能结合大量水分， 增加了消化道内容物的粘稠 度。高粘度的肠道食糜对畜禽动物的料重比和增重有十分明显的负面影响。因为葡聚糖类物质可使肠内容物呈浓稠的胶冻样， 因此减缓了肠内食糜通过消化道的速度， 从而降低了 畜禽的采食量。另外， 高粘度会使畜禽的饮水量增加， 粪便水分含量随之提高， 从而养分排 出量也增加， 这就意味着养分消耗增加。β- 葡聚糖导致消化道内容物粘度增加， 降低了葡 萄糖、 脂肪、 水和氨基酸等营养物质在肠道中的吸收， 引起腹泻， 生产性能明显降低。
(2) 营养屏障作用
粘稠的胶状 β- 葡聚糖类物质可将肠道中的食糜如网状包裹起来， 阻碍了内源消 化酶与营养物质的接触， 起营养屏障作用。
另外， β- 葡聚糖的存在还会抑制胆酸的分泌， 影响了脂肪代谢的顺利进行。
通过添加外源性 β- 葡聚糖酶， 可将胶质状的 β- 葡聚糖水解为小分子物质， 食糜 的粘性则大大降低， 内源性消化酶可充分与食糜混合， 提高了淀粉、 蛋白质、 脂肪等营养物 质有吸收。
(3) 促进肠道内有害菌的增殖， 损害肠道粘膜正常形态
养分的消化吸收不良可导致营养物质在肠道内蓄积， 富含养分的食糜是细菌， 特 别是致病菌的良好培养基， 并且食糜通过消化道的速率降低， 会大大减少了菌群的移动， 使 细菌尤其是厌氧微生物得以在肠道上大量定居下来， 从而改变了肠道内的微生物区系。并 且大量有害细菌的增殖会消耗许多营养物质， 从而降低营养物质的利用率。 此外， 肠内细菌数量增多会刺激肠壁， 并使之增厚， 同时损伤肠壁， 进一步降低肠 道对养分的吸收。某些细菌还可能产生毒素， 影响宿主健康。
通过外源添加 β- 葡聚糖酶是一种有效途径， 但由于饲料制粒需要经受高温， 要 求所使用的 β- 葡聚糖酶不仅作用效果显著， 还需具有耐高温的特点。
β- 葡聚糖酶作为一种饲料用酶， 其作用机理主要包括如下几个方面 ：
(1)β- 葡聚糖酶可以降解饲料原料中的 β- 葡聚糖， 消除 β- 葡聚糖的抗营养作 用， 提高饲料的消化利用率。
(2)β- 葡聚糖酶可改善动物消化道的生态环境和功能。β- 葡聚糖酶水解 β- 葡 聚糖后， 粘性大大降低， 食糜的排空速度提高， 减少了肠道内发酵， 尤其是厌氧微生物发酵 的可能性， 从而降低了动物肠道疾病的发生。有研究表明， 在大麦日粮中添加以 β- 葡聚糖 酶可显著降低断奶仔猪的腹泻率。 另外， 消外道黏度的降低也有利于水、 蛋白质、 脂类、 电解 质的内源分泌， 使消化道的功能得到改善。
(3) 提高动物内源酶的分泌及活性。 研究表明， 添加 β- 葡聚糖酶可显著提高畜禽 肠道内容物中的胰蛋白酶、 淀粉酶和脂肪酶等内源酶的分泌及活性。 β- 葡聚糖酶可使饲料 营养物质的消化转移至肠道进行， 从而提高内源酶的活性， 降低胆汁盐的早期分离， 可更好 地促进动物对养分的消化吸收， 显著提高大麦等农副产品的消化利用率。在 β- 葡聚糖酶 对仔猪消化机能的影响实验中， 仔猪十二指肠内溶物总蛋白水解酶和淀粉酶的活性分别提 高了 20.96％ (P ＜ 0.01) 和 5.66％ (P ＜ 0.05)。
(4) 促进动物生长， 提高机体免疫功能。 添加 β- 葡聚糖酶于大麦、 小麦等日粮中， 可明显改善动物神经内分泌状况。研究表明， 麦类等高水平 SNSP 基础日粮中添加以 β- 葡 聚糖酶为主的 NSP 酶制后， 除了加强营养成分的消化吸收外， 还能影响神经内分泌调节， 从 而影响代谢， 促进生长。
啤酒作为一种大众化的酒精饮料， 素有 “液体面包” 之称， 其消费量呈逐年上升
趋势。在啤酒生产时需要用到大麦， 通常大麦中 β- 葡聚糖含量高达 4％ -8％， 由于大麦 β- 葡聚糖链分子发生扭结， 分子间结合不紧密， 且溶解后黏度高， 糖化时使麦汁黏度增高， β- 葡聚糖易被高分子蛋白质吸附， 造成麦糟 “板结” ， 从而导致麦汁和啤酒过滤困难， 降低 麦汁得率 ； 另外， 大麦 β- 葡聚糖不能被酵母利用或分解， 易引起啤酒混浊和凝胶沉淀， 影 响啤酒的稳定性， 降低啤酒的品质和经济效益。
据统计， 2010 年中国啤酒产量达到 4300 万吨， 连续 9 年位居世界第一。但由于大 麦中 β- 葡聚糖的影响， 每年对啤酒行业造成的经济损失估计在 20 亿元左右， 解决大麦中 的 β- 葡聚糖问题一直是该行业的一个重大课题。
最近的研究及应用情况表明， 采用 β- 葡聚糖酶可有效地去除啤酒糖化过程大麦 中的 β- 葡聚糖。
β- 葡聚糖酶属于水解酶类， 对水解谷物中的 β- 葡聚糖具有重要作用。 其应用于 啤酒生产中， 可以分解大麦及麦芽中的 β- 葡聚糖凝胶， 降低胶状深沉物， 发送啤酒的混浊 度， 提高产品质量。近年来， 利用 β- 葡聚糖酶分解 β- 葡聚糖提高发酵菌种的糖化力， 减 少麦芽汁中 β- 葡聚糖的残留量， 改善啤酒质量， 取得了良好效果。
目前， β- 葡聚糖酶广泛应用于啤酒发酵工业， 美国、 日本、 丹麦、 德国、 澳大利亚、 加拿大等国均已采用 β- 葡聚糖酶作为啤酒工业的主要酶制剂。 我国每年啤酒产量达 4300 多万吨， 且仍量上升趋势， 但在啤酒酿造过程中， 大麦胚乳细胞中的 β- 葡聚糖不能充分降 解， β- 葡聚糖的残留是造成啤酒酒体混浊、 泡沫持久力减少和挂杯力不强的主要原因之 一。
β- 葡聚糖酶作为啤酒用酶， 其主要作用机理如下 ：
(1) 降解大麦胚乳细胞中的 β- 葡聚糖， 增加可发酵产物， 提高糖化生产效率。 β- 葡聚糖酶可专一性地分解粘度很高的各种大麦 β- 葡聚糖， 能够疏松大麦胚乳细胞壁， 促进细胞内容物的外溢， 从而提高了原料的利用率。
(2) 降低麦汁粘度， 改善过滤性能， 提高过滤速度， 改善麦汁清亮度。
(3) 提高啤酒的胶体稳定性， 清除因 β- 葡聚糖引起的冷混浊。
另外， β- 葡聚糖酶还可用于制糖工业、 环保及资源处理等方面， 具有良好的应用 前景。
β- 葡聚糖酶主要来源于微生物， 产生 β- 葡聚糖酶的微生物主要包括细菌 ( 芽孢 杆菌 )、 真菌 ( 曲霉、 毛霉、 木霉等 ) 和瘤胃微生物等。
由于饲料制粒、 啤酒酿造过程中通常均需高温处理， 而普通 β- 葡聚糖酶耐热性 能较差， 因此开发出的 β- 葡聚糖酶应具有耐高温性能， 才能广泛地作为饲料用酶、 啤酒酿 造用酶等使用。
本发明提供了一种新型耐高温 β- 葡聚糖酶， 其耐热性能良好， 并在毕赤酵母这 一真核系统中高效表达， 具有重要的工业应用价值。 发明内容
本发明的目的是提供一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU。 本发明的另一目的是提供编码上述新型 β- 葡聚糖酶的基因。 本发明的另一目的是提供一种新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。本发明的另一目的是提供编码上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述新型 β- 葡聚糖酶或上述新型耐高温 β- 葡聚 糖酶的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述新型 β- 葡聚糖酶基因 GLU 或上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的的重组菌株。
本发明的另一目的是提供制备上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的方法。
本发明的另一目的是提供上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的应用。
本发明的一种生产上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 的黑曲霉 AN070902(Aspergillus niger)， 于 2010 年 10 月 20 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏号为 ： CGMCC No.4235， 其相关信息记载于申请号为 CN201010566249.0 的专利申请中， 已于 2011 年 4 月 6 日公开。
本发明提供了一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ：
MSRPFIFPAV FTLAASALAA PVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLEGDFDV
AVLPFSNSTN 60 LNGLFINTTI ASIAAKEEGV SLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEWLYTLEEV QYGKFEARMK 120 SAAAMGTVSS MFLYQNGSEI ADGRPWVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKA GAQKTSEKHH 180 AVSPDRLAAF HTYGLEWTPN YWSRTVDVRE VRKTEGGQVS RFTGTQGLNL NLWSSESAAW 240 VGQFDESKLP LFQFINWVKV GEYTPGQKYG GSDFTLDWTD NFDTFDGSRW GKGDWTFDGN 300 RVDLTDKNIY SRDGMLILAL VKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST 344 该酶蛋白由 344 个氨基酸组成， 其理论 pI/Mw ： 4.70/38025.29。 本发明还提供了编码上述 β- 葡聚糖酶的基因 GLU， 该基因的序列如 SEQ ID NO.2 atgtctagac ccagtcaaca tactctgacc ttgaatggtt tctcttgaga gccgagtggt tctgctgccg gccgatggaa taccaatcca gctgtttctc tactggtcaa cattcatttt ctactaccga tggaaggaga tgttcatcaa agagagaggc tgtacacttt ctatgggaac gaccatgggt acttcatcat ctgacaggct ggactgttga tcccgctgtt ggacgagact tttcgacgtt cactactatc tgaagcctac agaggaagtc agtcagttcc agaggtggat cggtaaagct cgccgctttc cgtcagagag6所示 ：
tttaccttgg gctcaaattc gctgtcttgc gcttctattg gttgaattcg caatacggta atgttcttgt atcgaagttc ggtgctcaaa cacacctacg gtcagaaagactgcctctgc ctgctgaggc ctttctccaa ctgccaagga tttctgctaa agttcgaggc accagaacgg tcggtaagaa agacttccga gtttggaatg ctgaaggtggtttggccgct tgtcatcggt ctccaccaac agagggtgtt ggacttttct tcgtatgaag ttccgaaatc cccaggatcc gaagcaccac gactcctaac acaagtttcc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 agattcaccg gtactcaagg attgaacttg aatctttggt cctctgagtc tgcagcttgg 720
gttggtcaat tcgacgaatc taagctgcca ctgttccagt tcattaactg ggtcaaagtt 780
ggtgaataca cgccaggtca aaagtatggc ggttctgact tcactttgga ctggaccgac 840
aactttgaca ccttcgatgg ttctagatgg ggtaagggtg actggacttt cgacggtaac 900
cgtgtcgact tgaccgacaa gaacatctac tccagagacg gtatgttgat tcttgccttg 960
gtcaagagtc caagttccaa accagaaagg gagatgacga gcctgctagc cttcaacggt 1020
caatcttcca cctaa 1035
经检测， 该酶在 pH 2.0 ～ 6.5 的条件下酶活稳定， 属于酸性葡聚糖酶， 动物消化 道全程的各种 pH 环境均不会显著降低酶活， 同时蛋白酶体外水解实验表明本发明获得的 β- 葡聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。另外， 在模拟啤酒酿造条件下， 该酶也对麦芽中的 β- 葡聚糖具有良好的水解效果。但该酶具有一个缺点， 即其耐高温性 能稍差， 75℃水浴中保存 10min 后， 其酶活力损失达 70％左右， 因此， 需对该酶进行相应的 改造， 以筛选获得耐高温性能的 β- 葡聚糖酶。
本 发 明 优 选 采 用 定 点 突 变 法 和 易 错 PCR 对 SEQ ID NO.1 所 示 的 黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 来源的 β- 葡聚糖酶 GLU 进行改造， 并经过高通量筛选的方法筛选得 到新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 和原有黑曲霉 生产的 β- 葡聚糖酶 GLU 相比， 有 4 个氨基酸的差异， 突变位点由 +46G， +62N， +288T， +313D 突变成 +46C， +62C， +288C， +313C， 整个蛋白质空间结构中增加了两个二硫键， 突变后的氨基 酸序列如 SEQ ID NO.3 所示 ：
MSRPFIFPAV FTLAASALAA PVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLECDFDV AVLPFSNSTN 60 LCGLFINTTI ASIAAKEEGV SLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEWLYTLEEV QYGKFEARMK 120 SAAAMGTVSS MFLYQNGSEI ADGRPWVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKA GAQKTSEKHH 180 AVSPDRLAAF HTYGLEWTPN YWSRTVDVRE VRKTEGGQVS RFTGTQGLNL NLWSSESAAW 240 VGQFDESKLP LFQFINWVKV GEYTPGQKYG GSDFTLDWTD NFDCFDGSRW GKGDWTFDGN 300 RVDLTDKNIY SRCGMLILAL VKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST 344 编码该氨基酸序列的基因如 SEQ ID NO.4 所示， 命名为 VGLU ： atgtctagac cattcatttt tcccgctgtt tttaccttgg ctgcctctgc tttggccgct ccagtcaaca ctactaccga ggacgagact gctcaaattc ctgctgaggc tgtcatcggt tactctgacc tggaatgcga tttcgacgtt gctgtcttgc ctttctccaa ctccaccaac ttgtgcggtt tgttcatcaa cactactatc gcttctattg ctgccaagga agagggtgtt tctcttgaga agagagaggc tgaagcctac gttgaattcg tttctgctaa ggacttttct gccgagtggt tgtacacttt agaggaagtc caatacggta agttcgaggc tcgtatgaag tctgctgccg ctatgggaac agtcagttcc atgttcttgt accagaacgg ttccgaaatc gccgatggaa gaccatgggt agaggtggat atcgaagttc tcggtaagaa cccaggatcc760 120 180 240 300 360 420 taccaatcca acttcatcat cggtaaagct ggtgctcaaa agacttccga gaagcaccac 540
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ggtgaataca cgccaggtca aaagtatggc ggttctgact tcactttgga ctggaccgac 840
aactttgaca ccttcgatgg ttgcagatgg ggtaagggtg actggacttt cgacggtaac 900
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gtcaagagtc caagttccaa accagaaagg gagatgacga gcctgctagc cttcaacggt 1020
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经检测， 该重组酶的热稳定性良好， 在 75℃水浴中放置 1h 酶活力仍能保持 85％ 左右， 在很大程度上能减少高温操作时引起的酶活丧失， 并且该酶的其他性能及稳定性 能也非常优良， 因此该酶可广泛作为饲料用酶及啤酒酿造用酶使用， 该酶的理论 PI/Mw ： 4.74/38050.50。
本 发 明 还 提 供 了 包 含 上 述 新 型 β- 葡 聚 糖 酶 基 因 GLU 的 重 组 载 体， 优选为 pPICzαA-GLU ； 以及包含上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的重组载体， 优选为 pPICzαA-VGLU。将本发明的新型 β- 葡聚糖酶基因与新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因分别 插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相 连接。作为本发明的一个最优选的实施方案， 优选为将本发明的新型 β- 葡聚糖酶基因与 新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因分别插入到质粒 pPICzαA 上的 EcoR I 和 NotI 限制性酶切 位点之间， 使该核苷酸序列位于 AOX1 启动子的下游并受其调控， 分别得到重组酵母表达质 粒 pPICzαA-GLU 与 pPICzαA-VGLU。
本发明还提供了包含上述新型 β- 葡聚糖酶基因 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 基因 VGLU 的重组菌株的重组菌株， 优选为毕赤酵母重组菌株 X33。
本发明还提供了一种制备新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤 ：
1) 用上述重组载体 pPICzαA-VGLU 转化宿主细胞， 得重组菌株 ；
2) 培养重组菌株， 诱导新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的表达 ； 以及
3) 回收并纯化所表达的新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。
本发明还提供了上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的 应用， 优选其在饲料、 啤酒酿造工业中的应用。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性 能良好， 是一种优良的酸性 β- 葡聚糖酶， 并且具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水 解能力， 完全可达到饲料及啤酒酿造用酶的要求。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶通过 高效表达后能够达到较高的发酵水平， 在工业生产中可大大降低生产成本， 使其在饲料、 啤 酒酿造等工业中显示出更大的应用潜力。 附图说明
图 1 重组耐高温 β- 葡聚糖酶在 50L 罐中的发酵过程曲线。
图 2 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度。图 3 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应 pH 值。
图 4 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的温度耐受性能 ( 不同处理温度 )。
图 5 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的温度耐受性能 ( 不同处理时间 )。
图 6 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的 pH 耐受性能。
图 7 重组耐高温 β- 葡聚糖酶在胃蛋白酶， 胰蛋白酶处理后剩余酶活。
本发明的一种生产上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 的黑曲霉 AN070902(Aspergillus niger)， 于 2010 年 10 月 20 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏号为 ： CGMCC No.4235， 其相关信息记载于申请号为 CN201010566249.0 的专利中， 该专利已公开于 2011 年 4 月 6 日。 具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版 )J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书进行 ； 所述试剂和生物材料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。
实验材料和试剂 ：
1、 菌株与载体
大肠杆菌菌株 Topl0、 毕赤酵母 X33、 载体 pPICzalphaA 购自 Invitrogen 公司。
2、 酶与试剂盒
逆转录酶 SuperScriptTM III、 RNA 提取试剂盒购自 Invitrogen 公司。 质粒 DNA 提取 试剂盒， 胶回收试剂盒， PCR 纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自 Fermentas 公司。
3、 培养基
基本盐培养基 ： 磷酸氢二铵 5 ％、 磷酸二氢钾 0.5 ％、 七水硫酸镁 1.5 ％、 硫酸钾 1.95％、 硫酸钙 0.1％、 氢氧化钾 0.1％、 消泡剂 0.03％。高压后每升加 4.35 毫升 PTM1
PTM1( 微量盐溶液 ) ： 硫酸铜 0.6 ％、 碘化钾 0.018 ％、 一水硫酸锰 0.3 ％、 二水钼 酸钠 0.02 ％、 硼酸 0.002 ％、 六水氯化钴 0.05 ％、 氯化锌 2 ％、 七水硫酸铁 6.5 ％、 浓硫酸 0.5％、 生物素 0.02％
实施例 1、 黑曲霉 (Aspergillus niger)β- 葡聚糖酶 GLU 基因的克隆
运用 RNA 提取试剂盒， 提取黑曲霉 (Aspergillus niger) 总 RNA， 按照逆转录酶 TM SuperScript III Reverse Transcriptase 操作说明合成第一链 cDNA。以 cDNA 为模板， 设计 β- 葡聚糖酶引物 (GLU5EcoRI， GLU3NotI) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物由 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体 pPICzalphaA 相连接， 连接产物转 化大肠杆菌 Topl0 感受态细胞， 经抗生素 Zeocin 筛选后， 获得阳性克隆。 提取阳性克隆的质 粒。送样到上海英骏生物公司测序， 测序结果表明， 所获得克隆 DNA 插入片段含有 β- 葡聚 糖酶基因完整的开放阅读框。该 β- 葡聚糖酶基因 GLU， 全长 1035bp， 编码 344 个氨基酸。
扩增所用引物如下 ：
GLU 5EcoRI ：
5’ CTGAGAATTCATGTCTAGACCATTCATTTTTCCCG3’GLU 3NotI ：
5’ AGAGCGGCCGCTTAGGTGGAAGATTGACCGTTGAAG3’
实施例 2、 GLU 的基因定点突变
将克隆出的 GLU 基因， 采用 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 连接到经相同双酶切的载 体 pPICzαA 上， 获得重组表达载体 pPICzαA-GLU， 然后转化到 BL21 中， 选择阳性克隆子采 用 IPTG 诱导产酶。然后采用该酶在不同温度下 (60-100℃ ) 处理 10min 后检测剩余酶活， 发现该酶在 85℃下酶活损失达 80％以上， 这说明直接由 GLU 编码的 β- 葡聚糖酶耐高温性 能较差。因此需对该基因进行优化改良。通过对 β- 葡聚糖酶进行蛋白结构自动建模分析 (swissmodel)， 分析其二级结构和三级结构。 在不破坏其二级结构与活性中心的前提下， 对 活性中心附近以及二级结构连接处进行氨基酸定点突变， 增加二硫键， 以增强 β- 葡聚糖 酶蛋白的稳定性能及耐高温性能。共预测了 4 个待突变位点， 分别为 ： +46G， +62N， +288T， +313D， 然后针对性的设计了 4 对突变引物， 目的基因突变位点统一为 TGC， TGC 左右各取 15 个碱基构成正向引物 ； 反向引物与正向引物完全互补。
PCR 产物经 DpnI 酶切处理后转化 BL21 感受态细胞， 在 LB-Amp 平板筛选阳性突变 重组克隆， 并对筛选的阳性克隆子进行摇瓶培养， 采用 IPTG 诱导， 经对比测试， 优化后的基 因所编码的 β- 葡聚糖酶耐高温性能大大提高。经四次定点突变， 获得了优化后的 β- 葡 聚糖酶基因， 命名为 VGLU。 实施例 3、 包含耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的毕赤酵母工程菌的构建
优化后的耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU， 采用 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 重新连 接到经相同双酶切的载体 pPICzαA 上， 获得重组表达载体 pPICzαA-VGLU。然后采用 SacI 进行线性化， 线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母 X33， 电转化后涂布于 YPD(Zeo+) 平板 上进行筛选， 得到毕赤酵母重组菌株。
实施例 4、 耐高温 β- 葡聚糖酶重组菌株的高效表达
将筛选获得的耐高温 β- 葡聚糖酶重组菌株 pPICZaA-VGLU-X33-9 进行高密度发 酵培养。
配制 20L 基本盐培养基， 在 50L 自动控制发酵罐中灭菌后， 冷却至常温备用。用 氨水和磷酸调节发酵液的 pH 值至 4.6， 通过调节转速和空气流量控制溶氧大于 20 ％以 上， 发酵温度为 30 ℃。整个发酵过程分 3 个阶段 ： 第一阶段为菌体培养阶段， 将重组菌 pPICZaA-VGLU-X33-9 按照 10％的接种量接种至发酵罐中， 流加已灭菌的 4L50％的葡萄糖， 培养 24-30 小时， 以补完葡萄糖为标志 ； 第二阶段为饥饿阶段， 当葡萄糖补完之后， 不流加 任何碳源， 当溶氧上升至 80％以上即表明该阶段结束， 为期约 30-60min ； 第三阶段为诱导 表达阶段， 流加诱导培养基， 并且保持溶氧在 20％以上， 培养时间在 180-200 小时之间。发 酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。
在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活， 发酵过程中耐高温 β- 葡聚糖酶的表 达情况如图 1 所示， 发酵 195h 的发酵液酶活为 16250U/mL。
实施例 5、 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的活性分析
采用 DNS 法进行检测。
1 个酶活单位 (U) 定义为 ： 在规定条件 (pH 4.8， 40℃ ) 下， 每分钟释放出具有相当 于 1μmol 葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量 (μmol/min)
实施例 6、 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的性质测定
1、 耐高温 β- 葡聚糖酶比活测定
将上述发酵液中的耐高温 β- 葡聚糖酶通过离子交换柱 (Q SepharoseTM Fast Flow Ion Exchanger) 纯化， 采用改良型 Bradford 试剂盒 ( 上海 Sangon 公司 ) 测定蛋白浓 度， 得出该耐高温 β- 葡聚糖酶比活为 2031U/mg。
2、 耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度及 pH 测定
最适反应温度 ： 将酶液稀释适当倍数， 在不同温度 (25 ～ 80℃ ) 下反应， 测定耐高 温 β- 葡聚糖酶的酶活。以最高酶活力为 100％， 其它温度下测得的酶活与之相比， 即得到 该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图 2。
最适反应 pH ： 将稀释后的酶液， 与不同 pH(2.0 ～ 7.0) 检测条件下， 检测该耐高温 β- 葡聚糖酶的酶活力， 并采用最高酶活为 100％， 其他检测结果与之相比， 即得到不同 pH 检测条件下的相对酶活。最适反应 pH 曲线见图 3。
结果如图 3 和图 4 所示 ： 该重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度为 60℃， 最 适反应 pH 为 5.0。
3、 耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能测定 (1) 不同温度耐热性能 ： 将酶液稀释适当倍数， 在不同温度下处理 10min 后， 以未 处理的酶活力为对照测定耐高温 β- 葡聚糖酶的相对酶活， 结果见图 4。
(2) 不 同 时 间 耐 热 性 能 ： 在 75 ℃ 条 件 下， 将适当稀释的酶液处理不同时间 (10min-60min)， 以未处理的酶活为对照测定该耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能， 结果见图 5。
结果显示该耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能良好， 完全可达到饲料及啤酒酿造用 酶的要求。
4、 耐高温 β- 葡聚糖酶 pH 稳定性测定
将稀释后的酶液与不同 pH 的缓冲液混合， 室温放置 2h， 以未处理的酶液为对照， 测定耐高温 β- 葡聚糖酶的相对酶活， 结果如图 6 所示。
该 β- 葡聚糖酶的最适 pH 为 5.0， 并且在 pH 3 ～ 6 范围内相对酶活均可达到 80％ 以上， 为一种良好的酸性 β- 葡聚糖酶。
5、 耐高温 β- 葡聚糖酶对胃蛋白酶、 胰蛋白酶消化耐受性测定
取 0.1mL 耐高温 β- 葡聚糖酶液， 分别加入 0.5mL 0.1mg/mL 胃蛋白酶 (pH 2.0 浓 度 80U/mL) 和 0.5mL 0.1mg/mL 胰蛋白酶 (pH 7.0 浓度 150U/mL)， 于 37℃处理不同时间后 测酶活。结果如图 7 所示。
其中胃蛋白酶处理 120min 后， 酶活性仍达 92％左右， 用胰蛋白酶处理 120min 后， 剩余 83％。这说明本 β- 葡聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力。
6、 金属离子和 EDTA 对酶活力的影响
将含有 1mM K+、 Mg2+、 Ca2+、 Zn2+、 Fe2+、 Fe3+、 Mn2+、 Co2+、 Cu2+ 和 EDTA 的溶液与稀释适 当倍数的酶液混合， 室温放置 30min， 以未处理的酶液为对照， 结果如表 1 所示。 2+ 2+
结果表明， Mg 、 Ca 对该 β- 葡聚糖酶有一定的激活作用， 酶活性分别促进 11％、 + 2+ 3+ 2+ 2+ 25％ ； K、 EDTA、 Zn 对酶活性没有影响 ； 其余金属离子 Cr 、 Cu 、 Fe 和 Fe3+ 对酶活性均有 不同程度的抑制作用 ； 而 SDS 完全抑制了酶的活性。
本发明涉及基因工程领域， 具体地， 本发明涉及一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU、 新型 耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 及其基因和应用。背景技术
β- 葡聚糖是植物细胞壁的主要组成成分， 属结构性非淀粉多糖 (Non-starch polysaccharides， NSP)， 广泛存在于禾谷类 ( 大麦、 燕麦、 黑麦和小麦等 ) 的糊粉层和胚乳 细胞壁中。β- 葡聚糖通常是饲料中的抗营养因子及在啤酒酿造过程中会降低啤酒的品质 及产率。
β- 葡聚糖酶 (β-Glucanase， E.C 3.2.1.73) 可水解 β- 糖苷键而形成葡萄糖聚 合物等小分子物质， 属于半纤维素水解酶。由于 β- 葡聚糖酶的作用特点， 该酶可广泛应用 于啤酒酿造、 饲料等行业， 具有十分广阔的应用前景。
改革开放以来， 我国的饲料工业得到迅速发展。据统计， 2010 年， 中国饲料总产量 达到 1.57 亿吨， 比上年提高 5.9％。 在饲料产量快速增长的同时， 饲料原料的短缺问题日益 严重， 预计 2010 年到 2020 年我国饲料用粮将缺乏 2.4 ～ 8.3×107 吨能量饲料， 因此， 非常 规饲料原料如大麦、 小麦、 棕榈粕等的应用成为解决短缺问题的有效途径， 但由于这些原料 中 β- 葡聚糖等抗营养因子含量较高， 单胃动物不能分泌内源性 β- 葡聚糖酶， 无法消化利 用 β- 葡聚糖， 再加上 β- 葡聚糖的存在会造成较高的黏稠性， 影响其它营养物质的消化吸 收， 因此 β- 葡聚糖成为饲料中一种主要的抗营养因子， 严重影响了这些原料的使用。
β- 葡聚糖是由 β-1， 3 和 β-1， 4 混合的糖苷键连接形成的葡聚糖聚合物， 分为水 溶性和水不溶性两种， 其中与蛋白质结合的 β- 葡聚糖大都不溶于水。水溶性的 β- 葡聚 糖所占的比例较大， 可与水形成粘稠状物质， 而且 β- 葡聚糖浓度愈高， 粘度越大。
高浓度 β- 葡聚糖会形成网状结构， 吸收其周围的水分子， 从而降低了周围环境 的物理特性。 β- 葡聚糖是表层带负电荷的表面活性物质， 在溶液中极易与带相反电荷的养 分物质结合， 从而影响养分的吸收。此外， β- 葡聚糖还能吸附 Ca2+、 Zn2+、 Na+ 等金属离子以 及有机质， 造成这些物质的代谢受阻。
研究表明 ： β- 葡聚糖， 尤其是水溶性 β- 葡聚糖具有很强的抗营养作用， 即使饲 料中含有少量的 β- 葡聚糖， 也能对畜禽 ( 主要是单胃动物 ) 的营养吸收具有很强的阻碍 作用， 其结果可造成畜禽营养性下痢， 动物生长和饲料利用率降低， 蛋鸡采食量、 蛋重和产 蛋率下降。由于畜禽均不能分泌 β- 葡聚糖酶， 因此对这类物质的转化需要添加外源酶制 剂。
β- 葡聚糖的抗营养作用主要表现在以下几个方面 ：
(1) 增大动物胃肠道食糜粘性
麦类饲料中含有的葡聚糖类物质能结合大量水分， 增加了消化道内容物的粘稠 度。高粘度的肠道食糜对畜禽动物的料重比和增重有十分明显的负面影响。因为葡聚糖类物质可使肠内容物呈浓稠的胶冻样， 因此减缓了肠内食糜通过消化道的速度， 从而降低了 畜禽的采食量。另外， 高粘度会使畜禽的饮水量增加， 粪便水分含量随之提高， 从而养分排 出量也增加， 这就意味着养分消耗增加。β- 葡聚糖导致消化道内容物粘度增加， 降低了葡 萄糖、 脂肪、 水和氨基酸等营养物质在肠道中的吸收， 引起腹泻， 生产性能明显降低。
(2) 营养屏障作用
粘稠的胶状 β- 葡聚糖类物质可将肠道中的食糜如网状包裹起来， 阻碍了内源消 化酶与营养物质的接触， 起营养屏障作用。
另外， β- 葡聚糖的存在还会抑制胆酸的分泌， 影响了脂肪代谢的顺利进行。
通过添加外源性 β- 葡聚糖酶， 可将胶质状的 β- 葡聚糖水解为小分子物质， 食糜 的粘性则大大降低， 内源性消化酶可充分与食糜混合， 提高了淀粉、 蛋白质、 脂肪等营养物 质有吸收。
(3) 促进肠道内有害菌的增殖， 损害肠道粘膜正常形态
养分的消化吸收不良可导致营养物质在肠道内蓄积， 富含养分的食糜是细菌， 特 别是致病菌的良好培养基， 并且食糜通过消化道的速率降低， 会大大减少了菌群的移动， 使 细菌尤其是厌氧微生物得以在肠道上大量定居下来， 从而改变了肠道内的微生物区系。并 且大量有害细菌的增殖会消耗许多营养物质， 从而降低营养物质的利用率。 此外， 肠内细菌数量增多会刺激肠壁， 并使之增厚， 同时损伤肠壁， 进一步降低肠 道对养分的吸收。某些细菌还可能产生毒素， 影响宿主健康。
通过外源添加 β- 葡聚糖酶是一种有效途径， 但由于饲料制粒需要经受高温， 要 求所使用的 β- 葡聚糖酶不仅作用效果显著， 还需具有耐高温的特点。
β- 葡聚糖酶作为一种饲料用酶， 其作用机理主要包括如下几个方面 ：
(1)β- 葡聚糖酶可以降解饲料原料中的 β- 葡聚糖， 消除 β- 葡聚糖的抗营养作 用， 提高饲料的消化利用率。
(2)β- 葡聚糖酶可改善动物消化道的生态环境和功能。β- 葡聚糖酶水解 β- 葡 聚糖后， 粘性大大降低， 食糜的排空速度提高， 减少了肠道内发酵， 尤其是厌氧微生物发酵 的可能性， 从而降低了动物肠道疾病的发生。有研究表明， 在大麦日粮中添加以 β- 葡聚糖 酶可显著降低断奶仔猪的腹泻率。 另外， 消外道黏度的降低也有利于水、 蛋白质、 脂类、 电解 质的内源分泌， 使消化道的功能得到改善。
(3) 提高动物内源酶的分泌及活性。 研究表明， 添加 β- 葡聚糖酶可显著提高畜禽 肠道内容物中的胰蛋白酶、 淀粉酶和脂肪酶等内源酶的分泌及活性。 β- 葡聚糖酶可使饲料 营养物质的消化转移至肠道进行， 从而提高内源酶的活性， 降低胆汁盐的早期分离， 可更好 地促进动物对养分的消化吸收， 显著提高大麦等农副产品的消化利用率。在 β- 葡聚糖酶 对仔猪消化机能的影响实验中， 仔猪十二指肠内溶物总蛋白水解酶和淀粉酶的活性分别提 高了 20.96％ (P ＜ 0.01) 和 5.66％ (P ＜ 0.05)。
(4) 促进动物生长， 提高机体免疫功能。 添加 β- 葡聚糖酶于大麦、 小麦等日粮中， 可明显改善动物神经内分泌状况。研究表明， 麦类等高水平 SNSP 基础日粮中添加以 β- 葡 聚糖酶为主的 NSP 酶制后， 除了加强营养成分的消化吸收外， 还能影响神经内分泌调节， 从 而影响代谢， 促进生长。
啤酒作为一种大众化的酒精饮料， 素有 “液体面包” 之称， 其消费量呈逐年上升
趋势。在啤酒生产时需要用到大麦， 通常大麦中 β- 葡聚糖含量高达 4％ -8％， 由于大麦 β- 葡聚糖链分子发生扭结， 分子间结合不紧密， 且溶解后黏度高， 糖化时使麦汁黏度增高， β- 葡聚糖易被高分子蛋白质吸附， 造成麦糟 “板结” ， 从而导致麦汁和啤酒过滤困难， 降低 麦汁得率 ； 另外， 大麦 β- 葡聚糖不能被酵母利用或分解， 易引起啤酒混浊和凝胶沉淀， 影 响啤酒的稳定性， 降低啤酒的品质和经济效益。
据统计， 2010 年中国啤酒产量达到 4300 万吨， 连续 9 年位居世界第一。但由于大 麦中 β- 葡聚糖的影响， 每年对啤酒行业造成的经济损失估计在 20 亿元左右， 解决大麦中 的 β- 葡聚糖问题一直是该行业的一个重大课题。
最近的研究及应用情况表明， 采用 β- 葡聚糖酶可有效地去除啤酒糖化过程大麦 中的 β- 葡聚糖。
β- 葡聚糖酶属于水解酶类， 对水解谷物中的 β- 葡聚糖具有重要作用。 其应用于 啤酒生产中， 可以分解大麦及麦芽中的 β- 葡聚糖凝胶， 降低胶状深沉物， 发送啤酒的混浊 度， 提高产品质量。近年来， 利用 β- 葡聚糖酶分解 β- 葡聚糖提高发酵菌种的糖化力， 减 少麦芽汁中 β- 葡聚糖的残留量， 改善啤酒质量， 取得了良好效果。
目前， β- 葡聚糖酶广泛应用于啤酒发酵工业， 美国、 日本、 丹麦、 德国、 澳大利亚、 加拿大等国均已采用 β- 葡聚糖酶作为啤酒工业的主要酶制剂。 我国每年啤酒产量达 4300 多万吨， 且仍量上升趋势， 但在啤酒酿造过程中， 大麦胚乳细胞中的 β- 葡聚糖不能充分降 解， β- 葡聚糖的残留是造成啤酒酒体混浊、 泡沫持久力减少和挂杯力不强的主要原因之 一。
β- 葡聚糖酶作为啤酒用酶， 其主要作用机理如下 ：
(1) 降解大麦胚乳细胞中的 β- 葡聚糖， 增加可发酵产物， 提高糖化生产效率。 β- 葡聚糖酶可专一性地分解粘度很高的各种大麦 β- 葡聚糖， 能够疏松大麦胚乳细胞壁， 促进细胞内容物的外溢， 从而提高了原料的利用率。
(2) 降低麦汁粘度， 改善过滤性能， 提高过滤速度， 改善麦汁清亮度。
(3) 提高啤酒的胶体稳定性， 清除因 β- 葡聚糖引起的冷混浊。
另外， β- 葡聚糖酶还可用于制糖工业、 环保及资源处理等方面， 具有良好的应用 前景。
β- 葡聚糖酶主要来源于微生物， 产生 β- 葡聚糖酶的微生物主要包括细菌 ( 芽孢 杆菌 )、 真菌 ( 曲霉、 毛霉、 木霉等 ) 和瘤胃微生物等。
由于饲料制粒、 啤酒酿造过程中通常均需高温处理， 而普通 β- 葡聚糖酶耐热性 能较差， 因此开发出的 β- 葡聚糖酶应具有耐高温性能， 才能广泛地作为饲料用酶、 啤酒酿 造用酶等使用。
本发明提供了一种新型耐高温 β- 葡聚糖酶， 其耐热性能良好， 并在毕赤酵母这 一真核系统中高效表达， 具有重要的工业应用价值。 发明内容
本发明的目的是提供一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU。 本发明的另一目的是提供编码上述新型 β- 葡聚糖酶的基因。 本发明的另一目的是提供一种新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。本发明的另一目的是提供编码上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述新型 β- 葡聚糖酶或上述新型耐高温 β- 葡聚 糖酶的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述新型 β- 葡聚糖酶基因 GLU 或上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的的重组菌株。
本发明的另一目的是提供制备上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的方法。
本发明的另一目的是提供上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的应用。
本发明的一种生产上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 的黑曲霉 AN070902(Aspergillus niger)， 于 2010 年 10 月 20 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏号为 ： CGMCC No.4235， 其相关信息记载于申请号为 CN201010566249.0 的专利申请中， 已于 2011 年 4 月 6 日公开。
本发明提供了一种新型 β- 葡聚糖酶 GLU， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ：
MSRPFIFPAV FTLAASALAA PVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLEGDFDV
AVLPFSNSTN 60 LNGLFINTTI ASIAAKEEGV SLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEWLYTLEEV QYGKFEARMK 120 SAAAMGTVSS MFLYQNGSEI ADGRPWVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKA GAQKTSEKHH 180 AVSPDRLAAF HTYGLEWTPN YWSRTVDVRE VRKTEGGQVS RFTGTQGLNL NLWSSESAAW 240 VGQFDESKLP LFQFINWVKV GEYTPGQKYG GSDFTLDWTD NFDTFDGSRW GKGDWTFDGN 300 RVDLTDKNIY SRDGMLILAL VKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST 344 该酶蛋白由 344 个氨基酸组成， 其理论 pI/Mw ： 4.70/38025.29。 本发明还提供了编码上述 β- 葡聚糖酶的基因 GLU， 该基因的序列如 SEQ ID NO.2 atgtctagac ccagtcaaca tactctgacc ttgaatggtt tctcttgaga gccgagtggt tctgctgccg gccgatggaa taccaatcca gctgtttctc tactggtcaa cattcatttt ctactaccga tggaaggaga tgttcatcaa agagagaggc tgtacacttt ctatgggaac gaccatgggt acttcatcat ctgacaggct ggactgttga tcccgctgtt ggacgagact tttcgacgtt cactactatc tgaagcctac agaggaagtc agtcagttcc agaggtggat cggtaaagct cgccgctttc cgtcagagag6所示 ：
tttaccttgg gctcaaattc gctgtcttgc gcttctattg gttgaattcg caatacggta atgttcttgt atcgaagttc ggtgctcaaa cacacctacg gtcagaaagactgcctctgc ctgctgaggc ctttctccaa ctgccaagga tttctgctaa agttcgaggc accagaacgg tcggtaagaa agacttccga gtttggaatg ctgaaggtggtttggccgct tgtcatcggt ctccaccaac agagggtgtt ggacttttct tcgtatgaag ttccgaaatc cccaggatcc gaagcaccac gactcctaac acaagtttcc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 agattcaccg gtactcaagg attgaacttg aatctttggt cctctgagtc tgcagcttgg 720
gttggtcaat tcgacgaatc taagctgcca ctgttccagt tcattaactg ggtcaaagtt 780
ggtgaataca cgccaggtca aaagtatggc ggttctgact tcactttgga ctggaccgac 840
aactttgaca ccttcgatgg ttctagatgg ggtaagggtg actggacttt cgacggtaac 900
cgtgtcgact tgaccgacaa gaacatctac tccagagacg gtatgttgat tcttgccttg 960
gtcaagagtc caagttccaa accagaaagg gagatgacga gcctgctagc cttcaacggt 1020
caatcttcca cctaa 1035
经检测， 该酶在 pH 2.0 ～ 6.5 的条件下酶活稳定， 属于酸性葡聚糖酶， 动物消化 道全程的各种 pH 环境均不会显著降低酶活， 同时蛋白酶体外水解实验表明本发明获得的 β- 葡聚糖酶具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化能力。另外， 在模拟啤酒酿造条件下， 该酶也对麦芽中的 β- 葡聚糖具有良好的水解效果。但该酶具有一个缺点， 即其耐高温性 能稍差， 75℃水浴中保存 10min 后， 其酶活力损失达 70％左右， 因此， 需对该酶进行相应的 改造， 以筛选获得耐高温性能的 β- 葡聚糖酶。
本 发 明 优 选 采 用 定 点 突 变 法 和 易 错 PCR 对 SEQ ID NO.1 所 示 的 黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 来源的 β- 葡聚糖酶 GLU 进行改造， 并经过高通量筛选的方法筛选得 到新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 和原有黑曲霉 生产的 β- 葡聚糖酶 GLU 相比， 有 4 个氨基酸的差异， 突变位点由 +46G， +62N， +288T， +313D 突变成 +46C， +62C， +288C， +313C， 整个蛋白质空间结构中增加了两个二硫键， 突变后的氨基 酸序列如 SEQ ID NO.3 所示 ：
MSRPFIFPAV FTLAASALAA PVNTTTEDET AQIPAEAVIG YSDLECDFDV AVLPFSNSTN 60 LCGLFINTTI ASIAAKEEGV SLEKREAEAY VEFVSAKDFS AEWLYTLEEV QYGKFEARMK 120 SAAAMGTVSS MFLYQNGSEI ADGRPWVEVD IEVLGKNPGS YQSNFIIGKA GAQKTSEKHH 180 AVSPDRLAAF HTYGLEWTPN YWSRTVDVRE VRKTEGGQVS RFTGTQGLNL NLWSSESAAW 240 VGQFDESKLP LFQFINWVKV GEYTPGQKYG GSDFTLDWTD NFDCFDGSRW GKGDWTFDGN 300 RVDLTDKNIY SRCGMLILAL VKSPSSKPER EMTSLLAFNG QSST 344 编码该氨基酸序列的基因如 SEQ ID NO.4 所示， 命名为 VGLU ： atgtctagac cattcatttt tcccgctgtt tttaccttgg ctgcctctgc tttggccgct ccagtcaaca ctactaccga ggacgagact gctcaaattc ctgctgaggc tgtcatcggt tactctgacc tggaatgcga tttcgacgtt gctgtcttgc ctttctccaa ctccaccaac ttgtgcggtt tgttcatcaa cactactatc gcttctattg ctgccaagga agagggtgtt tctcttgaga agagagaggc tgaagcctac gttgaattcg tttctgctaa ggacttttct gccgagtggt tgtacacttt agaggaagtc caatacggta agttcgaggc tcgtatgaag tctgctgccg ctatgggaac agtcagttcc atgttcttgt accagaacgg ttccgaaatc gccgatggaa gaccatgggt agaggtggat atcgaagttc tcggtaagaa cccaggatcc760 120 180 240 300 360 420 taccaatcca acttcatcat cggtaaagct ggtgctcaaa agacttccga gaagcaccac 540
gctgtttctc ctgacaggct cgccgctttc cacacctacg gtttggaatg gactcctaac 600
tactggtcaa ggactgttga cgtcagagag gtcagaaaga ctgaaggtgg acaagtttcc 660
agattcaccg gtactcaagg attgaacttg aatctttggt cctctgagtc tgcagcttgg 720
gttggtcaat tcgacgaatc taagctgcca ctgttccagt tcattaactg ggtcaaagtt 780
ggtgaataca cgccaggtca aaagtatggc ggttctgact tcactttgga ctggaccgac 840
aactttgaca ccttcgatgg ttgcagatgg ggtaagggtg actggacttt cgacggtaac 900
cgtgtcgact tgaccgacaa gaacatctac tccagatgcg gtatgttgat tcttgccttg 960
gtcaagagtc caagttccaa accagaaagg gagatgacga gcctgctagc cttcaacggt 1020
caatcttcca cctaa 1035
经检测， 该重组酶的热稳定性良好， 在 75℃水浴中放置 1h 酶活力仍能保持 85％ 左右， 在很大程度上能减少高温操作时引起的酶活丧失， 并且该酶的其他性能及稳定性 能也非常优良， 因此该酶可广泛作为饲料用酶及啤酒酿造用酶使用， 该酶的理论 PI/Mw ： 4.74/38050.50。
本 发 明 还 提 供 了 包 含 上 述 新 型 β- 葡 聚 糖 酶 基 因 GLU 的 重 组 载 体， 优选为 pPICzαA-GLU ； 以及包含上述新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的重组载体， 优选为 pPICzαA-VGLU。将本发明的新型 β- 葡聚糖酶基因与新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因分别 插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相 连接。作为本发明的一个最优选的实施方案， 优选为将本发明的新型 β- 葡聚糖酶基因与 新型耐高温 β- 葡聚糖酶基因分别插入到质粒 pPICzαA 上的 EcoR I 和 NotI 限制性酶切 位点之间， 使该核苷酸序列位于 AOX1 启动子的下游并受其调控， 分别得到重组酵母表达质 粒 pPICzαA-GLU 与 pPICzαA-VGLU。
本发明还提供了包含上述新型 β- 葡聚糖酶基因 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 基因 VGLU 的重组菌株的重组菌株， 优选为毕赤酵母重组菌株 X33。
本发明还提供了一种制备新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的方法， 其特征在于， 包 括以下步骤 ：
1) 用上述重组载体 pPICzαA-VGLU 转化宿主细胞， 得重组菌株 ；
2) 培养重组菌株， 诱导新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的表达 ； 以及
3) 回收并纯化所表达的新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU。
本发明还提供了上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 或新型耐高温 β- 葡聚糖酶 VGLU 的 应用， 优选其在饲料、 啤酒酿造工业中的应用。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性 能良好， 是一种优良的酸性 β- 葡聚糖酶， 并且具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水 解能力， 完全可达到饲料及啤酒酿造用酶的要求。本发明的新型耐高温 β- 葡聚糖酶通过 高效表达后能够达到较高的发酵水平， 在工业生产中可大大降低生产成本， 使其在饲料、 啤 酒酿造等工业中显示出更大的应用潜力。 附图说明
图 1 重组耐高温 β- 葡聚糖酶在 50L 罐中的发酵过程曲线。
图 2 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度。图 3 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应 pH 值。
图 4 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的温度耐受性能 ( 不同处理温度 )。
图 5 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的温度耐受性能 ( 不同处理时间 )。
图 6 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的 pH 耐受性能。
图 7 重组耐高温 β- 葡聚糖酶在胃蛋白酶， 胰蛋白酶处理后剩余酶活。
本发明的一种生产上述新型 β- 葡聚糖酶 GLU 的黑曲霉 AN070902(Aspergillus niger)， 于 2010 年 10 月 20 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北 京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏号为 ： CGMCC No.4235， 其相关信息记载于申请号为 CN201010566249.0 的专利中， 该专利已公开于 2011 年 4 月 6 日。 具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 《分子克隆实验指南》 ( 第三版 )J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书进行 ； 所述试剂和生物材料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。
实验材料和试剂 ：
1、 菌株与载体
大肠杆菌菌株 Topl0、 毕赤酵母 X33、 载体 pPICzalphaA 购自 Invitrogen 公司。
2、 酶与试剂盒
逆转录酶 SuperScriptTM III、 RNA 提取试剂盒购自 Invitrogen 公司。 质粒 DNA 提取 试剂盒， 胶回收试剂盒， PCR 纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自 Fermentas 公司。
3、 培养基
基本盐培养基 ： 磷酸氢二铵 5 ％、 磷酸二氢钾 0.5 ％、 七水硫酸镁 1.5 ％、 硫酸钾 1.95％、 硫酸钙 0.1％、 氢氧化钾 0.1％、 消泡剂 0.03％。高压后每升加 4.35 毫升 PTM1
PTM1( 微量盐溶液 ) ： 硫酸铜 0.6 ％、 碘化钾 0.018 ％、 一水硫酸锰 0.3 ％、 二水钼 酸钠 0.02 ％、 硼酸 0.002 ％、 六水氯化钴 0.05 ％、 氯化锌 2 ％、 七水硫酸铁 6.5 ％、 浓硫酸 0.5％、 生物素 0.02％
实施例 1、 黑曲霉 (Aspergillus niger)β- 葡聚糖酶 GLU 基因的克隆
运用 RNA 提取试剂盒， 提取黑曲霉 (Aspergillus niger) 总 RNA， 按照逆转录酶 TM SuperScript III Reverse Transcriptase 操作说明合成第一链 cDNA。以 cDNA 为模板， 设计 β- 葡聚糖酶引物 (GLU5EcoRI， GLU3NotI) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物由 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体 pPICzalphaA 相连接， 连接产物转 化大肠杆菌 Topl0 感受态细胞， 经抗生素 Zeocin 筛选后， 获得阳性克隆。 提取阳性克隆的质 粒。送样到上海英骏生物公司测序， 测序结果表明， 所获得克隆 DNA 插入片段含有 β- 葡聚 糖酶基因完整的开放阅读框。该 β- 葡聚糖酶基因 GLU， 全长 1035bp， 编码 344 个氨基酸。
扩增所用引物如下 ：
GLU 5EcoRI ：
5’ CTGAGAATTCATGTCTAGACCATTCATTTTTCCCG3’GLU 3NotI ：
5’ AGAGCGGCCGCTTAGGTGGAAGATTGACCGTTGAAG3’
实施例 2、 GLU 的基因定点突变
将克隆出的 GLU 基因， 采用 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 连接到经相同双酶切的载 体 pPICzαA 上， 获得重组表达载体 pPICzαA-GLU， 然后转化到 BL21 中， 选择阳性克隆子采 用 IPTG 诱导产酶。然后采用该酶在不同温度下 (60-100℃ ) 处理 10min 后检测剩余酶活， 发现该酶在 85℃下酶活损失达 80％以上， 这说明直接由 GLU 编码的 β- 葡聚糖酶耐高温性 能较差。因此需对该基因进行优化改良。通过对 β- 葡聚糖酶进行蛋白结构自动建模分析 (swissmodel)， 分析其二级结构和三级结构。 在不破坏其二级结构与活性中心的前提下， 对 活性中心附近以及二级结构连接处进行氨基酸定点突变， 增加二硫键， 以增强 β- 葡聚糖 酶蛋白的稳定性能及耐高温性能。共预测了 4 个待突变位点， 分别为 ： +46G， +62N， +288T， +313D， 然后针对性的设计了 4 对突变引物， 目的基因突变位点统一为 TGC， TGC 左右各取 15 个碱基构成正向引物 ； 反向引物与正向引物完全互补。
PCR 产物经 DpnI 酶切处理后转化 BL21 感受态细胞， 在 LB-Amp 平板筛选阳性突变 重组克隆， 并对筛选的阳性克隆子进行摇瓶培养， 采用 IPTG 诱导， 经对比测试， 优化后的基 因所编码的 β- 葡聚糖酶耐高温性能大大提高。经四次定点突变， 获得了优化后的 β- 葡 聚糖酶基因， 命名为 VGLU。 实施例 3、 包含耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU 的毕赤酵母工程菌的构建
优化后的耐高温 β- 葡聚糖酶基因 VGLU， 采用 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 重新连 接到经相同双酶切的载体 pPICzαA 上， 获得重组表达载体 pPICzαA-VGLU。然后采用 SacI 进行线性化， 线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母 X33， 电转化后涂布于 YPD(Zeo+) 平板 上进行筛选， 得到毕赤酵母重组菌株。
实施例 4、 耐高温 β- 葡聚糖酶重组菌株的高效表达
将筛选获得的耐高温 β- 葡聚糖酶重组菌株 pPICZaA-VGLU-X33-9 进行高密度发 酵培养。
配制 20L 基本盐培养基， 在 50L 自动控制发酵罐中灭菌后， 冷却至常温备用。用 氨水和磷酸调节发酵液的 pH 值至 4.6， 通过调节转速和空气流量控制溶氧大于 20 ％以 上， 发酵温度为 30 ℃。整个发酵过程分 3 个阶段 ： 第一阶段为菌体培养阶段， 将重组菌 pPICZaA-VGLU-X33-9 按照 10％的接种量接种至发酵罐中， 流加已灭菌的 4L50％的葡萄糖， 培养 24-30 小时， 以补完葡萄糖为标志 ； 第二阶段为饥饿阶段， 当葡萄糖补完之后， 不流加 任何碳源， 当溶氧上升至 80％以上即表明该阶段结束， 为期约 30-60min ； 第三阶段为诱导 表达阶段， 流加诱导培养基， 并且保持溶氧在 20％以上， 培养时间在 180-200 小时之间。发 酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。
在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活， 发酵过程中耐高温 β- 葡聚糖酶的表 达情况如图 1 所示， 发酵 195h 的发酵液酶活为 16250U/mL。
实施例 5、 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的活性分析
采用 DNS 法进行检测。
1 个酶活单位 (U) 定义为 ： 在规定条件 (pH 4.8， 40℃ ) 下， 每分钟释放出具有相当 于 1μmol 葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量 (μmol/min)
实施例 6、 重组耐高温 β- 葡聚糖酶的性质测定
1、 耐高温 β- 葡聚糖酶比活测定
将上述发酵液中的耐高温 β- 葡聚糖酶通过离子交换柱 (Q SepharoseTM Fast Flow Ion Exchanger) 纯化， 采用改良型 Bradford 试剂盒 ( 上海 Sangon 公司 ) 测定蛋白浓 度， 得出该耐高温 β- 葡聚糖酶比活为 2031U/mg。
2、 耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度及 pH 测定
最适反应温度 ： 将酶液稀释适当倍数， 在不同温度 (25 ～ 80℃ ) 下反应， 测定耐高 温 β- 葡聚糖酶的酶活。以最高酶活力为 100％， 其它温度下测得的酶活与之相比， 即得到 该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图 2。
最适反应 pH ： 将稀释后的酶液， 与不同 pH(2.0 ～ 7.0) 检测条件下， 检测该耐高温 β- 葡聚糖酶的酶活力， 并采用最高酶活为 100％， 其他检测结果与之相比， 即得到不同 pH 检测条件下的相对酶活。最适反应 pH 曲线见图 3。
结果如图 3 和图 4 所示 ： 该重组耐高温 β- 葡聚糖酶的最适反应温度为 60℃， 最 适反应 pH 为 5.0。
3、 耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能测定 (1) 不同温度耐热性能 ： 将酶液稀释适当倍数， 在不同温度下处理 10min 后， 以未 处理的酶活力为对照测定耐高温 β- 葡聚糖酶的相对酶活， 结果见图 4。
(2) 不 同 时 间 耐 热 性 能 ： 在 75 ℃ 条 件 下， 将适当稀释的酶液处理不同时间 (10min-60min)， 以未处理的酶活为对照测定该耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能， 结果见图 5。
结果显示该耐高温 β- 葡聚糖酶的耐热性能良好， 完全可达到饲料及啤酒酿造用 酶的要求。
4、 耐高温 β- 葡聚糖酶 pH 稳定性测定
将稀释后的酶液与不同 pH 的缓冲液混合， 室温放置 2h， 以未处理的酶液为对照， 测定耐高温 β- 葡聚糖酶的相对酶活， 结果如图 6 所示。
该 β- 葡聚糖酶的最适 pH 为 5.0， 并且在 pH 3 ～ 6 范围内相对酶活均可达到 80％ 以上， 为一种良好的酸性 β- 葡聚糖酶。
5、 耐高温 β- 葡聚糖酶对胃蛋白酶、 胰蛋白酶消化耐受性测定
取 0.1mL 耐高温 β- 葡聚糖酶液， 分别加入 0.5mL 0.1mg/mL 胃蛋白酶 (pH 2.0 浓 度 80U/mL) 和 0.5mL 0.1mg/mL 胰蛋白酶 (pH 7.0 浓度 150U/mL)， 于 37℃处理不同时间后 测酶活。结果如图 7 所示。
其中胃蛋白酶处理 120min 后， 酶活性仍达 92％左右， 用胰蛋白酶处理 120min 后， 剩余 83％。这说明本 β- 葡聚糖酶具有非常好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解能力。
6、 金属离子和 EDTA 对酶活力的影响
将含有 1mM K+、 Mg2+、 Ca2+、 Zn2+、 Fe2+、 Fe3+、 Mn2+、 Co2+、 Cu2+ 和 EDTA 的溶液与稀释适 当倍数的酶液混合， 室温放置 30min， 以未处理的酶液为对照， 结果如表 1 所示。 2+ 2+
结果表明， Mg 、 Ca 对该 β- 葡聚糖酶有一定的激活作用， 酶活性分别促进 11％、 + 2+ 3+ 2+ 2+ 25％ ； K、 EDTA、 Zn 对酶活性没有影响 ； 其余金属离子 Cr 、 Cu 、 Fe 和 Fe3+ 对酶活性均有 不同程度的抑制作用 ； 而 SDS 完全抑制了酶的活性。
表 1 金属离子和 EDTA 对重组耐高温 β- 葡聚糖酶酶活力的影响12102363773 A CN 102363791
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