多发性硬化症严重程度的遗传标志 发明领域 本发明涉及利用 SNP 来鉴定其与受试者多发性硬化症 (MS) 严重程度的关联性。
发明背景
多发性硬化症 (MS) 是中枢神经系统 (CNS) 的慢性炎症和脱髓鞘疾病， 常始于成年 早期。MS 被为是一种复杂的疾病， 因为很可能有多种遗传和非遗传因素结合起来影响患此 病的风险性。 遗传因素作用的证据是令人注目的， 它得到双胞胎、 半同胞和收养子女研究的 支持。 虽然 MS 发病起始时通常即呈现为复发 - 缓解过程 (RR)， 但大多数患者发病后进入继 发性渐进期 (SP)， 而其他患者 ( 常常是后来发病的 ) 可能直接进入原发渐进期 (PP)。
基因组扫描排除了远离 HLAII 类区中存在 MS 主要易感基因座的推断， 但未能揭示 1-3 是否存在几个以上推测的易感基因座 。已显示在 HLA 基因复合体中有几个 HLA-DRB1 等 位基因与此病相关 4， 而一些证据也提示 HLA I 类区域中存在独立的 MS 风险因子 5-7。最近， 支持 IL7Ra 基因在 MS 上至关重要的证据越来越多 8-10。然而， 显然其他遗传风险因子仍待 鉴定。
已明确 MS 易感性是一种复杂的遗传性状。 MS 的临床病程和结局大相径庭， 看来某 11， 12 些基因可能参与诱生该病， 而其他基因可能在影响此病严重性上起作用 。评估 MS 严重 性是评估随疾病进程是否发展为残疾， 但可能因以下事实而复杂化， 即此病的进程随时间 而不同， 患者也可能出现改善期。临床评估 MS 严重程度应用最广泛的方法是残疾状态扩展 等级表 (EDSS13)。传统上广泛采用进展指数 (PI ＝ EDSS 评分 / 持续时间 ( 年 ))， 但受到上 述原因的阻碍。最近， 提出 MS 严重性评分 (MSSS) 可作为一种新方法， 涉及对有相当病程患 14 者的残疾分布进行 EDSS 评分， 部分弥补了 PI 的弱点 。
已测试了可能与 MS 严重性相关的几种候选基因 ( 参见综述 15)， 它们大多数没有 显示与 MS 进程遗传相关的证据。 这些候选基因是 ： 载脂蛋白 ε(APOE， 参见综述 16)、 脊髓小 17 19 脑性共济失调 2(SCA2 )、 脑源性神经营养因子 (BDNF18)、 Toll 样受体 4(TLR4 )、 骨桥蛋白 20 21 、 细胞毒 T 淋巴细胞相关因子 4(CD152 或 CTLA4) 和 CD28 、 趋化因子 CC 受体 5(CCR5) 和 22 HLA-DRB1*1501 。 已报导的与 MS 临床结局相关的只有少数基因座 ： 位于染色体 2q12-14 上 的白介素 1 基因座， 含有 3 个基因 (IL-1， IL-1 和 IL-1 受体拮抗剂 IL-1RN)， 其中 6 个位点、 5 个单核苷酸多态性 (SNP) 和一个数目可变串联重复 (variable number tandem repeat， VNTR) 序列据报导与在三类严重等级上用 EDSS 测定的严重程度相关 23 ； 在白介素 10 启动 子中， 两个微卫星标记在轻度 (PI ＜ 0.5) 与严重 (PI ＞ 0.5) 疾病进程类别之间有差异 24 ； 已发现 ADAMTS14 基因中两个 SNP 与 MS 分类 ( 复发缓解 -RR 与原发渐进 -PP) 有关， 但与用 25 MSSS 测得的预后无关 ； 在 CD59a 缺陷的 MOG-EAE 小鼠模型上已证明此病发病率和严重性 26 升高 。然而， 这些研究依据的个体数目有限并且没有进行重复研究。此外， 所有这些研究 都采用检测与严重程度相关性的分类方法 ： 通过按病损范围、 EDSS、 PI 或 MSSS 的等级划分 选择截取域值， 将病人分成轻度 / 中度 / 严重或轻度 / 严重 MS 类型， 并比较各类别之间的 等位基因和基因型频率。
鉴于 MS 的重要性， 对用于 MS 患者的鉴定标志特别是遗传标志存在需求。特别是，
需要鉴定用于预测 MS 易感性、 特别是疾病严重程度的基因标志。
发明概述
本发明的一个方面涉及一种基因分型方法， 包括 a) 使用分离自个体样品的核 酸； 和 b) 测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922 和 / 或 rs4315313 的核苷酸类型， 和 / 或与 一个或多个这些 SNP 连锁不平衡 (LD) 的 SNP 中的核苷酸类型。
本发明的一个方面涉及选自 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725 、 rs1343522 、 rs4573623 、 rs333548 、 rs10508075 、 rs2839580 、 rs2495725 、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 中的一个或多个 SNP， 与这些 SNP 的一个或多个连锁不平 衡 (LD) 的 SNP， 用于预测个体 MS 疾病的严重程度。
在另一方面， 本发明涉及在需要治疗的个体上治疗 MS 的方法， 该方法包括步骤 a) 将上述方法体外应用于个体的样品 ； b) 治疗经鉴定显示有上述一种或多种标志并经鉴定 显示 MS 疾病严重性达到某种水平的个体。
发明详述
以下更详细地描述本发明， 其中实施例旨在说明本发明， 而不构成对本发明范围 的限制。
表格和附图的简要说明
图 1.MSSS 分布 ： 1,040 个 MS 患者的 MS 严重性评分分布直方图。
图 2. 严重程度相关性的 FDR( 假发现率 ) 评估 ： 用 10,000 轮 MSSS 慢慢移动估计 FDR， 并对所选阳性数 R 作图， R ≤ 100( 粗线 )。此曲线给出了估计的给定阳性数中的假阳 性比例 ( 如 40 个最可能相关的 SNP 的 90％ (R ≤ 40) 评估为假阳性 )， 或给定的假发现率 中的阳性数 ( 例如 40％ FDR 域值只选出一个 SNP)。虚线代表 95％估计置信区间边界。
图 3. 与疾病严重程度相关的 SNP 举例 ： 左侧分布图代表全体人群 ( 黑色 ： (1) 最 左侧柱 )、 多数纯合子个体 ( 红色 ： (2) 左侧第 2 柱 )、 杂合子个体 ( 蓝色 ： 左侧第 3 柱 ) 和 少数纯合子个体 ( 绿色 ： 最右侧柱 ) 中所考虑的 SNP 的 MSSS 分布。水平线 ( 各个方框 ) 表 示各类别 MSSS 的平均值 ( 各自的标准差 )。右侧图提供累积分布函数。
图 3.1 ： SNP 1 遗弃染色体 4， rs6552511
图 3.2 ： SNP 2 遗弃染色体 17， rs7221818
图 3.3 ： SNPs 3 和 4.XYLT1， rs12927173 和 rs2059283
图 3.4 ： SNPs 5， 7 和 11.HIF1AN， rs1343522， rs4573623 和 rs2495725
图 3.5 ： SNPs 6 和 12.MGAT5， rs4953911 和 rs3814022
图 3.6 ： SNP 8.MEGF11， rs333548
图 3.7 ： SNP 9.FGF14， rs10508075
图 3.8 ： SNP 10.PDE9A， rs2839580
图 3.9 ： SNP 13.MTPN， rs1078922
图 3.10 ： SNP 14.CDH13， rs4315313
图 4.XYLT1 和 MGAT5 中的 SNP 重复 ：
873 份独立样品重复数据组的 3 个 SNP 相关性分布图 ( 图例与图 3 相同 )。上面两个 SNP 位于 MGAT5 基因内， 第三个 SNP 位于 XYLT1 基因内。
以下描述 SNP 及其序列
SNP 的 IUPAC 代码 ：IUPAC 代码 R SNP G或A6102365370 A CN 102365391说IUPAC 代码 Y M K S W明SNP书4/17 页T或C A或C G或T G或C A或T
本发明一方面涉及基因分型的方法， 包括步骤 ： a) 使用分离自个体样品的核 酸； 和 b) 测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922 和 / 或 rs4315313 的核苷酸类型， 和 / 或与 这些 SNP 的一个或多个连锁不平衡 (LD) 的 SNP 中的核苷酸类型。特 别 感 兴 趣 的 SNP 优 选 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
在一个实施方式中， 按照本发明和用于本发明方法和应用的 SNP 也是与一个或多 个所鉴定的 SNP 连锁不平衡 (LD) 的那些 SNP， 表示为至少包括 100 名个体的至少一群患者 2 2 的 LD 相关系数 r ＞ 0.8， 优选 LD 相关系数 r ＞ 0.95。
一种标志 ( 如 SNP) 与按照本发明的多发性硬化症患者的严重性 “相关” ， 表示 MS 严重程度不同的两群患者之间该标志的频率有统计学显著差异。
多发性硬化症 (MS) 的 “严重程度” ， 按照本发明可用 MS 领域已知的任何方法表 示， 例如残疾状态扩展等级表 (Expanded Disease Status Scale， EDSS)， 或用该领域其它 常用的技术或衡量方法或定义表示。在这种情况下及在本领域中常用的术语 “疾病残余活 动” 应理解为表示 MS 疾病活动的某种程度， 例如， 出现用 MS 领域常用的衡量方法或定义所 限定的临床症状。 “疾病残余活动” 的一种指征或衡量标准， 可以是如用残疾状态扩展等级 表 (EDSS) 或磁共振成像 (MRI) 所测得的经历疾病复发或病情发展。作为时间框架的一个 例子是两年治疗期间的评估。 应理解其它时间框架也可被定义和采用， 如一年、 三年或临床 研究方案中常用的、 技术人员熟知的其它时间框架。 可选择参比时间框架， 以利于衡量和适 当的读出。 可采用同样适用的、 其它已被接受的疾病状态衡量方法， 例如多发性硬化症剑桥 基础评分 (CAMBS) 和技术人员使用的其它方法。MS 领域及如本领域技术人员所知道的， MS 攻击有各种定义， 它们可用于本发明。因此， 当实施本发明时， 技术人员可采用各种可能的 方法。评估或诊断 MS 方法的例子可参见以下出版文献 ： Kurzke J.F， Neuroepidemiology， 1991， 10 ： 1-8 ； Kurzke J.F， Neurology， 1983， 33 ： 1444-1452 ； McDonald W.I et al.， Ann. Neurol.， 2001， 50 ： 121-127 ； Polman C.H.et al.， Ann.Neurol.2005， 58 ： 840-846。因此， 严
重程度标志或 SNP 可以是表明一个患者与 MS 人群相比其疾病严重程度高或低的标志。
按本发明治疗的个体会对治疗有 “反应” 。诊断为有 MS、 罹患 MS 的个体或本发明7102365370 A CN 102365391说明书和5/17 页意义上的 MS 患者对干扰素治疗 “有反应” 或 “有反应者” 应理解为 MS 患者经干扰素治疗， 特别是用干扰素 1a 或 1b( 具体是 )治 疗后， 按下面设置的标准所表现的疾病残余活动。有反应可被定义和 / 或衡量为疾病进程 延迟， 例如， 可采用疾病状态扩展等级表 (EDSS) 或本领域常用的其它技术或衡量方法或定 义来衡量。 具体说， 有反应应理解为 MS 无发展或无恶化、 或临床病情 / 疾病活动稳定、 或 MS 改善， 例如在临床症状上的改善， 或用 MRI 或脑脊液 (CSF) 分析等其它方法测量的 MS 改善。 特别是， 可理解为复发 / 发作 / 恶化频率减少， 或复发 / 发作 / 恶化程度减轻。 本说明书和权利要求书中所用的 “一个” 或 “一种” 指一个或多个， 除非另有说明。
“等位基因” 是特定形式的基因、 遗传标志或其它遗传基因座， 它可与其它形式的 基因、 遗传标志或其它遗传基因座区分， 例如但不限于其特定的核苷酸序列。 术语等位基因 包括例如 ( 但不限于 ) 一种形式的单核苷酸多态性 (SNP)。个体的二倍体细胞可以是某等 位基因的纯合子， 即两个配对染色体上的等位基因相同 ； 或是所述等位基因的杂合子， 即两 个配对染色体上的等位基因不同。
“遗传标志” 是一种可鉴定的多态性遗传基因座。一个例子 ( 但不限于遗传标志 ) 是单核苷酸多态性 (SNP)。 本发明所用的 “标志” 可以是遗传标志或任何其他标志， 例如特定 基因在核苷酸水平如 mRNA 上的表达水平， 在本发明中可用作对干扰素治疗有反应的指标。
本文所用的 “基因型” 指一个个体的配对 ( 同源 ) 染色体上一个遗传基因座的基 因标志的两个等位基因的联合遗传标志， 例如但不限于 SNP。本文所用的 “基因型” 也指一 个个体的一对或一对以上同源染色体上一个以上遗传基因座的等位基因组合， 例如但不限 于 SNP。
“基因分型” 是测定个体基因型的方法。
“基因座” 或 “遗传基因座” 指基因在染色体或其他遗传物质上的具体位置。
“寡核苷酸” 指核酸或核酸衍生物， 包括但不限于 ： 连锁核酸 (locked nucleic acie， LNA)、 肽核酸 (PNA) 或桥连核酸 (BNA) ； 通常长度为 5-100 个毗连碱基， 最常见长度为 5-40、 5-35、 5-30、 5-25、 5-20、 5-15、 5-10、 10-50、 10-40、 10-30、 10-25、 10-20、 15-50、 15-40、 15-30、 15-25、 15-20、 20-50、 20-40、 20-30 或 20-25 个毗连碱基。可设计能与遗传标志的任 何形式等位基因特异性杂交的寡核苷酸序列， 这种寡核苷酸序列称为等位基因的特异性探 针。如果所述遗传标志是一个 SNP， 该 SNP 的互补等位基因可位于等位基因特异性探针的 任何位置。实施本发明可用的其他寡核苷酸是能与 3’ 末端相距遗传标志基因座 1 个或少 于或等于 10 个核苷酸、 优选≤约 5 个核苷酸的 SNP 毗邻靶区域杂交的寡核苷酸。这类能与 SNP 毗邻区杂交的寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中， 本文称为 “引物延伸寡核 苷酸” 。在一个优选的实施方式中， 引物延伸寡核苷酸的 3’ 末端是与紧靠 SNP 的核苷酸互 补的脱氧核苷酸。
“多态性” 指人群某遗传基因座核苷酸序列不同或含有不同数目重复核苷酸单位 的两种或多种替换形式 ( 等位基因 )。多态性见于基因的编码区 ( 外显子 )、 非编码区或基 因外侧。人群中不同等位基因多态性出现的频率不同， 在选定人群中最常见的等位基因有 时称为 “主要” 等位基因。二倍体生物可以存在不同等位基因的纯合子或杂合子。双等位 基因多态性有两个等位基因。
在所述方法中， 所述双等位基因标志的核苷酸的鉴定较佳为测定所述个体基因组
中存在的所述双等位基因标志的两个拷贝。可采用技术人员已知的任何方法， 优选用微测 序试验进行所述测定。此外， 可以用例如 PCR 先扩增含双等位基因标志的序列的一部分， 再 进行所述测定步骤。然而， 也可采用任何可利用的方法。
按照本发明， 优选的方法还包括将基因分型步骤的结果与多发性硬化症严重程度 的结果相关联。
本发明人在一个按照本发明的优选方法中发现， 存在可表明严重程度的特征等位 基因， 它们是 ： rs3814022 中的 G， rs4953911 中的 T， rs2059283 中的 A， rs12927173 中的 A， rs2495725 中的 A， rs1343522 中的 G， rs4573623 中的 G， rs333548 中的 T， rs10508075 中的 G， rs2839580 中的 A， rs2495725 中的 A， rs3814022 中的 G， rs1078922 中的 G 和 / 或 rs4315313 中的 C ； 这些等位基因是多发性硬化症严重程度的指标。 在按照本发明的一个特 定 SNP 中， 在一个等位基因或优选两个等位基因中存在各自的碱基 A、 T、 C、 G， 是表示 MS 严 重程度的指征。特别是， 与 MS 人群的平均值相比， 本发明的 SNP 可表示受 MS 影响更严重的 个体， 或可提供表示受 MS 影响较不严重的标志。
本发明人有益地提供了区分 MS 人群整体中不同患者、 不同患者组别的方法， 特别 是将他们按疾病严重程度分类。 这个方法中采用本领域技术人员通常知晓的分子生物学方 法和装置， 如 PCR 和 PCR 循环仪， 及统计学算法。 可按 MSSS 预计的 MS 严重程度对患者分组， 例如， 非常严重、 中等严重、 不太严重和轻微严重组。 因此， 本发明提供了按照患者的疾病阶 段和严重程度更好地治疗患者的工具。具体说， 现在有可能对各患者个体采取更好的治疗 剂量和治疗方案。
本 发 明 的 一 个 优 选 方 面 涉 及 利 用 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 的一个或多个 SNP， 与这些 SNP 的一个或多 个连锁不平衡 (LD) 的 SNP， 来预测多发性硬化症个体疾病的严重程度。
本发明的另一个方面涉及预测个体多发性硬化症严重程度的方法， 包括 a) 使用 得自所述个体样品的核酸 ； 和 b) 用已知方法鉴定所述个体是否存在有用的遗传标志 ； c) 根 据步骤 b) 的结果预测所述个体多发性硬化症的严重程度。
在 所 述 方 法 中， 所 述 遗 传 标 志 涉 及 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 的一个或多个 SNP， 与一个或多个这些 SNP 连锁不平衡 (LD) 的 SNP。特别感兴趣的 SNP 优选自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
本发明的还有一个方面涉及治疗有需要的个体多发性硬化症的方法， 该方法包括 步骤 a) 将上述方法施用于个体的样品 ； b) 用干扰素治疗所述个体， 该个体已被上述方法中 的任何一种鉴定为显示有一种或多种上述标志并处于罹患多发性硬化症或有发展成严重 多发性硬化症的风险中。或者， 本发明涉及干扰素在治疗多发性硬化症患者上的应用或用 于治疗多发性硬化症患者的干扰素， 所述患者的特征是带有或经鉴定显示有至少一个本发 明的判断严重性的 SNP 等位基因。在另一备选方案中， 本发明涉及采用本发明的 SNP 诊断 患者 MS 严重程度， 和根据其疾病严重程度治疗所述患者。
所 述 方 法 或 应 用 中 特 别 感 兴 趣 的 SNP 优 选 选 自 rs3814022、 rs4953911、rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
因此本发明特别有利于对干扰素治疗剂量和 / 或治疗时间点进行分层和调整。一 种可能的措施是高剂量治疗， 或者对被鉴定为 MS 严重程度高的患者在 MS 临床症状出现前 进行治疗。可用 MRI 分析患者的疾病状况， 和以上文所指出的方式根据这些结果对患者进 行分组 / 分类。对于按照本发明鉴定为处于成为受该病严重影响的 MS 患者的高风险中的 MS 患者， 在早的时间点进行治疗以早期控制该病是特别有益的。因此， 可选择适当的措施， 例如足量的干扰素治疗及其剂量。此外， 对患者的告知也获得对该治疗的顺从性支持。提 高顺从性进而可获得对治疗结果的正面作用， 如提高其药效。
优选的干扰素 -β(IFN) 是干扰素 -β1a 或 1b。干扰素 β 的例子有或 上述方法或应用中施用于个体的 IFN 剂量 ( 采用单剂量或多剂量 )， 除患者分组结 果外， 随各种因素而有所不同， 包括药物的动力学性能、 给药途径、 患者状况和特征 ( 性别、 年龄、 体重、 健康状况、 个头大小 )、 症状的程度、 同时进行的治疗、 治疗频率和所需达到的效 果。
人 IFN-β 的 标 准 剂 量 范 围 是 每 天 80000IU/kg 至 200000IU/kg， 或每人每天 6-12MIU( 百万国际单位 ) 或每人 22-44μg。按照本发明， 优选的 IFN 给药剂量是每人每天 约 1-50μg， 更优选约 10-30μg 或约 10-20μg。
按照本发明的活性成分给药可通过静脉内、 肌肉内或皮下途径。优选的 IFN 给药 途径是皮下途径。
也可每天、 隔天或以较低频率给予 IFN。优选每周给予 IFN 一次、 二次或三次。
优选的给药途径是皮下给药， 例如每周给药三次。另一优选的给药途径是肌肉内 给药， 可以例如每周给药一次。
优选每周三次皮下注射给予 22-44μg 或 6-12MIU 的 IFN-β。皮下给予 IFN-β 的 剂量是每隔一天 25-30μg 或 8-9.6MIU。 也可以每周一次肌肉内给予 30μg 或 6MIU IFN-β。
实施例 以下实施例并不意味着构成对本发明的限制， 以下实施例给出了本发明的优选实 施方式， 这些实施方式将用于阐述本发明。
实施例以本发明优选的实施方式显示了鉴定严重性标志的方法即 (i) 全基因组 ( 即无假说， hypothesis-free) 和 (ii) 无范围 ( 即连续 ) 方法的结果。首先， 从法国、 瑞 典和意大利的医院募集三组 MS 患者 (n ＝ 1,040)， 用 Affymetrix 500K 技术， 给 全基因组约 500,000 个 SNP 分型。用 MSSS 对 MS 的严重程度连续评分， 并通过纯合子患者 每种标志的等位基因 MSSS 分布之间的无参数检验对最高频率多态性 ( 约 105,000SNP) 的 基因型相关性进行评估。用假发现率 (FDR) 估算法控制多重检测问题。此方法的结果鉴定 到 14 个严重性标志， 位于 8 个不同基因和 2 个遗弃区内。其次， 对独立的 873 名 MS 患者重 复组作某些标志的基因分型， 鉴定到两个糖基化酶基因， 从而支持了 MS 中聚糖调节的重要 性。
材料和方法
数据收集
“筛选数据组” 包括来自法国、 瑞典和意大利的总数 1,040 名无亲缘关系的患者， “重复数据组” 包括 873 个无亲缘关系和独立的法国和瑞典患者 ( 表 1)。所有患者都是高 加索人， 按麦克唐纳德标准诊断为多发性硬化症 27， 他们的病程分为复发 - 缓解型、 继发进 28 展型或原发进展型 。用 Kurtzke EDSS 对残疾进行评分。平均年龄 43.8 岁， 平均 EDSS 评 分为 3.6， 性别比为 2 ∶ 1( 女 / 男 )。遗传分析征得所有个体同意， 研究方案得到当地道德 论理委员会的批准。
表 2 显示筛选和重复数据组 MS 患者的详细人口统计和临床特征。进入本项研究 的大多数病例中， 疾病持续时间定义为第一次出现症状那一年至最近用 EDSS 评估检查那 一年之间的年数， 发病年龄定义为第一次出现脱髓鞘病症神经功能障碍的年龄。
残疾等级划分
在 MS 研究中评价残疾最广泛采用的方法是 Kurtzke EDSS， 但它不考虑描述疾病 14 进展速度的关键参数 -- 病程。为此理由， 我们采用 MSSS ， 它可从横断面上提供衡量个体 的疾病严重程度。此衡量尺度涉及对具有相当病程的大数据组患者的残疾分布的 EDSS 评 分。用参考文献 14 中描述的 MSSS 测试软件第 2 版对 MSSS 进行计算。
基因分型和质量控制 用 Affymetrix 公司的 人类图谱 500K 技术独立研究了筛选数据组的 DNA 样品。Affymetrix 用 B-RLMM 软件程序选出每份 DNA 样品的 497,641 个 SNP 基因型， 确 保最小点名率 (call rate)97％。只保留常染色体的 SNP 用作分析。为了避免由于基因型 的极低频率所造成的偏差， 过滤掉带有低频率微少等位基因 (MAF ＜ 30％ ) 的标志或高比例 丢失数据 ( 未分型的 DNA ＞ 5％比例 ) 的标志。我们选择把重点放在非常频繁的标志 (MAF ＞ 30％ ) 上， 保证微少纯合子的最低频率在哈地 - 温伯格 (Hardy-Weinberg) 平衡下大于 9％ ( 然后微少纯合子人群的规模平均大于 100 名 )。
用美国应用生物系统 (Applied BioSystems) 公司的 基因分型试验， 对重 复数据组的 DNA 样品独立地作所选 SNP 的基因分型。
严重程度扫描
对于每个 SNP， 对相应于纯合子患者每个标志等位基因的两组 MS 严重程度的评分 进行 Wilcoxon 秩和检验 29。这种非参数检验对每个 SNP 指派一个概率值 (p- 值 )。对于 筛选数据组， 通过置换估计假发现率 (FDR) ： (i) 慢慢移动 MS 严重程度评分模拟零位分布 (null distribution)， 重新计算 Wilcoxon 的 p- 值， 重复此过程 10,000 次 ； (ii) 按先前置 30， 31 换步骤估计的那样 ， 如下计算 FDR 的每个 p- 值的阈值 ： FDR ＝ min(1， p.m/R)， 其中 R 是 水平的阳性数 (p 值小于的 SNP 数 )， m 是进行的检验次数 ( 扫描 SNP 的次数 )， p 是在零位 假设下 p- 值小于 α 的概率。
基因组分析
SNP 位于 NCBI v36 人类基因组序列上。基因结构 ( 外显子和内含子 ) 注释得自 ENSEMBL 释放 4332。单倍型和 LD 矩阵的计算采用 HaploView33， 用 LD 法的坚实支持 (solid spine)， 扩展截断值＝ 0.8D’ 。
结果
全部 1,040 个患者的 MSSS 平均值为 4.42( 标准差 2.79)， 跨越 0.086-9.964( 参见 图 1 的总分布 )。497,641 个 SNP 中 105,035 个 (21％ ) 通过过滤标准， 它们用于分析， 覆盖
基因组的 63％。
用 10,000 轮慢慢移动的 MSSS 对观察到结果的 FDR 进行评估， 并将 100 个最小的 p- 值作成图 2。FDR 一开始时就高 ( 约 50％ )， 迅速上升到 80％坪值， 然后收敛慢慢趋向于 1。当考虑 95％置信区间的下限时， 40％ FDR 阈值选择 14 个 SNP( 表 3)。这些 SNP 对应于 常见基因型 ( 由最初的 30％ MAF 过滤所确保 ) 并且都在哈地 - 温伯格平衡下。选择对应于 严重程度 p- 值的截断值为 1.4e-4。基因型与 MSSS 之间的相关性见图 3。
在经典分类方法中， MSSS 尺度分不同的类别， 例如， 轻度和重度 MS， 进行经典相关 性研究以检测这两个类别之间的基因型差异。当应用于我们的数据组时， 例如用于 501 名 轻度 MS(MSSS ＜ 4) 和 356 名重度 MS(MSSS ＞ 6) 患者两个组， 经 FDR 多次测试纠正后， 我 31 们未能检测到显著相关的 SNP 。例如， SNP rs7221818( 在我们的连续方法中排序 2， 见表 3) 在该分类法 ( 基因型 p- 值＝ 6.7e-4) 中排序 67， 此选择的 FDR 评估为 80％。只有排序 第一的 SNP rs6552511 是采用各种 MSSS 阈值 ( 数据未显示 ) 分类方法唯一检索到的。一 旦用连续扫描法选出这 14 个 SNP， 就可以分析它们的经典分类相对风险和优势比 ： 微少基 因型有 9 个与较高 MSSS 相关 ( 相对风险范围 1.5-2.3)， 5 个与较低 MSSS 相关 ( 风险范围 0.4-0.8， 细节见表 )。 将按照本发明的这些 SNP 绘制在人类基因组序列图谱中， 与 ENSEMBL 基因注释作 比较。图谱的细节见表 4。两个 SNP(rs6552511 和 rs7221818) 位于遗弃区 ( 最靠近的基 因相距 100kb 以上 )。其它 12 个 SNP 在 8 个基因的 100kb 内或相距不到 100kb。这些基因 的一些 (XYLT1， HIF1AN 和 MGAT5) 以确定基因内连锁不平衡 (LD) 严重性区的几个 SNP 为代 表。这三个位于 10 号染色体上 HIF1AN 基因 3’ 端的标志是在 LD 区内， 该区不含 HIF1AN 基 因结构的任何部分 ( 该区离 HIF1AN 终止密码子 50kb) 或已知的任何 HIF1AN 基因调节区。 rs1078922SNP 位于离 MTPN 基因 5’ 端 22kb。 其它 SNP 位于这些指定基因的内含子中 ： XYLT1 的第一内含子 (2 个 SNP)， MGAT5 的第 2 内含子 (2 个 SNP)， MEGF11 的第 8 内含子， FGF14 的 第 3 内含子， PDE9A 的第 7 内含子和 CDH13 的第 2 内含子。
XYLT1 与 MGAT5 的信号重复， 因为 (i) 这些信号由 LD 中多个 SNP 所代表， 可认为 是其本身的技术复制品， 和 (ii) 这两个基因均编码糖基化酶， 是生物学感兴趣的候选目标 ( 参见讨论 )。这两个基因中选出以下 3 个 SNP ： XYLT1 基因中的 rs12927173 ； MGAT5 基因中 的 rs3814022 和 rs4953911(XYLT1 基因选出第 2 个 SNP rs2059283， 但制备者不能提供其引 物 )。 重复数据组 (n ＝ 873) 中这 3 个 SNP 的 p- 值分别为 0.42、 1.31e-2 和 3.76e-3( 图 4 和表 5)。 然后重复检测此独立数据组 MGAT5SNP 与 MS 严重程度的相关性。 两个数据组的总 p- 值 分别是 2.81e-6 与 1.54e-7(rs3814022 和 rs4953911)。对于 XYLT1 的 SNP(rs12927173)， 重复数据组没能产生相关性 (p ＝ 0.42)。然而， 这两个数据组的总 p- 值仍有显著差异 (P ＝ 1.88e-4)。
我们对超过 1000 名的 MS 患者进行了全基因组扫描分析， 以鉴定与该病严重程度 相关的标志。这种全基因组扫描法导致鉴定到 ： 未标注区 2 个标志， 靠近 HIF1AN 基因的 LD 区 3 个 SNP， MTPN 5’ 区 1 个 SNP， 和其它 6 个基因内的 8 个标志。选出两个基因中的 3 个 标志， 对独立的重复人群作基因型分析， 导致 MGAT5 与该病严重程度相关的确认。本文中我 们讨论了使得到这些结果成为可能的临床和方法学选择， 然后把重点放在研究所选择并复 制的严重性关联基因的生物学关系上。
对于用残疾程度单一横向评估衡量 MS 进程， 并没有一致的方法。 近年开发的 MSSS 法是在基因相关性研究中比较疾病进程的强有力方法， 它可调整已被广泛接受的用于在具 有同等病程的病例中比较个体残疾程度与评分分布的疾病持续期间残疾程度的测定方法 EDSS。对于统计学评价， MSSS 可能优于非线性 EDSS， 因为它将 EDSS 与病程合并成一种常态 分布的变量。在我们的三种人群中， MSSS 的分布均不均匀。这可以用不同病程人群的组成 不同来解释， 也可用已知的观察者之间的差异来解释 ( 因为搜集的数据来自三个不同的医 院 )。残疾衡量的评估不一致可能显著影响到相关性研究的结果， 特别是在用随意 MSSS 截 取阈值来定义类别时。
以前发表的 ( 候选基因 ) 严重性研究传统地进行轻度与严重 MS 人群之间的相关 性测试。在我们的病例中， 采用不同 MSSS 阈值的类似分类方法未能检测到任何显著相关 标志。采用 EDSS( 或其衍生的 ) 评分的截断值可能太武断， 不足以确定严重程度相同的亚 人群， 因为 EDSS 只能部分 ( 有时主观地 ) 反映 MS 的进程。看来采用连续临床评分的方法 可能更为合适。对于扫描， 我们选择排除杂合子， 在每个 SNP 均为纯合子的 MS 患者之间 进行两样本 U 检验。其相对于三样本经典线性回归方法， 理论上讲具有优势， 首先不必假 设杂合子患者 MS 严重性为中等程度 ( 位于两个纯合子组的严重程度之间 )， 这可能是严 重性风险的另一种模式。我们的方法理论上允许检测风险等位基因的显性或隐性分布模 式。其次， Wilcoxon 秩和检验是一种非参数检验， 适用于非高斯 MSSS 分布。作为极相似 的一种方法， 本方法可能对罕见标志动力不足。然而我们把重点放在哈地 - 温伯格平衡 (Hardy-Weinberg Equilibrium) 下次要基因型频率大于 9％的频繁标志 (MAF ＞ 30％ ) 上， 它很好地代表了我们所筛选的人群 (n ＞ 100)。 这种过滤显著减少了要分析的 SNP 数量 ( 减 少至 105,035) 同时维持了对基因组的合理覆盖度 (63％ )。用此法可能需要较大的样本数 来调查频率较低的标志 ( 例如， 频率为 20％的标志要调查 2500 个体， 频率为 10％的标志要 调查 10,000 个体 )。我们可以看到， 整个人群中 MSSS 分布是不均匀的， 一般来说每个 SNP 基因型的 MSSS 分布不是高斯型 (Gassian) 的 ( 图 1 和 SNP 实施例图 3)。最后， 重要的是要 考虑多重检测问题。采用保守的家庭明智错误率估计方法 ( 如波佛洛尼 Bonferroni 校正 法 ) 不用选择 SNP， 意味着我们不能选出我们估计不存在假阳性的一组标志。我们宁可利 用 FDR 估测来控制这种多重检测， 因为它更灵活 ( 允许给定的假阳性比例不一定是 0％ )， 31 并且考虑了标志之间的独立性 。
FDR- 控制方法导致选出了 14 个标志。 2 个排序第一的 SNP 显示了轻度 (MSSS ＜ 2) 与严重 (MSSS ＞ 8) 患者临床结果之间基因型频率轻微但重要的差异 ( 相对风险约 2.2)， 它 们是受关注的 MS 严重程度标志。然而， 它们位于未曾公布过的基因组区域， 因此不可能就 它们对该病的预后影响作出假设。其它 SNP 位于已公布的基因内或附近。它们中间 MGAT5 是生物学特别感兴趣的。MGAT5( 也称为 GNT-V) 基因编码 β-1， 6N- 乙酰葡糖氨基转移酶， 这是一种参与结合于细胞表面的 β-1， 6GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖的合成和糖蛋白分泌 的酶。在小鼠中， MGAT5 缺陷对肿瘤生长有保护作用 34， 并与对实验性自身免疫性脑脊髓炎 35 (EAE) 的易感性升高 ( 与野生型相比 ) 有关 。MGAT5 缺陷增加募集到抗原递呈表面的 T 细 胞受体数目， 从而减少了对 CD28 协同受体整合的需求。CD28 和 MGAT5 的功能是 T 细胞活化 阈值的相反调节剂， 对免疫疾病易感。以前曾测试过 CD28 与 MS 严重程度的相关性， 显示无 21 显著意义 。然而， β-1， 6GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖的表达选择性地抑制 Th1 细胞分化和促进 Th2 细胞的极化 36。在 MS 患者的单核细胞中也已观察到糖基化缺陷 ： GCNT1( 另一种 葡糖氨基转移酶 ) 活性降低约 25-30％与复发 - 缓解患者出现 MS 急性临床症状和存在活动 性病灶相关 37。因此， 我们支持 MGAT5 和更常见的 GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖与 MS 进程 相关。像 MGAT5 一样， XYLT1( 木糖基转移酶 1， XT-1) 是糖基化过程涉及的一种酶。XYLT1 是参与含葡糖氨基聚糖 (GAG) 的蛋白聚糖生物合成的链启动酶。蛋白聚糖包括一大群糖蛋 白， 有两个主要类型 ： 硫酸软骨素 (CSPG) 和硫酸肝素 (HSPG)。大多数 CSPG 由细胞分泌， 参 与胞外基质 (ECM) 形成。CSPG 是哺乳动物 CNS 中所表达的蛋白聚糖的最丰富类型， 特别通 过它们的 GAG- 链， 主要起着影响轴突生长、 细胞迁移和变形的屏障分子的作用。成年人的 CNS 病损会刺激由增殖和迁移的神经胶质细胞 ( 主要是反应活性星状细胞、 小神经胶质细 胞和少突胶质细胞前体细胞 ) 组成的胶质斑痕的形成， 使几种 ECM 分子包括 CSPG 的表达上 调。胶质斑痕的蛋白聚糖可能有保护作用， 但胶质斑痕及与其相关的 CSPG 是损伤的 CNS 神 38 经元轴突再生的主要障碍 。已报导在 MS 中 ECM 分子发生改变， 并已证明活动性 MS 损伤 39 中基底膜组分的过度产生和沉积可能促使轴突损伤 。因此， 由于 XYLT1 能引起 GAG- 链的 延伸和 CSPG 的合成， 两个 ( 研究 ) 团队开发了一种 DNA 酶， 该酶靶向其 mRNA， 显示能减少 40， 41 CSPG 。除与 MS 相关外， 还显示全身硬化症患者血清中 XYLT1 的活性增强， 这与临床分类 42 相关 。被确定为所选严重性标志的其它基因有 ： HIF1AN( 缺氧诱导因子 1α 的抑制剂 )、 MEGF11( 多重 EGF 样结构域 11)、 FGF14( 成纤维细胞生长因子 14)、 PDE9A( 磷酸二酯酶 9A)、 MTPN( 重组胰岛素样生长因子 ) 和 CDH13( 钙粘蛋白 13)。在以前报导的与 MS 严重程度相 关的区域中未发现重要标志 23-26。
因为 MGAT5 和 XYLT1 是生物学相关候选标志， 二者有类似的糖基化作用， 我们决定 以一个独立人群重复该实验。结果清楚地证实， MGAT5 中有两个 SNP， XYLT1 中的一个 SNP 在重复数据组中未发现相关。
结论是， 我们进行的第一次全基因组 MS 严重性标志扫描， 导致该病预后相关标志 的无假设鉴定。 对该病病情发展分子机制的了解是与搜索易感因素平行的需要解决的关键 点。鉴定到的两个主要基因 MGAT5 和 XYLT1 参与糖基化过程， 从而证实聚糖调节在 MS 中的 重要性。这两个基因中， MGAT5 在独立的重复数据组中得到证实， 而 XYLT1 重复导致我们研 究中的结果更加矛盾。聚糖在调节多种生理系统 ( 包括免疫防御系统 ) 的分子相互作用中 44 起着举足轻重的作用， 已证明糖基化在免疫应答的总体调节中具有关键性的作用 43， 。 蛋白 糖基化是自身免疫病发病学的重要机制， 一些证据支持 MS、 类风湿关节炎 (RA) 和糖尿病的 45 “遗留表位产生自身免疫 (REGA) 的模型” 。按照此模型， 自身免疫过程涉及细胞因子、 趋化 因子和蛋白酶， 蛋白酶将糖蛋白切割成遗留表位， 提呈给自体反应性 T 淋巴细胞， 维持自身 免疫反应。可产生这种遗留表位的底物的例子包括 MS 中的髓磷脂碱性蛋白、 αB- 晶体蛋 46 白和干扰素 -β， 和 RA 中的 II 型胶原蛋白 。已用动物模型体内测试过这种 REGA 模型， 显 示可有令人感兴趣的治疗作用， 因为抑制蛋白酶， 如明胶酶 B， 对于 MS 或 RA 来说， 可导致有 47， 48 益效应 。
表 1. 多发性硬化症收集数据
表 2. 筛选和重复数据组 MS 患者的人口统计学和平均临床特征
表 3. 按 40％ FDR 阈值下限选出的 SNP
n： 具有此基因型的个体数 ； m 和 sd ： 这些人的 MSSS 平均值和标准差。p- 值指对纯 合子类型进行的秩和检验 ( 不用杂合子， 见上文 ) 的 p- 值。
表 4. 选出的严重性 SNP 在基因组中的位置
SNP 身份 rs6552511 rs7221818 rs12927173 rs2059283 rs1343522 rs4953911 rs4573623 rs333548 rs10508075 rs2839580 rs2495725 排序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 染色体 4q34 17p13 16p13.1 16p13.1 10q24 2q21 10q24 15q22 13q32 21q22 10q24 位置 182,688,603 5,742,055 17,378,835 17,377,011 102,358,165 134,785,280 102,361,387 64,032,567 101,237,200 43,030,176 102,354,010 MAF 35％ 35％ 49％ 49％ 44％ 36％ 46％ 32％ 46％ 40％ 45％ 最靠近的基因 ( 遗弃 ) ( 遗弃 ) XYLT1( 内含子 ) XYLT1( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 58kb MGAT5( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 61kb MEGF11( 内含子 ) FGF14( 内含子 ) PDE9A( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 54kb16102365370 A CN 102365391rs3814022 rs1078922 rs4315313 12 13 14 2q21 7q33 16q23说明书31％ 42％ 35％ MGAT5( 内含子 ) 距 MTPN 5’ 端 22kb CDH13( 内含子 )14/17 页134,764,405 135,334,939 81,644,234
表 5. 独立样品中严重程度标志的重复测试参考文献
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发明背景
多发性硬化症 (MS) 是中枢神经系统 (CNS) 的慢性炎症和脱髓鞘疾病， 常始于成年 早期。MS 被为是一种复杂的疾病， 因为很可能有多种遗传和非遗传因素结合起来影响患此 病的风险性。 遗传因素作用的证据是令人注目的， 它得到双胞胎、 半同胞和收养子女研究的 支持。 虽然 MS 发病起始时通常即呈现为复发 - 缓解过程 (RR)， 但大多数患者发病后进入继 发性渐进期 (SP)， 而其他患者 ( 常常是后来发病的 ) 可能直接进入原发渐进期 (PP)。
基因组扫描排除了远离 HLAII 类区中存在 MS 主要易感基因座的推断， 但未能揭示 1-3 是否存在几个以上推测的易感基因座 。已显示在 HLA 基因复合体中有几个 HLA-DRB1 等 位基因与此病相关 4， 而一些证据也提示 HLA I 类区域中存在独立的 MS 风险因子 5-7。最近， 支持 IL7Ra 基因在 MS 上至关重要的证据越来越多 8-10。然而， 显然其他遗传风险因子仍待 鉴定。
已明确 MS 易感性是一种复杂的遗传性状。 MS 的临床病程和结局大相径庭， 看来某 11， 12 些基因可能参与诱生该病， 而其他基因可能在影响此病严重性上起作用 。评估 MS 严重 性是评估随疾病进程是否发展为残疾， 但可能因以下事实而复杂化， 即此病的进程随时间 而不同， 患者也可能出现改善期。临床评估 MS 严重程度应用最广泛的方法是残疾状态扩展 等级表 (EDSS13)。传统上广泛采用进展指数 (PI ＝ EDSS 评分 / 持续时间 ( 年 ))， 但受到上 述原因的阻碍。最近， 提出 MS 严重性评分 (MSSS) 可作为一种新方法， 涉及对有相当病程患 14 者的残疾分布进行 EDSS 评分， 部分弥补了 PI 的弱点 。
已测试了可能与 MS 严重性相关的几种候选基因 ( 参见综述 15)， 它们大多数没有 显示与 MS 进程遗传相关的证据。 这些候选基因是 ： 载脂蛋白 ε(APOE， 参见综述 16)、 脊髓小 17 19 脑性共济失调 2(SCA2 )、 脑源性神经营养因子 (BDNF18)、 Toll 样受体 4(TLR4 )、 骨桥蛋白 20 21 、 细胞毒 T 淋巴细胞相关因子 4(CD152 或 CTLA4) 和 CD28 、 趋化因子 CC 受体 5(CCR5) 和 22 HLA-DRB1*1501 。 已报导的与 MS 临床结局相关的只有少数基因座 ： 位于染色体 2q12-14 上 的白介素 1 基因座， 含有 3 个基因 (IL-1， IL-1 和 IL-1 受体拮抗剂 IL-1RN)， 其中 6 个位点、 5 个单核苷酸多态性 (SNP) 和一个数目可变串联重复 (variable number tandem repeat， VNTR) 序列据报导与在三类严重等级上用 EDSS 测定的严重程度相关 23 ； 在白介素 10 启动 子中， 两个微卫星标记在轻度 (PI ＜ 0.5) 与严重 (PI ＞ 0.5) 疾病进程类别之间有差异 24 ； 已发现 ADAMTS14 基因中两个 SNP 与 MS 分类 ( 复发缓解 -RR 与原发渐进 -PP) 有关， 但与用 25 MSSS 测得的预后无关 ； 在 CD59a 缺陷的 MOG-EAE 小鼠模型上已证明此病发病率和严重性 26 升高 。然而， 这些研究依据的个体数目有限并且没有进行重复研究。此外， 所有这些研究 都采用检测与严重程度相关性的分类方法 ： 通过按病损范围、 EDSS、 PI 或 MSSS 的等级划分 选择截取域值， 将病人分成轻度 / 中度 / 严重或轻度 / 严重 MS 类型， 并比较各类别之间的 等位基因和基因型频率。
鉴于 MS 的重要性， 对用于 MS 患者的鉴定标志特别是遗传标志存在需求。特别是，
需要鉴定用于预测 MS 易感性、 特别是疾病严重程度的基因标志。
发明概述
本发明的一个方面涉及一种基因分型方法， 包括 a) 使用分离自个体样品的核 酸； 和 b) 测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922 和 / 或 rs4315313 的核苷酸类型， 和 / 或与 一个或多个这些 SNP 连锁不平衡 (LD) 的 SNP 中的核苷酸类型。
本发明的一个方面涉及选自 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725 、 rs1343522 、 rs4573623 、 rs333548 、 rs10508075 、 rs2839580 、 rs2495725 、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 中的一个或多个 SNP， 与这些 SNP 的一个或多个连锁不平 衡 (LD) 的 SNP， 用于预测个体 MS 疾病的严重程度。
在另一方面， 本发明涉及在需要治疗的个体上治疗 MS 的方法， 该方法包括步骤 a) 将上述方法体外应用于个体的样品 ； b) 治疗经鉴定显示有上述一种或多种标志并经鉴定 显示 MS 疾病严重性达到某种水平的个体。
发明详述
以下更详细地描述本发明， 其中实施例旨在说明本发明， 而不构成对本发明范围 的限制。
表格和附图的简要说明
图 1.MSSS 分布 ： 1,040 个 MS 患者的 MS 严重性评分分布直方图。
图 2. 严重程度相关性的 FDR( 假发现率 ) 评估 ： 用 10,000 轮 MSSS 慢慢移动估计 FDR， 并对所选阳性数 R 作图， R ≤ 100( 粗线 )。此曲线给出了估计的给定阳性数中的假阳 性比例 ( 如 40 个最可能相关的 SNP 的 90％ (R ≤ 40) 评估为假阳性 )， 或给定的假发现率 中的阳性数 ( 例如 40％ FDR 域值只选出一个 SNP)。虚线代表 95％估计置信区间边界。
图 3. 与疾病严重程度相关的 SNP 举例 ： 左侧分布图代表全体人群 ( 黑色 ： (1) 最 左侧柱 )、 多数纯合子个体 ( 红色 ： (2) 左侧第 2 柱 )、 杂合子个体 ( 蓝色 ： 左侧第 3 柱 ) 和 少数纯合子个体 ( 绿色 ： 最右侧柱 ) 中所考虑的 SNP 的 MSSS 分布。水平线 ( 各个方框 ) 表 示各类别 MSSS 的平均值 ( 各自的标准差 )。右侧图提供累积分布函数。
图 3.1 ： SNP 1 遗弃染色体 4， rs6552511
图 3.2 ： SNP 2 遗弃染色体 17， rs7221818
图 3.3 ： SNPs 3 和 4.XYLT1， rs12927173 和 rs2059283
图 3.4 ： SNPs 5， 7 和 11.HIF1AN， rs1343522， rs4573623 和 rs2495725
图 3.5 ： SNPs 6 和 12.MGAT5， rs4953911 和 rs3814022
图 3.6 ： SNP 8.MEGF11， rs333548
图 3.7 ： SNP 9.FGF14， rs10508075
图 3.8 ： SNP 10.PDE9A， rs2839580
图 3.9 ： SNP 13.MTPN， rs1078922
图 3.10 ： SNP 14.CDH13， rs4315313
图 4.XYLT1 和 MGAT5 中的 SNP 重复 ：
873 份独立样品重复数据组的 3 个 SNP 相关性分布图 ( 图例与图 3 相同 )。上面两个 SNP 位于 MGAT5 基因内， 第三个 SNP 位于 XYLT1 基因内。
以下描述 SNP 及其序列
SNP 的 IUPAC 代码 ：IUPAC 代码 R SNP G或A6102365370 A CN 102365391说IUPAC 代码 Y M K S W明SNP书4/17 页T或C A或C G或T G或C A或T
本发明一方面涉及基因分型的方法， 包括步骤 ： a) 使用分离自个体样品的核 酸； 和 b) 测定双等位基因标志的一个或两个等位基因中 SNP rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922 和 / 或 rs4315313 的核苷酸类型， 和 / 或与 这些 SNP 的一个或多个连锁不平衡 (LD) 的 SNP 中的核苷酸类型。特 别 感 兴 趣 的 SNP 优 选 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
在一个实施方式中， 按照本发明和用于本发明方法和应用的 SNP 也是与一个或多 个所鉴定的 SNP 连锁不平衡 (LD) 的那些 SNP， 表示为至少包括 100 名个体的至少一群患者 2 2 的 LD 相关系数 r ＞ 0.8， 优选 LD 相关系数 r ＞ 0.95。
一种标志 ( 如 SNP) 与按照本发明的多发性硬化症患者的严重性 “相关” ， 表示 MS 严重程度不同的两群患者之间该标志的频率有统计学显著差异。
多发性硬化症 (MS) 的 “严重程度” ， 按照本发明可用 MS 领域已知的任何方法表 示， 例如残疾状态扩展等级表 (Expanded Disease Status Scale， EDSS)， 或用该领域其它 常用的技术或衡量方法或定义表示。在这种情况下及在本领域中常用的术语 “疾病残余活 动” 应理解为表示 MS 疾病活动的某种程度， 例如， 出现用 MS 领域常用的衡量方法或定义所 限定的临床症状。 “疾病残余活动” 的一种指征或衡量标准， 可以是如用残疾状态扩展等级 表 (EDSS) 或磁共振成像 (MRI) 所测得的经历疾病复发或病情发展。作为时间框架的一个 例子是两年治疗期间的评估。 应理解其它时间框架也可被定义和采用， 如一年、 三年或临床 研究方案中常用的、 技术人员熟知的其它时间框架。 可选择参比时间框架， 以利于衡量和适 当的读出。 可采用同样适用的、 其它已被接受的疾病状态衡量方法， 例如多发性硬化症剑桥 基础评分 (CAMBS) 和技术人员使用的其它方法。MS 领域及如本领域技术人员所知道的， MS 攻击有各种定义， 它们可用于本发明。因此， 当实施本发明时， 技术人员可采用各种可能的 方法。评估或诊断 MS 方法的例子可参见以下出版文献 ： Kurzke J.F， Neuroepidemiology， 1991， 10 ： 1-8 ； Kurzke J.F， Neurology， 1983， 33 ： 1444-1452 ； McDonald W.I et al.， Ann. Neurol.， 2001， 50 ： 121-127 ； Polman C.H.et al.， Ann.Neurol.2005， 58 ： 840-846。因此， 严
重程度标志或 SNP 可以是表明一个患者与 MS 人群相比其疾病严重程度高或低的标志。
按本发明治疗的个体会对治疗有 “反应” 。诊断为有 MS、 罹患 MS 的个体或本发明7102365370 A CN 102365391说明书和5/17 页意义上的 MS 患者对干扰素治疗 “有反应” 或 “有反应者” 应理解为 MS 患者经干扰素治疗， 特别是用干扰素 1a 或 1b( 具体是 )治 疗后， 按下面设置的标准所表现的疾病残余活动。有反应可被定义和 / 或衡量为疾病进程 延迟， 例如， 可采用疾病状态扩展等级表 (EDSS) 或本领域常用的其它技术或衡量方法或定 义来衡量。 具体说， 有反应应理解为 MS 无发展或无恶化、 或临床病情 / 疾病活动稳定、 或 MS 改善， 例如在临床症状上的改善， 或用 MRI 或脑脊液 (CSF) 分析等其它方法测量的 MS 改善。 特别是， 可理解为复发 / 发作 / 恶化频率减少， 或复发 / 发作 / 恶化程度减轻。 本说明书和权利要求书中所用的 “一个” 或 “一种” 指一个或多个， 除非另有说明。
“等位基因” 是特定形式的基因、 遗传标志或其它遗传基因座， 它可与其它形式的 基因、 遗传标志或其它遗传基因座区分， 例如但不限于其特定的核苷酸序列。 术语等位基因 包括例如 ( 但不限于 ) 一种形式的单核苷酸多态性 (SNP)。个体的二倍体细胞可以是某等 位基因的纯合子， 即两个配对染色体上的等位基因相同 ； 或是所述等位基因的杂合子， 即两 个配对染色体上的等位基因不同。
“遗传标志” 是一种可鉴定的多态性遗传基因座。一个例子 ( 但不限于遗传标志 ) 是单核苷酸多态性 (SNP)。 本发明所用的 “标志” 可以是遗传标志或任何其他标志， 例如特定 基因在核苷酸水平如 mRNA 上的表达水平， 在本发明中可用作对干扰素治疗有反应的指标。
本文所用的 “基因型” 指一个个体的配对 ( 同源 ) 染色体上一个遗传基因座的基 因标志的两个等位基因的联合遗传标志， 例如但不限于 SNP。本文所用的 “基因型” 也指一 个个体的一对或一对以上同源染色体上一个以上遗传基因座的等位基因组合， 例如但不限 于 SNP。
“基因分型” 是测定个体基因型的方法。
“基因座” 或 “遗传基因座” 指基因在染色体或其他遗传物质上的具体位置。
“寡核苷酸” 指核酸或核酸衍生物， 包括但不限于 ： 连锁核酸 (locked nucleic acie， LNA)、 肽核酸 (PNA) 或桥连核酸 (BNA) ； 通常长度为 5-100 个毗连碱基， 最常见长度为 5-40、 5-35、 5-30、 5-25、 5-20、 5-15、 5-10、 10-50、 10-40、 10-30、 10-25、 10-20、 15-50、 15-40、 15-30、 15-25、 15-20、 20-50、 20-40、 20-30 或 20-25 个毗连碱基。可设计能与遗传标志的任 何形式等位基因特异性杂交的寡核苷酸序列， 这种寡核苷酸序列称为等位基因的特异性探 针。如果所述遗传标志是一个 SNP， 该 SNP 的互补等位基因可位于等位基因特异性探针的 任何位置。实施本发明可用的其他寡核苷酸是能与 3’ 末端相距遗传标志基因座 1 个或少 于或等于 10 个核苷酸、 优选≤约 5 个核苷酸的 SNP 毗邻靶区域杂交的寡核苷酸。这类能与 SNP 毗邻区杂交的寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中， 本文称为 “引物延伸寡核 苷酸” 。在一个优选的实施方式中， 引物延伸寡核苷酸的 3’ 末端是与紧靠 SNP 的核苷酸互 补的脱氧核苷酸。
“多态性” 指人群某遗传基因座核苷酸序列不同或含有不同数目重复核苷酸单位 的两种或多种替换形式 ( 等位基因 )。多态性见于基因的编码区 ( 外显子 )、 非编码区或基 因外侧。人群中不同等位基因多态性出现的频率不同， 在选定人群中最常见的等位基因有 时称为 “主要” 等位基因。二倍体生物可以存在不同等位基因的纯合子或杂合子。双等位 基因多态性有两个等位基因。
在所述方法中， 所述双等位基因标志的核苷酸的鉴定较佳为测定所述个体基因组
中存在的所述双等位基因标志的两个拷贝。可采用技术人员已知的任何方法， 优选用微测 序试验进行所述测定。此外， 可以用例如 PCR 先扩增含双等位基因标志的序列的一部分， 再 进行所述测定步骤。然而， 也可采用任何可利用的方法。
按照本发明， 优选的方法还包括将基因分型步骤的结果与多发性硬化症严重程度 的结果相关联。
本发明人在一个按照本发明的优选方法中发现， 存在可表明严重程度的特征等位 基因， 它们是 ： rs3814022 中的 G， rs4953911 中的 T， rs2059283 中的 A， rs12927173 中的 A， rs2495725 中的 A， rs1343522 中的 G， rs4573623 中的 G， rs333548 中的 T， rs10508075 中的 G， rs2839580 中的 A， rs2495725 中的 A， rs3814022 中的 G， rs1078922 中的 G 和 / 或 rs4315313 中的 C ； 这些等位基因是多发性硬化症严重程度的指标。 在按照本发明的一个特 定 SNP 中， 在一个等位基因或优选两个等位基因中存在各自的碱基 A、 T、 C、 G， 是表示 MS 严 重程度的指征。特别是， 与 MS 人群的平均值相比， 本发明的 SNP 可表示受 MS 影响更严重的 个体， 或可提供表示受 MS 影响较不严重的标志。
本发明人有益地提供了区分 MS 人群整体中不同患者、 不同患者组别的方法， 特别 是将他们按疾病严重程度分类。 这个方法中采用本领域技术人员通常知晓的分子生物学方 法和装置， 如 PCR 和 PCR 循环仪， 及统计学算法。 可按 MSSS 预计的 MS 严重程度对患者分组， 例如， 非常严重、 中等严重、 不太严重和轻微严重组。 因此， 本发明提供了按照患者的疾病阶 段和严重程度更好地治疗患者的工具。具体说， 现在有可能对各患者个体采取更好的治疗 剂量和治疗方案。
本 发 明 的 一 个 优 选 方 面 涉 及 利 用 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 的一个或多个 SNP， 与这些 SNP 的一个或多 个连锁不平衡 (LD) 的 SNP， 来预测多发性硬化症个体疾病的严重程度。
本发明的另一个方面涉及预测个体多发性硬化症严重程度的方法， 包括 a) 使用 得自所述个体样品的核酸 ； 和 b) 用已知方法鉴定所述个体是否存在有用的遗传标志 ； c) 根 据步骤 b) 的结果预测所述个体多发性硬化症的严重程度。
在 所 述 方 法 中， 所 述 遗 传 标 志 涉 及 选 自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522、 rs4573623、 rs333548、 rs10508075、 rs2839580、 rs2495725、 rs3814022、 rs1078922、 rs4315313 的一个或多个 SNP， 与一个或多个这些 SNP 连锁不平衡 (LD) 的 SNP。特别感兴趣的 SNP 优选自 rs3814022、 rs4953911、 rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
本发明的还有一个方面涉及治疗有需要的个体多发性硬化症的方法， 该方法包括 步骤 a) 将上述方法施用于个体的样品 ； b) 用干扰素治疗所述个体， 该个体已被上述方法中 的任何一种鉴定为显示有一种或多种上述标志并处于罹患多发性硬化症或有发展成严重 多发性硬化症的风险中。或者， 本发明涉及干扰素在治疗多发性硬化症患者上的应用或用 于治疗多发性硬化症患者的干扰素， 所述患者的特征是带有或经鉴定显示有至少一个本发 明的判断严重性的 SNP 等位基因。在另一备选方案中， 本发明涉及采用本发明的 SNP 诊断 患者 MS 严重程度， 和根据其疾病严重程度治疗所述患者。
所 述 方 法 或 应 用 中 特 别 感 兴 趣 的 SNP 优 选 选 自 rs3814022、 rs4953911、rs2059283、 rs12927173、 rs2495725、 rs1343522 和 / 或 rs4573623。
因此本发明特别有利于对干扰素治疗剂量和 / 或治疗时间点进行分层和调整。一 种可能的措施是高剂量治疗， 或者对被鉴定为 MS 严重程度高的患者在 MS 临床症状出现前 进行治疗。可用 MRI 分析患者的疾病状况， 和以上文所指出的方式根据这些结果对患者进 行分组 / 分类。对于按照本发明鉴定为处于成为受该病严重影响的 MS 患者的高风险中的 MS 患者， 在早的时间点进行治疗以早期控制该病是特别有益的。因此， 可选择适当的措施， 例如足量的干扰素治疗及其剂量。此外， 对患者的告知也获得对该治疗的顺从性支持。提 高顺从性进而可获得对治疗结果的正面作用， 如提高其药效。
优选的干扰素 -β(IFN) 是干扰素 -β1a 或 1b。干扰素 β 的例子有或 上述方法或应用中施用于个体的 IFN 剂量 ( 采用单剂量或多剂量 )， 除患者分组结 果外， 随各种因素而有所不同， 包括药物的动力学性能、 给药途径、 患者状况和特征 ( 性别、 年龄、 体重、 健康状况、 个头大小 )、 症状的程度、 同时进行的治疗、 治疗频率和所需达到的效 果。
人 IFN-β 的 标 准 剂 量 范 围 是 每 天 80000IU/kg 至 200000IU/kg， 或每人每天 6-12MIU( 百万国际单位 ) 或每人 22-44μg。按照本发明， 优选的 IFN 给药剂量是每人每天 约 1-50μg， 更优选约 10-30μg 或约 10-20μg。
按照本发明的活性成分给药可通过静脉内、 肌肉内或皮下途径。优选的 IFN 给药 途径是皮下途径。
也可每天、 隔天或以较低频率给予 IFN。优选每周给予 IFN 一次、 二次或三次。
优选的给药途径是皮下给药， 例如每周给药三次。另一优选的给药途径是肌肉内 给药， 可以例如每周给药一次。
优选每周三次皮下注射给予 22-44μg 或 6-12MIU 的 IFN-β。皮下给予 IFN-β 的 剂量是每隔一天 25-30μg 或 8-9.6MIU。 也可以每周一次肌肉内给予 30μg 或 6MIU IFN-β。
实施例 以下实施例并不意味着构成对本发明的限制， 以下实施例给出了本发明的优选实 施方式， 这些实施方式将用于阐述本发明。
实施例以本发明优选的实施方式显示了鉴定严重性标志的方法即 (i) 全基因组 ( 即无假说， hypothesis-free) 和 (ii) 无范围 ( 即连续 ) 方法的结果。首先， 从法国、 瑞 典和意大利的医院募集三组 MS 患者 (n ＝ 1,040)， 用 Affymetrix 500K 技术， 给 全基因组约 500,000 个 SNP 分型。用 MSSS 对 MS 的严重程度连续评分， 并通过纯合子患者 每种标志的等位基因 MSSS 分布之间的无参数检验对最高频率多态性 ( 约 105,000SNP) 的 基因型相关性进行评估。用假发现率 (FDR) 估算法控制多重检测问题。此方法的结果鉴定 到 14 个严重性标志， 位于 8 个不同基因和 2 个遗弃区内。其次， 对独立的 873 名 MS 患者重 复组作某些标志的基因分型， 鉴定到两个糖基化酶基因， 从而支持了 MS 中聚糖调节的重要 性。
材料和方法
数据收集
“筛选数据组” 包括来自法国、 瑞典和意大利的总数 1,040 名无亲缘关系的患者， “重复数据组” 包括 873 个无亲缘关系和独立的法国和瑞典患者 ( 表 1)。所有患者都是高 加索人， 按麦克唐纳德标准诊断为多发性硬化症 27， 他们的病程分为复发 - 缓解型、 继发进 28 展型或原发进展型 。用 Kurtzke EDSS 对残疾进行评分。平均年龄 43.8 岁， 平均 EDSS 评 分为 3.6， 性别比为 2 ∶ 1( 女 / 男 )。遗传分析征得所有个体同意， 研究方案得到当地道德 论理委员会的批准。
表 2 显示筛选和重复数据组 MS 患者的详细人口统计和临床特征。进入本项研究 的大多数病例中， 疾病持续时间定义为第一次出现症状那一年至最近用 EDSS 评估检查那 一年之间的年数， 发病年龄定义为第一次出现脱髓鞘病症神经功能障碍的年龄。
残疾等级划分
在 MS 研究中评价残疾最广泛采用的方法是 Kurtzke EDSS， 但它不考虑描述疾病 14 进展速度的关键参数 -- 病程。为此理由， 我们采用 MSSS ， 它可从横断面上提供衡量个体 的疾病严重程度。此衡量尺度涉及对具有相当病程的大数据组患者的残疾分布的 EDSS 评 分。用参考文献 14 中描述的 MSSS 测试软件第 2 版对 MSSS 进行计算。
基因分型和质量控制 用 Affymetrix 公司的 人类图谱 500K 技术独立研究了筛选数据组的 DNA 样品。Affymetrix 用 B-RLMM 软件程序选出每份 DNA 样品的 497,641 个 SNP 基因型， 确 保最小点名率 (call rate)97％。只保留常染色体的 SNP 用作分析。为了避免由于基因型 的极低频率所造成的偏差， 过滤掉带有低频率微少等位基因 (MAF ＜ 30％ ) 的标志或高比例 丢失数据 ( 未分型的 DNA ＞ 5％比例 ) 的标志。我们选择把重点放在非常频繁的标志 (MAF ＞ 30％ ) 上， 保证微少纯合子的最低频率在哈地 - 温伯格 (Hardy-Weinberg) 平衡下大于 9％ ( 然后微少纯合子人群的规模平均大于 100 名 )。
用美国应用生物系统 (Applied BioSystems) 公司的 基因分型试验， 对重 复数据组的 DNA 样品独立地作所选 SNP 的基因分型。
严重程度扫描
对于每个 SNP， 对相应于纯合子患者每个标志等位基因的两组 MS 严重程度的评分 进行 Wilcoxon 秩和检验 29。这种非参数检验对每个 SNP 指派一个概率值 (p- 值 )。对于 筛选数据组， 通过置换估计假发现率 (FDR) ： (i) 慢慢移动 MS 严重程度评分模拟零位分布 (null distribution)， 重新计算 Wilcoxon 的 p- 值， 重复此过程 10,000 次 ； (ii) 按先前置 30， 31 换步骤估计的那样 ， 如下计算 FDR 的每个 p- 值的阈值 ： FDR ＝ min(1， p.m/R)， 其中 R 是 水平的阳性数 (p 值小于的 SNP 数 )， m 是进行的检验次数 ( 扫描 SNP 的次数 )， p 是在零位 假设下 p- 值小于 α 的概率。
基因组分析
SNP 位于 NCBI v36 人类基因组序列上。基因结构 ( 外显子和内含子 ) 注释得自 ENSEMBL 释放 4332。单倍型和 LD 矩阵的计算采用 HaploView33， 用 LD 法的坚实支持 (solid spine)， 扩展截断值＝ 0.8D’ 。
结果
全部 1,040 个患者的 MSSS 平均值为 4.42( 标准差 2.79)， 跨越 0.086-9.964( 参见 图 1 的总分布 )。497,641 个 SNP 中 105,035 个 (21％ ) 通过过滤标准， 它们用于分析， 覆盖
基因组的 63％。
用 10,000 轮慢慢移动的 MSSS 对观察到结果的 FDR 进行评估， 并将 100 个最小的 p- 值作成图 2。FDR 一开始时就高 ( 约 50％ )， 迅速上升到 80％坪值， 然后收敛慢慢趋向于 1。当考虑 95％置信区间的下限时， 40％ FDR 阈值选择 14 个 SNP( 表 3)。这些 SNP 对应于 常见基因型 ( 由最初的 30％ MAF 过滤所确保 ) 并且都在哈地 - 温伯格平衡下。选择对应于 严重程度 p- 值的截断值为 1.4e-4。基因型与 MSSS 之间的相关性见图 3。
在经典分类方法中， MSSS 尺度分不同的类别， 例如， 轻度和重度 MS， 进行经典相关 性研究以检测这两个类别之间的基因型差异。当应用于我们的数据组时， 例如用于 501 名 轻度 MS(MSSS ＜ 4) 和 356 名重度 MS(MSSS ＞ 6) 患者两个组， 经 FDR 多次测试纠正后， 我 31 们未能检测到显著相关的 SNP 。例如， SNP rs7221818( 在我们的连续方法中排序 2， 见表 3) 在该分类法 ( 基因型 p- 值＝ 6.7e-4) 中排序 67， 此选择的 FDR 评估为 80％。只有排序 第一的 SNP rs6552511 是采用各种 MSSS 阈值 ( 数据未显示 ) 分类方法唯一检索到的。一 旦用连续扫描法选出这 14 个 SNP， 就可以分析它们的经典分类相对风险和优势比 ： 微少基 因型有 9 个与较高 MSSS 相关 ( 相对风险范围 1.5-2.3)， 5 个与较低 MSSS 相关 ( 风险范围 0.4-0.8， 细节见表 )。 将按照本发明的这些 SNP 绘制在人类基因组序列图谱中， 与 ENSEMBL 基因注释作 比较。图谱的细节见表 4。两个 SNP(rs6552511 和 rs7221818) 位于遗弃区 ( 最靠近的基 因相距 100kb 以上 )。其它 12 个 SNP 在 8 个基因的 100kb 内或相距不到 100kb。这些基因 的一些 (XYLT1， HIF1AN 和 MGAT5) 以确定基因内连锁不平衡 (LD) 严重性区的几个 SNP 为代 表。这三个位于 10 号染色体上 HIF1AN 基因 3’ 端的标志是在 LD 区内， 该区不含 HIF1AN 基 因结构的任何部分 ( 该区离 HIF1AN 终止密码子 50kb) 或已知的任何 HIF1AN 基因调节区。 rs1078922SNP 位于离 MTPN 基因 5’ 端 22kb。 其它 SNP 位于这些指定基因的内含子中 ： XYLT1 的第一内含子 (2 个 SNP)， MGAT5 的第 2 内含子 (2 个 SNP)， MEGF11 的第 8 内含子， FGF14 的 第 3 内含子， PDE9A 的第 7 内含子和 CDH13 的第 2 内含子。
XYLT1 与 MGAT5 的信号重复， 因为 (i) 这些信号由 LD 中多个 SNP 所代表， 可认为 是其本身的技术复制品， 和 (ii) 这两个基因均编码糖基化酶， 是生物学感兴趣的候选目标 ( 参见讨论 )。这两个基因中选出以下 3 个 SNP ： XYLT1 基因中的 rs12927173 ； MGAT5 基因中 的 rs3814022 和 rs4953911(XYLT1 基因选出第 2 个 SNP rs2059283， 但制备者不能提供其引 物 )。 重复数据组 (n ＝ 873) 中这 3 个 SNP 的 p- 值分别为 0.42、 1.31e-2 和 3.76e-3( 图 4 和表 5)。 然后重复检测此独立数据组 MGAT5SNP 与 MS 严重程度的相关性。 两个数据组的总 p- 值 分别是 2.81e-6 与 1.54e-7(rs3814022 和 rs4953911)。对于 XYLT1 的 SNP(rs12927173)， 重复数据组没能产生相关性 (p ＝ 0.42)。然而， 这两个数据组的总 p- 值仍有显著差异 (P ＝ 1.88e-4)。
我们对超过 1000 名的 MS 患者进行了全基因组扫描分析， 以鉴定与该病严重程度 相关的标志。这种全基因组扫描法导致鉴定到 ： 未标注区 2 个标志， 靠近 HIF1AN 基因的 LD 区 3 个 SNP， MTPN 5’ 区 1 个 SNP， 和其它 6 个基因内的 8 个标志。选出两个基因中的 3 个 标志， 对独立的重复人群作基因型分析， 导致 MGAT5 与该病严重程度相关的确认。本文中我 们讨论了使得到这些结果成为可能的临床和方法学选择， 然后把重点放在研究所选择并复 制的严重性关联基因的生物学关系上。
对于用残疾程度单一横向评估衡量 MS 进程， 并没有一致的方法。 近年开发的 MSSS 法是在基因相关性研究中比较疾病进程的强有力方法， 它可调整已被广泛接受的用于在具 有同等病程的病例中比较个体残疾程度与评分分布的疾病持续期间残疾程度的测定方法 EDSS。对于统计学评价， MSSS 可能优于非线性 EDSS， 因为它将 EDSS 与病程合并成一种常态 分布的变量。在我们的三种人群中， MSSS 的分布均不均匀。这可以用不同病程人群的组成 不同来解释， 也可用已知的观察者之间的差异来解释 ( 因为搜集的数据来自三个不同的医 院 )。残疾衡量的评估不一致可能显著影响到相关性研究的结果， 特别是在用随意 MSSS 截 取阈值来定义类别时。
以前发表的 ( 候选基因 ) 严重性研究传统地进行轻度与严重 MS 人群之间的相关 性测试。在我们的病例中， 采用不同 MSSS 阈值的类似分类方法未能检测到任何显著相关 标志。采用 EDSS( 或其衍生的 ) 评分的截断值可能太武断， 不足以确定严重程度相同的亚 人群， 因为 EDSS 只能部分 ( 有时主观地 ) 反映 MS 的进程。看来采用连续临床评分的方法 可能更为合适。对于扫描， 我们选择排除杂合子， 在每个 SNP 均为纯合子的 MS 患者之间 进行两样本 U 检验。其相对于三样本经典线性回归方法， 理论上讲具有优势， 首先不必假 设杂合子患者 MS 严重性为中等程度 ( 位于两个纯合子组的严重程度之间 )， 这可能是严 重性风险的另一种模式。我们的方法理论上允许检测风险等位基因的显性或隐性分布模 式。其次， Wilcoxon 秩和检验是一种非参数检验， 适用于非高斯 MSSS 分布。作为极相似 的一种方法， 本方法可能对罕见标志动力不足。然而我们把重点放在哈地 - 温伯格平衡 (Hardy-Weinberg Equilibrium) 下次要基因型频率大于 9％的频繁标志 (MAF ＞ 30％ ) 上， 它很好地代表了我们所筛选的人群 (n ＞ 100)。 这种过滤显著减少了要分析的 SNP 数量 ( 减 少至 105,035) 同时维持了对基因组的合理覆盖度 (63％ )。用此法可能需要较大的样本数 来调查频率较低的标志 ( 例如， 频率为 20％的标志要调查 2500 个体， 频率为 10％的标志要 调查 10,000 个体 )。我们可以看到， 整个人群中 MSSS 分布是不均匀的， 一般来说每个 SNP 基因型的 MSSS 分布不是高斯型 (Gassian) 的 ( 图 1 和 SNP 实施例图 3)。最后， 重要的是要 考虑多重检测问题。采用保守的家庭明智错误率估计方法 ( 如波佛洛尼 Bonferroni 校正 法 ) 不用选择 SNP， 意味着我们不能选出我们估计不存在假阳性的一组标志。我们宁可利 用 FDR 估测来控制这种多重检测， 因为它更灵活 ( 允许给定的假阳性比例不一定是 0％ )， 31 并且考虑了标志之间的独立性 。
FDR- 控制方法导致选出了 14 个标志。 2 个排序第一的 SNP 显示了轻度 (MSSS ＜ 2) 与严重 (MSSS ＞ 8) 患者临床结果之间基因型频率轻微但重要的差异 ( 相对风险约 2.2)， 它 们是受关注的 MS 严重程度标志。然而， 它们位于未曾公布过的基因组区域， 因此不可能就 它们对该病的预后影响作出假设。其它 SNP 位于已公布的基因内或附近。它们中间 MGAT5 是生物学特别感兴趣的。MGAT5( 也称为 GNT-V) 基因编码 β-1， 6N- 乙酰葡糖氨基转移酶， 这是一种参与结合于细胞表面的 β-1， 6GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖的合成和糖蛋白分泌 的酶。在小鼠中， MGAT5 缺陷对肿瘤生长有保护作用 34， 并与对实验性自身免疫性脑脊髓炎 35 (EAE) 的易感性升高 ( 与野生型相比 ) 有关 。MGAT5 缺陷增加募集到抗原递呈表面的 T 细 胞受体数目， 从而减少了对 CD28 协同受体整合的需求。CD28 和 MGAT5 的功能是 T 细胞活化 阈值的相反调节剂， 对免疫疾病易感。以前曾测试过 CD28 与 MS 严重程度的相关性， 显示无 21 显著意义 。然而， β-1， 6GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖的表达选择性地抑制 Th1 细胞分化和促进 Th2 细胞的极化 36。在 MS 患者的单核细胞中也已观察到糖基化缺陷 ： GCNT1( 另一种 葡糖氨基转移酶 ) 活性降低约 25-30％与复发 - 缓解患者出现 MS 急性临床症状和存在活动 性病灶相关 37。因此， 我们支持 MGAT5 和更常见的 GlcNAc- 支链 N- 连接葡聚糖与 MS 进程 相关。像 MGAT5 一样， XYLT1( 木糖基转移酶 1， XT-1) 是糖基化过程涉及的一种酶。XYLT1 是参与含葡糖氨基聚糖 (GAG) 的蛋白聚糖生物合成的链启动酶。蛋白聚糖包括一大群糖蛋 白， 有两个主要类型 ： 硫酸软骨素 (CSPG) 和硫酸肝素 (HSPG)。大多数 CSPG 由细胞分泌， 参 与胞外基质 (ECM) 形成。CSPG 是哺乳动物 CNS 中所表达的蛋白聚糖的最丰富类型， 特别通 过它们的 GAG- 链， 主要起着影响轴突生长、 细胞迁移和变形的屏障分子的作用。成年人的 CNS 病损会刺激由增殖和迁移的神经胶质细胞 ( 主要是反应活性星状细胞、 小神经胶质细 胞和少突胶质细胞前体细胞 ) 组成的胶质斑痕的形成， 使几种 ECM 分子包括 CSPG 的表达上 调。胶质斑痕的蛋白聚糖可能有保护作用， 但胶质斑痕及与其相关的 CSPG 是损伤的 CNS 神 38 经元轴突再生的主要障碍 。已报导在 MS 中 ECM 分子发生改变， 并已证明活动性 MS 损伤 39 中基底膜组分的过度产生和沉积可能促使轴突损伤 。因此， 由于 XYLT1 能引起 GAG- 链的 延伸和 CSPG 的合成， 两个 ( 研究 ) 团队开发了一种 DNA 酶， 该酶靶向其 mRNA， 显示能减少 40， 41 CSPG 。除与 MS 相关外， 还显示全身硬化症患者血清中 XYLT1 的活性增强， 这与临床分类 42 相关 。被确定为所选严重性标志的其它基因有 ： HIF1AN( 缺氧诱导因子 1α 的抑制剂 )、 MEGF11( 多重 EGF 样结构域 11)、 FGF14( 成纤维细胞生长因子 14)、 PDE9A( 磷酸二酯酶 9A)、 MTPN( 重组胰岛素样生长因子 ) 和 CDH13( 钙粘蛋白 13)。在以前报导的与 MS 严重程度相 关的区域中未发现重要标志 23-26。
因为 MGAT5 和 XYLT1 是生物学相关候选标志， 二者有类似的糖基化作用， 我们决定 以一个独立人群重复该实验。结果清楚地证实， MGAT5 中有两个 SNP， XYLT1 中的一个 SNP 在重复数据组中未发现相关。
结论是， 我们进行的第一次全基因组 MS 严重性标志扫描， 导致该病预后相关标志 的无假设鉴定。 对该病病情发展分子机制的了解是与搜索易感因素平行的需要解决的关键 点。鉴定到的两个主要基因 MGAT5 和 XYLT1 参与糖基化过程， 从而证实聚糖调节在 MS 中的 重要性。这两个基因中， MGAT5 在独立的重复数据组中得到证实， 而 XYLT1 重复导致我们研 究中的结果更加矛盾。聚糖在调节多种生理系统 ( 包括免疫防御系统 ) 的分子相互作用中 44 起着举足轻重的作用， 已证明糖基化在免疫应答的总体调节中具有关键性的作用 43， 。 蛋白 糖基化是自身免疫病发病学的重要机制， 一些证据支持 MS、 类风湿关节炎 (RA) 和糖尿病的 45 “遗留表位产生自身免疫 (REGA) 的模型” 。按照此模型， 自身免疫过程涉及细胞因子、 趋化 因子和蛋白酶， 蛋白酶将糖蛋白切割成遗留表位， 提呈给自体反应性 T 淋巴细胞， 维持自身 免疫反应。可产生这种遗留表位的底物的例子包括 MS 中的髓磷脂碱性蛋白、 αB- 晶体蛋 46 白和干扰素 -β， 和 RA 中的 II 型胶原蛋白 。已用动物模型体内测试过这种 REGA 模型， 显 示可有令人感兴趣的治疗作用， 因为抑制蛋白酶， 如明胶酶 B， 对于 MS 或 RA 来说， 可导致有 47， 48 益效应 。
表 1. 多发性硬化症收集数据
表 2. 筛选和重复数据组 MS 患者的人口统计学和平均临床特征
表 3. 按 40％ FDR 阈值下限选出的 SNP
n： 具有此基因型的个体数 ； m 和 sd ： 这些人的 MSSS 平均值和标准差。p- 值指对纯 合子类型进行的秩和检验 ( 不用杂合子， 见上文 ) 的 p- 值。
表 4. 选出的严重性 SNP 在基因组中的位置
SNP 身份 rs6552511 rs7221818 rs12927173 rs2059283 rs1343522 rs4953911 rs4573623 rs333548 rs10508075 rs2839580 rs2495725 排序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 染色体 4q34 17p13 16p13.1 16p13.1 10q24 2q21 10q24 15q22 13q32 21q22 10q24 位置 182,688,603 5,742,055 17,378,835 17,377,011 102,358,165 134,785,280 102,361,387 64,032,567 101,237,200 43,030,176 102,354,010 MAF 35％ 35％ 49％ 49％ 44％ 36％ 46％ 32％ 46％ 40％ 45％ 最靠近的基因 ( 遗弃 ) ( 遗弃 ) XYLT1( 内含子 ) XYLT1( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 58kb MGAT5( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 61kb MEGF11( 内含子 ) FGF14( 内含子 ) PDE9A( 内含子 ) 距 HIF1AN 3’ 端 54kb16102365370 A CN 102365391rs3814022 rs1078922 rs4315313 12 13 14 2q21 7q33 16q23说明书31％ 42％ 35％ MGAT5( 内含子 ) 距 MTPN 5’ 端 22kb CDH13( 内含子 )14/17 页134,764,405 135,334,939 81,644,234
表 5. 独立样品中严重程度标志的重复测试参考文献
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