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1、10申请公布号CN102321569A43申请公布日20120118CN102321569ACN102321569A21申请号201110316881422申请日20111019C12N5/07120100171申请人山东省分析测试中心地址250014山东省济南市历下区科院路19号72发明人魏云波刘书花张瑞凌李福伟王兴民徐建荣74专利代理机构济南舜源专利事务所有限公司37205代理人曲志波54发明名称一种石鲽肝脏细胞系的构建方法57摘要本发明涉及一种石鲽肝脏细胞系的构建方法，它是以石鲽肝脏组织细胞为材料，采用两步酶消化法启动原代培养，在含胎牛血清、肝细胞生长因子、硫酸软骨素、N乙酰葡萄糖盐酸盐。
2、和石鲽肝脏抽提液的DMEM/F12培养液PH值7074中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；本发明工艺科学合理，避免了常规细胞系构建中的酶消化法对石鲽肝脏细胞的损伤，细胞可正常贴壁生长，各培养液添加物有效促进了肝脏细胞的增殖，由本发明构建的石鲽肝脏细胞系目前已传至第110代，细胞增殖状态良好，可望应用该细胞系进行分子细胞水平上多种中草药有效成分对鱼类病毒进行抗病毒作用机理研究，从而研制出病害防治中的有效治疗药物或免疫增强剂，解决日益严重的各种水产养殖病害。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102321575A1/1页21一种石鲽肝脏细胞。
3、系的构建方法，其特征是它包括如下步骤对鲜活石鲽用75酒精消毒处理，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下肝脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后粗剪成约50100立方毫米的组织块；进行两步酶消化法后，混合所得细胞悬液；经200目钢网过滤，离心收集后，用含有5胎牛血清、12比例的硫酸软骨素和12比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，2224下贴壁1小时，每孔再加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置2224生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35。
4、天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次；待细胞长成单层后，使用浓度为0125025胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养，并最终建立石鲽肝脏细胞系；所述石鲽肝脏细胞专用增殖培养液配方为含有20胎牛血清、12比例的硫酸软骨素和12比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液PH值7074。2如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述两步酶消化法是指在消化液I中消化肝脏组织块510分钟，消化液I中含0102的胰蛋白酶和0102EDTA的磷酸盐缓冲液，离心收集组织块后再加入消化液II，消化液II是0102型胶原酶的DMEM/F12培养液，混合均匀静置消化05小时后将上部悬液取出；再加入。
5、新的消化液II，用051小时慢速将肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米后，继续消化1小时，获得所需的肝脏细胞。3如权利要求2所述的构建方法，其特征是在上述石鲽肝脏细胞专用增殖培养液中添加了占上述专用增殖培养液002004的人肝细胞生长因子和1020的已抽滤的石鲽肝脏抽提液。权利要求书CN102321569ACN102321575A1/5页3一种石鲽肝脏细胞系的构建方法技术领域0001本发明涉及一种利用石鲽肝脏组织细胞建立肝脏细胞系的方法石鲽肝脏细胞系的构建方法。背景技术0002石鲽（KAREIUSBICOLORATUS）是温热带海洋底栖鱼类，盛产于我国的黄海、渤海，是我国重要的海水养殖经济鱼类。频。
6、繁爆发的各种病毒性疾病对石鲽养殖业带来了严重的影响，造成患病石鲽大面积死亡，经济损失严重，并可能通过食物链威胁到人类健康。目前尚无适当的药物或疫苗可进行有效防治，亟待开发和生产安全高效的无公害渔药。其中，将抗病毒谱广、毒副作用小的各种中草药有效成分应用于疾病防治，可以解决使用化学药物造成的耐药性和药物残留超标等问题，符合国际上食用性动物药品的“低毒、无残留、高药效”的发展要求。因此，为了研究石鲽病毒传播机制、宿主细胞的防御机制及病毒与宿主之间的相互作用机理，并进行中草药有效成分抗病毒机理研究，利用病毒易于感染的石鲽肝脏组织，建立石鲽肝脏连续性细胞系是十分必要的。0003鱼类肝脏组织含有较多的胶。
7、原和纤维组织，现有专利中的鱼类细胞系构建方法中，快速剪碎组织时产生的机械剪切力，会对肝脏细胞产生很大影响，不能使肝脏原代细胞正常贴壁并增殖，所提供的各种酶消化法处理后，肝脏组织块中细胞迁出数量少，消化后的细胞数量少，不易贴壁，且鱼类肝脏组织不同于哺乳动物肝脏，无法使用目前构建哺乳动物肝脏细胞系常用的灌注消化法进行细胞系建立。因此，需要研究一种有效的石鲽肝脏细胞系的构建方法，以建立石鲽肝脏细胞系，为在分子细胞水平上研究多种中草药有效成分的抗病毒作用机理，从而研制出病害防治中的有效治疗药物或免疫增强剂，解决日益严重的各种水产养殖病害。0004发明内容0005本发明的目的是利用石鲽肝脏组织，针对肝脏。
8、组织特点，提供一种石鲽肝脏细胞系的构建技术，以弥补现有技术的不足。0006本发明的构建方法首先对鲜活石鲽用75酒精消毒处理，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下肝脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后粗剪成约50100立方毫米的组织块。根据肝脏组织特点，设定两次酶消化处理。首先在消化液I（含0102的胰蛋白酶和0102EDTA的磷酸盐缓冲液）中对处理好的肝脏组织块消化510分钟，用血清中和反应后，离心收集肝脏组织块；再在消化液II（0102型胶原酶的DMEM/F12培养液）中进行第二次酶消化处理，首先用滴管缓慢吹打组织块，使其混合均匀，静置消化05小时后将上部悬液取出；再加入新的消化液II，慢速将。
9、肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米（约051小时）后，继续消化1小时，消化完毕后，混合所得细胞悬液，经200目钢网过滤，离心收集后，用含有5胎牛血清、12比例的硫酸软骨素和12比例的N乙说明书CN102321569ACN102321575A2/5页4酰葡萄糖盐酸盐的PH值为7074的DMEM/F12培养液充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，2224下贴壁1小时后，每孔加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置2224生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，将细胞悬浮、混合，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35天半量更换石鲽。
10、肝脏细胞专用增殖培养液一次；待细胞长成单层后，使用浓度为0125025胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的石鲽肝脏细胞专用增殖培养液配方为含有20胎牛血清、12比例的硫酸软骨素和12比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐、PH值为7074的DMEM/F12培养液。为了促进石鲽肝脏细胞的分裂和快速增殖，本发明又添加了002004的人肝细胞生长因子和1020的已抽滤的石鲽肝脏抽提液。0007本发明的有益效果是针对石鲽肝脏组织特点，采用两步酶消化法，避免原代培养中常规酶消化法及组织块处理时机械剪切力对肝脏细胞造成的影响，获得的原代肝脏细胞可以正常贴壁生长，并通过添加多种细胞外基质成分及添加物，。
11、使肝脏细胞快速增殖，连续传代并成功建系，经这种方法所构建的肝脏细胞系现已传至第110代，细胞仍保持石鲽肝脏细胞的特性，该细胞系可在分子细胞水平上进行鱼类病毒学研究并进行相关治疗药物的研制。0008具体实施方式0009将上述本发明的方法按照细致步骤进行详述如下1、石鲽肝脏组织块的初步处理首先对鲜活石鲽用75酒精浸泡510分钟，用纱布擦除体表粘液，置于超净工作台中解剖取下肝脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗2遍后在含有5胎牛血清的DMEM/F12培养液中将肝脏组织粗剪成约50100立方毫米的组织块，800RPM离心收集肝脏组织块。00102、对肝脏组织块进行两步酶消化法处理在消化液I（含0102的胰蛋白酶和。
12、0102EDTA的磷酸盐缓冲液）中对上一步处理好的肝脏组织块消化510分钟，加入2滴胎牛血清中和反应后，1000RPM离心收集肝脏组织块；再在肝脏组织块中加入消化液II（0102型胶原酶的DMEM/F12培养液），用滴管缓慢吹打组织块，使其混合均匀，静置消化05小时后将上部细胞悬液取出；再加入新的消化液II，慢速将肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米（约051小时）后，继续消化1小时。00113、石鲽肝脏细胞专用增殖培养液的配制取常规配制的DMEM/F12培养液（PH7074）30毫升，加入硫酸软骨素510毫克，N乙酰葡萄糖盐酸盐510毫克，完全溶解后用022微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛。
13、血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至50毫升，即为本发明的石鲽肝脏细胞专用培养液。为了促进石鲽肝脏细胞的分裂和快速增殖，并添加石鲽肝脏细胞所需的众多未知的促分裂增殖因子，达到其最佳生长条件，本发明又添加了002004的人肝细胞生长因子和1020的已抽滤的石鲽肝脏抽提液，此石鲽肝脏抽提液为将石鲽肝脏组织匀浆经022微米的微孔滤膜过滤除去其他杂质而得。00124、石鲽肝脏细胞培养的获得及原代培养的启动混合消化完毕后的细胞悬液经说明书CN102321569ACN102321575A3/5页5200目钢网过滤，离心收集后，用1毫升含有5胎牛血清、12比例的硫酸软骨素和12比例的N乙酰葡萄糖盐酸。
14、盐的DMEM/F12培养液（PH值7074）充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，每孔加入的细胞悬液覆盖底部即可，2224下贴壁1小时后，每孔加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置2224生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，将多个孔中细胞悬浮混合，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35天，吸出25毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入25毫升新鲜的石鲽肝脏细胞专用培养液。00135、石鲽肝脏细胞的传代培养待石鲽肝脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0125。
15、025的胰蛋白酶溶液，静置消化051分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成石鲽肝脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出25毫升肝脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液25毫升，使之最终体积至5毫升；待石鲽肝脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养，至细胞系建立。0014实施例1将鲜活石鲽于盛有75酒精的容器中浸泡消毒510分钟，用纱布擦除体表粘液，移入超净工作台中，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出肝脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中漂洗2遍；转入含有5胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中粗剪成约50100立方毫米的组。
16、织块；800RPM离心收集肝脏组织块，加入消化液I（含01的胰蛋白酶和01EDTA的磷酸盐缓冲液）对肝脏组织块消化5分钟；加入2滴胎牛血清中和反应后，1000RPM离心收集组织块；再在消化液II（01型胶原酶的DMEM/F12培养液）中，用滴管缓慢吹打组织块将酶液与组织块混合均匀，静置消化05小时后，取出上部细胞悬液，再加入新的消化液II，慢速将肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米（约05小时）后，继续消化1小时。0015取常规配制的DMEM/F12培养液（PH7074）30毫升，加入硫酸软骨素5毫克，N乙酰葡萄糖盐酸盐5毫克，完全溶解后用022微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规。
17、配制的DMEM/F12培养液至50毫升，即为本发明的石鲽肝脏细胞专用培养液。为了促进石鲽肝脏细胞的分裂和快速增殖，并添加石鲽肝脏细胞所需的众多未知的促分裂增殖因子，达到其最佳生长条件，本发明又添加了002的人肝细胞生长因子和20的已抽滤的石鲽肝脏抽提液，此石鲽肝脏抽提液为将石鲽肝脏组织匀浆经022微米的微孔滤膜过滤除去其他杂质而得。0016混合消化完毕后的细胞悬液经200目钢网过滤，1000RPM离心收集后，用1毫升含有5胎牛血清、1比例的硫酸软骨素和1比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液（PH值7074）充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，每孔加入的细胞。
18、悬液覆盖底部即可，22下贴壁1小时后，每孔加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置22生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，将多个孔中细胞悬浮混合，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35天，吸出25毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入25毫升新鲜的石鲽肝脏细胞专用培养液。待石鲽肝脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0125的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；说明书CN102321569ACN102321575A4/5页6吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶。
19、底制成石鲽肝脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出25毫升肝脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液25毫升，使之最终体积至5毫升；待石鲽肝脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养，至细胞系建立。0017实施例2将鲜活石鲽于盛有75酒精的容器中浸泡消毒510分钟，用纱布擦除体表粘液，移入超净工作台中，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出肝脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中漂洗2遍；转入含有5胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中粗剪成约50100立方毫米的组织块；800RPM离心收集肝脏组织块，加入消化液I（含01的胰蛋白酶和02EDTA的磷酸盐缓冲液）对肝脏组织。
20、块消化10分钟；加入2滴胎牛血清中和反应后，1000RPM离心收集组织块；再在消化液II（02型胶原酶的DMEM/F12培养液）中，用滴管缓慢吹打组织块将酶液与组织块混合均匀，静置消化05小时后，取出上部细胞悬液，再加入新的消化液II，慢速将肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米（约1小时）后，继续消化1小时。0018取常规配制的DMEM/F12培养液（PH7074）30毫升，加入硫酸软骨素10毫克，N乙酰葡萄糖盐酸盐5毫克，完全溶解后用022微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至50毫升，即为本发明的石鲽肝脏细胞专用培养液。为了促进石鲽肝脏细胞的分裂和快。
21、速增殖，并添加石鲽肝脏细胞所需的众多未知的促分裂增殖因子，达到其最佳生长条件，本发明又添加了002的人肝细胞生长因子和10的已抽滤的石鲽肝脏抽提液，此石鲽肝脏抽提液为将石鲽肝脏组织匀浆经022微米的微孔滤膜过滤除去其他杂质而得。0019混合消化完毕后的细胞悬液经200目钢网过滤，1000RPM离心收集后，用1毫升含有5胎牛血清、2比例的硫酸软骨素和1比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液（PH值7074）充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，每孔加入的细胞悬液覆盖底部即可，24下贴壁1小时后，每孔加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置24生化培养箱中培养，第。
22、二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，将多个孔中细胞悬浮混合，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35天，吸出25毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入25毫升新鲜的石鲽肝脏细胞专用培养液。待石鲽肝脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为0125的胰蛋白酶溶液，静置消化05分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成石鲽肝脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出25毫升肝脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液25毫升，使之最终体积至5毫升；待石鲽肝脏细胞再。
23、次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养，至细胞系建立。0020实施例3将鲜活石鲽于盛有75酒精的容器中浸泡消毒510分钟，用纱布擦除体表粘液，移入超净工作台中，用棉球擦拭鱼体表后解剖取出肝脏组织，置于盛有磷酸盐缓冲液的烧杯中漂洗2遍；转入含有5胎牛血清DMEM/F12培养液的青霉素小瓶中粗剪成约50100立方毫米的组织块；800RPM离心收集肝脏组织块，加入消化液I（含02的胰蛋白酶和02EDTA的磷酸盐缓冲液）对肝脏组织块消化5分钟；加入2滴胎牛血清中和反应后，1000RPM离心说明书CN102321569ACN102321575A5/5页7收集组织块；再在消化液II（02型胶原酶的D。
24、MEM/F12培养液）中，用滴管缓慢吹打组织块将酶液与组织块混合均匀，静置消化05小时后，取出上部细胞悬液，再加入新的消化液II，慢速将肝脏组织块继续剪至小于1立方毫米（约1小时）后，继续消化1小时。0021取常规配制的DMEM/F12培养液（PH7074）30毫升，加入硫酸软骨素10毫克，N乙酰葡萄糖盐酸盐10毫克，完全溶解后用022微米的微孔滤膜过滤除菌，加入1毫升胎牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至50毫升，即为本发明的石鲽肝脏细胞专用培养液。为了促进石鲽肝脏细胞的分裂和快速增殖，并添加石鲽肝脏细胞所需的众多未知的促分裂增殖因子，达到其最佳生长条件，本发明又添加了004的人肝。
25、细胞生长因子和10的已抽滤的石鲽肝脏抽提液，此石鲽肝脏抽提液为将石鲽肝脏组织匀浆经022微米的微孔滤膜过滤除去其他杂质而得。0022混合消化完毕后的细胞悬液经200目钢网过滤，1000RPM离心收集后，用1毫升含有5胎牛血清、2比例的硫酸软骨素和2比例的N乙酰葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液（PH值7074）充分悬浮，均匀接种于已用01明胶预先铺板的24孔细胞培养板中，每孔加入的细胞悬液覆盖底部即可，24下贴壁1小时后，每孔加入1ML石鲽肝脏细胞专用增殖培养液，置24生化培养箱中培养，第二天半量更换石鲽肝脏细胞专用增殖培养液一次，待石鲽肝脏细胞长满培养孔后，将多个孔中细胞悬浮混合，转至25毫升培养瓶中培养，每隔35天，吸出25毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，以去除未贴壁的组织和死细胞，加入25毫升新鲜的石鲽肝脏细胞专用培养液。待石鲽肝脏细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1毫升浓度为025的胰蛋白酶溶液，静置消化05分钟；吸去胰蛋白酶溶液，将刚刚吸出的5毫升旧培养液加回，用滴管吹打培养瓶底制成石鲽肝脏细胞悬液；从每个培养瓶中分别取出25毫升肝脏细胞悬液，分别加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液25毫升，使之最终体积至5毫升；待石鲽肝脏细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行传代培养，至细胞系建立。说明书CN102321569A。