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1、10申请公布号CN102363752A43申请公布日20120229CN102363752ACN102363752A21申请号201110317359822申请日20111019C12N1/19200601C12N15/53200601C12N15/60200601C12N15/63200601C12P7/46200601C12R1/86520060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学国家重点实验室72发明人刘立明徐国强林新跑54发明名称一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响57摘要本发明公开了一种通过还原途径积累。
2、延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响。本发明通过在酿酒酵母SCEREVISIAEBMA64中过量表达源于米根霉RHIZOPUSORYZAENRRL1526的ROMDH基因及源于自身的PYC2基因，从而使得酿酒酵母通过还原TCA途径积累延胡索酸。本发明公开的酿酒酵母基因工程菌FMME0015在添加柠檬酸的条件下，延胡索酸的积累量明显增加，方法简单，产量可达5505233MG/L，为研究代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸奠定了基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图2页CN102363770A1/1页21一种通过还原途径。
3、积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于该基因工程菌可以通过胞质还原途径积累延胡索酸。并且，柠檬酸的添加可以极大地促进延胡索酸的积累。2权利1所述的基因工程菌，其特征在于通过在酿酒酵母中表达源于米根霉RHIZOPUSORYZAENRRL1526的苹果酸脱氢酶ROMDH和自身的PYC2，导致延胡索酸的积累。3权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤第一步基因的获得提取米根霉RHIZOPUSORYZAENRRL1526的总RNA，经反转录后获得其CDNA，然后以CDNA为模板，PCR扩增获得ROMDH；提取酿酒酵母SCEREVISIAEBMA64的基因组，以其为模板，PCR扩。
4、增获得PYC2；第二步基因的转化及转化子的验证将上述重组质粒转化酿酒酵母感受态细胞，用相应的筛选平板获得转化子。后经提取重组质粒，酶切验证确认为阳性转化子。4根据权利要求1所述的发酵特性研究，其特性是将30、200RPM下培养12H的基因工程菌种子以5的接种量转入发酵培养基于30、200RPM条件下培养78H，基因工程菌可积累延胡索酸，其浓度可达到1175035MG/L，在添加柠檬酸的条件下可积累延胡索酸为5505233MG/L。权利要求书CN102363752ACN102363770A1/3页3一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响技术领域0001本。
5、发明涉及一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法及柠檬酸的添加对其发酵特性的影响，属于遗传工程领域和发酵工程领域。背景技术0002作为一类重要的有机酸和最简单的不饱和二羧酸，延胡索酸广泛应用于食品、医药、化工以及畜牧等行业中，特别是作为聚合反应和酯化反应的良好材料，延胡索酸被称为最引人瞩目的十二大化工结构元件之一，因此，具有十分广阔的市场和应用前景。石油化工路线PETROCHEMICALROUTES是当前延胡索酸的主要生产方法，该工艺因原料有限、环境污染严重、生产成本高昂等问题，其产能的进一步扩大受到了限制。利用微生物发酵法生产延胡索酸引起了广泛的兴趣，目前研究得最多的微生物是米。
6、根霉RHIZOPUSORYZAE和少根根霉RHIZOPUSARRHIZUS。但是，RORYZAE和RARRHIZUS表现出复杂的生长形态，发酵工艺难以控制，且其遗传信息和生化机制研究较少，代谢工程改造十分困难。酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE作为一种真核模式微生物，因具有遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，生化分离工艺成本低廉；在低PH条件甚至PH30下生长良好；能耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRASGENERALLYREGARDEDASSAFE微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产延胡索酸的潜在最适微生物。0003酿酒酵母本身不具备积累延胡索酸的代。
7、谢途径，但研究发现RORYZAE是通过胞质还原途径积累大量延胡索酸的，并且，通过该途径积累延胡索酸具有最大的理论得率2MOL/MOLGLUCOSE，还可以通过丙酮酸羧化反应固定二氧化碳。那么，酿酒酵母是否也可以通过胞质还原途径大量积累延胡索酸并固定二氧化碳，是一个十分令人感兴趣的问题。此外，当胞质还原途径引入酿酒酵母细胞后，是否导致氧化还原的不平衡及能量的供应不足，也是一个需要考虑的问题，有报道认为，添加促进NADH合成的底物，如柠檬酸，可以提高胞内ATP的水平，同时还可以诱导与能量代谢相关的关键酶和酶系的表达，促进胞内ATP的合成。发明内容0004本发明所要解决的技术问题是通过在酿酒酵母里构。
8、建一条胞质还原TCA途径，使得延胡索酸得以积累，并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还原的问题。0005为解决上述技术问题，本发明的技术方案为0006通过在酿酒酵母中过量表达源于RHIZOPUSORYZAENRRL1526的苹果酸脱氢酶基因ROMDH和源于自身的丙酮酸羧化酶基因PYC2。并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还原不平衡的问题。0007本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌FMME0015发酵生产延胡索酸的方法。说明书CN102363752ACN102363770A2/3页40008为解决上述技术问题，本发明的技术方案为00091提取米根霉RHIZOPUSORYZA。
9、ENRRL1526的总RNA，经反转录后获得其CDNA，然后以CDNA为模板，PCR扩增获得ROMDH。00102提取酿酒酵母SCEREVISIAEBMA64的基因组，以其为模板，PCR扩增获得PYC2。00113重组质粒的构建将基因ROMDH连接到质粒PY26TEF/GPD，获得重组质粒PY26TEF/GPDROMDH；将基因PYC2连接到质粒PRS305TEF1，获得重组质粒PRS305TEF1PYC2。00124重组质粒的转化将上述重组质粒先后转化到处于感受态的酿酒酵母SCEREVISIAEBMA64细胞，通过筛选平板获得阳性转化子。0013本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述。
10、工程菌发酵生产延胡索酸的方法。将30、200RPM下培养12H的基因工程菌种子以5的接种量转入发酵培养基于30、200RPM条件下培养78H，因FMME001PYC2ROMDH为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的TRP、ADE、HIS。0014延胡索酸的测定方法0015高效液相HPLC检测法，色谱柱为ZORBAXSBAQ柱，流动相为磷酸缓冲盐磷酸二氢钾834G，磷酸氢二钾087G，乙腈5ML，加水定容到1000ML，用磷酸调节PH至25。流速为1MLMIN1，温度为35，检测器选用AGILENT1200DAD检测器，检测波长为210NM。0016所用培养基0017SC培养基DIFCOYEAST。
11、NITROGENBASEW/OAMINOACIDS17G/L，NH42SO45G/L，GLUCOSE20G/L。按要求分别添加LEU100MG/L、TRP20MG/L、ADE20MG/L、HIS20MG/L、URA20MG/L。0018种子培养基SC培养基，装液量为20ML/250ML，115灭菌20MIN。0019发酵培养基SC培养基，葡萄糖浓度改为60G/L，柠檬酸添加量为5G/L，装液量为50ML/250ML，115灭菌20MIN。0020本发明提供的基因工程菌可积累延胡索酸，其浓度可达到1175035MG/L，在添加柠檬酸的条件下可积累延胡索酸为5505233MG/L，为代谢工程进一步。
12、改造酿酒酵母生产C4二羧酸的研究奠定了基础。本基因工程菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。附图说明0021图1酿酒酵母积累延胡索酸的胞质还原途径0022图2APY26TEF/GPDROMDH重组质粒图谱0023BPRS305TEF1PYC2重组质粒图谱0024图3柠檬酸的添加对FMME0015延胡索酸的积累的影响具体实施方式0025以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册说明书CN102363752ACN102363770A3/3页5所述的条件进行操作。0026实施例1产延胡。
13、索酸的酿酒酵母基因工程菌0027一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌，是通过在酿酒酵母中过量表达来源于米根霉RHIZOPUSORYZAENRRL1526的ROMDH和整合表达源于自身的PYC2基因获得的。0028实施例2产延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法00291、菌株和质粒0030酿酒酵母SCEREVISIAEBMA64购自欧洲EUROSCARF，其基因型为MATA/MATURA352/URA352；TRP12/TRP12；LEU23，112/LEU23，112；HIS311/HIS311；ADE21/ADE21；CAN1100/CAN1100；质粒PY26TEF/GPD由本研。
14、究室保藏；质粒PRS305TEF1购自德而宝生物技术有限公司。00312、重组质粒的构建0032用带有BAMHI和HINDIII的引物扩增ROMDH，所用引物为FCGGGATCCATGTTTGCCGCCTCTCGTG；RCCCAAGCTTTTATTGAACAAAGCTGTTACCCTTGPCR产物连接到PMDTM19TSIMPLEVECTOR，然后将其进行双酶切，和经同样酶切的质粒PY26TEF/GPD进行连接，获得重组质粒PY26TEF/GPDROMDH；用带有酶切位点PSTI和SALI的引物扩增PYC2，所用引物为FAACTGCAGATGAGCAGTAGCAAGAAATTGGC；RACGC。
15、GTCGACTTACTTTTTTTGGGATGGGGGTPCR产物连接到PMDTM19TSIMPLEVECTOR，用PSTI和SALI对其进行双酶切，连接到经同样双酶切的质粒PRS305TEF1，获得重组质粒PRS305TEF1PYC2。00333、转化及验证0034用转化试剂盒FROZENEZYEASTTRANSFORMATIONIIKITZYMORESEARCH，ORANGE，CA，USA制作酿酒酵母感受态细胞，将上述重组质粒转化感受态细胞，用相应的筛选平板获得转化子。后经提取质粒，酶切验证确认为阳性转化子。0035实施例3发酵生产延胡索酸0036将30、200RPM下培养12H的基因工程。
16、菌种子以5的接种量转入发酵培养基于30、200RPM条件下培养78H，培养基中按实验要求添加不同浓度的TRP、ADE、HIS。0037种子培养基SC培养基，装液量为20ML/250ML，115灭菌20MIN。0038发酵培养基SC培养基，葡萄糖浓度改为60G/L，柠檬酸添加量为5G/L，装液量为50ML/250ML，115灭菌20MIN。0039延胡索酸的测定方法0040高效液相HPLC检测法，色谱柱为ZORBAXSBAQ柱，流动相为磷酸缓冲盐磷酸二氢钾834G，磷酸氢二钾087G，乙腈5ML，加水定容到1000ML，用磷酸调节PH至25。流速为1MLMIN1，温度为35，检测器选用AGILE。
17、NT1200DAD检测器，检测波长为210NM。0041通过代谢工程改造不积累延胡索酸的酵母菌得到本发明提供的可积累延胡索酸酵母基因工程菌FMME0015，通过添加5G/L的柠檬酸，延胡索酸含量可达5505MG/L，为代谢工程进一步改造酿酒酵母生产C4二羧酸的研究奠定了基础。0042虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。说明书CN102363752ACN102363770A1/2页6图1图2说明书附图CN102363752ACN102363770A2/2页7图3说明书附图CN102363752A。