大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子、 制备及检测方法 技术领域 本发明涉及一种生物工程领域检测用的标准分子， 特别是涉及一种大豆茎溃疡病 菌检测用阳性标准分子、 其制备方法及检测方法。
背景技术 大豆 (Glycine max) 是我国重要的油料作物和粮食作物， 也是世界上食用油和植 物蛋白的主要来源， 在我国国民经济中占有重要地位。 目前我国大豆产量居世界第四位， 但 仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增， 各 种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。
大豆茎溃疡病 (Soybean Stem Canker， 简称 SSC) 是大豆生产上的一种重要病 害， 病 原 菌 分 别 为 大 豆 北 方 茎 溃 疡 病 菌 (Diaporthe phaseolorum(Cooke etEll)Sacc. var.caulivora Athow et Caldwell， 简 称 DPC) 和 大 豆 南 方 茎 溃 疡 病 菌 (Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell.)Sacc.var.meridionalis F.A.Fernandez， 简称 DPM)。 这两种 大豆真菌病害目前严重影响大豆生产及贸易， 具有检疫重要性和经济重要性。这两种病原 菌都是我国重点关注进境植物检疫对象。
DPC 属于子囊菌门、 球壳目、 间座壳科、 间座壳属。 该病菌侵染植株后迅速发展形成 茎杆环状损伤， 并可导致正在生长的植株死亡。 发病严重的田块有 80％的植株受到侵染， 造 成严重的经济损失。在美国、 阿根廷、 巴西、 加拿大、 巴拉圭、 意大利、 前南斯拉夫、 克罗地亚 等欧洲部分国家及地区有发生报道， 是国外大豆生产上的重要病害。
1973 年在美国首次报道 DPM。茎溃疡病菌以菌丝和子囊壳在大豆植株残体上越 冬， 并且抗逆性很强， 病残体在 -18℃～ 15℃下可存活 14 个月。通过种子和混在大豆中的 病残体可进行远距离传播， 种子带菌是传病因素之一。 目前分布于美国、 巴西、 阿根廷、 玻利 维亚、 巴拉圭等国， 是国外大豆生产上的重要病害。
分子生物学检测方法如常规 PCR， 实时荧光 PCR， 基因芯片等在实际检测过程中这 些方法都需要阳性参考物质作为对照， 以保证实验结果的可靠性， 并对实验结果的分析及 判定有重要意义。而阳性参考物质的质量与实验结果有直接关系。在现阶段对大豆北方茎 溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌进行研究和检测的过程中所用的阳性参考物质通常是阳 性菌的基因组 DNA。 该基因组 DNA 是从真菌中直接抽提得到， 而抽提基因组 DNA 的过程较复 杂， 制备非常不方便。由于真菌保存条件较苛刻， 并非所有实验室都具有保存 DPC 和 DPM 的 条件。制备得到的基因组 DNA 的稳定性也尚不能满足长期及经常性使用的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种制备简便、 特异性强、 具有极好均 匀性和稳定性的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子。
本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。为实现上述目的， 本发明采用了以下技术方案 ：
本发明公开了一种大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子， 所述阳性标准分子为能 够自主复制的质粒分子， 且所述质粒中含有大豆茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列。
所述大豆茎溃疡病菌包括大豆北方茎溃疡病菌 (DPC) 和大豆南方茎溃疡病菌 (DPM) 中的至少一种。
所述质粒中含有大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列和大豆 南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列中的至少一种， 优选同时含有。
所述大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列含有 SeqID No.1 所 示的序列， 所述大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列含有 Seq ID No.2 所示的序列。
所 述 质 粒 优 选 为 T 载 体， 在 本 发 明 的 一 个 具 体 的 实 施 方 式 中， 所述质粒为 pMD18-T。
本发明进一步公开了上述大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子的制备方法， 所述 方法包括 ：
设计 PCR 引物， 并以大豆茎溃疡病菌基因组 DNA 为模板扩增得到大豆茎溃疡病菌 的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列， 并转化质粒。
优选的， 所述质粒中同时含有大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌的核糖 体内转录间隔区 DNA 序列， 并且所述方法包括将大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病 菌的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列分别转化质粒， 再将得到的重组子经酶切及拼接得到 所述阳性标准分子。
所述 PCR 引物包括用于扩增大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区 DNA 序列 的引物对 1 和用于扩增大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区 DNA 序列的引物对 2 中 的至少一种， 并且优选的，
引物对 1 含有下述 Seq ID No.3 和 Seq ID No.4 所示的序列，
Seq ID No.3 ： 5′ -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
Seq ID No.4 ： 5′ -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′
引物对 2 含有下述 Seq ID No.5 和 Seq ID No.6 所示的序列，
Seq ID No.5 ： 5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
Seq ID No.6 ： 5′ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。
本发明还公开了上述大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子的检测方法， 所述方法 包括， 利用特异性检测引物和探针， 以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光 PCR 反应， 所 述特异性检测引物和探针包括以下两组中的至少一组， 并且所述探针 5’ 端和 3’ 端分别标 记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，
a、 针对大豆北方茎溃疡病菌的特异性检测引物 DPC-F、 DPC-R 和探针 DPC-P ：
DPC-F ： 5′ -GCTTGGTGTTGGGGCACT-3′ Seq ID No.7
DPC-R ： 5′ -TACGCTCGGGGTCCTGG-3′ Seq ID No.8
DPC-P ： 5′ -TGAAATTCATTGGCGAGCT-3′ Seq ID No.9
b、 针对大豆南方茎溃疡病菌的特异性检测引物 DPM-F、 DPM-R 和探针 DPM-P ：DPM-F ： 5′ -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3′ Seq ID No.10
DPM-R ： 5′ -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3′ Seq ID No.11
DPM-P ： 5′ -ACAAGAGTTGGCTTGGC-3′ Seq ID No.12
由于采用了以上技术方案， 使本发明具备的有益效果在于 ：
利用本发明的方法制备得到的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子， 具有可以长 期稳定保存、 高拷贝数、 易获得、 纯度高和制备方便等特点， 并且制备简便、 特异性强、 具有 极好均匀性和稳定性， 可以替代大豆茎溃疡病菌的基因组 DNA 用于大豆茎溃疡病菌的定性 PCR、 定量 PCR 检测及分析， 解决了大豆茎溃疡病菌检测中标准分子缺乏的难题。该标准分 子适合于口岸检验检疫、 农业生产、 植物保护等部门使用。 附图说明
图 1 为本发明构建的标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 的示意图谱 ； 图 2 为以 DPC-F/R/P 引物探针对供试材料的实时荧光特异性测试结果图 ； 图 3 为以 DPM-F/R/P 引物探针对供试材料的实时荧光特异性测试结果图 ； 图 4 为以 DPC-F/R/P 引物探针对 pMD18-T-DPC-DPM 的实时荧光灵敏度测试结果图 ； 图 5 为以 DPC-F/R/P 引物探针对 pMD18-T-DPC-DPM 的实时荧光扩增标准曲线 ； 图 6 为以 DPC-F/R/P 引物探针对 pMD18-T-DPC-DPM 的实时荧光灵敏度测试结果图 ； 图 7 为以 DPC-F/R/P 引物探针对 pMD18-T-DPC-DPM 的实时荧光扩增标准曲线。具体实施方式
本发明的目的在于克服现有技术不足， 研制制备简便、 特异性强、 具有极好均匀性 和稳定性的大豆茎溃疡病菌检测用阳性标准分子， 或者称大豆茎溃疡病菌的分子检测标准 分子， 使其可以替代大豆茎溃疡病菌的基因组 DNA 用于大豆茎溃疡病菌的定性 PCR、 定量 PCR 检测及分析。根据大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列和大豆南方茎溃疡 病菌的核糖体内转录间隔区序列， 设计 PCR 引物， 经过 PCR 扩增获得大豆北方茎溃疡病菌的 核糖体内转录间隔区序列和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列。 利用分子克 隆技术将 DNA 片段克隆到可以自主复制的质粒载体上， 获得新的重组质粒分子。本发明的 质粒优选用 T 载体， 比如可以将上述扩增得到的 DNA 片段克隆到 pMD18-T 载体上， 获得新的 质粒分子 pMD-T-DPC-DPM。本发明构建的标准质粒分子可代替大豆茎溃疡病菌原有的阳性 标准分子， 用于定性和定量 PCR 检测， 解决大豆茎溃疡病菌检测中标准分子缺乏的难题。
本发明的阳性标准分子， 可根据具体使用情况仅包含 DPC 的核糖体内转录间隔区 的 DNA 序列或者 DPM 的核糖体内转录间隔区的 DNA 序列， 优选同时含有两者。当仅包含上 述一种 DNA 序列时， 所制备的阳性标准分子也仅可作为该种类型大豆茎溃疡病菌检测时的 阳性标准分子。当同时包含两者时， 所制备的阳性标准分子即可作为检测 DPC 的阳性标准 分子， 也可作为检测 DPM 的阳性标准分子。
所述的大豆茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列， 指的是大豆茎溃疡病菌 internal transcribed spacer DNA 序列， 其在大豆茎溃疡病菌基因组中高度保守， 具有种 间特异性、 种内非特异性和高拷贝数的特点。
本发明的标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 构建方法， 包括如下步骤 ：①利用 GenBank 等数据库进行生物信息学分析， 获得大豆茎溃疡病菌的核糖体内 转录间隔区序列。
②设计 PCR 引物。
所述的 PCR 引物， 指的是长度为 28 士 10nt 的寡核普酸链， 其与大豆茎溃疡病菌的 核糖体内转录间隔区序列完全相同或者互补。
③扩增大豆北方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列和大豆南方茎溃疡病菌 的核糖体内转录间隔区序列。
所述的扩增， 指的是利用设计的 PCR 引物， 在 Taq 聚合酶作用下扩增大豆北方茎溃 疡病菌的核糖体内转录间隔区序列和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列。
④分别含有大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌核糖体内转录间隔区序 列的质粒分子克隆。
所述的分子克隆， 指的是将上述得到的特异性 DNA 片段按照设计的限制性内切酶 酶切位点连接到质粒载体 pMD18-T 上， 获得标准质粒分子 pMD18-T-DPM 及 pMD18-T-DPC。
⑤标准分子 pMD18-T-DPC-DPM 的构建
根据预先设计的限制性内切酶酶切位点， 利用核酸内切酶消化、 连接酶连接等分 子生物学技术将 pMD18-T-DPM 及 pMD18-T-DPC 进行酶切并将目标片段再连接， 从而获得标 准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM。 ⑥标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 定性和定量 PCR 检测方法验证。
所述的定性 PCR 检测方法验证， 是指用于标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 构建的 种特异性片段只能在大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌基因组 DNA 中扩增获得， 而不能在其他大豆茎溃疡病菌近似种基因组中扩增得到。
所述的定量 PCR 检测方法验证， 是指检测标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 在进行定 量 PCR 分析时的特异性、 灵敏度、 均匀性和重复性等特性， 以鉴定该标准分子替代大豆茎溃疡 病菌阳性标准分子的能力， 以及实际应用于定量 PCR 检测大豆茎溃疡病菌的测定有效性。
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例 1 ： 标准分子的构建
一、 实验试剂
限制性内切酶 XbaI， KpnI 以及限制性内切酶缓冲液， pMD18-T 载体， T4 DNA 连 接酶及其缓冲液， dNTPs， Taq DNA 聚合酶及其缓冲液、 DL2000Marker， Agarose Gel DNA Purification Kit 和 MiniBEST Plasmid Purification Kit 购自大连宝生物工程有限公 司。DH5α 感受态细胞购自北京天根生物公司。TaqMan 探针及引物由上海超世生物科技有 限公司合成。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
二、 实验仪器
DY-8 型 核 酸 电 泳 仪 ( 北 京 六 一 仪 器 有 限 公 司 )， Biometra Grident PCR 仪， Syngene 凝胶成像系统， 其他仪器包括 ： 离心机， 恒温水浴锅， 培养箱， 天平等。
三、 试验方法和过程
1、 在 GenBank 中搜索大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌及其近似种核 糖体内转录间隔区序列。
2、 构建标准质粒分子 pMD18-T-DPC-DPM 的 PCR 引物序列设计
根据获得的大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌及其近似种核糖体内转 录间隔区序列， 利用软件 Primer 5.0 设计两对 PCR 引物， 分别用于扩增大豆北方茎溃疡病 菌和大豆南方茎溃疡病菌的核糖体内转录间隔区序列。具体的引物序列见表 1。
表 1 供试引物
编号 ITS4-XbaI ITS5-KpnI ITS4 ITS5
序列 (5’ → 3’ ) 5′ -TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 5′ -GTTCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ 5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ 5′ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ Seq ID No. 3 4 5 63、 大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌核糖体内转录间隔区序列的克隆
根据表 1 的引物， 采用引物 ITS4 和 ITS5 对大豆北方茎溃疡病菌的基因组 DNA 进行 扩增， 扩增得到的序列如 Seq ID No.1 所示。引物 ITS4-XbaI 和 ITS5-KpnI 对大豆南方茎 溃疡病菌的基因组 DNA 进行扩增， 扩增得到的序列如 Seq ID No.2 所示。体系见表 2。PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离， 目的产物用 PCR 产物纯化试剂盒纯化。将 PCR 纯化产 物与 pMD18-T Vector 进行连接， 连接体系见表 4， 16℃过夜连接。 转化及筛选重组克隆过程 见 《分子克隆实验指南》 。重组子命名为 pMD18-T-DPC 和 pMD18-T-DPM。
表 2PCR 反应体系
试剂组分 ( 初始浓度 ) 10×PCR buffer 2.5mmol/L dNTPs 上游引物 (10μM) 下游引物 (10μM) 模板 DNA 5U/μL Taq 酶 ddH2O
加入量 (μL) 2.5μL 2μL 0.5μL 0.5μL 1μL 0.2μL 补至 25μL 体积表 3PCR 检测反应条件
表 4 连接反应体系试剂组分 ( 初始浓度 ) Ligation Mix PCR 纯化产物 pMD18-T Vector ddH2O 加入量 (μL) 5μL 3.5μL 1μL 补至 10μL 体积4、 标准分子 pMD18-T-DPC-DPM 的构建
将 pMD18-T-DPC 和 pMD18-T-DPM 均用 XbaI 和 KpnI 进行双酶切。 体系见表 5。 37℃ 温浴 5h， 琼脂糖凝胶电泳， 切胶回收 pMD18-T-DPC 载体大片段和 pMD18-T-DPM 的小片段。 将 pMD18-T-DPM 的小片段与 pMD18-T-DPC 载体大片段进行连接。连接体系见表 6。16℃过夜 连接。转化及筛选重组克隆过程见 《分子克隆实验指南》 。筛选得到的重组克隆通过 M13F/ R 引物的常规 PCR 验证及 XbaI 和 KpnI 的酶切验证及酶切产物测序验证， 最终的重组子命名 为 pMD18-T-DPC-DPM。
表 5 酶切反应体系
试剂组分 ( 初始浓度 ) 10×M buffer 质粒 XbaI KpnI ddH2O
9 加入量 (μL) 2μL 5μL 0.5μL 0.5μL 补至 20μL 体积表 6 连接反应体系102373233 A CN 102373236说试剂组分 ( 初始浓度 ) Ligation Mix明书加入量 (μL) 5μL 1μL 1μL 补至 10μL 体积7/10 页引物探针混合液 (10μM) 模板 ddH2O
实施例 2 ： 标准质粒分子性能评价
一、 实验试剂
Universal Real-time Master Mix 购自 ABI 公司。
引物及探针由上海超世生物科技有限公司合成。
二、 实验仪器
ABI 7700 实时荧光 PCR 仪。
三、 试验方法和过程及结果
1、 特异性测试
以大豆茎溃疡病菌 DNA 为阳性对照， 其近似种菌株的 DNA 为阴性对照见表 7， 进一 步设计特异性检测引物和探针见表 8， 对构建的分子检测标准分子进行特异性检测。其中， DPC-P 和 DPM-P 的两端分别标记有具有相互淬灭特性、 即作为荧光报告基团也作为荧光淬 灭基团的 MAR 和 JUP。反应体系见表 9， 程序见表 10。
表 7 供试菌株
菌株名称 大豆北方茎溃疡病菌 编号 ATCC28464a SU01b SU06-8b SA266b SA258b 大豆南方茎溃疡病菌 ATCC200236a FSO508c D.phaseolorum var.sojae ATCC12049a A4b 大豆 美国 大豆 美国 大豆 大豆 大豆 大豆 美国 美国 阿根廷 阿根廷 寄主 来源ATCC60325a A1b SA01b SU03b 大豆 大豆 大豆 美国 阿根廷 美国
表 8 供试引物及探针
表 9 实时荧光 PCR 反应体系
表 10 实时荧光 PCR 检测反应条件
特异性测试结果
DPC-F/R/P 引物对及探针和 DPM-F/R/P 引物对及探针对阳性菌株， 近似种和标准 分子的特异性检测结果 ( 图 1， 图 2)。结果表明， 所设计的特异性检测引物和探针， 都能检 测出阳性对照， 而阴性对照则都没有信号， 所构建的重组质粒也能被特异性的探针检测到， 且不会有交叉反应， 具有很好的特异性。
2、 灵敏度检测
对标准分子进行十倍梯度稀释 (10-1 至 10-7)， 采用特异性探针 ( 见表 8) 进行实时 荧光 PCR 检测， 反应体系及反应条件同特异性检测， 每个反应重复 2 次。建立标准曲线， 根 据检测样品的扩增效率和相关系数分析标准分子的均匀性。
灵敏度测试结果
结果见图 4-7。其中图 4， 5 为大豆北方茎溃疡病菌灵敏度检测结果图， 图 6， 7为 -7 大豆南方茎溃疡病菌灵敏度检测结果图。结果表明最低检测值均为达到 10 稀释度。根 据 Ct 值计算得出的标准曲线公式为大豆北方茎溃疡病菌 y ＝ -3.438x+12.180， 相关系数为 0.998。大豆南方茎溃疡病菌的标准曲线公式为 y ＝ -3.423x+12.095， 相关系数为 0.998。
3、 稳定性检测
将构建的标准分子置于室温条件下 ( 平均室温 20℃ )， 分别在放置 24h、 48h、 72h、 1 周、 2 周、 1 月、 2 月， 进行实时荧光 PCR 检测， 对获得的 Ct 值进行统计分析标准分子的稳定 性。
稳定性测试结果
对每次实时荧光测试每个反应 2 个重复的 Ct 值平均值进行相对标准偏差分析 (RSD) 结果见表 11， 结果表明 7 个放置不同时间的 RSD 均小于 4％ ( 标准偏差小于 35％可 以接受 )。可见本试验研究的标准分子在室温下放置 2 个月仍然具有很好的稳定性。
表 11 标准曲线相关参数分析
表 12 标准分子实时荧光检测 Ct 值统计表以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护 范围。