运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110382348.8	申请日：	2011.11.25
公开号：	CN102363815A	公开日：	2012.02.29
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20111125\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/10	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	杭州优思达生物技术有限公司
发明人：	祁军; 张霞; 胡林; 左锋; 王馨; 刘振宇; 刘寅; 杨春江; 柴宏森; 詹曦菁; 刘智勇; 徐高连; 刘启军; 崔景柏; 李波; 许丽霞
地址：	310053 浙江省杭州市滨江区南环路3766号801-808室
优先权：
专利代理机构：	天津市鼎和专利商标代理有限公司 12101	代理人：	李凤
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内容摘要

本发明公开了一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法，设计了五个引物组序列包括以下五个引物：5’GCGGAAGTCGCGGCCCG；5’TCGCACCGTCAAAGGAACC；5’AGGCCGGTATTATTGATGC；TTTCTCTGGATGGTATGC；5’AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC，其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术快速低成本的沙门菌检测方法。

权利要求书

1：一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，包括以下五个引物： SEQ ID NO.1 ： 5’GCGGAAGTCGCGGCCCG SEQ ID NO.2 ： 5’TCGCACCGTCAAAGGAACC SEQ ID NO.3 ： 5’AGGCCGGTATTATTGATGC SEQ ID NO.4 ： 5' TTTCTCTGGATGGTATGC SEQ ID NO.5 ： 5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC 其中引物序列 3 的 5’ 端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列 4 的 5’ 端有生物素荧光基团标记。
2：根据权利要求 1 所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：成分浓度加样量 Bst 酶 5U/μL 1μL Bst 酶缓冲液 5μL SEQ ID NO.1 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.2 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.3 ： 10μmol/L 0.5μL SEQ ID NO.4 ： 10μmol/L 0.5μL SEQ ID NO.5 ： 10μmol/L 0.2μL DNA 样品 2μL 双蒸水 1
3： 8μL 总体积 25 μL 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl 、 10 mM (NH4)2SO4、 10 mM KCl、 2 mM MgSO4、质量百分比 0.1 % Triton X-100，且 pH 为 8.8 。 3. 一种权利要求 1 所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，其特征在于，核酸扩增程序为：（1） 63℃ 90 分钟；（2） 80℃ 2 分钟。
4：一种权利要求 1 所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，其特征在于，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在 15-30 分钟内读取结果，如果仅在质控区 C 出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。

说明书

运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
    技术领域本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。
     背景技术沙门菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种 ( 或菌株 )。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。除引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测沙门菌是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如 PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。
     发明内容针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。
     为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物： SEQ ID NO.1 ： 5’GCGGAAGTCGCGGCCCG SEQ ID NO.2 ： 5’TCGCACCGTCAAAGGAACC SEQ ID NO.3 ： 5’AGGCCGGTATTATTGATGC SEQ ID NO.4 ： 5' TTTCTCTGGATGGTATGC SEQ ID NO.5 ： 5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC 其中引物序列 3 的 5’ 端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列 4 的 5’ 端有生物素荧光基团标记。
     核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：成分浓度加样量 Bst 酶 5U/μL 1μL Bst 酶缓冲液 5μL SEQ ID NO.1 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.2 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.3 ： 10μmol/L 0.5μL SEQ ID NO.4 ： 10μmol/L 0.5μL 10μmol/L 0.2μL SEQ ID NO.5 ：
     DNA 样品 2μL 双蒸水 13.8μL 总体积 25 μL 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl 、 10 mM (NH4)2SO4、 10 mM KCl、 2 mM MgSO4、质量百分比 0.1 % Triton X-100，且 pH 为 8.8 。
     核酸扩增程序为：（1） 63℃ 90 分钟；（2） 80℃ 2 分钟。
     所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在 15-30 分钟内读取结果，如果仅在质控区 C 出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。
     与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，交叉引物核酸恒温扩增技术适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次恒温扩增就能够检测沙门菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它方法，本方法制仅需要简单的设备即可，大大提高了性价比节约了成本。该技术检测沙门菌具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定，避免了反复培养，节约时间；该方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。附图说明图 1 本发明结果判读示意图。
     图 2 本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的实验结果（检测条 1. 肠炎沙门菌 Np10012 检测结果；检测条 2. 肠炎沙门菌 CIQ021207 检测结果；检测条 3. 肠炎沙门菌 CIQ070123 检测结果；检测条 4. 志贺氏菌 ATCC12022 检测结果；检测条 5. 空白对照）。
     具体实施方式
     下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：本发明是通过以下技术方案实现的：（1）设计特异性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒温扩增技术检测；（2）整合各引物使之不相互干扰。
     （3）以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；（4）扩增完毕后可通过特定的胶体金检测试纸条目测结果。
     本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物： SEQ ID NO.1 ： 5’GCGGAAGTCGCGGCCCG SEQ ID NO.2 ： 5’TCGCACCGTCAAAGGAACC SEQ ID NO.3 ： 5’AGGCCGGTATTATTGATGC SEQ ID NO.4 ： 5' TTTCTCTGGATGGTATGCSEQ ID NO.5 ： 5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC 其中引物序列 3 的 5’ 端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列 4 的 5’ 端有生物素荧光基团标记。
     该引物为和沙门菌致病性密切相关的侵袭性蛋白 A 的基因中（invasion protein A）挑选设计的，参考序列为 GenBank CP002487.1 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. ST4/74, complete genome，检测基因区域为 3060976~ 3063033。
     优选的核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：成分浓度加样量 Bst 酶 5U/μL 1μL Bst 酶缓冲液 5μL SEQ ID NO.1 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.2 ： 10μmol/L 1μL SEQ ID NO.3 ： 10μmol/L 0.5μL SEQ ID NO.4 ： 10μmol/L 0.5μL SEQ ID NO.5 ： 10μmol/L 0.2μL DNA 样品 2μL 双蒸水 13.8μL 总体积 25 μL 其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl 、 10 mM (NH4)2SO4、 10 mM KCl、 2 mM MgSO4、质量百分比 0.1 % Triton X-100，且 pH 为 8.8 。
     上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，核酸扩增程序为：（1） 63℃ 90 分钟；（2） 80℃ 2 分钟。
     如图 1、 2 所示，上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在 15-30 分钟内读取结果，如果仅在质控区 C 出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。
     实施例 1 样本：某肉馅。
     用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测：（1）取 100 克待检样品，粉碎。
     （2）取 1 克样品进行核酸抽提。
     （3）交叉引物核酸恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：成分浓度加样量Bst 酶 5U/μL 1μL Bst 酶缓冲液 5μL 引物序列一： 10μmol/L 1μL 引物序列二： 10μmol/L 1μL 引物序列三： 10μmol/L 0.5μL 引物序列四： 10μmol/L 0.5μL 引物序列五： 10μmol/L 0.2μL DNA 样品 2μL 双蒸水 13.8μL 总体积 25 μL 。
     其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl 、 10 mM (NH4)2SO4、 10 mM KCl、 2 mM MgSO4、质量百分比 0.1 % Triton X-100 且 pH 为 8.8 。
     核酸扩增程序为： 63℃ 90 分钟；80℃ 2 分钟。
     共进行 3 管实验，其中 DNA 样品所加入的分别为：沙门菌 DNA 模板标准品；本待测样品 DNA ；无 DNA 的阴性对照。（4）结果观察将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在 20 分钟内读取结果，沙门菌 DNA 模板标准品和本待测样品 DNA 出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无 DNA 的阴性对照仅在质控区 C 出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。
     3 天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。
     实施例 2 样本：某速冻肉饼。
     用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测：（1）取 100 克待检样品，粉碎。
     （2）取 1 克样品进行核酸抽提。
     （3）交叉引物核酸恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：成分浓度加样量 Bst 酶 5U/μL 1μL Bst 酶缓冲液 5μL 引物序列一： 10μmol/L 1μL 引物序列二： 10μmol/L 1μL 引物序列三： 10μmol/L 0.5μL 引物序列四： 10μmol/L 0.5μL 引物序列五： 10μmol/L 0.2μL
     DNA 样品 2μL 双蒸水 13.8μL 总体积 25 μL 。
     其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl 、 10 mM (NH4)2SO4、 10 mM KCl、 2 mM MgSO4、质量百分比 0.1 % Triton X-100 且 pH 为 8.8 。
     核酸扩增程序为： 63℃ 90 分钟；80℃ 2 分钟。
     共进行 3 管实验，其中 DNA 样品所加入的分别为：沙门菌 DNA 模板标准品；本待测样品 DNA ；无 DNA 的阴性对照。
     （4）结果观察将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在 20 分钟内读取结果，沙门菌 DNA 模板标准品和本待测样品 DNA 出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无 DNA 的阴性对照仅在质控区 C 出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。
     3 天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

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1、10申请公布号CN102363815A43申请公布日20120229CN102363815ACN102363815A21申请号201110382348822申请日20111125C12Q1/68200601C12Q1/1020060171申请人杭州优思达生物技术有限公司地址310053浙江省杭州市滨江区南环路3766号801808室72发明人祁军张霞胡林左锋王馨刘振宇刘寅杨春江柴宏森詹曦菁刘智勇徐高连刘启军崔景柏李波许丽霞74专利代理机构天津市鼎和专利商标代理有限公司12101代理人李凤54发明名称运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法57摘要本发明公开了一种运用交。

2、叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法，设计了五个引物组序列包括以下五个引物5GCGGAAGTCGCGGCCCG；5TCGCACCGTCAAAGGAACC；5AGGCCGGTATTATTGATGC；TTTCTCTGGATGGTATGC；5AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC，其中引物序列3的5端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5端有生物素荧光基团标记。针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术快速低成本的沙门菌检测方法。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申。

3、请权利要求书1页说明书5页附图1页CN102363833A1/1页21一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，包括以下五个引物SEQIDNO15GCGGAAGTCGCGGCCCGSEQIDNO25TCGCACCGTCAAAGGAACCSEQIDNO35AGGCCGGTATTATTGATGCSEQIDNO45TTTCTCTGGATGGTATGCSEQIDNO55AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC其中引物序列3的5端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5端有生物素荧光基团标记。2根据权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩。

4、增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量BST酶5U/L1LBST酶缓冲液5LSEQIDNO110MOL/L1LSEQIDNO210MOL/L1LSEQIDNO310MOL/L05LSEQIDNO410MOL/L05LSEQIDNO510MOL/L02LDNA样品2L双蒸水138L总体积25L其中BST酶缓冲液的成分为20MMTRISHCL、10MMNH42SO4、10MMKCL、2MMMGSO4、质量百分比01TRITONX100，且PH为88。3一种权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，其特征在于，核酸扩增程序。

5、为（1）6390分钟；（2）802分钟。4一种权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，其特征在于，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在1530分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。权利要求书CN102363815ACN102363833A1/5页3运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法技术领域0001本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运。

6、用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。背景技术0002沙门菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种或菌株。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。除引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测沙门菌是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是。

7、一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。发明内容0003针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。0004为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物SEQIDNO15GCGGAAGTCGCGGCCCGSEQIDNO25TCGCACCGTCAAAGGAACCSEQIDNO35AGGCCGGTATTATTGATGCSEQIDNO45TTTCTCTGGATGGTATGCSEQIDNO55AGATGAGTATTGATGC。

8、CGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC其中引物序列3的5端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5端有生物素荧光基团标记。0005核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量BST酶5U/L1LBST酶缓冲液5LSEQIDNO110MOL/L1LSEQIDNO210MOL/L1LSEQIDNO310MOL/L05LSEQIDNO410MOL/L05LSEQIDNO510MOL/L02L说明书CN102363815ACN102363833A2/5页4DNA样品2L双蒸水138L总体积25L其中BST酶缓冲液的成分为20MMTRISHCL、10MMNH42SO4、10MMK。

9、CL、2MMMGSO4、质量百分比01TRITONX100，且PH为88。0006核酸扩增程序为（1）6390分钟；（2）802分钟。0007所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在1530分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。0008与现有技术相比，本发明的有益效果是相比传统生理生化检测方法，交叉引物核酸恒温扩增技术适用于直接从患者含菌。

10、体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次恒温扩增就能够检测沙门菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它方法，本方法制仅需要简单的设备即可，大大提高了性价比节约了成本。该技术检测沙门菌具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定，避免了反复培养，节约时间；该方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。附图说明0009图1本发明结果判读示意图。0010图2本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的实验结果（检测条1肠炎沙门菌NP10012检测结果；检测条2肠炎沙门菌CIQ021207检测结果；检测条3肠炎沙门菌CIQ070123检测。

11、结果；检测条4志贺氏菌ATCC12022检测结果；检测条5空白对照）。具体实施方式0011下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明本发明是通过以下技术方案实现的（1）设计特异性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒温扩增技术检测；（2）整合各引物使之不相互干扰。0012（3）以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；（4）扩增完毕后可通过特定的胶体金检测试纸条目测结果。0013本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物SEQIDNO15GCGGAAGTCGCGGCCCGSEQIDNO25TCGCACCGTCAAAGGAACCSEQIDNO35AGGC。

12、CGGTATTATTGATGCSEQIDNO45TTTCTCTGGATGGTATGC说明书CN102363815ACN102363833A3/5页5SEQIDNO55AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC其中引物序列3的5端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5端有生物素荧光基团标记。0014该引物为和沙门菌致病性密切相关的侵袭性蛋白A的基因中（INVASIONPROTEINA）挑选设计的，参考序列为GENBANKCP0024871SALMONELLAENTERICASUBSPENTERICASEROVARTYPHIMURIUMSTRST4/。

13、74,COMPLETEGENOME，检测基因区域为30609763063033。0015优选的核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量BST酶5U/L1LBST酶缓冲液5LSEQIDNO110MOL/L1LSEQIDNO210MOL/L1LSEQIDNO310MOL/L05LSEQIDNO410MOL/L05LSEQIDNO510MOL/L02LDNA样品2L双蒸水138L总体积25L其中BST酶缓冲液的成分为20MMTRISHCL、10MMNH42SO4、10MMKCL、2MMMGSO4、质量百分比01TRITONX100，且PH为88。0016上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检。

14、测沙门菌的试剂的扩增方法，核酸扩增程序为（1）6390分钟；（2）802分钟。0017如图1、2所示，上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在1530分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。0018实施例1样本某肉馅。0019用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测（1）取100克待检样品，粉碎。002。

15、0（2）取1克样品进行核酸抽提。0021（3）交叉引物核酸恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量说明书CN102363815ACN102363833A4/5页6BST酶5U/L1LBST酶缓冲液5L引物序列一10MOL/L1L引物序列二10MOL/L1L引物序列三10MOL/L05L引物序列四10MOL/L05L引物序列五10MOL/L02LDNA样品2L双蒸水138L总体积25L。0022其中BST酶缓冲液的成分为20MMTRISHCL、10MMNH42SO4、10MMKCL、2MMMGSO4、质量百分比01TRITONX100且PH为88。0023核酸扩增程序为6390分钟；8。

16、02分钟。0024共进行3管实验，其中DNA样品所加入的分别为沙门菌DNA模板标准品；本待测样品DNA；无DNA的阴性对照。0025（4）结果观察将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在20分钟内读取结果，沙门菌DNA模板标准品和本待测样品DNA出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无DNA的阴性对照仅在质控区C出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。00263天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。0027实施例2样本某速冻肉饼。0028用常规生理、生。

17、化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测（1）取100克待检样品，粉碎。0029（2）取1克样品进行核酸抽提。0030（3）交叉引物核酸恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量BST酶5U/L1LBST酶缓冲液5L引物序列一10MOL/L1L引物序列二10MOL/L1L引物序列三10MOL/L05L引物序列四10MOL/L05L引物序列五10MOL/L02L说明书CN102363815ACN102363833A5/5页7DNA样品2L双蒸水138L总体积25L。0031其中BST酶缓冲液的成分为20MMTRISHCL、10MMNH42SO4、10MMKCL、2。

18、MMMGSO4、质量百分比01TRITONX100且PH为88。0032核酸扩增程序为6390分钟；802分钟。0033共进行3管实验，其中DNA样品所加入的分别为沙门菌DNA模板标准品；本待测样品DNA；无DNA的阴性对照。0034（4）结果观察将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在20分钟内读取结果，沙门菌DNA模板标准品和本待测样品DNA出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无DNA的阴性对照仅在质控区C出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。00353天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。0036以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。说明书CN102363815ACN102363833A1/1页8图1图2说明书附图CN102363815A。

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