与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物 技术领域 本发明涉及疾病诊断领域， 特别是涉及用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治 疗疗效的分子标志物及其相关试剂盒。
背景技术 神经胶质瘤起源于神经外胚层， 约占成人颅内肿瘤的 40 ～ 50％。胶质母细胞瘤 (GBM) 约占所有胶质瘤临床病例的 50％左右， 是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。 原发性胶质母细胞瘤 (glioblastoma multiforme， GBM) 约占所有胶质母细胞瘤临床病例的 90％以上， 是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。 胶质母细胞瘤呈侵袭性生长、 手术切 除困难、 复发率和致死率极高， 是当今神经外科领域的国际性难题。针对胶质母细胞瘤， 目 前强调最大程度手术切除、 放射治疗和化学治疗等综合治疗策略， 然而患者生存预后极差， 中位生存期约为 12 ～ 14 个月。大量临床研究表明， 常规病理学诊断相同的胶质母细胞瘤， 对各种治疗的效果及临床预后存在显著差异， 其浸润、 复发、 转移情况也多有不同， 有的患 者仅仅存活数周， 而有的患者却可以存活几年以上。 因此， 年龄等传统临床预后因素的预测 价值极为有限。
现代观点认为， 分子标志物广泛应用于临床可以改善对肿瘤患者的治疗效果 [1]。 近年来， 肿瘤基因组学研究不断进展， 运用基因表达谱芯片等高通量的检测方法已经研究 出大量具有临床价值的肿瘤分子标志物。最新研究证实， 微小 RNA(microRNA， miRNA) 表达 谱芯片在肿瘤分类方面比蛋白编码基因表达谱芯片更加准确和有效 [2-4]。microRNA 作为 肿瘤分子标志物与 mRNA 相比具有更大的优势， 因为对于数量在 40000 以上的人类基因， 从 大约 1000 个人类 microRNA 中寻找可靠标志物将会变得容易的多。而且 microRNA 相对更 加稳定而不易降解， 可以用于长期保存的石蜡包埋标本。因此， 我们从 microRNA 表达谱芯 片中获得的信息将可以作为普通基因表达谱芯片的有益补充。
microRNA 是长度在大约 22nt 左右的单链、 非编码 RNA， 其主要作用在于转录后 水平调控成百上千个基因的表达， 因而具有广泛的生物学功能 [5， 6]。目前研究表明， microRNA 与某些人类肿瘤的临床预后显著相关， 如白血病 [7]、 肺癌 [8]、 胰腺癌 [9]、 肝细 胞癌 [10]、 结肠癌 [11] 以及卵巢癌 [12] 等等。
然而， microRNA 标志物能否预测胶质母细胞瘤患者的临床预后至今未见报道。
一项胶质母细胞瘤治疗重大进展是发现烷化剂替莫唑胺 (TMZ) 联合放疗有益于 患者预后。尽管数据显示只有 10％的病人通过这种治疗方案获得 5 年生存期， 但所有胶质 母细胞瘤患者都需接受这种治疗方案， 因为目前不能预测哪些患者可以从这种治疗方案中 受益。因此， 具有预测作用的生物标记物的发现， 成为了神经肿瘤领域的主要挑战。
发明内容 因此， 本发明涉及胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物的发现， 以及 开发胶质母细胞瘤患者是否需要用替莫唑胺治疗的试剂盒。
在本发明的一个实施方式中公开一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治 疗疗效的试剂盒， 试剂盒包括测定胶质母细胞瘤患者的 miR-181d 水平的试剂盒和任选地 所述试剂盒使用说明书。
在本发明的另一个实施方式中， 所述试剂盒进一步包括从胶质母细胞瘤患者的肿 瘤组织样品中提取 RNA 的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。
在本发明的还另一个实施方式中， 所述试剂盒是 miRNA 表达谱试剂盒 ； 或者所述 试剂盒是 qRT-PCR 试剂盒。
在本发明更另一个实施方式中， 所述测定胶质母细胞瘤患者的 miR-181d 水平与 与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关。
在本发明的一个实施方式中， 公开了一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺 治疗疗效的分子标志物 miR-181d。
本发明在此报道 miR-181d 作为胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物 的发现， 还提供了其在胶质母细胞瘤治疗中的应用。 附图说明 图 1 是 miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关的图 ： (a) 在 TCGA 数据库中 miR-181d 表达水平与患者总生存期呈负相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红 色： 低于平均表达水平 ； (b) 通过 qRT-PCR 评估在 35 个患者的独立验证组中 miR-181d 与总 生存期相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红色 ： 低于平均表达水平 ； (c) 在 TMZ 治疗状况的分 层后， miA-181d 与生存期相关性。
图 2 是 miR-181d 下调 MGMT 表达的图 ： (a) 转染 miR-181d 抑制了 mRNA( 左图 ) 和 A1207 神经胶母细胞瘤细胞系中蛋白 ( 右图 ) 的表达， 对于 qPCR， MGMT mRNA 不是归一化为 β- 肌动蛋白就是归一化为 U6rRNA( 具有相似的结果， 数据没有示出 )， 对于蛋白印迹法， β- 肌动蛋白被用作为加样对照 ； (b)MGMT 3’ UTR 中的 miR-181d 结合位点在 miR-181d 存 在情况下抑制了荧光素酶表达 ； (c)MGMT 3’ UTR 中预测的 miR-181d 结合位点 ； (d)miR-181d 与 MGMT 转录物物理地相互作用， β- 肌动蛋白被用作为被用作为内对照。
图 3 是 miR-181d 水平与 MGMT mRNA 水平呈负相关的图 ： (a) 在具有表征的 MGMT 启动子、 MGMT mRNA 水平和 miR181-d 水平的 223TCGA 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平 之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13) ； (b) 在具有未甲基化的 MGMT 启动子的 159 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13)， MGMT 和 miR-181d 的 相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图 ； (c) 在神经胶母细胞瘤的独立组中 miR-181d 和 MGMT 转录 物水平之间的负相关性 (p ＝ 0.04， R2 ＝ 0.62)。miR-181d 和 MGMT 的表达水平通过 qPCR 进行评估。每一个的相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一 . 患者资料与标本来源
本研究经机构审查委员会批准， 所有病人均签署知情同意书， 所有病人均接受手 术治疗， 并且病理诊断为胶质母细胞瘤。所有病人均接受放疗治疗。但只有部分病人接受TMZ 治疗。患者的特征在以下表中列出。所有样本在切除后 5 分钟内冰冻， 排除肿瘤组织小 于 80％的样本。 切除程度经过 2 名放射科医师术后 72 小时行核磁共振检查， 确定为全切除 (GTR) 级和非全切除 (non-GTR) 级。
表 1 所有入组本研究的 117 例原发性胶质母细胞瘤患者的临床病理学资料
项目 实验组 (n ＝ 82) No.(％ ) 性别 男性 女性 年龄， 岁 均值 ( 标准差 ) 范围 术前 KPS 评分 ≥ 70 ＜ 70 手术切除程度 近全切除 次全切除 替莫唑胺化疗 是 否
29(35.0) 53(65.0) 51(62.0) 31(38.0) 43.1(13.4) 17-70 55(67) 55(67) 27(33) 48.9(12.2) 21-67 25(71.4) 25(71.4) 10(28.6) 54(65.9) 28(34.1) 17(48.6) 18(51.4) 验证组 (n ＝ 35) No.(％ )二 .DNA、 RNA 和 miRNA 表达谱
按照生产厂商说明书从肿瘤组织中提取 RNA， miRNA 表达谱通过 Human v2.0miRNA Expression BeadChip(Illumina， Inc.， San Diego， CA) 检测， 芯片数据依照 MIAME 指南 储存于 GEO 中 ( 序列号 GSE25632)， qRT-PCR 应用 ABI 7900real-time PCR 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 检测。
1. 标本总 RNA 提取
实验流程如下， 具体请参见 mirVana miRNA Isolation kit 说明书。1.1 主要试剂1.2 实验步骤
(1) 所有肿瘤标本在手术后立即置入液氮冷冻保存， 同时进行标本冰冻切片和常 规 HE 染色以判定肿瘤细胞的所占比例， 选择肿瘤细胞占 80％以上的标本进行下一步提取 总 RNA。
(2) 组织研磨 ： 使用 180℃高温处理 6h 的研钵， 加入液氮预冷， 取直径 0.5cm 大小 肿瘤组织迅速研磨至粉末状， 为防止组织融化研磨时需间断加入液氮。
(3) 组 织 裂 解 ： 取 30mg 左 右 研 磨 好 的 组 织 粉 末， 加 入 300ulLysis/Binding Buffer， 充分振荡混匀后置于冰上。
(4) 有机剂萃取 ： 加入 30ul miRNA Homogenate Additive， 充分振荡混匀后置于冰 上 10min ； 加入 350ul 酚氯仿有机剂， 充分振荡混匀 30-60sec ； 10000g 离心 10min 后回收上 层液相约 250ul。
(5) 总 RNA 分离 ： 加入 375ul 室温下无水乙醇， 充分混匀后加入滤柱过滤， 10000g 离心 15sec， 弃去滤液 ； 加入 700ul miRNA Wash Solution 1， 10000g 离心 15sec， 洗脱， 弃去 滤液 ； 加入 500ul Wash Solution 2/3， 10000g 离心 15sec 洗脱， 重复一次， 弃去滤液， 再空 离 60sec ； 更换收集管， 加入 50ul 预热至 95℃的 Elution Solution， 10000g 离心 30sec 洗 脱， 重复一次， 收集洗脱液即组织总 RNA。
(6) 应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 RNA 定量， 并用琼脂糖甲醛变性 凝胶电泳检测 RNA 完整性， 然后将总 RNA 样品贮存于 -80℃。
2.Illumina microRNA 表达谱芯片
2.1 主要试剂
2.2 实验步骤 (1) 在 RNA 样本的 3’ 端加上多聚腺苷酸尾 ( 制作 PAP 板 ) ：①将完整的 RNA 样本用 DEPC 处理过的水标准化至 200ng/μl 的样本体系。
② 96 孔板每孔加 5μl 多聚腺苷酸化反应试剂 PAS， 再每孔加 5μl RNA 样本， 热封 封好充分振荡混匀后快速离心。
③将 96 孔板置于加热仪中 37℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(2)microRNA 的 cDNA 合成 ( 制作 CSP 板 ) ：
①在新 96 孔板中每孔加入 8μl cDNA 合成试剂 CSS。
②从 PAP 板中取 8μl 加过多聚腺苷酸尾的 RNA 加 CSP 板中对应的孔中， 将 CSP 板 封好， 充分振荡混匀， 快速离心。
③将 CSP 板置于加热仪中 42℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(3)cDNA 和 microRNA 特异核苷酸的杂交 ( 制作 ASE 板 ) ：
①在一个新 96 孔板中每孔加 5μl microRNA Assay Pool(MAP) 和 30μlOligo 杂 交 &DNA 结合缓冲液 1(OB1)。
②将 CSP 板中生物素酰化的 cDNA 转移 15μl 到 ASE 板对应孔中。
③将 ASE 板快速离心， 充分振荡混匀后， 在加热仪中温度从 70℃降至 40℃孵育 4h。 (4)microRNA 特殊引物的延伸和连接 ：
①将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体， 留下磁珠。
②每孔加 50μl AM1， 充分振荡后置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
③每孔加缓冲液 50μl UB1， 置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
④每孔加 37μl 延伸结合混合液 MEL， 充分振荡， 加热仪中 45℃孵育 15min。
(5) 延伸产物的扩增 (PCR) ：
①将 64μl DNA 多聚酶加入 SCM 管中， 再加 50μl 尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶 (UDG) 后混合， 在一个新 96 孔板 (PCR 板 ) 每孔中加入 30μl SCM 混合物封好待用。
②将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体， 加入 50μl UB1， 再置于磁板上吸去液体。
③ ASE 板每孔中加入 35μl 接种 PCR 试剂 (IP1)， 充分振荡， 加热仪中 90 ℃孵育 1min 后将板置于磁板上， 吸 30μl 上层液体转移到 PCR 板相应的孔中， 抽吸混匀液体后封 好。④将 PCR 板放入循环变温加热仪中， 运行下例程序 ： 37℃， 10 分钟 ； 95℃， 3 分钟 ； 34 个 以下循环 ： 95℃、 35 秒， 56℃、 35 秒， 和 72℃、 2 分钟 ； 72℃， 10 分钟 ； 4℃， 5 分钟。
(6) 固定 PCR 产物 ：
① PCR 板的每孔中加入 20μl 已混匀的磁性颗粒试剂 (MPB)， 将混合后的 PCR 产物 和磁珠转移至过滤板的对应孔中。
②盖上过滤板盖， 避光放置 60min。
(7) 制作上芯片的过度板 (INT 板 ) ：
①将过滤板接合器放置到 V 型孔底的 96 孔板 ( 废液板 ) 上， 再将含有固定 PCR 产 物的过滤板放到接合器上。
② 25℃ 1000×g 离心 5min 后， 打开盖子， 每孔加 50μl 缓冲液 UB2， 然后封闭盖子 再次离心 5min。
③加 30μl MH1 到过度板 (INT 板 ) 每个孔中， 然后用 INT 板代替废液板， 再加 30μl 0.1N NaOH 到过滤板每孔中。 ④ 25℃ 1000×g 离心 5min， 最后在 INT 板中不会有可见的磁珠。
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
3.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加入 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ； ③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ； ④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。 步骤 5 ： cRNA 纯化 ①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ； ②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇，充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ；
⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集 cRNA。
(2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱 5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。 (3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
4.Illumina mRNA 表达谱芯片
4.1 主要试剂
试剂名称 TaqMan MicroRNA Assays has-miR-181d has-miR-518b has-miR-524-5p has-miR-566 has-miR-1227 U6rRNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4373180 #4373246 #4395174 #4380943 #4409021 #4395470 #4366596 #4324018 ABI ABI 产品编号 生产厂家 ABI10102329860 A CN 102329870 DEPC 处理水
说明书100ml9/16 页 Invitrogen4.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55℃ ；
②每个样品加入 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ；
③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ；
④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。
步骤 5 ： cRNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ；
②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇， 充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ； ⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ； ⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集cRNA。 (2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng， 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱
5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。
(3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
5 实时定量 RT-PCR
5.1 主要试剂
5.2 实验步骤
实验流程如下， 具体请参见 ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol 说明书。
(1) 反转录反应 ：
①总 RNA 样本 ： 15ul 反转录反应体系需要总 RNA 量为 1-10ng。
②配制反转录反应混合液 7ul， 成分如下， 轻柔充分混匀。
③取总 RNA 样本 5ul， 加入反转录反应混合液 7ul， 轻柔充分混匀 ； 再加入反转录引 物 3ul， 配制成反转录反应体系 15ul， 充分混匀后冰上孵育 5min。
④普通 PCR 仪进行反转录反应， 反应条件如下。
成分 100mM dNTP( 含有 dTTP) MultiScribeTM 逆转录酶， 50U/μL 10× 逆转录缓冲液 RNase 抑制剂， 20U/μL 预混合体积 /15μL 反应 0.15 1.00 1.50 0.1912102329860 A CN 102329870 无核酸酶水 总体积
步骤类型 保持 保持 保持 保持
说明书4.16 7.0011/16 页时间 (min) 30 30 5 ∞温度 (℃ ) 16 42 85 4(2)PCR 扩增反应 ： ①准备 PCR 反应模板， 成分如下。
②准备 96 孔 PCR 反应板， 每例样本重复三次， 充分离心避免气泡产生。 ③ Real-Time PCR 仪进行 PCR 扩增反应， 反应条件如下。
④数据分析 ： 观测扩增曲线图， 设置基线和阈值 ； 以 U6rRNA 为内源性对照， 应用相 对 CT 值的方法计算所检测 microRNA 的相对表达量。
三、 统计分析
通过 Illumina BeadArray Reader 读取芯片结果， 用 Illumina BeadStudio 软件分 析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个 miRNA 检测变异系数 (CV)， 对 CV ＞ 0.8 的 miRNA 进行进一步分析。用 z 值进行标准化。用单因素 COX 回归分析 miRNA 与生存期相
关性。进行 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 修正后， 筛选出 9 个候选 miRNA 进行进 一步分析。对这些 miRNA 进行 pearson 相关和 spearman 相关分析。在所有分析中有显著 相关性的 miRNA 与 KPS 评分， TMZ 治疗和切除程度一起列入 COX 回归方程。所有统计分析应 用 Matlab 2009b， JMP(SAS Institute， Cary， NC) 和 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla， CA) 统计软件
四、 细胞转染， 免疫印记， 荧光素酶报告分析， 共沉淀研究
A1207 细胞系在 10％胎牛血清， 1％ Pen-Strep((Invitrogen， Carlsbad CA)) 培养 基和 5％ CO2 培养箱中孵育。 miR-181d 和对照 miRNA 通过 Hyperfect 转染进细胞 (QIAGEN)， 细胞培养 72 消失。总 RNA 用 QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN) 提取， cDNA 通过 iScript cDNA synthesis kit(Biorad， Hercules， CA) 生成。MGMT 和 ACTB cDNA 水平通过 qRT-PCR 检测。 免疫印记方法的原始抗体为 anti-MGMT(Abcam， ab7045， 1 ∶ 500) 和 α- 微管蛋白 (Sigma Aldrich， T9026， 1 ∶ 3000)。
荧光素酶报告分析
1001bp 的 MGMT 3’ UTR 被扩增并克隆至 pSiCheck-2 双报告载体 (Promega)。然 后将带有 pSi-Check-2-MGMT 3’ UTR 质粒或 Psi-Check2 质粒的 miR-181d 或对照 miRNA 共 转染至 A1207 细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测 miR-181d 是否直接连接 于 MGMT 的 3’ UTR 端， 用 TargetScan4.2 检测 miR-181d 结合位点。鉴定出 2 个位点 ( 第 5-27 核苷酸和第 226-248 核苷酸 )。合成跨第 1-50 和 210-260 核苷酸的合成寡核苷酸 (Integrated DNA Technology， Coralville， Iowa)， 并克隆至 pSiCheck-2 质粒 ( 图 2C， 构 建 3 和 5)。miR-181d 结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆 ( 图 2C， 构建 4 和 6)。所有克隆序列被 DNA 测序验证。
miRNA 共沉淀分析
用 RNAiMax(Invitrogen) 将 40nM 生物素化 miR-181d 和对照 miRNA 转染至 A1207 细胞系。转染 72 小时， 细胞溶解 ( 溶解缓冲液 ： 700ul of 20mM Tris(pH7.5)， 100mM KCl， 5mM MgCl2， 0.3 ％ NonidetP-40， 50U RNAseOUT(Invitrogen)， and 1 ∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche， Madison， WI))， 离心 (10,000xg， 10min)， 留取 10％的溶解产物 待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在 4℃下混合 4 小时。清洗磁珠， 并通过 miRNAeasy kit(QIAGEN) 提取缠绕 mRNA， 称为 “解离” 。总 RNA 用同样方法从溶解产物中提 取。用 MMLV-RT(Epicenter Biotechnology， Madison， WI) 从溶解产物和解离 RNA 中合成 cDNA 和随机引物。随后进行 qRT-PCR。
PCR 引物
用于扩增 1,001bp 的 MGMT 3’ UTR PCR 引物 ：
MGMT 3’ UTR 正向引物 ： ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA ；
MGMT3’ UTR 反向引物 ：
AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC ；
用于 MGMT 和 ACTB 的 qRT PCR 的 PCR 引物 ：
MGMT 正向引物 ： CCTGGCTGAATGCCTATTTC ；
MGMT_R ： GATGAGGATGGGGACAGGATT ；
ACTB 正向引物 ： TGAAGTGTGACGTGGACATC ；ACTB 反向引物 ： GGAGGAAGCAATGATCTTGAT ； 用于荧光素酶报告构建的 PCR 引物 ： MGMT WT1-50 正向引物 ： TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA ； MGMT WT 1-50 反向引物 ： GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC ； MGMT M1-50 正向引物 ： TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA ； ACACTGCA ； MGMT M 1-50 反向引物 ： GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA ； MGMT WT 210-260 正向引物 ： TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT ； MGMT WT 210-260 反向引物 ： GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG ； MGMT M 210-260 正向引物 ：TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT ；
MGMT M 210-260 反向引物 ：
GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。
用于评估 miR-181d 表达的引物 ： Applied Biosystems ： miR-181d(P/N ： 4373180) 和 U6rRNA 内源性对照 (P/N ： 4395470)。
TCGA 数据库分析
胶质母细胞瘤从 TCGA 数据库网站 (http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/) 下载， 全部生物标本标签临床文件下载于 2011 年 2 月 24 日。下载标准化， 下载 Agilent miRNA 芯片数据， miRNA 取平均值。 下载标准化和 Agilent 244K 基因表达芯片数据， 并且基因取平 均值。下载 Illumina GoldenGate DNA 甲基化芯片 OMA-002level 2 数据分析甲基化。用 MGMT_P281_F 探针决定 MGMT 甲基化状态， β 值大于 0.25 被定义为甲基化。为了进行生存 分析， 我们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。 将病人依据 TMZ 治疗分组后， 我们进行了重复性分析。
TCGA miRNA 数据 ： unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0
TCGA Agilent 244K 定制基因表达新品数据 ：
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0
Illumina GoldenGate DNA 甲基化试验 OMA-002 数据 ：
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0验证组分析
我们从哈尔滨医学中心收集了 35 例新诊断的胶质母细胞瘤标本， 标本收集标准 与实验组相同， 用带有比较 Ct 方法的 ABI 7900real-time PCR 系统进行 miR-181d 水平的 qRT-PCR 检测， miR-181d 表达水平通过 Applied Biosystems 检测。为了进行生存分析， 我 们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。
焦磷酸测序
我们从天坛医院收集了 20 例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序， 收集标 准 与 实 验 组 和 验 证 组 相 同。 通 过 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN) 从 冰 冻 组 织 中 提 取 DNA， 用 EpiTect Kit 对 DNA 进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增 MGMT 启动子区， 5’ -GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’ 和 5’ ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’ 。这个区域包含 12 个 CpG 位 点。 PCR 在 40ul 反应柱中进行， PCR 的条件是 ： 95℃ -3min ； 40 个循环 ： 95℃ -15s， 52℃ -30s， 72℃ -30s ； 72℃ -5min(ABI PCR system 9700)。通过 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) 从总 PCR 产物中纯化 DNA。并用 5′ -GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序 ((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。
对 MGMT 启动子区得 12 个 CpG 位点进行焦磷酸测序。12 个 CpG 位点在 PCR 反应中 平均后获得每一个 CpG 位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于 9％被定义为胶质母 细胞瘤标本 MGMT 甲基化。 五 . 结果和分析
1.miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关
为了检测 miRNA 在判断预后和预测治疗效果中的作用， 我们对天坛医院收集的 82 例资料完备的胶质母细胞瘤样本 ( 命名为 “实验组” ) 进行分析， 所有病人均接受放射治疗， 部分病人辅助 TMZ 化疗。该组病人临床基本信息见表 1。miRNA 表达谱数据通过多重比较 修正的 COX 模型进行分析， 通过 pearson 和 spearman 相关方法进一步分析候选 miRNA 与总 生存期的关系。经过三种方法的筛选， miR-936， miR-1238， miR-181d 与总生存期相关。
同时， 手术切除程度 ( 全切除对比次全切除 ) 和病人基本信息 (KPS 评分， 年龄， 性 别 ) 也通过单因素 COX 回归进行分析。结果显示 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与总生存期相 关。我们继续将 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与候选 miRNA 纳入多因素 COX 回归分析， 结果 显示全切除， TMZ 化疗和 miR-181d 仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同， 年龄和 KPS 评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性 偏倚 ( 以高龄患者为主 ) 以及在中国 KPS 评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。
我们继续在 424 例 TCGA 胶质母细胞瘤数据库中验证 miR-181d 与总生存期之间的 关系， 证实 miR-181d 表达高于中位水平的 TCGA 胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位 水平的胶质母细胞瘤病人。(p ＝ 0.018)( 图 1a)。为了进一步证实， 我们又对哈尔滨医科 大学一组 35 例胶母独立样本 ( 命名为 “验证组” ) 进行 qRT-PCR 分析 miR-181d 表达情况， 再一次验证 miR-181d 的表达和本组病人的总生存期呈负相关 (p ＝ 0.001)( 图 1b)
接下来， 我们通过单因素 COX 回归检测 miR-181d 是否是预后或预测治疗反应的生 物标记物， 结果显示， 无论在实验组或 TCGA 数据库 (p 值分别为 0.004 和 0.036) 或两组病 人中接受 TMZ 治疗的病人 (p 值分别为 0.010 和 0.089)， 说明 miR-181d 对 TMZ 化疗有潜在 的预测价值。
2.MGMT 是 miR-181d 的直接靶点
生物信息学分析 MGMT 是 miR-181d 的潜在靶点。考虑到 MGMT 在 TMZ 化疗中的 重要作用， 我们认为 miR-181d 下调 MGMT 的表达， 因此使胶母病人对 TMZ 化疗更敏感。将 miR-181d 质粒转染至 A1207 胶母细胞系会使 MGMT 在表达谱和蛋白水平表达下调。( 图 2a) 我们进一步用 pSiCheck-2 荧光素酶报告分析方法评估 MGMT 是否为 miR-181d 的直接靶 点。与对照 miRNA 相比， miR-181d 使 MGMT3’ UTR 端荧光素酶活性降低约 2 倍， 这种结果并 未在无 3’ UTR 端的结构中发现。我们进一步用 Targetscan 方法确定了 2 个 miR-181d 结 合位点， 并对每一个推测位点在 pSiCheck-2 载体上克隆了 50 个核苷酸 ( 图 2c)。在转染 miR-181d 后， 每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约 2 倍。另外， 该推测位点的突变， 将 使 miR-181d 的结合位点消失。为了显示 miR181d 和 MGMT 的直接关系， 生物素化 miR-181d 和对照 miR181d 被转染进 A1207 细胞系， 同时， mRNA- 生物素化 miRRNA 复合体通过链霉抗 生素蛋白珠解体。与对照 miRNA 相比， miR-181d 解体后， MGMT 表达增加了约 2.5 倍。( 图 2d) 综上， miR-181d 直接影响 MGMT 的转录并下调它的表达。
3.MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关
miR-181d 在转录后调节 MGMT， 我们发现 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈负 相关， 通过分析 223 例 TCGA 数据库病人， 结果显示 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈 负相关， 但非显著相关， 我们知道除了 miR-181d 调解， MGMT 启动子区甲基化会影响 MGMT 转 录水平。因此， 我们用之前公布的标准在 TCGA 数据库中检测 MGMT 启动子区非甲基化的胶 质母细胞瘤标本。在 159 个 MGMT 启动子区非甲基化标本中， MGMT 转录水平与 miR-181d 水 平呈负相关， 我们又在一个 20 例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析 MGMT 启动子区甲基 化， 其中 9 例标本甲基化明显， 所有甲基化肿瘤 MGMTmRNA 表达低或检测不到表达， 其余 11 例标本 MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关。
MGMT 在 预 测 TMZ 化 疗 反 应 方 面 的 重 要 作 用 已 经 广 为 人 知， 我们第一次提出 miR-181d 可以在转录后水平调控 MGMT 的表达， 转染实验， 荧光素酶报告分析， 共沉淀实 验证实 miR-181d 直接作用于 MGMT3’ UTR 端调节 MGMT 转录后水平。胶质母细胞瘤标本 miR-181d 水平与 MGMT 转录水平的负相关也支持了这一假说。 另外， 在三个独立样本库 ( 共 计超过 500 例样本 ) 中， miR-181d 的高表达与预后良好相关。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、 方案和物质， 因为这些 均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的， 而不是 意欲限制本发明的范围， 本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到， 或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所 述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
参考文献 ：
[1]Ludwig JA， Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging， prognosis and treatment selection.Nat Rev Cancer 2005 ； 5： 845-56.
[2]Calin GA， Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nat Rev Cancer 2006 ； 6： 857-66.
[3]Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ；103 ： 2257-61.
[4]Lu J， Getz G， Miska EA， et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 2005 ； 435 ： 834-8.
[5 Lim LP， Lau NC， Garrett-Engele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature 2005 ； 433 ： 769-73.
[6]Blenkiron C ， Miska EA.miRNAs in cancer ： approaches ， aetiology ， diagnostics and therapy.Hum Mol Genet 2007 ； 16Spec No 1 ： R106-13.
[7]Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med 2005 ； 353 ： 1793-801.
[8]Yanaihara N， Caplen N， Bowman E， et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell 2006 ； 9： 189-98.
[9]Bloomston M ， Frankel WL ， Petrocca F ， et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA 2007 ； 297 ： 1901-8.
[10]Jiang J， Gusev Y， Aderca I， et al.Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res 2008 ； 14 ： 419-27.
[11]Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008 ； 299 ： 425-36.
背景技术 神经胶质瘤起源于神经外胚层， 约占成人颅内肿瘤的 40 ～ 50％。胶质母细胞瘤 (GBM) 约占所有胶质瘤临床病例的 50％左右， 是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。 原发性胶质母细胞瘤 (glioblastoma multiforme， GBM) 约占所有胶质母细胞瘤临床病例的 90％以上， 是中枢神经系统恶性度最高的脑肿瘤之一。 胶质母细胞瘤呈侵袭性生长、 手术切 除困难、 复发率和致死率极高， 是当今神经外科领域的国际性难题。针对胶质母细胞瘤， 目 前强调最大程度手术切除、 放射治疗和化学治疗等综合治疗策略， 然而患者生存预后极差， 中位生存期约为 12 ～ 14 个月。大量临床研究表明， 常规病理学诊断相同的胶质母细胞瘤， 对各种治疗的效果及临床预后存在显著差异， 其浸润、 复发、 转移情况也多有不同， 有的患 者仅仅存活数周， 而有的患者却可以存活几年以上。 因此， 年龄等传统临床预后因素的预测 价值极为有限。
现代观点认为， 分子标志物广泛应用于临床可以改善对肿瘤患者的治疗效果 [1]。 近年来， 肿瘤基因组学研究不断进展， 运用基因表达谱芯片等高通量的检测方法已经研究 出大量具有临床价值的肿瘤分子标志物。最新研究证实， 微小 RNA(microRNA， miRNA) 表达 谱芯片在肿瘤分类方面比蛋白编码基因表达谱芯片更加准确和有效 [2-4]。microRNA 作为 肿瘤分子标志物与 mRNA 相比具有更大的优势， 因为对于数量在 40000 以上的人类基因， 从 大约 1000 个人类 microRNA 中寻找可靠标志物将会变得容易的多。而且 microRNA 相对更 加稳定而不易降解， 可以用于长期保存的石蜡包埋标本。因此， 我们从 microRNA 表达谱芯 片中获得的信息将可以作为普通基因表达谱芯片的有益补充。
microRNA 是长度在大约 22nt 左右的单链、 非编码 RNA， 其主要作用在于转录后 水平调控成百上千个基因的表达， 因而具有广泛的生物学功能 [5， 6]。目前研究表明， microRNA 与某些人类肿瘤的临床预后显著相关， 如白血病 [7]、 肺癌 [8]、 胰腺癌 [9]、 肝细 胞癌 [10]、 结肠癌 [11] 以及卵巢癌 [12] 等等。
然而， microRNA 标志物能否预测胶质母细胞瘤患者的临床预后至今未见报道。
一项胶质母细胞瘤治疗重大进展是发现烷化剂替莫唑胺 (TMZ) 联合放疗有益于 患者预后。尽管数据显示只有 10％的病人通过这种治疗方案获得 5 年生存期， 但所有胶质 母细胞瘤患者都需接受这种治疗方案， 因为目前不能预测哪些患者可以从这种治疗方案中 受益。因此， 具有预测作用的生物标记物的发现， 成为了神经肿瘤领域的主要挑战。
现代观点认为， 分子标志物广泛应用于临床可以改善对肿瘤患者的治疗效果 [1]。 近年来， 肿瘤基因组学研究不断进展， 运用基因表达谱芯片等高通量的检测方法已经研究 出大量具有临床价值的肿瘤分子标志物。最新研究证实， 微小 RNA(microRNA， miRNA) 表达 谱芯片在肿瘤分类方面比蛋白编码基因表达谱芯片更加准确和有效 [2-4]。microRNA 作为 肿瘤分子标志物与 mRNA 相比具有更大的优势， 因为对于数量在 40000 以上的人类基因， 从 大约 1000 个人类 microRNA 中寻找可靠标志物将会变得容易的多。而且 microRNA 相对更 加稳定而不易降解， 可以用于长期保存的石蜡包埋标本。因此， 我们从 microRNA 表达谱芯 片中获得的信息将可以作为普通基因表达谱芯片的有益补充。
microRNA 是长度在大约 22nt 左右的单链、 非编码 RNA， 其主要作用在于转录后 水平调控成百上千个基因的表达， 因而具有广泛的生物学功能 [5， 6]。目前研究表明， microRNA 与某些人类肿瘤的临床预后显著相关， 如白血病 [7]、 肺癌 [8]、 胰腺癌 [9]、 肝细 胞癌 [10]、 结肠癌 [11] 以及卵巢癌 [12] 等等。
然而， microRNA 标志物能否预测胶质母细胞瘤患者的临床预后至今未见报道。
一项胶质母细胞瘤治疗重大进展是发现烷化剂替莫唑胺 (TMZ) 联合放疗有益于 患者预后。尽管数据显示只有 10％的病人通过这种治疗方案获得 5 年生存期， 但所有胶质 母细胞瘤患者都需接受这种治疗方案， 因为目前不能预测哪些患者可以从这种治疗方案中 受益。因此， 具有预测作用的生物标记物的发现， 成为了神经肿瘤领域的主要挑战。
发明内容 因此， 本发明涉及胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物的发现， 以及 开发胶质母细胞瘤患者是否需要用替莫唑胺治疗的试剂盒。
在本发明的一个实施方式中公开一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治 疗疗效的试剂盒， 试剂盒包括测定胶质母细胞瘤患者的 miR-181d 水平的试剂盒和任选地 所述试剂盒使用说明书。
在本发明的另一个实施方式中， 所述试剂盒进一步包括从胶质母细胞瘤患者的肿 瘤组织样品中提取 RNA 的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。
在本发明的还另一个实施方式中， 所述试剂盒是 miRNA 表达谱试剂盒 ； 或者所述 试剂盒是 qRT-PCR 试剂盒。
在本发明更另一个实施方式中， 所述测定胶质母细胞瘤患者的 miR-181d 水平与 与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关。
在本发明的一个实施方式中， 公开了一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺 治疗疗效的分子标志物 miR-181d。
本发明在此报道 miR-181d 作为胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物 的发现， 还提供了其在胶质母细胞瘤治疗中的应用。 附图说明 图 1 是 miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关的图 ： (a) 在 TCGA 数据库中 miR-181d 表达水平与患者总生存期呈负相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红 色： 低于平均表达水平 ； (b) 通过 qRT-PCR 评估在 35 个患者的独立验证组中 miR-181d 与总 生存期相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红色 ： 低于平均表达水平 ； (c) 在 TMZ 治疗状况的分 层后， miA-181d 与生存期相关性。
图 2 是 miR-181d 下调 MGMT 表达的图 ： (a) 转染 miR-181d 抑制了 mRNA( 左图 ) 和 A1207 神经胶母细胞瘤细胞系中蛋白 ( 右图 ) 的表达， 对于 qPCR， MGMT mRNA 不是归一化为 β- 肌动蛋白就是归一化为 U6rRNA( 具有相似的结果， 数据没有示出 )， 对于蛋白印迹法， β- 肌动蛋白被用作为加样对照 ； (b)MGMT 3’ UTR 中的 miR-181d 结合位点在 miR-181d 存 在情况下抑制了荧光素酶表达 ； (c)MGMT 3’ UTR 中预测的 miR-181d 结合位点 ； (d)miR-181d 与 MGMT 转录物物理地相互作用， β- 肌动蛋白被用作为被用作为内对照。
图 3 是 miR-181d 水平与 MGMT mRNA 水平呈负相关的图 ： (a) 在具有表征的 MGMT 启动子、 MGMT mRNA 水平和 miR181-d 水平的 223TCGA 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平 之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13) ； (b) 在具有未甲基化的 MGMT 启动子的 159 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13)， MGMT 和 miR-181d 的 相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图 ； (c) 在神经胶母细胞瘤的独立组中 miR-181d 和 MGMT 转录 物水平之间的负相关性 (p ＝ 0.04， R2 ＝ 0.62)。miR-181d 和 MGMT 的表达水平通过 qPCR 进行评估。每一个的相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一 . 患者资料与标本来源
本研究经机构审查委员会批准， 所有病人均签署知情同意书， 所有病人均接受手 术治疗， 并且病理诊断为胶质母细胞瘤。所有病人均接受放疗治疗。但只有部分病人接受TMZ 治疗。患者的特征在以下表中列出。所有样本在切除后 5 分钟内冰冻， 排除肿瘤组织小 于 80％的样本。 切除程度经过 2 名放射科医师术后 72 小时行核磁共振检查， 确定为全切除 (GTR) 级和非全切除 (non-GTR) 级。
表 1 所有入组本研究的 117 例原发性胶质母细胞瘤患者的临床病理学资料
项目 实验组 (n ＝ 82) No.(％ ) 性别 男性 女性 年龄， 岁 均值 ( 标准差 ) 范围 术前 KPS 评分 ≥ 70 ＜ 70 手术切除程度 近全切除 次全切除 替莫唑胺化疗 是 否
29(35.0) 53(65.0) 51(62.0) 31(38.0) 43.1(13.4) 17-70 55(67) 55(67) 27(33) 48.9(12.2) 21-67 25(71.4) 25(71.4) 10(28.6) 54(65.9) 28(34.1) 17(48.6) 18(51.4) 验证组 (n ＝ 35) No.(％ )二 .DNA、 RNA 和 miRNA 表达谱
按照生产厂商说明书从肿瘤组织中提取 RNA， miRNA 表达谱通过 Human v2.0miRNA Expression BeadChip(Illumina， Inc.， San Diego， CA) 检测， 芯片数据依照 MIAME 指南 储存于 GEO 中 ( 序列号 GSE25632)， qRT-PCR 应用 ABI 7900real-time PCR 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 检测。
1. 标本总 RNA 提取
实验流程如下， 具体请参见 mirVana miRNA Isolation kit 说明书。1.1 主要试剂1.2 实验步骤
(1) 所有肿瘤标本在手术后立即置入液氮冷冻保存， 同时进行标本冰冻切片和常 规 HE 染色以判定肿瘤细胞的所占比例， 选择肿瘤细胞占 80％以上的标本进行下一步提取 总 RNA。
(2) 组织研磨 ： 使用 180℃高温处理 6h 的研钵， 加入液氮预冷， 取直径 0.5cm 大小 肿瘤组织迅速研磨至粉末状， 为防止组织融化研磨时需间断加入液氮。
(3) 组 织 裂 解 ： 取 30mg 左 右 研 磨 好 的 组 织 粉 末， 加 入 300ulLysis/Binding Buffer， 充分振荡混匀后置于冰上。
(4) 有机剂萃取 ： 加入 30ul miRNA Homogenate Additive， 充分振荡混匀后置于冰 上 10min ； 加入 350ul 酚氯仿有机剂， 充分振荡混匀 30-60sec ； 10000g 离心 10min 后回收上 层液相约 250ul。
(5) 总 RNA 分离 ： 加入 375ul 室温下无水乙醇， 充分混匀后加入滤柱过滤， 10000g 离心 15sec， 弃去滤液 ； 加入 700ul miRNA Wash Solution 1， 10000g 离心 15sec， 洗脱， 弃去 滤液 ； 加入 500ul Wash Solution 2/3， 10000g 离心 15sec 洗脱， 重复一次， 弃去滤液， 再空 离 60sec ； 更换收集管， 加入 50ul 预热至 95℃的 Elution Solution， 10000g 离心 30sec 洗 脱， 重复一次， 收集洗脱液即组织总 RNA。
(6) 应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 RNA 定量， 并用琼脂糖甲醛变性 凝胶电泳检测 RNA 完整性， 然后将总 RNA 样品贮存于 -80℃。
2.Illumina microRNA 表达谱芯片
2.1 主要试剂
2.2 实验步骤 (1) 在 RNA 样本的 3’ 端加上多聚腺苷酸尾 ( 制作 PAP 板 ) ：①将完整的 RNA 样本用 DEPC 处理过的水标准化至 200ng/μl 的样本体系。
② 96 孔板每孔加 5μl 多聚腺苷酸化反应试剂 PAS， 再每孔加 5μl RNA 样本， 热封 封好充分振荡混匀后快速离心。
③将 96 孔板置于加热仪中 37℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(2)microRNA 的 cDNA 合成 ( 制作 CSP 板 ) ：
①在新 96 孔板中每孔加入 8μl cDNA 合成试剂 CSS。
②从 PAP 板中取 8μl 加过多聚腺苷酸尾的 RNA 加 CSP 板中对应的孔中， 将 CSP 板 封好， 充分振荡混匀， 快速离心。
③将 CSP 板置于加热仪中 42℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(3)cDNA 和 microRNA 特异核苷酸的杂交 ( 制作 ASE 板 ) ：
①在一个新 96 孔板中每孔加 5μl microRNA Assay Pool(MAP) 和 30μlOligo 杂 交 &DNA 结合缓冲液 1(OB1)。
②将 CSP 板中生物素酰化的 cDNA 转移 15μl 到 ASE 板对应孔中。
③将 ASE 板快速离心， 充分振荡混匀后， 在加热仪中温度从 70℃降至 40℃孵育 4h。 (4)microRNA 特殊引物的延伸和连接 ：
①将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体， 留下磁珠。
②每孔加 50μl AM1， 充分振荡后置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
③每孔加缓冲液 50μl UB1， 置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
④每孔加 37μl 延伸结合混合液 MEL， 充分振荡， 加热仪中 45℃孵育 15min。
(5) 延伸产物的扩增 (PCR) ：
①将 64μl DNA 多聚酶加入 SCM 管中， 再加 50μl 尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶 (UDG) 后混合， 在一个新 96 孔板 (PCR 板 ) 每孔中加入 30μl SCM 混合物封好待用。
②将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体， 加入 50μl UB1， 再置于磁板上吸去液体。
③ ASE 板每孔中加入 35μl 接种 PCR 试剂 (IP1)， 充分振荡， 加热仪中 90 ℃孵育 1min 后将板置于磁板上， 吸 30μl 上层液体转移到 PCR 板相应的孔中， 抽吸混匀液体后封 好。④将 PCR 板放入循环变温加热仪中， 运行下例程序 ： 37℃， 10 分钟 ； 95℃， 3 分钟 ； 34 个 以下循环 ： 95℃、 35 秒， 56℃、 35 秒， 和 72℃、 2 分钟 ； 72℃， 10 分钟 ； 4℃， 5 分钟。
(6) 固定 PCR 产物 ：
① PCR 板的每孔中加入 20μl 已混匀的磁性颗粒试剂 (MPB)， 将混合后的 PCR 产物 和磁珠转移至过滤板的对应孔中。
②盖上过滤板盖， 避光放置 60min。
(7) 制作上芯片的过度板 (INT 板 ) ：
①将过滤板接合器放置到 V 型孔底的 96 孔板 ( 废液板 ) 上， 再将含有固定 PCR 产 物的过滤板放到接合器上。
② 25℃ 1000×g 离心 5min 后， 打开盖子， 每孔加 50μl 缓冲液 UB2， 然后封闭盖子 再次离心 5min。
③加 30μl MH1 到过度板 (INT 板 ) 每个孔中， 然后用 INT 板代替废液板， 再加 30μl 0.1N NaOH 到过滤板每孔中。 ④ 25℃ 1000×g 离心 5min， 最后在 INT 板中不会有可见的磁珠。
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
3.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加入 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ； ③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ； ④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。 步骤 5 ： cRNA 纯化 ①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ； ②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇，充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ；
⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集 cRNA。
(2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱 5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。 (3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
4.Illumina mRNA 表达谱芯片
4.1 主要试剂
试剂名称 TaqMan MicroRNA Assays has-miR-181d has-miR-518b has-miR-524-5p has-miR-566 has-miR-1227 U6rRNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4373180 #4373246 #4395174 #4380943 #4409021 #4395470 #4366596 #4324018 ABI ABI 产品编号 生产厂家 ABI10102329860 A CN 102329870 DEPC 处理水
说明书100ml9/16 页 Invitrogen4.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55℃ ；
②每个样品加入 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ；
③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ；
④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。
步骤 5 ： cRNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ；
②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇， 充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ； ⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ； ⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集cRNA。 (2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng， 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱
5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。
(3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
5 实时定量 RT-PCR
5.1 主要试剂
5.2 实验步骤
实验流程如下， 具体请参见 ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol 说明书。
(1) 反转录反应 ：
①总 RNA 样本 ： 15ul 反转录反应体系需要总 RNA 量为 1-10ng。
②配制反转录反应混合液 7ul， 成分如下， 轻柔充分混匀。
③取总 RNA 样本 5ul， 加入反转录反应混合液 7ul， 轻柔充分混匀 ； 再加入反转录引 物 3ul， 配制成反转录反应体系 15ul， 充分混匀后冰上孵育 5min。
④普通 PCR 仪进行反转录反应， 反应条件如下。
成分 100mM dNTP( 含有 dTTP) MultiScribeTM 逆转录酶， 50U/μL 10× 逆转录缓冲液 RNase 抑制剂， 20U/μL 预混合体积 /15μL 反应 0.15 1.00 1.50 0.1912102329860 A CN 102329870 无核酸酶水 总体积
步骤类型 保持 保持 保持 保持
说明书4.16 7.0011/16 页时间 (min) 30 30 5 ∞温度 (℃ ) 16 42 85 4(2)PCR 扩增反应 ： ①准备 PCR 反应模板， 成分如下。
②准备 96 孔 PCR 反应板， 每例样本重复三次， 充分离心避免气泡产生。 ③ Real-Time PCR 仪进行 PCR 扩增反应， 反应条件如下。
④数据分析 ： 观测扩增曲线图， 设置基线和阈值 ； 以 U6rRNA 为内源性对照， 应用相 对 CT 值的方法计算所检测 microRNA 的相对表达量。
三、 统计分析
通过 Illumina BeadArray Reader 读取芯片结果， 用 Illumina BeadStudio 软件分 析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个 miRNA 检测变异系数 (CV)， 对 CV ＞ 0.8 的 miRNA 进行进一步分析。用 z 值进行标准化。用单因素 COX 回归分析 miRNA 与生存期相
关性。进行 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 修正后， 筛选出 9 个候选 miRNA 进行进 一步分析。对这些 miRNA 进行 pearson 相关和 spearman 相关分析。在所有分析中有显著 相关性的 miRNA 与 KPS 评分， TMZ 治疗和切除程度一起列入 COX 回归方程。所有统计分析应 用 Matlab 2009b， JMP(SAS Institute， Cary， NC) 和 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla， CA) 统计软件
四、 细胞转染， 免疫印记， 荧光素酶报告分析， 共沉淀研究
A1207 细胞系在 10％胎牛血清， 1％ Pen-Strep((Invitrogen， Carlsbad CA)) 培养 基和 5％ CO2 培养箱中孵育。 miR-181d 和对照 miRNA 通过 Hyperfect 转染进细胞 (QIAGEN)， 细胞培养 72 消失。总 RNA 用 QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN) 提取， cDNA 通过 iScript cDNA synthesis kit(Biorad， Hercules， CA) 生成。MGMT 和 ACTB cDNA 水平通过 qRT-PCR 检测。 免疫印记方法的原始抗体为 anti-MGMT(Abcam， ab7045， 1 ∶ 500) 和 α- 微管蛋白 (Sigma Aldrich， T9026， 1 ∶ 3000)。
荧光素酶报告分析
1001bp 的 MGMT 3’ UTR 被扩增并克隆至 pSiCheck-2 双报告载体 (Promega)。然 后将带有 pSi-Check-2-MGMT 3’ UTR 质粒或 Psi-Check2 质粒的 miR-181d 或对照 miRNA 共 转染至 A1207 细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测 miR-181d 是否直接连接 于 MGMT 的 3’ UTR 端， 用 TargetScan4.2 检测 miR-181d 结合位点。鉴定出 2 个位点 ( 第 5-27 核苷酸和第 226-248 核苷酸 )。合成跨第 1-50 和 210-260 核苷酸的合成寡核苷酸 (Integrated DNA Technology， Coralville， Iowa)， 并克隆至 pSiCheck-2 质粒 ( 图 2C， 构 建 3 和 5)。miR-181d 结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆 ( 图 2C， 构建 4 和 6)。所有克隆序列被 DNA 测序验证。
miRNA 共沉淀分析
用 RNAiMax(Invitrogen) 将 40nM 生物素化 miR-181d 和对照 miRNA 转染至 A1207 细胞系。转染 72 小时， 细胞溶解 ( 溶解缓冲液 ： 700ul of 20mM Tris(pH7.5)， 100mM KCl， 5mM MgCl2， 0.3 ％ NonidetP-40， 50U RNAseOUT(Invitrogen)， and 1 ∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche， Madison， WI))， 离心 (10,000xg， 10min)， 留取 10％的溶解产物 待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在 4℃下混合 4 小时。清洗磁珠， 并通过 miRNAeasy kit(QIAGEN) 提取缠绕 mRNA， 称为 “解离” 。总 RNA 用同样方法从溶解产物中提 取。用 MMLV-RT(Epicenter Biotechnology， Madison， WI) 从溶解产物和解离 RNA 中合成 cDNA 和随机引物。随后进行 qRT-PCR。
PCR 引物
用于扩增 1,001bp 的 MGMT 3’ UTR PCR 引物 ：
MGMT 3’ UTR 正向引物 ： ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA ；
MGMT3’ UTR 反向引物 ：
AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC ；
用于 MGMT 和 ACTB 的 qRT PCR 的 PCR 引物 ：
MGMT 正向引物 ： CCTGGCTGAATGCCTATTTC ；
MGMT_R ： GATGAGGATGGGGACAGGATT ；
ACTB 正向引物 ： TGAAGTGTGACGTGGACATC ；ACTB 反向引物 ： GGAGGAAGCAATGATCTTGAT ； 用于荧光素酶报告构建的 PCR 引物 ： MGMT WT1-50 正向引物 ： TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA ； MGMT WT 1-50 反向引物 ： GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC ； MGMT M1-50 正向引物 ： TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA ； ACACTGCA ； MGMT M 1-50 反向引物 ： GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA ； MGMT WT 210-260 正向引物 ： TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT ； MGMT WT 210-260 反向引物 ： GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG ； MGMT M 210-260 正向引物 ：TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT ；
MGMT M 210-260 反向引物 ：
GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。
用于评估 miR-181d 表达的引物 ： Applied Biosystems ： miR-181d(P/N ： 4373180) 和 U6rRNA 内源性对照 (P/N ： 4395470)。
TCGA 数据库分析
胶质母细胞瘤从 TCGA 数据库网站 (http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/) 下载， 全部生物标本标签临床文件下载于 2011 年 2 月 24 日。下载标准化， 下载 Agilent miRNA 芯片数据， miRNA 取平均值。 下载标准化和 Agilent 244K 基因表达芯片数据， 并且基因取平 均值。下载 Illumina GoldenGate DNA 甲基化芯片 OMA-002level 2 数据分析甲基化。用 MGMT_P281_F 探针决定 MGMT 甲基化状态， β 值大于 0.25 被定义为甲基化。为了进行生存 分析， 我们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。 将病人依据 TMZ 治疗分组后， 我们进行了重复性分析。
TCGA miRNA 数据 ： unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0
TCGA Agilent 244K 定制基因表达新品数据 ：
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0
Illumina GoldenGate DNA 甲基化试验 OMA-002 数据 ：
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0验证组分析
我们从哈尔滨医学中心收集了 35 例新诊断的胶质母细胞瘤标本， 标本收集标准 与实验组相同， 用带有比较 Ct 方法的 ABI 7900real-time PCR 系统进行 miR-181d 水平的 qRT-PCR 检测， miR-181d 表达水平通过 Applied Biosystems 检测。为了进行生存分析， 我 们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。
焦磷酸测序
我们从天坛医院收集了 20 例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序， 收集标 准 与 实 验 组 和 验 证 组 相 同。 通 过 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN) 从 冰 冻 组 织 中 提 取 DNA， 用 EpiTect Kit 对 DNA 进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增 MGMT 启动子区， 5’ -GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’ 和 5’ ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’ 。这个区域包含 12 个 CpG 位 点。 PCR 在 40ul 反应柱中进行， PCR 的条件是 ： 95℃ -3min ； 40 个循环 ： 95℃ -15s， 52℃ -30s， 72℃ -30s ； 72℃ -5min(ABI PCR system 9700)。通过 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) 从总 PCR 产物中纯化 DNA。并用 5′ -GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序 ((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。
对 MGMT 启动子区得 12 个 CpG 位点进行焦磷酸测序。12 个 CpG 位点在 PCR 反应中 平均后获得每一个 CpG 位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于 9％被定义为胶质母 细胞瘤标本 MGMT 甲基化。 五 . 结果和分析
1.miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关
为了检测 miRNA 在判断预后和预测治疗效果中的作用， 我们对天坛医院收集的 82 例资料完备的胶质母细胞瘤样本 ( 命名为 “实验组” ) 进行分析， 所有病人均接受放射治疗， 部分病人辅助 TMZ 化疗。该组病人临床基本信息见表 1。miRNA 表达谱数据通过多重比较 修正的 COX 模型进行分析， 通过 pearson 和 spearman 相关方法进一步分析候选 miRNA 与总 生存期的关系。经过三种方法的筛选， miR-936， miR-1238， miR-181d 与总生存期相关。
同时， 手术切除程度 ( 全切除对比次全切除 ) 和病人基本信息 (KPS 评分， 年龄， 性 别 ) 也通过单因素 COX 回归进行分析。结果显示 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与总生存期相 关。我们继续将 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与候选 miRNA 纳入多因素 COX 回归分析， 结果 显示全切除， TMZ 化疗和 miR-181d 仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同， 年龄和 KPS 评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性 偏倚 ( 以高龄患者为主 ) 以及在中国 KPS 评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。
我们继续在 424 例 TCGA 胶质母细胞瘤数据库中验证 miR-181d 与总生存期之间的 关系， 证实 miR-181d 表达高于中位水平的 TCGA 胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位 水平的胶质母细胞瘤病人。(p ＝ 0.018)( 图 1a)。为了进一步证实， 我们又对哈尔滨医科 大学一组 35 例胶母独立样本 ( 命名为 “验证组” ) 进行 qRT-PCR 分析 miR-181d 表达情况， 再一次验证 miR-181d 的表达和本组病人的总生存期呈负相关 (p ＝ 0.001)( 图 1b)
接下来， 我们通过单因素 COX 回归检测 miR-181d 是否是预后或预测治疗反应的生 物标记物， 结果显示， 无论在实验组或 TCGA 数据库 (p 值分别为 0.004 和 0.036) 或两组病 人中接受 TMZ 治疗的病人 (p 值分别为 0.010 和 0.089)， 说明 miR-181d 对 TMZ 化疗有潜在 的预测价值。
2.MGMT 是 miR-181d 的直接靶点
生物信息学分析 MGMT 是 miR-181d 的潜在靶点。考虑到 MGMT 在 TMZ 化疗中的 重要作用， 我们认为 miR-181d 下调 MGMT 的表达， 因此使胶母病人对 TMZ 化疗更敏感。将 miR-181d 质粒转染至 A1207 胶母细胞系会使 MGMT 在表达谱和蛋白水平表达下调。( 图 2a) 我们进一步用 pSiCheck-2 荧光素酶报告分析方法评估 MGMT 是否为 miR-181d 的直接靶 点。与对照 miRNA 相比， miR-181d 使 MGMT3’ UTR 端荧光素酶活性降低约 2 倍， 这种结果并 未在无 3’ UTR 端的结构中发现。我们进一步用 Targetscan 方法确定了 2 个 miR-181d 结 合位点， 并对每一个推测位点在 pSiCheck-2 载体上克隆了 50 个核苷酸 ( 图 2c)。在转染 miR-181d 后， 每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约 2 倍。另外， 该推测位点的突变， 将 使 miR-181d 的结合位点消失。为了显示 miR181d 和 MGMT 的直接关系， 生物素化 miR-181d 和对照 miR181d 被转染进 A1207 细胞系， 同时， mRNA- 生物素化 miRRNA 复合体通过链霉抗 生素蛋白珠解体。与对照 miRNA 相比， miR-181d 解体后， MGMT 表达增加了约 2.5 倍。( 图 2d) 综上， miR-181d 直接影响 MGMT 的转录并下调它的表达。
3.MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关
miR-181d 在转录后调节 MGMT， 我们发现 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈负 相关， 通过分析 223 例 TCGA 数据库病人， 结果显示 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈 负相关， 但非显著相关， 我们知道除了 miR-181d 调解， MGMT 启动子区甲基化会影响 MGMT 转 录水平。因此， 我们用之前公布的标准在 TCGA 数据库中检测 MGMT 启动子区非甲基化的胶 质母细胞瘤标本。在 159 个 MGMT 启动子区非甲基化标本中， MGMT 转录水平与 miR-181d 水 平呈负相关， 我们又在一个 20 例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析 MGMT 启动子区甲基 化， 其中 9 例标本甲基化明显， 所有甲基化肿瘤 MGMTmRNA 表达低或检测不到表达， 其余 11 例标本 MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关。
MGMT 在 预 测 TMZ 化 疗 反 应 方 面 的 重 要 作 用 已 经 广 为 人 知， 我们第一次提出 miR-181d 可以在转录后水平调控 MGMT 的表达， 转染实验， 荧光素酶报告分析， 共沉淀实 验证实 miR-181d 直接作用于 MGMT3’ UTR 端调节 MGMT 转录后水平。胶质母细胞瘤标本 miR-181d 水平与 MGMT 转录水平的负相关也支持了这一假说。 另外， 在三个独立样本库 ( 共 计超过 500 例样本 ) 中， miR-181d 的高表达与预后良好相关。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、 方案和物质， 因为这些 均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的， 而不是 意欲限制本发明的范围， 本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到， 或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所 述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
参考文献 ：
[1]Ludwig JA， Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging， prognosis and treatment selection.Nat Rev Cancer 2005 ； 5： 845-56.
[2]Calin GA， Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nat Rev Cancer 2006 ； 6： 857-66.
[3]Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ；103 ： 2257-61.
[4]Lu J， Getz G， Miska EA， et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 2005 ； 435 ： 834-8.
[5 Lim LP， Lau NC， Garrett-Engele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature 2005 ； 433 ： 769-73.
[6]Blenkiron C ， Miska EA.miRNAs in cancer ： approaches ， aetiology ， diagnostics and therapy.Hum Mol Genet 2007 ； 16Spec No 1 ： R106-13.
[7]Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med 2005 ； 353 ： 1793-801.
[8]Yanaihara N， Caplen N， Bowman E， et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell 2006 ； 9： 189-98.
[9]Bloomston M ， Frankel WL ， Petrocca F ， et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA 2007 ； 297 ： 1901-8.
[10]Jiang J， Gusev Y， Aderca I， et al.Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res 2008 ； 14 ： 419-27.
[11]Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008 ； 299 ： 425-36.
[12]Eitan R， Kushnir M， Lithwick-Yanai G， et al.Tumor microRNA expression patterns associated with resistance to platinum based chemotherapy and survival in ovarian cancer patients.Gynecol Oncol 2009 ； 114 ： 253-9.18102329860 A CN 102329870
在本发明的另一个实施方式中， 所述试剂盒进一步包括从胶质母细胞瘤患者的肿 瘤组织样品中提取 RNA 的试剂盒和任选地所述试剂盒使用说明书。
在本发明的还另一个实施方式中， 所述试剂盒是 miRNA 表达谱试剂盒 ； 或者所述 试剂盒是 qRT-PCR 试剂盒。
在本发明更另一个实施方式中， 所述测定胶质母细胞瘤患者的 miR-181d 水平与 与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关。
在本发明的一个实施方式中， 公开了一种用于确定胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺 治疗疗效的分子标志物 miR-181d。
本发明在此报道 miR-181d 作为胶质母细胞瘤患者用替莫唑胺治疗的分子标志物 的发现， 还提供了其在胶质母细胞瘤治疗中的应用。 附图说明 图 1 是 miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关的图 ： (a) 在 TCGA 数据库中 miR-181d 表达水平与患者总生存期呈负相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红 色： 低于平均表达水平 ； (b) 通过 qRT-PCR 评估在 35 个患者的独立验证组中 miR-181d 与总 生存期相关， 蓝色 ： 高于平均表达水平， 红色 ： 低于平均表达水平 ； (c) 在 TMZ 治疗状况的分 层后， miA-181d 与生存期相关性。
图 2 是 miR-181d 下调 MGMT 表达的图 ： (a) 转染 miR-181d 抑制了 mRNA( 左图 ) 和 A1207 神经胶母细胞瘤细胞系中蛋白 ( 右图 ) 的表达， 对于 qPCR， MGMT mRNA 不是归一化为 β- 肌动蛋白就是归一化为 U6rRNA( 具有相似的结果， 数据没有示出 )， 对于蛋白印迹法， β- 肌动蛋白被用作为加样对照 ； (b)MGMT 3’ UTR 中的 miR-181d 结合位点在 miR-181d 存 在情况下抑制了荧光素酶表达 ； (c)MGMT 3’ UTR 中预测的 miR-181d 结合位点 ； (d)miR-181d 与 MGMT 转录物物理地相互作用， β- 肌动蛋白被用作为被用作为内对照。
图 3 是 miR-181d 水平与 MGMT mRNA 水平呈负相关的图 ： (a) 在具有表征的 MGMT 启动子、 MGMT mRNA 水平和 miR181-d 水平的 223TCGA 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平 之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13) ； (b) 在具有未甲基化的 MGMT 启动子的 159 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13)， MGMT 和 miR-181d 的 相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图 ； (c) 在神经胶母细胞瘤的独立组中 miR-181d 和 MGMT 转录 物水平之间的负相关性 (p ＝ 0.04， R2 ＝ 0.62)。miR-181d 和 MGMT 的表达水平通过 qPCR 进行评估。每一个的相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图。
图 2 是 miR-181d 下调 MGMT 表达的图 ： (a) 转染 miR-181d 抑制了 mRNA( 左图 ) 和 A1207 神经胶母细胞瘤细胞系中蛋白 ( 右图 ) 的表达， 对于 qPCR， MGMT mRNA 不是归一化为 β- 肌动蛋白就是归一化为 U6rRNA( 具有相似的结果， 数据没有示出 )， 对于蛋白印迹法， β- 肌动蛋白被用作为加样对照 ； (b)MGMT 3’ UTR 中的 miR-181d 结合位点在 miR-181d 存 在情况下抑制了荧光素酶表达 ； (c)MGMT 3’ UTR 中预测的 miR-181d 结合位点 ； (d)miR-181d 与 MGMT 转录物物理地相互作用， β- 肌动蛋白被用作为被用作为内对照。
图 3 是 miR-181d 水平与 MGMT mRNA 水平呈负相关的图 ： (a) 在具有表征的 MGMT 启动子、 MGMT mRNA 水平和 miR181-d 水平的 223TCGA 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平 之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13) ； (b) 在具有未甲基化的 MGMT 启动子的 159 患者中 miR-181d 和 MGMT 转录物水平之间的相关性 (p ＝ 0.004， R2 ＝ 0.13)， MGMT 和 miR-181d 的 相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图 ； (c) 在神经胶母细胞瘤的独立组中 miR-181d 和 MGMT 转录 物水平之间的负相关性 (p ＝ 0.04， R2 ＝ 0.62)。miR-181d 和 MGMT 的表达水平通过 qPCR 进行评估。每一个的相对丰度在 x- 和 y- 轴上作图。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
一 . 患者资料与标本来源
本研究经机构审查委员会批准， 所有病人均签署知情同意书， 所有病人均接受手 术治疗， 并且病理诊断为胶质母细胞瘤。所有病人均接受放疗治疗。但只有部分病人接受TMZ 治疗。患者的特征在以下表中列出。所有样本在切除后 5 分钟内冰冻， 排除肿瘤组织小 于 80％的样本。 切除程度经过 2 名放射科医师术后 72 小时行核磁共振检查， 确定为全切除 (GTR) 级和非全切除 (non-GTR) 级。
表 1 所有入组本研究的 117 例原发性胶质母细胞瘤患者的临床病理学资料
项目 实验组 (n ＝ 82) No.(％ ) 性别 男性 女性 年龄， 岁 均值 ( 标准差 ) 范围 术前 KPS 评分 ≥ 70 ＜ 70 手术切除程度 近全切除 次全切除 替莫唑胺化疗 是 否
29(35.0) 53(65.0) 51(62.0) 31(38.0) 43.1(13.4) 17-70 55(67) 55(67) 27(33) 48.9(12.2) 21-67 25(71.4) 25(71.4) 10(28.6) 54(65.9) 28(34.1) 17(48.6) 18(51.4) 验证组 (n ＝ 35) No.(％ )二 .DNA、 RNA 和 miRNA 表达谱
按照生产厂商说明书从肿瘤组织中提取 RNA， miRNA 表达谱通过 Human v2.0miRNA Expression BeadChip(Illumina， Inc.， San Diego， CA) 检测， 芯片数据依照 MIAME 指南 储存于 GEO 中 ( 序列号 GSE25632)， qRT-PCR 应用 ABI 7900real-time PCR 系统 (Applied Biosystems， Foster City， CA) 检测。
1. 标本总 RNA 提取
实验流程如下， 具体请参见 mirVana miRNA Isolation kit 说明书。1.1 主要试剂1.2 实验步骤
(1) 所有肿瘤标本在手术后立即置入液氮冷冻保存， 同时进行标本冰冻切片和常 规 HE 染色以判定肿瘤细胞的所占比例， 选择肿瘤细胞占 80％以上的标本进行下一步提取 总 RNA。
(2) 组织研磨 ： 使用 180℃高温处理 6h 的研钵， 加入液氮预冷， 取直径 0.5cm 大小 肿瘤组织迅速研磨至粉末状， 为防止组织融化研磨时需间断加入液氮。
(3) 组 织 裂 解 ： 取 30mg 左 右 研 磨 好 的 组 织 粉 末， 加 入 300ulLysis/Binding Buffer， 充分振荡混匀后置于冰上。
(4) 有机剂萃取 ： 加入 30ul miRNA Homogenate Additive， 充分振荡混匀后置于冰 上 10min ； 加入 350ul 酚氯仿有机剂， 充分振荡混匀 30-60sec ； 10000g 离心 10min 后回收上 层液相约 250ul。
(5) 总 RNA 分离 ： 加入 375ul 室温下无水乙醇， 充分混匀后加入滤柱过滤， 10000g 离心 15sec， 弃去滤液 ； 加入 700ul miRNA Wash Solution 1， 10000g 离心 15sec， 洗脱， 弃去 滤液 ； 加入 500ul Wash Solution 2/3， 10000g 离心 15sec 洗脱， 重复一次， 弃去滤液， 再空 离 60sec ； 更换收集管， 加入 50ul 预热至 95℃的 Elution Solution， 10000g 离心 30sec 洗 脱， 重复一次， 收集洗脱液即组织总 RNA。
(6) 应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 RNA 定量， 并用琼脂糖甲醛变性 凝胶电泳检测 RNA 完整性， 然后将总 RNA 样品贮存于 -80℃。
2.Illumina microRNA 表达谱芯片
2.1 主要试剂
2.2 实验步骤 (1) 在 RNA 样本的 3’ 端加上多聚腺苷酸尾 ( 制作 PAP 板 ) ：①将完整的 RNA 样本用 DEPC 处理过的水标准化至 200ng/μl 的样本体系。
② 96 孔板每孔加 5μl 多聚腺苷酸化反应试剂 PAS， 再每孔加 5μl RNA 样本， 热封 封好充分振荡混匀后快速离心。
③将 96 孔板置于加热仪中 37℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(2)microRNA 的 cDNA 合成 ( 制作 CSP 板 ) ：
①在新 96 孔板中每孔加入 8μl cDNA 合成试剂 CSS。
②从 PAP 板中取 8μl 加过多聚腺苷酸尾的 RNA 加 CSP 板中对应的孔中， 将 CSP 板 封好， 充分振荡混匀， 快速离心。
③将 CSP 板置于加热仪中 42℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(3)cDNA 和 microRNA 特异核苷酸的杂交 ( 制作 ASE 板 ) ：
①在一个新 96 孔板中每孔加 5μl microRNA Assay Pool(MAP) 和 30μlOligo 杂 交 &DNA 结合缓冲液 1(OB1)。
②将 CSP 板中生物素酰化的 cDNA 转移 15μl 到 ASE 板对应孔中。
③将 ASE 板快速离心， 充分振荡混匀后， 在加热仪中温度从 70℃降至 40℃孵育 4h。 (4)microRNA 特殊引物的延伸和连接 ：
①将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体， 留下磁珠。
②每孔加 50μl AM1， 充分振荡后置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
③每孔加缓冲液 50μl UB1， 置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
④每孔加 37μl 延伸结合混合液 MEL， 充分振荡， 加热仪中 45℃孵育 15min。
(5) 延伸产物的扩增 (PCR) ：
①将 64μl DNA 多聚酶加入 SCM 管中， 再加 50μl 尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶 (UDG) 后混合， 在一个新 96 孔板 (PCR 板 ) 每孔中加入 30μl SCM 混合物封好待用。
②将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体， 加入 50μl UB1， 再置于磁板上吸去液体。
③ ASE 板每孔中加入 35μl 接种 PCR 试剂 (IP1)， 充分振荡， 加热仪中 90 ℃孵育 1min 后将板置于磁板上， 吸 30μl 上层液体转移到 PCR 板相应的孔中， 抽吸混匀液体后封 好。④将 PCR 板放入循环变温加热仪中， 运行下例程序 ： 37℃， 10 分钟 ； 95℃， 3 分钟 ； 34 个 以下循环 ： 95℃、 35 秒， 56℃、 35 秒， 和 72℃、 2 分钟 ； 72℃， 10 分钟 ； 4℃， 5 分钟。
(6) 固定 PCR 产物 ：
① PCR 板的每孔中加入 20μl 已混匀的磁性颗粒试剂 (MPB)， 将混合后的 PCR 产物 和磁珠转移至过滤板的对应孔中。
②盖上过滤板盖， 避光放置 60min。
(7) 制作上芯片的过度板 (INT 板 ) ：
①将过滤板接合器放置到 V 型孔底的 96 孔板 ( 废液板 ) 上， 再将含有固定 PCR 产 物的过滤板放到接合器上。
② 25℃ 1000×g 离心 5min 后， 打开盖子， 每孔加 50μl 缓冲液 UB2， 然后封闭盖子 再次离心 5min。
③加 30μl MH1 到过度板 (INT 板 ) 每个孔中， 然后用 INT 板代替废液板， 再加 30μl 0.1N NaOH 到过滤板每孔中。 ④ 25℃ 1000×g 离心 5min， 最后在 INT 板中不会有可见的磁珠。
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
3.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加入 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ； ③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ； ④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。 步骤 5 ： cRNA 纯化 ①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ； ②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇，充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ；
⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集 cRNA。
(2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱 5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。 (3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
4.Illumina mRNA 表达谱芯片
4.1 主要试剂
试剂名称 TaqMan MicroRNA Assays has-miR-181d has-miR-518b has-miR-524-5p has-miR-566 has-miR-1227 U6rRNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4373180 #4373246 #4395174 #4380943 #4409021 #4395470 #4366596 #4324018 ABI ABI 产品编号 生产厂家 ABI10102329860 A CN 102329870 DEPC 处理水
说明书100ml9/16 页 Invitrogen4.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55℃ ；
②每个样品加入 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ；
③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ；
④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。
步骤 5 ： cRNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ；
②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇， 充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ； ⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ； ⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集cRNA。 (2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng， 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱
5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。
(3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
5 实时定量 RT-PCR
5.1 主要试剂
5.2 实验步骤
实验流程如下， 具体请参见 ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol 说明书。
(1) 反转录反应 ：
①总 RNA 样本 ： 15ul 反转录反应体系需要总 RNA 量为 1-10ng。
②配制反转录反应混合液 7ul， 成分如下， 轻柔充分混匀。
③取总 RNA 样本 5ul， 加入反转录反应混合液 7ul， 轻柔充分混匀 ； 再加入反转录引 物 3ul， 配制成反转录反应体系 15ul， 充分混匀后冰上孵育 5min。
④普通 PCR 仪进行反转录反应， 反应条件如下。
成分 100mM dNTP( 含有 dTTP) MultiScribeTM 逆转录酶， 50U/μL 10× 逆转录缓冲液 RNase 抑制剂， 20U/μL 预混合体积 /15μL 反应 0.15 1.00 1.50 0.1912102329860 A CN 102329870 无核酸酶水 总体积
步骤类型 保持 保持 保持 保持
说明书4.16 7.0011/16 页时间 (min) 30 30 5 ∞温度 (℃ ) 16 42 85 4(2)PCR 扩增反应 ： ①准备 PCR 反应模板， 成分如下。
②准备 96 孔 PCR 反应板， 每例样本重复三次， 充分离心避免气泡产生。 ③ Real-Time PCR 仪进行 PCR 扩增反应， 反应条件如下。
④数据分析 ： 观测扩增曲线图， 设置基线和阈值 ； 以 U6rRNA 为内源性对照， 应用相 对 CT 值的方法计算所检测 microRNA 的相对表达量。
三、 统计分析
通过 Illumina BeadArray Reader 读取芯片结果， 用 Illumina BeadStudio 软件分 析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个 miRNA 检测变异系数 (CV)， 对 CV ＞ 0.8 的 miRNA 进行进一步分析。用 z 值进行标准化。用单因素 COX 回归分析 miRNA 与生存期相
关性。进行 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 修正后， 筛选出 9 个候选 miRNA 进行进 一步分析。对这些 miRNA 进行 pearson 相关和 spearman 相关分析。在所有分析中有显著 相关性的 miRNA 与 KPS 评分， TMZ 治疗和切除程度一起列入 COX 回归方程。所有统计分析应 用 Matlab 2009b， JMP(SAS Institute， Cary， NC) 和 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla， CA) 统计软件
四、 细胞转染， 免疫印记， 荧光素酶报告分析， 共沉淀研究
A1207 细胞系在 10％胎牛血清， 1％ Pen-Strep((Invitrogen， Carlsbad CA)) 培养 基和 5％ CO2 培养箱中孵育。 miR-181d 和对照 miRNA 通过 Hyperfect 转染进细胞 (QIAGEN)， 细胞培养 72 消失。总 RNA 用 QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN) 提取， cDNA 通过 iScript cDNA synthesis kit(Biorad， Hercules， CA) 生成。MGMT 和 ACTB cDNA 水平通过 qRT-PCR 检测。 免疫印记方法的原始抗体为 anti-MGMT(Abcam， ab7045， 1 ∶ 500) 和 α- 微管蛋白 (Sigma Aldrich， T9026， 1 ∶ 3000)。
荧光素酶报告分析
1001bp 的 MGMT 3’ UTR 被扩增并克隆至 pSiCheck-2 双报告载体 (Promega)。然 后将带有 pSi-Check-2-MGMT 3’ UTR 质粒或 Psi-Check2 质粒的 miR-181d 或对照 miRNA 共 转染至 A1207 细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测 miR-181d 是否直接连接 于 MGMT 的 3’ UTR 端， 用 TargetScan4.2 检测 miR-181d 结合位点。鉴定出 2 个位点 ( 第 5-27 核苷酸和第 226-248 核苷酸 )。合成跨第 1-50 和 210-260 核苷酸的合成寡核苷酸 (Integrated DNA Technology， Coralville， Iowa)， 并克隆至 pSiCheck-2 质粒 ( 图 2C， 构 建 3 和 5)。miR-181d 结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆 ( 图 2C， 构建 4 和 6)。所有克隆序列被 DNA 测序验证。
miRNA 共沉淀分析
用 RNAiMax(Invitrogen) 将 40nM 生物素化 miR-181d 和对照 miRNA 转染至 A1207 细胞系。转染 72 小时， 细胞溶解 ( 溶解缓冲液 ： 700ul of 20mM Tris(pH7.5)， 100mM KCl， 5mM MgCl2， 0.3 ％ NonidetP-40， 50U RNAseOUT(Invitrogen)， and 1 ∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche， Madison， WI))， 离心 (10,000xg， 10min)， 留取 10％的溶解产物 待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在 4℃下混合 4 小时。清洗磁珠， 并通过 miRNAeasy kit(QIAGEN) 提取缠绕 mRNA， 称为 “解离” 。总 RNA 用同样方法从溶解产物中提 取。用 MMLV-RT(Epicenter Biotechnology， Madison， WI) 从溶解产物和解离 RNA 中合成 cDNA 和随机引物。随后进行 qRT-PCR。
PCR 引物
用于扩增 1,001bp 的 MGMT 3’ UTR PCR 引物 ：
MGMT 3’ UTR 正向引物 ： ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA ；
MGMT3’ UTR 反向引物 ：
AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC ；
用于 MGMT 和 ACTB 的 qRT PCR 的 PCR 引物 ：
MGMT 正向引物 ： CCTGGCTGAATGCCTATTTC ；
MGMT_R ： GATGAGGATGGGGACAGGATT ；
ACTB 正向引物 ： TGAAGTGTGACGTGGACATC ；ACTB 反向引物 ： GGAGGAAGCAATGATCTTGAT ； 用于荧光素酶报告构建的 PCR 引物 ： MGMT WT1-50 正向引物 ： TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA ； MGMT WT 1-50 反向引物 ： GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC ； MGMT M1-50 正向引物 ： TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA ； ACACTGCA ； MGMT M 1-50 反向引物 ： GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA ； MGMT WT 210-260 正向引物 ： TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT ； MGMT WT 210-260 反向引物 ： GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG ； MGMT M 210-260 正向引物 ：TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT ；
MGMT M 210-260 反向引物 ：
GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。
用于评估 miR-181d 表达的引物 ： Applied Biosystems ： miR-181d(P/N ： 4373180) 和 U6rRNA 内源性对照 (P/N ： 4395470)。
TCGA 数据库分析
胶质母细胞瘤从 TCGA 数据库网站 (http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/) 下载， 全部生物标本标签临床文件下载于 2011 年 2 月 24 日。下载标准化， 下载 Agilent miRNA 芯片数据， miRNA 取平均值。 下载标准化和 Agilent 244K 基因表达芯片数据， 并且基因取平 均值。下载 Illumina GoldenGate DNA 甲基化芯片 OMA-002level 2 数据分析甲基化。用 MGMT_P281_F 探针决定 MGMT 甲基化状态， β 值大于 0.25 被定义为甲基化。为了进行生存 分析， 我们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。 将病人依据 TMZ 治疗分组后， 我们进行了重复性分析。
TCGA miRNA 数据 ： unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0
TCGA Agilent 244K 定制基因表达新品数据 ：
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0
Illumina GoldenGate DNA 甲基化试验 OMA-002 数据 ：
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0验证组分析
我们从哈尔滨医学中心收集了 35 例新诊断的胶质母细胞瘤标本， 标本收集标准 与实验组相同， 用带有比较 Ct 方法的 ABI 7900real-time PCR 系统进行 miR-181d 水平的 qRT-PCR 检测， miR-181d 表达水平通过 Applied Biosystems 检测。为了进行生存分析， 我 们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。
焦磷酸测序
我们从天坛医院收集了 20 例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序， 收集标 准 与 实 验 组 和 验 证 组 相 同。 通 过 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN) 从 冰 冻 组 织 中 提 取 DNA， 用 EpiTect Kit 对 DNA 进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增 MGMT 启动子区， 5’ -GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’ 和 5’ ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’ 。这个区域包含 12 个 CpG 位 点。 PCR 在 40ul 反应柱中进行， PCR 的条件是 ： 95℃ -3min ； 40 个循环 ： 95℃ -15s， 52℃ -30s， 72℃ -30s ； 72℃ -5min(ABI PCR system 9700)。通过 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) 从总 PCR 产物中纯化 DNA。并用 5′ -GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序 ((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。
对 MGMT 启动子区得 12 个 CpG 位点进行焦磷酸测序。12 个 CpG 位点在 PCR 反应中 平均后获得每一个 CpG 位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于 9％被定义为胶质母 细胞瘤标本 MGMT 甲基化。 五 . 结果和分析
1.miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关
为了检测 miRNA 在判断预后和预测治疗效果中的作用， 我们对天坛医院收集的 82 例资料完备的胶质母细胞瘤样本 ( 命名为 “实验组” ) 进行分析， 所有病人均接受放射治疗， 部分病人辅助 TMZ 化疗。该组病人临床基本信息见表 1。miRNA 表达谱数据通过多重比较 修正的 COX 模型进行分析， 通过 pearson 和 spearman 相关方法进一步分析候选 miRNA 与总 生存期的关系。经过三种方法的筛选， miR-936， miR-1238， miR-181d 与总生存期相关。
同时， 手术切除程度 ( 全切除对比次全切除 ) 和病人基本信息 (KPS 评分， 年龄， 性 别 ) 也通过单因素 COX 回归进行分析。结果显示 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与总生存期相 关。我们继续将 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与候选 miRNA 纳入多因素 COX 回归分析， 结果 显示全切除， TMZ 化疗和 miR-181d 仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同， 年龄和 KPS 评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性 偏倚 ( 以高龄患者为主 ) 以及在中国 KPS 评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。
我们继续在 424 例 TCGA 胶质母细胞瘤数据库中验证 miR-181d 与总生存期之间的 关系， 证实 miR-181d 表达高于中位水平的 TCGA 胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位 水平的胶质母细胞瘤病人。(p ＝ 0.018)( 图 1a)。为了进一步证实， 我们又对哈尔滨医科 大学一组 35 例胶母独立样本 ( 命名为 “验证组” ) 进行 qRT-PCR 分析 miR-181d 表达情况， 再一次验证 miR-181d 的表达和本组病人的总生存期呈负相关 (p ＝ 0.001)( 图 1b)
接下来， 我们通过单因素 COX 回归检测 miR-181d 是否是预后或预测治疗反应的生 物标记物， 结果显示， 无论在实验组或 TCGA 数据库 (p 值分别为 0.004 和 0.036) 或两组病 人中接受 TMZ 治疗的病人 (p 值分别为 0.010 和 0.089)， 说明 miR-181d 对 TMZ 化疗有潜在 的预测价值。
2.MGMT 是 miR-181d 的直接靶点
生物信息学分析 MGMT 是 miR-181d 的潜在靶点。考虑到 MGMT 在 TMZ 化疗中的 重要作用， 我们认为 miR-181d 下调 MGMT 的表达， 因此使胶母病人对 TMZ 化疗更敏感。将 miR-181d 质粒转染至 A1207 胶母细胞系会使 MGMT 在表达谱和蛋白水平表达下调。( 图 2a) 我们进一步用 pSiCheck-2 荧光素酶报告分析方法评估 MGMT 是否为 miR-181d 的直接靶 点。与对照 miRNA 相比， miR-181d 使 MGMT3’ UTR 端荧光素酶活性降低约 2 倍， 这种结果并 未在无 3’ UTR 端的结构中发现。我们进一步用 Targetscan 方法确定了 2 个 miR-181d 结 合位点， 并对每一个推测位点在 pSiCheck-2 载体上克隆了 50 个核苷酸 ( 图 2c)。在转染 miR-181d 后， 每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约 2 倍。另外， 该推测位点的突变， 将 使 miR-181d 的结合位点消失。为了显示 miR181d 和 MGMT 的直接关系， 生物素化 miR-181d 和对照 miR181d 被转染进 A1207 细胞系， 同时， mRNA- 生物素化 miRRNA 复合体通过链霉抗 生素蛋白珠解体。与对照 miRNA 相比， miR-181d 解体后， MGMT 表达增加了约 2.5 倍。( 图 2d) 综上， miR-181d 直接影响 MGMT 的转录并下调它的表达。
3.MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关
miR-181d 在转录后调节 MGMT， 我们发现 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈负 相关， 通过分析 223 例 TCGA 数据库病人， 结果显示 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈 负相关， 但非显著相关， 我们知道除了 miR-181d 调解， MGMT 启动子区甲基化会影响 MGMT 转 录水平。因此， 我们用之前公布的标准在 TCGA 数据库中检测 MGMT 启动子区非甲基化的胶 质母细胞瘤标本。在 159 个 MGMT 启动子区非甲基化标本中， MGMT 转录水平与 miR-181d 水 平呈负相关， 我们又在一个 20 例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析 MGMT 启动子区甲基 化， 其中 9 例标本甲基化明显， 所有甲基化肿瘤 MGMTmRNA 表达低或检测不到表达， 其余 11 例标本 MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关。
MGMT 在 预 测 TMZ 化 疗 反 应 方 面 的 重 要 作 用 已 经 广 为 人 知， 我们第一次提出 miR-181d 可以在转录后水平调控 MGMT 的表达， 转染实验， 荧光素酶报告分析， 共沉淀实 验证实 miR-181d 直接作用于 MGMT3’ UTR 端调节 MGMT 转录后水平。胶质母细胞瘤标本 miR-181d 水平与 MGMT 转录水平的负相关也支持了这一假说。 另外， 在三个独立样本库 ( 共 计超过 500 例样本 ) 中， miR-181d 的高表达与预后良好相关。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、 方案和物质， 因为这些 均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的， 而不是 意欲限制本发明的范围， 本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到， 或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所 述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
参考文献 ：
[1]Ludwig JA， Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging， prognosis and treatment selection.Nat Rev Cancer 2005 ； 5： 845-56.
[2]Calin GA， Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nat Rev Cancer 2006 ； 6： 857-66.
[3]Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ；103 ： 2257-61.
[4]Lu J， Getz G， Miska EA， et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 2005 ； 435 ： 834-8.
[5 Lim LP， Lau NC， Garrett-Engele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature 2005 ； 433 ： 769-73.
[6]Blenkiron C ， Miska EA.miRNAs in cancer ： approaches ， aetiology ， diagnostics and therapy.Hum Mol Genet 2007 ； 16Spec No 1 ： R106-13.
[7]Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med 2005 ； 353 ： 1793-801.
[8]Yanaihara N， Caplen N， Bowman E， et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell 2006 ； 9： 189-98.
[9]Bloomston M ， Frankel WL ， Petrocca F ， et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA 2007 ； 297 ： 1901-8.
[10]Jiang J， Gusev Y， Aderca I， et al.Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res 2008 ； 14 ： 419-27.
[11]Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008 ； 299 ： 425-36.
[12]Eitan R， Kushnir M， Lithwick-Yanai G， et al.Tumor microRNA expression patterns associated with resistance to platinum based chemotherapy and survival in ovarian cancer patients.Gynecol Oncol 2009 ； 114 ： 253-9.18102329860 A CN 102329870
(1) 所有肿瘤标本在手术后立即置入液氮冷冻保存， 同时进行标本冰冻切片和常 规 HE 染色以判定肿瘤细胞的所占比例， 选择肿瘤细胞占 80％以上的标本进行下一步提取 总 RNA。
(2) 组织研磨 ： 使用 180℃高温处理 6h 的研钵， 加入液氮预冷， 取直径 0.5cm 大小 肿瘤组织迅速研磨至粉末状， 为防止组织融化研磨时需间断加入液氮。
(3) 组 织 裂 解 ： 取 30mg 左 右 研 磨 好 的 组 织 粉 末， 加 入 300ulLysis/Binding Buffer， 充分振荡混匀后置于冰上。
(4) 有机剂萃取 ： 加入 30ul miRNA Homogenate Additive， 充分振荡混匀后置于冰 上 10min ； 加入 350ul 酚氯仿有机剂， 充分振荡混匀 30-60sec ； 10000g 离心 10min 后回收上 层液相约 250ul。
(5) 总 RNA 分离 ： 加入 375ul 室温下无水乙醇， 充分混匀后加入滤柱过滤， 10000g 离心 15sec， 弃去滤液 ； 加入 700ul miRNA Wash Solution 1， 10000g 离心 15sec， 洗脱， 弃去 滤液 ； 加入 500ul Wash Solution 2/3， 10000g 离心 15sec 洗脱， 重复一次， 弃去滤液， 再空 离 60sec ； 更换收集管， 加入 50ul 预热至 95℃的 Elution Solution， 10000g 离心 30sec 洗 脱， 重复一次， 收集洗脱液即组织总 RNA。
(6) 应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 RNA 定量， 并用琼脂糖甲醛变性 凝胶电泳检测 RNA 完整性， 然后将总 RNA 样品贮存于 -80℃。
2.Illumina microRNA 表达谱芯片
2.1 主要试剂
(5) 总 RNA 分离 ： 加入 375ul 室温下无水乙醇， 充分混匀后加入滤柱过滤， 10000g 离心 15sec， 弃去滤液 ； 加入 700ul miRNA Wash Solution 1， 10000g 离心 15sec， 洗脱， 弃去 滤液 ； 加入 500ul Wash Solution 2/3， 10000g 离心 15sec 洗脱， 重复一次， 弃去滤液， 再空 离 60sec ； 更换收集管， 加入 50ul 预热至 95℃的 Elution Solution， 10000g 离心 30sec 洗 脱， 重复一次， 收集洗脱液即组织总 RNA。
(6) 应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 RNA 定量， 并用琼脂糖甲醛变性 凝胶电泳检测 RNA 完整性， 然后将总 RNA 样品贮存于 -80℃。
2.Illumina microRNA 表达谱芯片
2.1 主要试剂
2.2 实验步骤 (1) 在 RNA 样本的 3’ 端加上多聚腺苷酸尾 ( 制作 PAP 板 ) ：①将完整的 RNA 样本用 DEPC 处理过的水标准化至 200ng/μl 的样本体系。
② 96 孔板每孔加 5μl 多聚腺苷酸化反应试剂 PAS， 再每孔加 5μl RNA 样本， 热封 封好充分振荡混匀后快速离心。
③将 96 孔板置于加热仪中 37℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(2)microRNA 的 cDNA 合成 ( 制作 CSP 板 ) ：
①在新 96 孔板中每孔加入 8μl cDNA 合成试剂 CSS。
②从 PAP 板中取 8μl 加过多聚腺苷酸尾的 RNA 加 CSP 板中对应的孔中， 将 CSP 板 封好， 充分振荡混匀， 快速离心。
③将 CSP 板置于加热仪中 42℃孵育 60min， 再 70℃孵育 10min。
(3)cDNA 和 microRNA 特异核苷酸的杂交 ( 制作 ASE 板 ) ：
①在一个新 96 孔板中每孔加 5μl microRNA Assay Pool(MAP) 和 30μlOligo 杂 交 &DNA 结合缓冲液 1(OB1)。
②将 CSP 板中生物素酰化的 cDNA 转移 15μl 到 ASE 板对应孔中。
③将 ASE 板快速离心， 充分振荡混匀后， 在加热仪中温度从 70℃降至 40℃孵育 4h。 (4)microRNA 特殊引物的延伸和连接 ：
①将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体， 留下磁珠。
②每孔加 50μl AM1， 充分振荡后置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
③每孔加缓冲液 50μl UB1， 置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
④每孔加 37μl 延伸结合混合液 MEL， 充分振荡， 加热仪中 45℃孵育 15min。
(5) 延伸产物的扩增 (PCR) ：
①将 64μl DNA 多聚酶加入 SCM 管中， 再加 50μl 尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶 (UDG) 后混合， 在一个新 96 孔板 (PCR 板 ) 每孔中加入 30μl SCM 混合物封好待用。
②将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体， 加入 50μl UB1， 再置于磁板上吸去液体。
①将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有磁珠都被吸附后吸取孔中液体， 留下磁珠。
②每孔加 50μl AM1， 充分振荡后置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
③每孔加缓冲液 50μl UB1， 置板于磁板并吸取液体， 重复此步骤。
④每孔加 37μl 延伸结合混合液 MEL， 充分振荡， 加热仪中 45℃孵育 15min。
(5) 延伸产物的扩增 (PCR) ：
①将 64μl DNA 多聚酶加入 SCM 管中， 再加 50μl 尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶 (UDG) 后混合， 在一个新 96 孔板 (PCR 板 ) 每孔中加入 30μl SCM 混合物封好待用。
②将 ASE 板置于磁板上 2min， 直至所有的磁珠都被吸附后吸去液体， 加入 50μl UB1， 再置于磁板上吸去液体。
③ ASE 板每孔中加入 35μl 接种 PCR 试剂 (IP1)， 充分振荡， 加热仪中 90 ℃孵育 1min 后将板置于磁板上， 吸 30μl 上层液体转移到 PCR 板相应的孔中， 抽吸混匀液体后封 好。④将 PCR 板放入循环变温加热仪中， 运行下例程序 ： 37℃， 10 分钟 ； 95℃， 3 分钟 ； 34 个 以下循环 ： 95℃、 35 秒， 56℃、 35 秒， 和 72℃、 2 分钟 ； 72℃， 10 分钟 ； 4℃， 5 分钟。
(6) 固定 PCR 产物 ：
① PCR 板的每孔中加入 20μl 已混匀的磁性颗粒试剂 (MPB)， 将混合后的 PCR 产物 和磁珠转移至过滤板的对应孔中。
②盖上过滤板盖， 避光放置 60min。
(7) 制作上芯片的过度板 (INT 板 ) ：
①将过滤板接合器放置到 V 型孔底的 96 孔板 ( 废液板 ) 上， 再将含有固定 PCR 产 物的过滤板放到接合器上。
② 25℃ 1000×g 离心 5min 后， 打开盖子， 每孔加 50μl 缓冲液 UB2， 然后封闭盖子 再次离心 5min。
③加 30μl MH1 到过度板 (INT 板 ) 每个孔中， 然后用 INT 板代替废液板， 再加 30μl 0.1N NaOH 到过滤板每孔中。 ④ 25℃ 1000×g 离心 5min， 最后在 INT 板中不会有可见的磁珠。
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
3.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加入 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ； ③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ； ④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。 步骤 5 ： cRNA 纯化 ①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ； ②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇，充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ；
⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集 cRNA。
(2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱 5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。 (3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
4.Illumina mRNA 表达谱芯片
4.1 主要试剂
试剂名称 TaqMan MicroRNA Assays has-miR-181d has-miR-518b has-miR-524-5p has-miR-566 has-miR-1227 U6rRNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4373180 #4373246 #4395174 #4380943 #4409021 #4395470 #4366596 #4324018 ABI ABI 产品编号 生产厂家 ABI10102329860 A CN 102329870 DEPC 处理水
说明书100ml9/16 页 Invitrogen4.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55℃ ；
②每个样品加入 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ；
③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ；
④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。
步骤 5 ： cRNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ；
②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇， 充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ； ⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ； ⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集cRNA。 (2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng， 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱
5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。
(3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
5 实时定量 RT-PCR
5.1 主要试剂
5.2 实验步骤
实验流程如下， 具体请参见 ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol 说明书。
(1) 反转录反应 ：
①总 RNA 样本 ： 15ul 反转录反应体系需要总 RNA 量为 1-10ng。
②配制反转录反应混合液 7ul， 成分如下， 轻柔充分混匀。
③取总 RNA 样本 5ul， 加入反转录反应混合液 7ul， 轻柔充分混匀 ； 再加入反转录引 物 3ul， 配制成反转录反应体系 15ul， 充分混匀后冰上孵育 5min。
④普通 PCR 仪进行反转录反应， 反应条件如下。
成分 100mM dNTP( 含有 dTTP) MultiScribeTM 逆转录酶， 50U/μL 10× 逆转录缓冲液 RNase 抑制剂， 20U/μL 预混合体积 /15μL 反应 0.15 1.00 1.50 0.1912102329860 A CN 102329870 无核酸酶水 总体积
步骤类型 保持 保持 保持 保持
说明书4.16 7.0011/16 页时间 (min) 30 30 5 ∞温度 (℃ ) 16 42 85 4(2)PCR 扩增反应 ： ①准备 PCR 反应模板， 成分如下。
②准备 96 孔 PCR 反应板， 每例样本重复三次， 充分离心避免气泡产生。 ③ Real-Time PCR 仪进行 PCR 扩增反应， 反应条件如下。
④数据分析 ： 观测扩增曲线图， 设置基线和阈值 ； 以 U6rRNA 为内源性对照， 应用相 对 CT 值的方法计算所检测 microRNA 的相对表达量。
三、 统计分析
通过 Illumina BeadArray Reader 读取芯片结果， 用 Illumina BeadStudio 软件分 析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个 miRNA 检测变异系数 (CV)， 对 CV ＞ 0.8 的 miRNA 进行进一步分析。用 z 值进行标准化。用单因素 COX 回归分析 miRNA 与生存期相
关性。进行 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 修正后， 筛选出 9 个候选 miRNA 进行进 一步分析。对这些 miRNA 进行 pearson 相关和 spearman 相关分析。在所有分析中有显著 相关性的 miRNA 与 KPS 评分， TMZ 治疗和切除程度一起列入 COX 回归方程。所有统计分析应 用 Matlab 2009b， JMP(SAS Institute， Cary， NC) 和 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla， CA) 统计软件
四、 细胞转染， 免疫印记， 荧光素酶报告分析， 共沉淀研究
A1207 细胞系在 10％胎牛血清， 1％ Pen-Strep((Invitrogen， Carlsbad CA)) 培养 基和 5％ CO2 培养箱中孵育。 miR-181d 和对照 miRNA 通过 Hyperfect 转染进细胞 (QIAGEN)， 细胞培养 72 消失。总 RNA 用 QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN) 提取， cDNA 通过 iScript cDNA synthesis kit(Biorad， Hercules， CA) 生成。MGMT 和 ACTB cDNA 水平通过 qRT-PCR 检测。 免疫印记方法的原始抗体为 anti-MGMT(Abcam， ab7045， 1 ∶ 500) 和 α- 微管蛋白 (Sigma Aldrich， T9026， 1 ∶ 3000)。
荧光素酶报告分析
1001bp 的 MGMT 3’ UTR 被扩增并克隆至 pSiCheck-2 双报告载体 (Promega)。然 后将带有 pSi-Check-2-MGMT 3’ UTR 质粒或 Psi-Check2 质粒的 miR-181d 或对照 miRNA 共 转染至 A1207 细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测 miR-181d 是否直接连接 于 MGMT 的 3’ UTR 端， 用 TargetScan4.2 检测 miR-181d 结合位点。鉴定出 2 个位点 ( 第 5-27 核苷酸和第 226-248 核苷酸 )。合成跨第 1-50 和 210-260 核苷酸的合成寡核苷酸 (Integrated DNA Technology， Coralville， Iowa)， 并克隆至 pSiCheck-2 质粒 ( 图 2C， 构 建 3 和 5)。miR-181d 结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆 ( 图 2C， 构建 4 和 6)。所有克隆序列被 DNA 测序验证。
miRNA 共沉淀分析
用 RNAiMax(Invitrogen) 将 40nM 生物素化 miR-181d 和对照 miRNA 转染至 A1207 细胞系。转染 72 小时， 细胞溶解 ( 溶解缓冲液 ： 700ul of 20mM Tris(pH7.5)， 100mM KCl， 5mM MgCl2， 0.3 ％ NonidetP-40， 50U RNAseOUT(Invitrogen)， and 1 ∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche， Madison， WI))， 离心 (10,000xg， 10min)， 留取 10％的溶解产物 待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在 4℃下混合 4 小时。清洗磁珠， 并通过 miRNAeasy kit(QIAGEN) 提取缠绕 mRNA， 称为 “解离” 。总 RNA 用同样方法从溶解产物中提 取。用 MMLV-RT(Epicenter Biotechnology， Madison， WI) 从溶解产物和解离 RNA 中合成 cDNA 和随机引物。随后进行 qRT-PCR。
PCR 引物
用于扩增 1,001bp 的 MGMT 3’ UTR PCR 引物 ：
MGMT 3’ UTR 正向引物 ： ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA ；
MGMT3’ UTR 反向引物 ：
AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC ；
用于 MGMT 和 ACTB 的 qRT PCR 的 PCR 引物 ：
MGMT 正向引物 ： CCTGGCTGAATGCCTATTTC ；
MGMT_R ： GATGAGGATGGGGACAGGATT ；
ACTB 正向引物 ： TGAAGTGTGACGTGGACATC ；ACTB 反向引物 ： GGAGGAAGCAATGATCTTGAT ； 用于荧光素酶报告构建的 PCR 引物 ： MGMT WT1-50 正向引物 ： TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA ； MGMT WT 1-50 反向引物 ： GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC ； MGMT M1-50 正向引物 ： TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA ； ACACTGCA ； MGMT M 1-50 反向引物 ： GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA ； MGMT WT 210-260 正向引物 ： TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT ； MGMT WT 210-260 反向引物 ： GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG ； MGMT M 210-260 正向引物 ：TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT ；
MGMT M 210-260 反向引物 ：
GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。
用于评估 miR-181d 表达的引物 ： Applied Biosystems ： miR-181d(P/N ： 4373180) 和 U6rRNA 内源性对照 (P/N ： 4395470)。
TCGA 数据库分析
胶质母细胞瘤从 TCGA 数据库网站 (http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/) 下载， 全部生物标本标签临床文件下载于 2011 年 2 月 24 日。下载标准化， 下载 Agilent miRNA 芯片数据， miRNA 取平均值。 下载标准化和 Agilent 244K 基因表达芯片数据， 并且基因取平 均值。下载 Illumina GoldenGate DNA 甲基化芯片 OMA-002level 2 数据分析甲基化。用 MGMT_P281_F 探针决定 MGMT 甲基化状态， β 值大于 0.25 被定义为甲基化。为了进行生存 分析， 我们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。 将病人依据 TMZ 治疗分组后， 我们进行了重复性分析。
TCGA miRNA 数据 ： unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0
TCGA Agilent 244K 定制基因表达新品数据 ：
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0
Illumina GoldenGate DNA 甲基化试验 OMA-002 数据 ：
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0验证组分析
我们从哈尔滨医学中心收集了 35 例新诊断的胶质母细胞瘤标本， 标本收集标准 与实验组相同， 用带有比较 Ct 方法的 ABI 7900real-time PCR 系统进行 miR-181d 水平的 qRT-PCR 检测， miR-181d 表达水平通过 Applied Biosystems 检测。为了进行生存分析， 我 们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。
焦磷酸测序
我们从天坛医院收集了 20 例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序， 收集标 准 与 实 验 组 和 验 证 组 相 同。 通 过 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN) 从 冰 冻 组 织 中 提 取 DNA， 用 EpiTect Kit 对 DNA 进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增 MGMT 启动子区， 5’ -GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’ 和 5’ ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’ 。这个区域包含 12 个 CpG 位 点。 PCR 在 40ul 反应柱中进行， PCR 的条件是 ： 95℃ -3min ； 40 个循环 ： 95℃ -15s， 52℃ -30s， 72℃ -30s ； 72℃ -5min(ABI PCR system 9700)。通过 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) 从总 PCR 产物中纯化 DNA。并用 5′ -GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序 ((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。
对 MGMT 启动子区得 12 个 CpG 位点进行焦磷酸测序。12 个 CpG 位点在 PCR 反应中 平均后获得每一个 CpG 位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于 9％被定义为胶质母 细胞瘤标本 MGMT 甲基化。 五 . 结果和分析
1.miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关
为了检测 miRNA 在判断预后和预测治疗效果中的作用， 我们对天坛医院收集的 82 例资料完备的胶质母细胞瘤样本 ( 命名为 “实验组” ) 进行分析， 所有病人均接受放射治疗， 部分病人辅助 TMZ 化疗。该组病人临床基本信息见表 1。miRNA 表达谱数据通过多重比较 修正的 COX 模型进行分析， 通过 pearson 和 spearman 相关方法进一步分析候选 miRNA 与总 生存期的关系。经过三种方法的筛选， miR-936， miR-1238， miR-181d 与总生存期相关。
同时， 手术切除程度 ( 全切除对比次全切除 ) 和病人基本信息 (KPS 评分， 年龄， 性 别 ) 也通过单因素 COX 回归进行分析。结果显示 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与总生存期相 关。我们继续将 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与候选 miRNA 纳入多因素 COX 回归分析， 结果 显示全切除， TMZ 化疗和 miR-181d 仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同， 年龄和 KPS 评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性 偏倚 ( 以高龄患者为主 ) 以及在中国 KPS 评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。
我们继续在 424 例 TCGA 胶质母细胞瘤数据库中验证 miR-181d 与总生存期之间的 关系， 证实 miR-181d 表达高于中位水平的 TCGA 胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位 水平的胶质母细胞瘤病人。(p ＝ 0.018)( 图 1a)。为了进一步证实， 我们又对哈尔滨医科 大学一组 35 例胶母独立样本 ( 命名为 “验证组” ) 进行 qRT-PCR 分析 miR-181d 表达情况， 再一次验证 miR-181d 的表达和本组病人的总生存期呈负相关 (p ＝ 0.001)( 图 1b)
接下来， 我们通过单因素 COX 回归检测 miR-181d 是否是预后或预测治疗反应的生 物标记物， 结果显示， 无论在实验组或 TCGA 数据库 (p 值分别为 0.004 和 0.036) 或两组病 人中接受 TMZ 治疗的病人 (p 值分别为 0.010 和 0.089)， 说明 miR-181d 对 TMZ 化疗有潜在 的预测价值。
2.MGMT 是 miR-181d 的直接靶点
生物信息学分析 MGMT 是 miR-181d 的潜在靶点。考虑到 MGMT 在 TMZ 化疗中的 重要作用， 我们认为 miR-181d 下调 MGMT 的表达， 因此使胶母病人对 TMZ 化疗更敏感。将 miR-181d 质粒转染至 A1207 胶母细胞系会使 MGMT 在表达谱和蛋白水平表达下调。( 图 2a) 我们进一步用 pSiCheck-2 荧光素酶报告分析方法评估 MGMT 是否为 miR-181d 的直接靶 点。与对照 miRNA 相比， miR-181d 使 MGMT3’ UTR 端荧光素酶活性降低约 2 倍， 这种结果并 未在无 3’ UTR 端的结构中发现。我们进一步用 Targetscan 方法确定了 2 个 miR-181d 结 合位点， 并对每一个推测位点在 pSiCheck-2 载体上克隆了 50 个核苷酸 ( 图 2c)。在转染 miR-181d 后， 每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约 2 倍。另外， 该推测位点的突变， 将 使 miR-181d 的结合位点消失。为了显示 miR181d 和 MGMT 的直接关系， 生物素化 miR-181d 和对照 miR181d 被转染进 A1207 细胞系， 同时， mRNA- 生物素化 miRRNA 复合体通过链霉抗 生素蛋白珠解体。与对照 miRNA 相比， miR-181d 解体后， MGMT 表达增加了约 2.5 倍。( 图 2d) 综上， miR-181d 直接影响 MGMT 的转录并下调它的表达。
3.MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关
miR-181d 在转录后调节 MGMT， 我们发现 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈负 相关， 通过分析 223 例 TCGA 数据库病人， 结果显示 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈 负相关， 但非显著相关， 我们知道除了 miR-181d 调解， MGMT 启动子区甲基化会影响 MGMT 转 录水平。因此， 我们用之前公布的标准在 TCGA 数据库中检测 MGMT 启动子区非甲基化的胶 质母细胞瘤标本。在 159 个 MGMT 启动子区非甲基化标本中， MGMT 转录水平与 miR-181d 水 平呈负相关， 我们又在一个 20 例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析 MGMT 启动子区甲基 化， 其中 9 例标本甲基化明显， 所有甲基化肿瘤 MGMTmRNA 表达低或检测不到表达， 其余 11 例标本 MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关。
MGMT 在 预 测 TMZ 化 疗 反 应 方 面 的 重 要 作 用 已 经 广 为 人 知， 我们第一次提出 miR-181d 可以在转录后水平调控 MGMT 的表达， 转染实验， 荧光素酶报告分析， 共沉淀实 验证实 miR-181d 直接作用于 MGMT3’ UTR 端调节 MGMT 转录后水平。胶质母细胞瘤标本 miR-181d 水平与 MGMT 转录水平的负相关也支持了这一假说。 另外， 在三个独立样本库 ( 共 计超过 500 例样本 ) 中， miR-181d 的高表达与预后良好相关。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、 方案和物质， 因为这些 均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的， 而不是 意欲限制本发明的范围， 本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到， 或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所 述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
参考文献 ：
[1]Ludwig JA， Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging， prognosis and treatment selection.Nat Rev Cancer 2005 ； 5： 845-56.
[2]Calin GA， Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nat Rev Cancer 2006 ； 6： 857-66.
[3]Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ；103 ： 2257-61.
[4]Lu J， Getz G， Miska EA， et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 2005 ； 435 ： 834-8.
[5 Lim LP， Lau NC， Garrett-Engele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature 2005 ； 433 ： 769-73.
[6]Blenkiron C ， Miska EA.miRNAs in cancer ： approaches ， aetiology ， diagnostics and therapy.Hum Mol Genet 2007 ； 16Spec No 1 ： R106-13.
[7]Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med 2005 ； 353 ： 1793-801.
[8]Yanaihara N， Caplen N， Bowman E， et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell 2006 ； 9： 189-98.
[9]Bloomston M ， Frankel WL ， Petrocca F ， et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA 2007 ； 297 ： 1901-8.
[10]Jiang J， Gusev Y， Aderca I， et al.Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res 2008 ； 14 ： 419-27.
[11]Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008 ； 299 ： 425-36.
[12]Eitan R， Kushnir M， Lithwick-Yanai G， et al.Tumor microRNA expression patterns associated with resistance to platinum based chemotherapy and survival in ovarian cancer patients.Gynecol Oncol 2009 ； 114 ： 253-9.18102329860 A CN 102329870
序列表1/3 页与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物 .txt 序列表 <110> 江涛 <120> 与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物 <130>2011 <140>201110246645.X <141>2011-08-26 <160>14 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>28 <212>DNA <213> 人工序列 <400>1 actcgagtgc agtaggatgg atgtttga 28 <210>2 <211>29 <212>DNA <213> 人工序列 <400>2 agcggccgca tgcagagcta caggtttcc 29 <210>3 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <400>3 cctggctgaa tgcctatttc 20 <210>4 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <400>4 gatgaggatg gggacaggat t 21 <210>5 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <400>519102329860 A CN 102329870
(6) 固定 PCR 产物 ：
① PCR 板的每孔中加入 20μl 已混匀的磁性颗粒试剂 (MPB)， 将混合后的 PCR 产物 和磁珠转移至过滤板的对应孔中。
②盖上过滤板盖， 避光放置 60min。
(7) 制作上芯片的过度板 (INT 板 ) ：
①将过滤板接合器放置到 V 型孔底的 96 孔板 ( 废液板 ) 上， 再将含有固定 PCR 产 物的过滤板放到接合器上。
② 25℃ 1000×g 离心 5min 后， 打开盖子， 每孔加 50μl 缓冲液 UB2， 然后封闭盖子 再次离心 5min。
③加 30μl MH1 到过度板 (INT 板 ) 每个孔中， 然后用 INT 板代替废液板， 再加 30μl 0.1N NaOH 到过滤板每孔中。 ④ 25℃ 1000×g 离心 5min， 最后在 INT 板中不会有可见的磁珠。
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
⑤丢弃过滤板， 轻轻摇动 INT 板以混匀其中液体， 封好后避光放置待上芯片。
(8) 芯片杂交 ：
①将过渡板中荧光标记过的 PCR 产物取 15μl 点到 microRNA 表达谱芯片上， 杂交 炉中 60℃杂交 30min， 然后 45℃过夜杂交 18h。
②准备冲洗液 UB2 和 XC4， XC4 完全解冻后中加 335ml 100％ EtOH， 然后 XC4 放置 摇床上混匀 30-40min。
③取出杂交过后的芯片撕下盖膜， 置于盛装着 UB2 的离心管中， 盖上管帽， 倒转 5 次冲洗芯片， 将冲洗过的芯片放置于另一个盛装 UB2 的离心管中放置 5min， 再将芯片置于 盛装 XC4 的离心管中倒转 10 次冲洗芯片。
④在真空干燥器中将冲洗过的芯片干燥 50-55min， 压力为 67kPa。
(9) 芯片扫描与数据分析 ：
该 芯 片 包 含 1146 个 人 类 microRNA， 约 占 miRBase 12.0 数 据 库 的 97 ％。 利 用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分 析。
3.Illumina mRNA 表达谱芯片
3.1 主要试剂
3.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55 度 ；
②每个样品加 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加入 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ； ③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ； ④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。 步骤 5 ： cRNA 纯化 ①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ； ②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇，充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ；
⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集 cRNA。
(2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱 5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。 (3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
4.Illumina mRNA 表达谱芯片
4.1 主要试剂
试剂名称 TaqMan MicroRNA Assays has-miR-181d has-miR-518b has-miR-524-5p has-miR-566 has-miR-1227 U6rRNA TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit TaqMan 2×Universal PCR Master Mix #4373180 #4373246 #4395174 #4380943 #4409021 #4395470 #4366596 #4324018 ABI ABI 产品编号 生产厂家 ABI10102329860 A CN 102329870 DEPC 处理水
说明书100ml9/16 页 Invitrogen4.2 实验步骤
(1) 样 本 RNA 线 性 扩 增 ： 实 验 流 程 如 下， 具 体 请 参 见 Illumina TotalPre RNA Amplification Kit 说明书。
步骤 1 ： 反转录合成第一链 cDNA
①取样本 RNA 500ng 加 RNase-free 水成 11ul 体系 ；
②加入 9ul 反转录反应混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
③置于杂交炉 42 度反应 2h。
步骤 2 ： 合成第二链 cDNA
①每个样品加 80ul 第二条 cDNA 链合成混合液 (kit 内提供 )， 充分混匀 ；
②置于杂交炉 16 度反应 2h。
步骤 3 ： cDNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-55℃ ；
②每个样品加入 250ul cDNA 结合缓冲液 ；
③将混合液过柱 (kit 内提供 )， 离心后去滤液 ；
④加入 500ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ；
⑤加 10ul 预热的 RNAase-free 水于柱子中央， 溶解 2min 后离心， 再加 10ul 预热 的 RNase-free 水溶解一次。
步骤 4 ： 体外转录 (IVT) 合成 cRNA
①干燥 cDNA ；
②每个样品加 10ul IVT 反应混合液 (kit 内提供 ) ；
③置于杂交炉中 37 度反应 4-14h ；
④每个样品加入 75ul RNase-free 水终止反应。
步骤 5 ： cRNA 纯化
①预热 RNAase-free 水到 50-60 度 ；
②每个反应产物中加入 350ul cRNA 结合缓冲 (kit 内提供 ) 和 250ul 无水乙醇， 充分混匀 ；
③立即过纯化柱， 离心后去滤液 ；
④过纯化柱 (kit 内提供 ) ； ⑤加入 650ul 清洗缓冲液清洗柱子， 离心后去滤液 ； ⑥ 加 100ul 50-55 度 预 热 的 RNase-free 水 于 柱 子 中 央， 溶 解 2min， 离心收集cRNA。 (2) 芯片杂交 ：
①应用 NanoDrop ND-1000 紫外分光光度仪进行 cRNA 定量， 上样量 1500ng， 上样体 积 20ul。
②准备芯片杂交盒， 将足量 cRNA 样本与 20ul 杂交缓冲液 HYB 混合后点于芯片上， 杂交炉中 58 度过夜杂交 18h。
③芯片洗脱 ： 清洗缓冲液 High-Temp Wash Buffer 洗脱 10min， Wash E1BC 洗脱
5min， 无水乙醇洗脱 10min， Wash E1BC 再次洗脱 2min。
④芯片封闭 ： 封闭缓冲液 Block E1 Buffer 封闭 10min。
⑤芯片染色和干燥 ： Streptavidin-Cy3 染色 10min， 再次用 Wash E1BC 洗脱芯片 5min， 离心 4min 甩干。
(3) 芯片扫描与数据分析 ：
该芯片包含 25440 个人类注释基因， 利用 Illumina BeadArray Reader 进行芯片 扫描， 所有扫描图像用 BeadStudio 软件进行数据分析。
5 实时定量 RT-PCR
5.1 主要试剂
5.2 实验步骤
实验流程如下， 具体请参见 ABI TaqMan MicroRNA Assays Protocol 说明书。
(1) 反转录反应 ：
①总 RNA 样本 ： 15ul 反转录反应体系需要总 RNA 量为 1-10ng。
②配制反转录反应混合液 7ul， 成分如下， 轻柔充分混匀。
③取总 RNA 样本 5ul， 加入反转录反应混合液 7ul， 轻柔充分混匀 ； 再加入反转录引 物 3ul， 配制成反转录反应体系 15ul， 充分混匀后冰上孵育 5min。
④普通 PCR 仪进行反转录反应， 反应条件如下。
成分 100mM dNTP( 含有 dTTP) MultiScribeTM 逆转录酶， 50U/μL 10× 逆转录缓冲液 RNase 抑制剂， 20U/μL 预混合体积 /15μL 反应 0.15 1.00 1.50 0.1912102329860 A CN 102329870 无核酸酶水 总体积
步骤类型 保持 保持 保持 保持
说明书4.16 7.0011/16 页时间 (min) 30 30 5 ∞温度 (℃ ) 16 42 85 4(2)PCR 扩增反应 ： ①准备 PCR 反应模板， 成分如下。
②准备 96 孔 PCR 反应板， 每例样本重复三次， 充分离心避免气泡产生。 ③ Real-Time PCR 仪进行 PCR 扩增反应， 反应条件如下。
④数据分析 ： 观测扩增曲线图， 设置基线和阈值 ； 以 U6rRNA 为内源性对照， 应用相 对 CT 值的方法计算所检测 microRNA 的相对表达量。
三、 统计分析
通过 Illumina BeadArray Reader 读取芯片结果， 用 Illumina BeadStudio 软件分 析。相关性进行卡方检验和单因素方差分析。每个 miRNA 检测变异系数 (CV)， 对 CV ＞ 0.8 的 miRNA 进行进一步分析。用 z 值进行标准化。用单因素 COX 回归分析 miRNA 与生存期相
关性。进行 Benjamini-Hochberg 错误发现率 (FDR) 修正后， 筛选出 9 个候选 miRNA 进行进 一步分析。对这些 miRNA 进行 pearson 相关和 spearman 相关分析。在所有分析中有显著 相关性的 miRNA 与 KPS 评分， TMZ 治疗和切除程度一起列入 COX 回归方程。所有统计分析应 用 Matlab 2009b， JMP(SAS Institute， Cary， NC) 和 GraphPad Prism(GraphPad Software， La Jolla， CA) 统计软件
四、 细胞转染， 免疫印记， 荧光素酶报告分析， 共沉淀研究
A1207 细胞系在 10％胎牛血清， 1％ Pen-Strep((Invitrogen， Carlsbad CA)) 培养 基和 5％ CO2 培养箱中孵育。 miR-181d 和对照 miRNA 通过 Hyperfect 转染进细胞 (QIAGEN)， 细胞培养 72 消失。总 RNA 用 QIAGEN RNeasy kit(QIAGEN) 提取， cDNA 通过 iScript cDNA synthesis kit(Biorad， Hercules， CA) 生成。MGMT 和 ACTB cDNA 水平通过 qRT-PCR 检测。 免疫印记方法的原始抗体为 anti-MGMT(Abcam， ab7045， 1 ∶ 500) 和 α- 微管蛋白 (Sigma Aldrich， T9026， 1 ∶ 3000)。
荧光素酶报告分析
1001bp 的 MGMT 3’ UTR 被扩增并克隆至 pSiCheck-2 双报告载体 (Promega)。然 后将带有 pSi-Check-2-MGMT 3’ UTR 质粒或 Psi-Check2 质粒的 miR-181d 或对照 miRNA 共 转染至 A1207 细胞系。试验依照制造商的说明书进行。为了检测 miR-181d 是否直接连接 于 MGMT 的 3’ UTR 端， 用 TargetScan4.2 检测 miR-181d 结合位点。鉴定出 2 个位点 ( 第 5-27 核苷酸和第 226-248 核苷酸 )。合成跨第 1-50 和 210-260 核苷酸的合成寡核苷酸 (Integrated DNA Technology， Coralville， Iowa)， 并克隆至 pSiCheck-2 质粒 ( 图 2C， 构 建 3 和 5)。miR-181d 结合位点中每一个核苷酸的突变寡核苷酸也被克隆 ( 图 2C， 构建 4 和 6)。所有克隆序列被 DNA 测序验证。
miRNA 共沉淀分析
用 RNAiMax(Invitrogen) 将 40nM 生物素化 miR-181d 和对照 miRNA 转染至 A1207 细胞系。转染 72 小时， 细胞溶解 ( 溶解缓冲液 ： 700ul of 20mM Tris(pH7.5)， 100mM KCl， 5mM MgCl2， 0.3 ％ NonidetP-40， 50U RNAseOUT(Invitrogen)， and 1 ∶ 50,000Protease Inhibitor Cocktail(Roche， Madison， WI))， 离心 (10,000xg， 10min)， 留取 10％的溶解产物 待进一步分析。上清液被链霉抗生素蛋白镀膜磁珠在 4℃下混合 4 小时。清洗磁珠， 并通过 miRNAeasy kit(QIAGEN) 提取缠绕 mRNA， 称为 “解离” 。总 RNA 用同样方法从溶解产物中提 取。用 MMLV-RT(Epicenter Biotechnology， Madison， WI) 从溶解产物和解离 RNA 中合成 cDNA 和随机引物。随后进行 qRT-PCR。
PCR 引物
用于扩增 1,001bp 的 MGMT 3’ UTR PCR 引物 ：
MGMT 3’ UTR 正向引物 ： ACTCGAGTGCAGTAGGATGGATGTTTGA ；
MGMT3’ UTR 反向引物 ：
AGCGGCCGCATGCAGAGCTACAGGTTTCC ；
用于 MGMT 和 ACTB 的 qRT PCR 的 PCR 引物 ：
MGMT 正向引物 ： CCTGGCTGAATGCCTATTTC ；
MGMT_R ： GATGAGGATGGGGACAGGATT ；
ACTB 正向引物 ： TGAAGTGTGACGTGGACATC ；ACTB 反向引物 ： GGAGGAAGCAATGATCTTGAT ； 用于荧光素酶报告构建的 PCR 引物 ： MGMT WT1-50 正向引物 ： TCGAGTATGTGCAGTAGGATGGATGTTTGAGCGACACACACGTGTAACACTGCA ； MGMT WT 1-50 反向引物 ： GGCCTGCAGTGTTACACGTGTGTGTCGCTCAAACATCCATCCTACTGCACATAC ； MGMT M1-50 正向引物 ： TCGATGCGTGTACTGCTTCGTTCGTGGGTCTATCACACACATTGTA ； ACACTGCA ； MGMT M 1-50 反向引物 ： GCCTGCAGTGTTACAATGTGTGTGATAGACCCACGAACGAAGCAGTACACGCA ； MGMT WT 210-260 正向引物 ： TCGACTATTTTTCATGTCCATTAAAACAGGCCAAGTGAGTGTGGAAGGCCTGGCT ； MGMT WT 210-260 反向引物 ： GGCCAGCCAGGCCTTCCACACTCACTTGGCCTGTTTTAATGGACATGAAAAATAG ； MGMT M 210-260 正向引物 ：TCGACTATTTTTCATTGAACGGCCCCACTTAACCTGTCTGTGTGAAGGCCTGGCT ；
MGMT M 210-260 反向引物 ：
GCCAGCCAGGCCTTCACACAGACAGGTTAAGTGGGGCCGTTCAATGAAAAATAG。
用于评估 miR-181d 表达的引物 ： Applied Biosystems ： miR-181d(P/N ： 4373180) 和 U6rRNA 内源性对照 (P/N ： 4395470)。
TCGA 数据库分析
胶质母细胞瘤从 TCGA 数据库网站 (http://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/) 下载， 全部生物标本标签临床文件下载于 2011 年 2 月 24 日。下载标准化， 下载 Agilent miRNA 芯片数据， miRNA 取平均值。 下载标准化和 Agilent 244K 基因表达芯片数据， 并且基因取平 均值。下载 Illumina GoldenGate DNA 甲基化芯片 OMA-002level 2 数据分析甲基化。用 MGMT_P281_F 探针决定 MGMT 甲基化状态， β 值大于 0.25 被定义为甲基化。为了进行生存 分析， 我们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。 将病人依据 TMZ 治疗分组后， 我们进行了重复性分析。
TCGA miRNA 数据 ： unc.edu_GBM.H-miRNA_8x15K.Level_3.1.7.0
TCGA Agilent 244K 定制基因表达新品数据 ：
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.2.0.0
unc.edu_GBM.AgilentG4502A_07_2.Level_3.1.5.0
Illumina GoldenGate DNA 甲基化试验 OMA-002 数据 ：
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.1.3.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.2.4.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.3.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.4.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.5.1.0
jhu-usc.edu_GBM.IlluminaDNAMethylation_OMA002_CPI.Level_2.6.1.0验证组分析
我们从哈尔滨医学中心收集了 35 例新诊断的胶质母细胞瘤标本， 标本收集标准 与实验组相同， 用带有比较 Ct 方法的 ABI 7900real-time PCR 系统进行 miR-181d 水平的 qRT-PCR 检测， miR-181d 表达水平通过 Applied Biosystems 检测。为了进行生存分析， 我 们将胶质母细胞瘤标本分为高 miRNA 表达 ( 表达高于中位水平 ) 和低 miRNA 表达。
焦磷酸测序
我们从天坛医院收集了 20 例独立胶质母细胞瘤标本进行焦磷酸测序， 收集标 准 与 实 验 组 和 验 证 组 相 同。 通 过 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN) 从 冰 冻 组 织 中 提 取 DNA， 用 EpiTect Kit 对 DNA 进行硫酸化修饰。用两个已知引物扩增 MGMT 启动子区， 5’ -GGGATAAGTTGGGATAGTT-3’ 和 5’ ATTTGGTGAGTGTTTGGG-3’ 。这个区域包含 12 个 CpG 位 点。 PCR 在 40ul 反应柱中进行， PCR 的条件是 ： 95℃ -3min ； 40 个循环 ： 95℃ -15s， 52℃ -30s， 72℃ -30s ； 72℃ -5min(ABI PCR system 9700)。通过 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen) 从总 PCR 产物中纯化 DNA。并用 5′ -GGATATGTTGGGATAGT-3′引物进行焦磷酸测序 ((PyroMark Q96ID System(QIAGEN))。
对 MGMT 启动子区得 12 个 CpG 位点进行焦磷酸测序。12 个 CpG 位点在 PCR 反应中 平均后获得每一个 CpG 位点的甲基化百分比。平均甲基化百分比大于 9％被定义为胶质母 细胞瘤标本 MGMT 甲基化。 五 . 结果和分析
1.miR-181d 表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存期呈负相关
为了检测 miRNA 在判断预后和预测治疗效果中的作用， 我们对天坛医院收集的 82 例资料完备的胶质母细胞瘤样本 ( 命名为 “实验组” ) 进行分析， 所有病人均接受放射治疗， 部分病人辅助 TMZ 化疗。该组病人临床基本信息见表 1。miRNA 表达谱数据通过多重比较 修正的 COX 模型进行分析， 通过 pearson 和 spearman 相关方法进一步分析候选 miRNA 与总 生存期的关系。经过三种方法的筛选， miR-936， miR-1238， miR-181d 与总生存期相关。
同时， 手术切除程度 ( 全切除对比次全切除 ) 和病人基本信息 (KPS 评分， 年龄， 性 别 ) 也通过单因素 COX 回归进行分析。结果显示 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与总生存期相 关。我们继续将 KPS 评分， 全切除， TMZ 化疗与候选 miRNA 纳入多因素 COX 回归分析， 结果 显示全切除， TMZ 化疗和 miR-181d 仍然与总生存期显著相关。与之前的研究不同， 年龄和 KPS 评分在我们的回归分析中并未与总生存期显著相关。我们认为这可能与病人的选择性 偏倚 ( 以高龄患者为主 ) 以及在中国 KPS 评分低的患者很少接受手术治疗等因素有关。
我们继续在 424 例 TCGA 胶质母细胞瘤数据库中验证 miR-181d 与总生存期之间的 关系， 证实 miR-181d 表达高于中位水平的 TCGA 胶质母细胞瘤预后好于表达水平低于中位 水平的胶质母细胞瘤病人。(p ＝ 0.018)( 图 1a)。为了进一步证实， 我们又对哈尔滨医科 大学一组 35 例胶母独立样本 ( 命名为 “验证组” ) 进行 qRT-PCR 分析 miR-181d 表达情况， 再一次验证 miR-181d 的表达和本组病人的总生存期呈负相关 (p ＝ 0.001)( 图 1b)
接下来， 我们通过单因素 COX 回归检测 miR-181d 是否是预后或预测治疗反应的生 物标记物， 结果显示， 无论在实验组或 TCGA 数据库 (p 值分别为 0.004 和 0.036) 或两组病 人中接受 TMZ 治疗的病人 (p 值分别为 0.010 和 0.089)， 说明 miR-181d 对 TMZ 化疗有潜在 的预测价值。
2.MGMT 是 miR-181d 的直接靶点
生物信息学分析 MGMT 是 miR-181d 的潜在靶点。考虑到 MGMT 在 TMZ 化疗中的 重要作用， 我们认为 miR-181d 下调 MGMT 的表达， 因此使胶母病人对 TMZ 化疗更敏感。将 miR-181d 质粒转染至 A1207 胶母细胞系会使 MGMT 在表达谱和蛋白水平表达下调。( 图 2a) 我们进一步用 pSiCheck-2 荧光素酶报告分析方法评估 MGMT 是否为 miR-181d 的直接靶 点。与对照 miRNA 相比， miR-181d 使 MGMT3’ UTR 端荧光素酶活性降低约 2 倍， 这种结果并 未在无 3’ UTR 端的结构中发现。我们进一步用 Targetscan 方法确定了 2 个 miR-181d 结 合位点， 并对每一个推测位点在 pSiCheck-2 载体上克隆了 50 个核苷酸 ( 图 2c)。在转染 miR-181d 后， 每一个推测位点的荧光素酶活性均下降约 2 倍。另外， 该推测位点的突变， 将 使 miR-181d 的结合位点消失。为了显示 miR181d 和 MGMT 的直接关系， 生物素化 miR-181d 和对照 miR181d 被转染进 A1207 细胞系， 同时， mRNA- 生物素化 miRRNA 复合体通过链霉抗 生素蛋白珠解体。与对照 miRNA 相比， miR-181d 解体后， MGMT 表达增加了约 2.5 倍。( 图 2d) 综上， miR-181d 直接影响 MGMT 的转录并下调它的表达。
3.MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关
miR-181d 在转录后调节 MGMT， 我们发现 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈负 相关， 通过分析 223 例 TCGA 数据库病人， 结果显示 miR-181d 表达水平和 MGMT 转录水平呈 负相关， 但非显著相关， 我们知道除了 miR-181d 调解， MGMT 启动子区甲基化会影响 MGMT 转 录水平。因此， 我们用之前公布的标准在 TCGA 数据库中检测 MGMT 启动子区非甲基化的胶 质母细胞瘤标本。在 159 个 MGMT 启动子区非甲基化标本中， MGMT 转录水平与 miR-181d 水 平呈负相关， 我们又在一个 20 例胶质母细胞瘤标本的样本中进行分析 MGMT 启动子区甲基 化， 其中 9 例标本甲基化明显， 所有甲基化肿瘤 MGMTmRNA 表达低或检测不到表达， 其余 11 例标本 MGMT 转录水平与 miR-181d 水平呈负相关。
MGMT 在 预 测 TMZ 化 疗 反 应 方 面 的 重 要 作 用 已 经 广 为 人 知， 我们第一次提出 miR-181d 可以在转录后水平调控 MGMT 的表达， 转染实验， 荧光素酶报告分析， 共沉淀实 验证实 miR-181d 直接作用于 MGMT3’ UTR 端调节 MGMT 转录后水平。胶质母细胞瘤标本 miR-181d 水平与 MGMT 转录水平的负相关也支持了这一假说。 另外， 在三个独立样本库 ( 共 计超过 500 例样本 ) 中， miR-181d 的高表达与预后良好相关。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、 方案和物质， 因为这些 均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的， 而不是 意欲限制本发明的范围， 本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到， 或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所 述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。
参考文献 ：
[1]Ludwig JA， Weinstein JN.Biomarkers in cancer staging， prognosis and treatment selection.Nat Rev Cancer 2005 ； 5： 845-56.
[2]Calin GA， Croce CM.MicroRNA signatures in human cancers.Nat Rev Cancer 2006 ； 6： 857-66.
[3]Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006 ；103 ： 2257-61.
[4]Lu J， Getz G， Miska EA， et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature 2005 ； 435 ： 834-8.
[5 Lim LP， Lau NC， Garrett-Engele P， et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature 2005 ； 433 ： 769-73.
[6]Blenkiron C ， Miska EA.miRNAs in cancer ： approaches ， aetiology ， diagnostics and therapy.Hum Mol Genet 2007 ； 16Spec No 1 ： R106-13.
[7]Calin GA， Ferracin M， Cimmino A， et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med 2005 ； 353 ： 1793-801.
[8]Yanaihara N， Caplen N， Bowman E， et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell 2006 ； 9： 189-98.
[9]Bloomston M ， Frankel WL ， Petrocca F ， et al.MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis.JAMA 2007 ； 297 ： 1901-8.
[10]Jiang J， Gusev Y， Aderca I， et al.Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection， cirrhosis， and patient survival.Clin Cancer Res 2008 ； 14 ： 419-27.
[11]Schetter AJ， Leung SY， Sohn JJ， et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008 ； 299 ： 425-36.
[12]Eitan R， Kushnir M， Lithwick-Yanai G， et al.Tumor microRNA expression patterns associated with resistance to platinum based chemotherapy and survival in ovarian cancer patients.Gynecol Oncol 2009 ； 114 ： 253-9.18102329860 A CN 102329870
序列表1/3 页与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物 .txt 序列表 <110> 江涛 <120> 与替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤相关的分子标志物 <130>2011 <140>201110246645.X <141>2011-08-26 <160>14 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>28 <212>DNA <213> 人工序列 <400>1 actcgagtgc agtaggatgg atgtttga 28 <210>2 <211>29 <212>DNA <213> 人工序列 <400>2 agcggccgca tgcagagcta caggtttcc 29 <210>3 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <400>3 cctggctgaa tgcctatttc 20 <210>4 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <400>4 gatgaggatg gggacaggat t 21 <210>5 <211>20 <212>DNA <213> 人工序列 <400>519102329860 A CN 102329870
序列表202/3 页tgaagtgtga cgtggacatc <210>6 <211>21 <212>DNA <213> 人工序列 <400>6 ggaggaagca atcatcttga <210>7 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <400>7 tcgagtatgt gcagtaggat <210>8 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <400>8 ggcctgcagt gttacacgtg <210>9 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <400>9 tcgatgcgtg tactgcttcg <210>10 <211>53 <212>DNA <213> 人工序列 <400>10 gcctgcagtg ttacaatgtg <210>11 <211>55 <212>DNA <213> 人工序列 <400>11 tcgactattt ttcatgtcca <210>12 <211>55t21ggatgtttga gcgacacaca cgtgtaacac tgca54tgtgtcgctc aaacatccat cctactgcac atac54ttcgtgggtc tatcacacac attgtaacac tgca54tgtgatagac ccacgaacga agcagtacac gca53ttaaaacagg ccaagtgagt gtggaaggcc tggct5520102329860 A CN 102329870
序列表3/3 页<212>DNA <213> 人工序列 <400>12 ggccagccag gccttccaca ctcacttggc ctgttttaat ggacatgaaa aatag <210>13 <211>55 <212>DNA <213> 人工序列 <400>13 tcgactattt ttcattgaac ggccccactt aacctgtctg tgtgaaggcct ggct <210>14 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <400>14 gccagccagg ccttcacaca gacaggttaa gtggggccgt tcaatgaaaa atag555554