用于鉴定RGS21活性调节子的方法、包含RGS21调节子的组合物以及用其调节味觉的方法.pdf

本发明提供了用于鉴定在味觉信号转导中选择性并特异性调节RGS21基因表达、RGS21蛋白表达和/或RGS21与G蛋白相互作用的化合物的方法。特别地，本发明提供了用于鉴定RGS21活性调节子来增加甜味或其它味觉的方法。还提供了包含用于调节味觉信号转导的RGS21活性调节子的组合物。

1、  一种鉴定特异性调控G-蛋白信号21调节子(RGS21)蛋白的活性的化合物的方法，包含：
a)制备分离的RGS21蛋白或其生物学活性片段，以及分离的Gα蛋白；
b)在缺少和存在测试化合物的条件下将分离的RGS21蛋白或其生物学活性片段与分离的Gα蛋白组合；以及
c)在缺少和存在测试化合物的条件下测定RGS21 GTP酶活化蛋白(GAP)对于分离的Gα蛋白的活性水平；以及
d)鉴定调控RGS21 GAP活性水平的测试化合物。

2、  权利要求1所述的方法，其中分离的Gα蛋白选自由α-味蛋白、Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz、Gαo、Gαs、Gαolf、Gαt、Gαq、Gαl1、Gαl2、Gαl3、Gαl4和Gαl6组成的组。

3、  权利要求1所述的方法，其中分离的Gα蛋白是α-味蛋白。

4、  权利要求1所述的方法，其中RGS21蛋白、Gα蛋白或两种蛋白都分离自味觉细胞。

5、  权利要求1所述的方法，其中RGS21蛋白、Gα蛋白或两种蛋白都分离自选自由细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞所组成的组的细胞。

6、  权利要求1所述的方法，其中通过测量GTP的水解量来测定RGS21 GAP活性，其中用放射性标记或荧光标记来标记GTP。

7、  权利要求6所述的方法，其中通过测量释放入上清液的放射性标记的无机磷酸盐(³²P_i)的量来测定RGS21 GAP活性。

8、  权利要求6所述的方法，其中由荧光光谱测定RGS21 GAP活性。

9、  权利要求6所述的方法，其中由时间分辨的荧光共振能量转移(TR-FRET)试验测定RGS21 GAP活性。

10、  一种鉴定特异性调控G蛋白信号21调节子(RGS21)蛋白活性的化合物的方法，包含：
a)制备表达RGS21蛋白或其生物学活性片段以及Gα蛋白的宿主细胞；
b)用测试化合物接触宿主细胞；
c)测定在宿主细胞中的RGS21活性水平；以及
d)鉴定调控细胞中RGS21活性水平的化合物。

11、  权利要求10所述的方法，其中G α蛋白选自由α-味蛋白、Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz、Gαo、Gαs、Gαolf、Gαt、Gαq、Gαl1、Gαl2、Gαl3、Gαl4和Gαl6组成的组。

12、  权利要求10所述的方法，其中Gα蛋白是α-味蛋白。

13、  权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是味觉细胞。

14、  权利要求13所述的方法，其中所述味觉细胞是选自由STC-1细胞、NCI-H716细胞或HuTu-80肠内分泌细胞所组成的组的典型味觉细胞。

15、  权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是人HuTu-80肠内分泌细胞。

16、  权利要求13所述的方法，其中所述味觉细胞来源于人味蕾细胞。

17、  权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞所组成的组。

18、  权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是自然表达功能性味觉受体、G蛋白、RGS21蛋白和效应子的真核细胞。

19、  权利要求18所述的方法，其中所述功能性味觉受体选自由甜味剂受体、苦味受体和鲜味受体所组成的组。

20、  权利要求18所述的方法，其中所述效应子是磷脂酶Cβ2(PLCβ2)。

21、  权利要求10所述的方法，其中通过测定细胞中胞内第二信使的水平来测定RGS21活性的水平。

22、  权利要求21所述的方法，其中胞内第二信使是cAMP。

23、  权利要求22所述的方法，其中通过直接测量cAMP的数值来测定cAMP水平。

24、  权利要求22所述的方法，其中通过测量在包含cAMP应答元件的启动子序列控制下的报告子基因的表达量来测定cAMP水平。

25、  权利要求10所述的方法，其中通过测定放射活性标记的磷酸肌醇的水解水平来测定RGS21活性水平。

26、  权利要求21所述的方法，其中胞内第二信使是肌醇三磷酸盐(IP₃)或二脂酰甘油(DAG)。

27、  权利要求10所述的方法，其中通过测定细胞中磷酸化激酶的水平来测定RGS21活性水平。

28、  权利要求27所述的方法，其中磷酸化激酶选自由ERK1、ERK2、Akt、MEK和表皮生长因子受体(EGF-R)组成的组。

29、  权利要求10所述的方法，其中通过测定细胞中甜味受体内化作用水平来测定RGS21活性水平。

30、  权利要求29所述的方法，其中通过荧光显微术、通过亚细胞分级分离、通过甜味受体的差别化学修饰或通过测量β-抑制蛋白的易位水平来测定甜味受体内化作用水平。

31、  权利要求10所述的方法，其中通过测定神经递质、神经肽或胃肠肽的水平来测定RGS21活性水平。

32、  权利要求31所述的方法，其中神经递质是ATP。

33、  权利要求31所述的方法，其中胃肠肽选自由肽YY(PYY)、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胃促胰岛素肽(GIP)组成的组。

34、  权利要求10所述的方法，其中通过测定Gα亚基和RGS21的相互作用水平来测定RGS21活性水平。

35、  权利要求34所述的方法，其中应用荧光共振能量转移或酵母双杂交试验来测定相互作用水平。

36、  一种鉴定增强甜味的化合物的方法，包含：
a)鉴定抑制RGS21活性的化合物；
b)测定由甜味剂受体活化的甜信号水平，所述甜味剂受体仅具有甜味剂，以及与化合物结合；以及
c)鉴定将由所述甜味剂活化的甜信号水平增强到高于仅有甜味剂所测定的水平的化合物。

37、  权利要求36所述的方法，其中所述甜味剂选自由碳水化合物甜味剂、化学合成的高效甜味剂、天然的高效甜味剂、多元醇和氨基酸组成的组。

38、  一种用于调控味觉的组合物，其中组合物包含一种通过权利要求1所述的方法鉴定的化合物。

39、  一种用于调控味觉的组合物，其中该组合物包含一种通过权利要求10所述的方法鉴定的化合物。

40、  一种用于调控味觉的组合物，其中该组合物包含一种通过权利要求36所述的方法鉴定的化合物。

用于鉴定RGS21活性调节子的方法、包含RGS21调节子的组合物以及用其调节味觉的方法
对于相关申请的交叉引用
本申请要求2006年7月26日递交的美国临时专利申请系列号60/820,426的优先权的权利，其内容以其整体并入本文。
本发明的背景
发明领域
本发明涉及用于鉴定G蛋白信号调节子(RGS)蛋白的调节子的方法。本发明还涉及包含RGS调节化合物的组合物，以及使用这样的组合物来调节G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导的方法。特别地，本发明涉及用于鉴定特异性抑制或增强RCS21蛋白或其生物学活性片段的活性的化合物的方法；包含这样的化合物的组合物；以及使用这样的化合物通过GPCR味觉信号转导途径来调节味觉信号转导的方法。

背景
G蛋白偶联受体(GPCRs)在信号转导中起重要作用，并且是很多治疗药物的靶标。很长时间以前已经报道了GPCR信号转导的标准模式限于三组分体系：G-蛋白偶联受体(GPCR)、G蛋白和效应子(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov，1(3)：187-97)。GPCR是具有七个跨膜结构域的细胞-表面受体蛋白。每个G蛋白是膜-结合的异源三聚体复合物，其包含GTP-水解Gα亚基和Gβγ二聚体亚单位。Gα亚基是在细胞中控制大量生理学过程的分子开关。Gα亚基以非活性的GDP-结合状态或以活性的GTP-结合状态存在，其中后者与下游信号蛋白相互作用而引起特异性信号反应(图1)。Gα蛋白的活化和钝化分别由配基-结合的GPCR和GTP酶促进蛋白(GAP)来调控。当结合于配基时，GPCR通过催化鸟苷三磷酸(GTP)转化为鸟苷二磷酸(GDP)到异源三聚体G蛋白的α亚基上来促进细胞信号。GAP结合到活性的GTP结合形式的Gα蛋白上，从而促进G蛋白固有的GTP酶活性，借此将结合的GTP的末端磷酸盐残基水解为GDP，从而使Gα蛋白回到非活性状态(图1)。
当激动剂结合到GPCR时，其引起提高GPCR的鸟嘌呤核苷转化活性的构型变化，导致Gα亚基的GDP释放(以及随后结合于GTP)。一旦与GTP结合，Gα亚基的三个“开关”区域内的构型变化使Gβγ亚基释放，并且随后接合特异于每个Gα亚型的效应子。释放的Gβγ亚基还可以调节包含离子通道和特定亚型的腺苷酰环化酶和磷脂酶(PLC)在内的的效应子(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.1(3)：187-97，图1和表1)。
最近，已经发现了一个作为GPCR信号转导新元件的蛋白家族。该蛋白家族由称为G蛋白信号调节子(RGS)蛋白的蛋白质组成(DeVries等人，2000，Ann.Rev，Pharmacol.40：235；Ross和Wilkie，2001，Ann.Rev.Biochem.69：795)。RGS蛋白有效调节G蛋白的活性，并且在GPCR信号转导中起关键作用。其众所周知的功能是充当GTP酶活化蛋白(GAP)，通过促进GTP水解来抑制G蛋白信号，并且从而关闭G蛋白信号。特别地，RGS蛋白通过直接结合于GTP-结合Gα亚基来控制由活化Gα亚基输出的信号。该结合显著促进了亚基的GTP水解率，因此促进了GPCR信号的钝化率(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.I(3)：187-97；Berman等人，3996，Cell 86：445-52；Hunt等人，1996，Nature383：175-77；Watson等人，1996，Nature 383：172-75)。
至少有37种RGS蛋白存在于人基因组中，并且这些蛋白可以再分成不同的蛋白家族，它们在其功能域的组分上有所不同(图2)。所有的RGS蛋白包含至少一个称为“RGS-盒”的大约120个氨基酸的保守结构域，其导致RGS蛋白可观察到的的GAP活性(图3)。RGS-盒与Gα开关区域接触来使其构象在GTP-结合和GDP-结合形态之间的过渡状态上稳定。因为RGS蛋白是非常多样的，具有独特的组织分布，并且在活细胞中起各种功能性的作用，所以RGS蛋白一般还包含各种非-RGS-盒结构域和基序(例如：GGL、DEP、DH/PH、PDZ结构域以及半胱氨酸串基序)。
RGS蛋白负调控GPCR信号，因此将RGS蛋白认为是潜在的发现药物的靶标，因为RGS-盒GAP活性的抑制将导致由激动剂-结合GPCR的信号的延长和增强(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.1(3)：187-97)。RGS蛋白的抑制剂可以通过减弱Gα蛋白的钝化来增强G蛋白信号。RGS抑制剂的潜在治疗作用包括但不限于，内源神经递质的增强功能；外源GPCR-激动剂的增强功能；激动剂的降低脱敏作用；外源激动剂的改变的特异性；以及RGS-蛋白-介导的效应子活性的阻滞调控(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.DrugDiscov.1(3)：187-97，Box 1：Zhong Sc Neubig，2001，J.Pharmacol.Exp.Ther.297：837-45)。
已经在中枢神经系统(CNS)中发现了一些RGS基因，其提供了潜在的药物靶标用于CNS疾病的RGS抑制剂的临床应用，所述的CNS疾病例如阿尔茨海默氏病、抑郁症、癫痫症、帕金森氏症、疼痛和僵直(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.1(3)：187-97，表3和4)。然而，因为RGS蛋白的高度多样性和复杂性，每个RGS蛋白的作用可能取决于特定结构域的功能，所述特定结构域包括RGS-盒、非RGS-盒基序和/或其它的功能组件(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.1(3)：187-97)。
味觉细胞装配成舌表面上的味蕾(Lindemann，1996，Physiol.Rev.76：718-66)。在味觉细胞中已经鉴定了GPCR的两个家族：介导甜味和鲜味的GPCRT1R家族，以及介导苦味的GPCR T2R家族(Nelson等人，2001，Cell 106：381-90；Nelson等人，2002，Nature 416：199-202；Li等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：4692-96；Zhao等人，2003，Cell 115：255-66；Adler等人，2000，Cell 100：693-702；Chandrashekar等人，2000，Cell 100：703-11；Bufe等人，2002，Nat Genet.32：397-401)。已经表明所有这些受体的下游信号依赖甜、鲜和苦味转导的关键效应子酶、磷脂酶C亚型β2(PLCβ2)以及色氨酸途径亚型m5(TRPM5)(Zhang等人，2003，Cell 112：293-301)。
Buccholtz等人鉴定了另一种RGS蛋白RGS21，并且证明RGS21在叶状、真菌状和有触毛的味蕾细胞中特异表达，其与苦味受体(T2R)、鲜味受体(T1R1/T1R3)、甜味受体(T1R2/T1R3)、α-味蛋白和磷脂酶Cβ2(PLCβ2)共定位。Buchholtz等人还表明RGS21蛋白可与Gα_i/o/t/z、G_q/11/14和α-味蛋白结合。人RGS21的序列分析表明其包含单个RGS-盒结构域并且没有其它功能域。此外，RGS21的RGS盒与RGS2(G_i/o和G_q蛋白的GAP)的RGS盒的序列同源性进一步支持了RGS21类似调控这些G蛋白的可能性(图3)。通过与其它的RGS蛋白类推，虽然尚未证明，但很可能RGS21蛋白减少了α-味蛋白和/或参与味觉细胞信号的其它相关Gα蛋白。
本领域所需要的是鉴定可用于调节味觉信号转导的化合物的方法。还需要调节味觉信号转导的化合物和使用这样的化合物来调节味觉信号转导的方法。
发明小结
鉴于RGS21蛋白在味觉组织中选择性地表达，并且其与甜味信号转导成分共表达，并且鉴于RGS21蛋白具有调节甜味转导过程的潜力，本发明提供了调节RGS21活性的化合物的鉴定方法。本发明还提供了当结合于碳水化合物和/或非热能甜味料时，这样的RGS21调节化合物增强甜味或调节甜味剂的瞬时轮廓的用途。
本发明提供了用于筛选大量化合物的方法和/或生物化学试验，以便能够发现甜味敏感味蕾细胞信号的增强子和调节子。特别地，本发明提供了在味蕾细胞中的替代蛋白靶标，其独立于甜味剂受体，用于发现甜味增强子和调节子。在一个优选实施方案中，本发明提供了用于筛选大量化合物的方法和/或生物化学试验，所述化合物选择性和特异地与RGS21蛋白相互作用，并且抑制RGS21蛋白的活性。RGS21蛋白是甜味信号的负调节子。RGS21蛋白功能以限定和短暂的方式的抑制通过增加每一活化甜味剂受体的信号输出来增强甜味信号。此外，由RGS21蛋白抑制剂来增强甜味敏感味蕾细胞信号，相对独立于这种经由甜味剂受体活性的正变构调节的增强。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了在宿主细胞中筛选抑制或增强RGS21基因表达的大量化合物的方法。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了在宿主细胞中筛选抑制或增强RGS21蛋白表达的大量化合物的方法。在又一个优选的实施方案中，本发明提供了用于筛选妨碍或促进RGS21蛋白与合适的G蛋白相互作用的大量化合物的方法。如果由本发明的方法所鉴定的所有化合物结合到RGS21蛋白、妨碍或增强与相应G蛋白的相互作用，则认为是RGS21蛋白抑制剂和/或调节子。因此，鉴定的调节化合物导致抑制或增强RGS21蛋白活性，分别例如GTP酶促进(GAA)活性或GTP酶活化蛋白(GAP)活性，用于GPCR介导的信号转导。
本发明提供了用于鉴定特异性调节G蛋白信号21调节子(RGS21)蛋白活性的化合物的方法，包含提供分离的RGS21蛋白或其生物学活性片段，以及分离的G α蛋白；在缺少和存在测试化合物的条件下将分离的RGS21蛋白或其生物学活性片段与分离的Gα蛋白结合；在缺少和存在测试化合物的条件下测定分离的Gα蛋白上的RGS21GTP酶活化蛋白(GAP)活性的水平；以及鉴定调节RGS21GAP活性水平的测试化合物。在一个优选实施方案中，本发明提供了用于在细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中重组表达和提纯RGS21蛋白和Gα蛋白的方法。这种方法分别包含克隆编码RGS21蛋白和适当的Gα蛋白的cDNA，以及制备编码RGS21和Gα蛋白的重组cDNA。在一个优选的实施方案中，合适的Gα蛋白包括但不限于从由α-味蛋白、Gαi1-3、Gαz、Gαo、Gαs、Gαolf、Gαt、Gαq、Gα11-14和Gα16组成的组中选出的Gαi蛋白。在特定的实施方案中，RGS21蛋白、Gα蛋白或两者在昆虫细胞、酵母细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞中表达，并由其中纯化。本发明表明蛋白还可在味觉细胞中表达，并从中纯化。在一个优选的实施方案中，蛋白还可在人HuTu-80细胞中表达，并从中纯化。本发明进一步提供了编码上述蛋白的特定重组构建体，以及能表达重组构建体的细胞宿主。
用于鉴定调节RGS21活性的化合物的方法包括在存在或缺少化合物的条件下测定RGS21 GAP活性的水平。将纯化的RGS21加入结合GTP的Gαi蛋白，增加了GTP的水解率。因此，本发明提供了测定GTP水解的方法。在一个优选实施方案中，如果来自膜结合Gα蛋白的放射性损失提供了GTP水解的测定方法的话，本发明提供了结合的放射性GTP的水解。在另一个优选实施方案中，如果当加入RGS21时来自Gα蛋白的BODIPY荧光发射的损失提供了GTP水解的测定方法的话，本发明提供了BODIPYFL-GTP的荧光光谱法。在又一个优选实施方案中，如果抑制Gα和RGS21的相互作用的调节化合物降低了TR-FRET信号的话，本发明提供了用于Gα和RGS21相互作用的时间分辨FRET试验(time-resolved FRET assay)。
本发明提供了用于筛选妨碍RGS21蛋白与合适的Gα蛋白相互作用的大量化合物的方法。这种方法包含制备表达RGS21蛋白或其生物学活性片段和Gα蛋白的宿主细胞；将宿主细胞与测试化合物接触；测定在宿主细胞中的RGS21活性水平；以及鉴定在细胞中调节RGS21活性的化合物。在优选的实施方案中，适当的Gα蛋白包括但不限于选自由α-味蛋白、Gαi1-3、Gαz、Gαo、Gαs、Gαolf、Gαt、Gαq、Gαl1-14和Gα16所组成的组的Gαi蛋白。在优选的实施方案中，宿主细胞是味觉细胞。在更优选的实施方案中，味觉细胞起源于人味蕾细胞或是选自由STC-1细胞、NCI-H716细胞或HuTu-80细胞所组成的组的模式味觉细胞。在其它的实施方案中，宿主细胞是细菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞。
本方法包括测定上述鉴定的调节化合物对于味觉细胞中的RGS21 GAP活性的作用。在优选的实施方案中，使用了监控甜味受体活化的标准信号试验。这种试验包括但不限于测定：a)在第二信使方面的变化(例如：钙(Ca²⁺)、IP₃、DAG、PIP₂、cAMP、cGMP等)，b)在蛋白激酶活性方面的变化(例如：PKA、PKC、GRK、ERK、Akt、Src、RTKs等)，c)在胃肠肽分泌方面的变化和/或d)在神经递质分泌方面的变化。特别地，将仅有甜味剂对于这些信号“读数”之一的作用与同推测的RGS21调节化合物相结合的甜味剂的作用相比。本发明表明RGS21蛋白抑制剂增强了观测到的甜味剂的作用。例如，如果仅有甜味剂增强了胞内钙的释放，则甜味剂和RGS21抑制剂的组合将使钙释放增加高于仅有甜味剂。在另一个优选实施方案中，本发明还提供了用于筛选RGS21蛋白抑制剂和调节鲜味与苦味的调节子的方法。
本发明提供了鉴定增强甜味的化合物的方法，包含：鉴定抑制RGS21活性的化合物；测定由甜味剂受体活化的甜信号水平，所述甜味剂受体仅有甜味剂，以及与化合物结合；以及鉴定将由所述甜味剂活化的甜信号水平增强到高于仅有甜味剂所测定的水平的化合物。在优选的实施方案中，甜味剂选自由碳水化合物甜味剂、化学合成的高效甜味剂、天然的高效甜味剂、多元醇和氨基酸组成的组。
此外，本发明提供了证实RGS21调节子对于人甜味以及鲜味和苦味的作用的方法。在一个优选的实施方案中，本发明提供了单独品尝测试甜味剂所感觉的甜度与测试甜味剂和RGS21调节化合物组合所感觉的甜度的比较。本发明规定RGS21抑制剂增强了测试甜味剂所感觉的甜度，而RGS21增强子降低了测试甜味剂所感觉的甜度。
本发明进一步提供了用于增强甜味信号的包含抑制剂和/或RGS21蛋白调节化合物的组合物。本发明还提供了包含用于调节其它味觉(例如：鲜味和苦味)的RGS21蛋白的抑制剂和/或调节化合物的组合物。

附图简述
图1说明了由GPCRs和RGS21蛋白对于异源三聚体G蛋白信号的调节。GPCRs通过促进GDP转换为GTP来活化Gα蛋白。其通过Gα亚基以及释放的βγ亚基来促进下游信号。RGS21蛋白通过促进Gα蛋白的内在GTP水解活性来钝化Gα蛋白。其将活性Gα-GTP返回到非活性Gα-GDP形式，其同βγ亚基再聚合，从而由这两种机制来终止信号。
图2说明了RGS蛋白的结构域构造。RGS蛋白进一步分成八个亚类。所有的RGS蛋白包含至少一个称为“RGS-盒”的大约120个氨基酸的保守结构域，该结构域导致观察到的RGS蛋白的GAP活性(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.DrugDiscov.1：187-97)。
图3是RGS蛋白的RGS盒的系统演化树。应用SMART软件来预测RGS蛋白的RGS盒结构域，应用CLUSTALW软件来比对，并利用比对来产生序列的基础系统演化树。本图表明RGS21的RGS盒的序列与RGS2的RGS盒的序列最相似，其是用于Gαi、Gαo和Gαq蛋白的GAP(在Hains等人，2004，Methods in Enz.389：71-88中的综述)。RGS2与RGS21的序列相似性支持了RGS21对于调节来自与Gαi家族成员(包括味蛋白(gustduein)和转导蛋白)相结合的T1R和T2R受体的G-蛋白信号的作用。
图4说明了用于鉴定hRGS21调节化合物的单个核苷酸结合与转换筛选试验。
发明详述
本发明提供了用于鉴定在味觉细胞中调节RGS21蛋白活性的化合物，以便通过G蛋白偶联的味觉受体来调节甜味、鲜味和苦味。特别地，本发明提供了用于筛选特异性调节RGS21基因表达、RGS21蛋白表达和/或RGS21同Gα蛋白相互作用，提供了在味觉细胞中对于RGS21活性(例如RGS21 GAP活性)的调节作用，并从而增强甜味敏感味觉细胞信号的方法和/或生物化学试验。
如本文所用，化合物文库是生理活性试剂，例如天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸或多聚核苷酸。换句话说，化合物是小分子。如本文所用，“味蕾细胞”或“味觉细胞”可交替使用，其包括组织成群而形成舌头上味蕾的神经上皮细胞，例如：叶状、真菌状以及有触毛的细胞(Roper等人，1989，Ann，Rev.NeuroscL 12：329-353)。还在上腭及其它组织，例如食管、肠和胃中发现了味觉细胞。
如本文所用，包括其各种语法形式的术语“调节(modulatory)”、“调节(modulation)”、“调节子(modulator)”、“抑制(inhibitory)”、“抑制(inhibiting)”、“抑制剂(inhibitors)”、“活化(activating)”和“活化剂(activators)”可交替使用来指调节、抑制和/或活化RGS21蛋白分子，例如：配基、激动剂、拮抗剂及其影响RGS21基因或蛋白的同系物和模拟体，或其包含生物学活性部分的片段。调节子包括例如改变在GPCR信号转导中RGS21基因或蛋白或其包含生物学活性部分的片段，与Gα蛋白及其它效应子的相互作用；以及阻止、钝化和退敏RGS21基因或蛋白的化合物。调节子可包括具有改变活性的RGS21基因或蛋白的遗传改进形式，以及天然存在和化学合成的配基、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。“调节作用”指上调、诱导、刺激、增强、减弱和/或抑制的解除，以及抑制和/或下调或抑压。抑制剂是例如结合、部分或完全阻滞刺激、降低、阻止、延迟活化、钝化、退敏或下调RGS21基因或蛋白的化合物，例如：拮抗剂。活化剂是例如结合、促进、增加、打开、活化、利于、增强活化、敏化或上调RGS21基因或蛋白的化合物，例如：激动剂。
如本文所用，术语“RGS”或“RGS蛋白”包括目前已知或新近描述的G蛋白信号蛋白的调节子，其能够抑制或结合到Gαi类蛋白或其它的Gα蛋白上。这种RGS蛋白包括，但不限于GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、RGS21、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN，以及任何目前已知或新近描述的亚型或同系物。另外，如本文所用，术语“RGS蛋白”包括含有RGS核心结构域的目前已知或新近描述的蛋白，所述RGS核心结构域含有RGS盒结构域、非RGS盒结构域或任何其它的功能性结构域/基序，有或没有一个或多个突变、缺失或添加。在一个优选实施方案中，RGS蛋白指RGS21蛋白、其亚型或同系物。在又一个优选实施方案中，RGS21蛋白核心结构域与野生型RGS21蛋白核心结构域具有至少60％同源性，优选75％同源性，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源性。如本文所用，RGS21蛋白核心结构域包含蛋白的生物学活性部分。
如本文所用，RGS蛋白(优选RGS21蛋白)的“生物学活性部分”包括含有足够同源于或来源于该蛋白的氨基酸序列的蛋白片段，其包括比全长蛋白少的氨基酸，并且显示出全长蛋白的至少一种活性。一般来说，生物学活性部分包括具有蛋白的至少一种活性的结构域或基序。蛋白的生物学活性部分可以是多肽，其长度例如10、25、50、100、200或更多个氨基酸。在一个实施方案中，可将RGS21蛋白的生物学活性部分用作靶点来开发调节RGS21与Gα蛋白相互作用的制剂。
本发明提供了用于在宿主细胞中重组表达和纯化RGS21蛋白和相应物和/或适当的Gα蛋白的方法，所述宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，方法分别从克隆并分离编码RGS21和适当的G αi蛋白的cDNA开始。然后分别将编码RGS21和适当的Gαi蛋白的分离的cDNA克隆入表达载体中，并且进一步转化并在宿主细胞中表达来制备重组RGS21和Gαi蛋白。
如本文所用，“重组体”指合成或体外操作的多聚核苷酸(例如：“重组多聚核苷酸”)，指使用重组多聚核苷酸来在细胞或其它生物学体系中制备基因产物的方法，或指由重组多聚核苷酸所编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组体”还包含将来自不同来源的各种编码区或结构域或启动子序列的核苷酸连接入用于融合蛋白的表达(例如：诱导性或组成性表达)的表达盒或载体，所述融合蛋白包含本发明的移位结构域和应用本发明的引物扩增的核酸序列。
如本文所用，术语“Gα”或“Gα蛋白”包括目前已知或新近描述的Gαi类的全部成员，包括但不限于Gαi1-3、Gαz、Gαo、Gαs、Gαolf、Gαt、Gαq、Gαl1-14和Gα16。如本文所用，术语“相应和/或适当的Gα蛋白”指在使用的细胞、筛选试验或体系中能够接触目的RGS蛋白(例如：RGS21蛋白)的Gα蛋白。在特定的实施方案中，Gα蛋白可包含一个或多个突变、缺失或添加。在这种实施方案中，Gα蛋白与野生型Gα蛋白具有至少60％同源性，优选75％同源性，更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源性。如本文所用，术语“相应和/或适当的Gα蛋白”指在使用的细胞、筛选试验或体系中能够接触目的RGS蛋白(例如：RGS21蛋白)的Gα蛋白。更优选地，适当的Gα蛋白能够接触RGS21蛋白。在使用的细胞、筛选试验或体系中还将相应的Gα蛋白结合到GPCR和/或结合到GTP上，以便Gα蛋白能够接触GPCR和/或GTP，或能够转导应答结合到GPCR的激动剂的信号。如本文所用，术语“结合到GPCR的激动剂”包括结合到GPCR并引起反应的任何分子或试剂。
如本文所用，术语“cDNAs”包括互补于存在于细胞或有机体mRNA中的mRNA分子的DNA，所述mRNA可由酶(例如：反转录酶)转化为cDNA。在一个优选实施方案中，应用本领域众所周知的RT-PCR方法从人味蕾细胞mRNA中分离编码RGS21的cDNA。
如本文所用，术语“多聚核苷酸”、“核酸/核苷酸”和“寡聚核苷酸”可交替使用，并且包括任何长度的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物的多聚体形式。多聚核苷酸可具有任何三维结构，并且可表现任何已知或未知的功能。以下是多聚核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、DNA、cDNA、基因组DNA、重组体多聚核苷酸、分支多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可为天然存在物、化学合成物、重组体或其任意组合。多聚核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在聚合物装配前后给予对于核苷酸构建体的修饰。可由非核苷酸组分来中断核苷酸序列。可在聚合后进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分结合。该术语还包括双链和单链分子。除非另作说明或要求，本发明的任何实施方案中多聚核苷酸包含双链形式和已知或预测的两个互补单链形式来组成双链形式。
如本文所用，术语“多聚核苷酸序列”是多聚核苷酸分子的字母表达式。多聚核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；并且当多聚核苷酸是RNA时尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶。可将该字母表达式输入电脑数据库，并用于生物信息申请，例如功能性基因组和同源性检索。
如本文所用，术语“分离的多聚核苷酸/cDNA分子”包括分离自存在于天然多聚核苷酸的资源的其它多聚核苷酸分子的多聚核苷酸分子。例如，就基因组DNA而言，术语“分离的”包括分离自基因组DNA天然结合的染色体的多聚核苷酸分子。优选地，“分离的”多聚核苷酸不包含在从中得到多聚核苷酸的有机体的基因组DNA中多聚核苷酸天然侧面的序列(即：位于目的多聚核苷酸的5’和3’端的序列)。例如，在各种的实施方案中，本发明的分离的多聚核苷酸分子，或编码本发明的多肽的多聚核苷酸分子，可以包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列，所述核苷酸序列位于在从中得到多聚核苷酸的细胞的基因组DNA中多聚核苷酸天然侧面。此外，当由重组技术制备时，“分离的”多聚核苷酸分子，例如cDNA分子，可以基本上不含其它的细胞物质或培养基，或者当用化学合成时，可以基本上不含化学制剂前体或其它化学制剂。
如本文所用，术语“基因”包括含有至少一个开放读码框的多聚核苷酸，所述开放读码框能够在转录和翻译之后编码特定的多肽或蛋白。本文所述的任意多聚核苷酸序列还可用于鉴定与其结合的基因的较大片段或全长编码序列。本领域技术人员已知分离更大片段序列的方法。如本文所用，“天然存在的”多聚核苷酸分子包括，例如：具有在自然界存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如：编码天然蛋白)。
如本文所用，术语“多肽”或“蛋白”可交替，并且包括两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或多肽模拟体。亚基可由肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可由其它键(例如：酯、醚等)连接。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然的或化学合成的氨基酸，所述甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和多肽模拟体。通常将三个或更多个氨基酸的肽认为是寡肽。将大于三个或更多个氨基酸的肽链认为是多肽或蛋白。
在优选的实施方案中，本文所用的RGS蛋白指在味觉细胞和/或宿主细胞中天然和/或重组表达的RGS蛋白。更优选地，在味觉细胞和/或宿主细胞中天然和/或重组表达的RGS21蛋白或编码RGS21多肽的多聚核苷酸。如本文所用，“表达(express)”或“表达(expression)”包括将多聚核苷酸转录成RNA和/或翻译成多肽的步骤。如果多聚核苷酸来源于基因组DNA，则若选择适当的真核宿主的话，表达可包括RNA的拼接。需要表达的调控元件包括结合RNA聚合酶的启动子序列和用于核糖体结合的转录起始序列。例如，细菌表达载体包括启动子(例如lac启动子)和用于转录起始的SD序列，以及起始密码子AUG。类似地，真核表达载体包括RNA聚合酶II的异源或同源启动子、下游多聚腺苷酸信号、起始密码子AUG和用于核糖体分离的终止密码子。可在商业上获得这种载体，或通过本领域已知的方法(例如：如下所述用于构建一般载体的方法)所描述的序列组合来得到这种载体。如本文所用，术语“载体”包括将插入的多聚核苷酸转移入和/或宿主细胞之间的自我复制核酸分子。该术语要包括功能主要用于将核酸分子插入细胞的载体、功能主要用于核酸复制的载体和功能用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供上述一个以上功能的载体。
如本文所用，“宿主细胞”包括任何单个细胞或细胞培养物，其可以或已经是载体的接受者或用于结合外来的多聚核苷酸和/或多肽。其还包括单个细胞的子代。由于天然、随机或有意的突变，子代可不必与原来的母细胞完全相同(在形态学上或在基因组或总DNA互补上)。细胞可为原核或真核的，并且包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，包括但不限于鼠、大鼠、猿或人细胞。如本文所用，“宿主细胞”还包括遗传修饰的细胞。术语“遗传修饰的细胞”包括含有和/或表达外来或外源性的基因或多聚核苷酸序列的细胞，其依次修饰细胞或其子代的基因型或表现型。“遗传修饰”还包括含有或表达已导入细胞的基因或多聚核苷酸序列的细胞。例如，在该实施方案中，将对于细胞来说是内源的基因导入遗传修饰的细胞中。术语“遗传修饰”还包括对于细胞的内源核苷酸的任何添加、缺失或断裂。如本文所用，“宿主细胞”还包括味觉细胞。在一个优选的实施方案中，味觉细胞是人味觉细胞。在优选的实施方案中，味觉细胞起源于人味蕾细胞。在另一个优选的实施方案中，味觉细胞是味觉细胞典型，例如：STC-1细胞、NCI-H716细胞或HuTu-80细胞。
更优选地，本文所用的RGS21蛋白包括由多聚核苷酸编码的RGS蛋白，所述多聚核苷酸在严谨条件下与编码RGS21蛋白的多聚核苷酸杂交。如本文所用，“杂交”包括一个或多个多聚核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物经由在核苷酸残基的碱基之间的氢键键合来保持稳定。可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它的序列-特异性方式产生氢键键合。该复合物可包含形成复合结构的双链，形成多链复合物的三链或更多链，单个自杂交链，或其任意组合。杂交反应可构成更广泛过程中的一步，例如：PCR反应的起始，或通过核酶的多聚核苷酸的酶切割。
可在不同的严谨条件下进行杂交反应。本发明包括能够在降低的严谨条件下，更优选在严谨条件下，并且最优选在高度严谨条件下与编码本文所述的RGS21蛋白的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。如本文所用，术语“严谨条件”指在60℃、10×Denhart氏溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精DNA中杂交过夜。继续将印迹以3×SSC/0.1％ SDS，随后以1×SSC/0.1％ SDS，并最后以0.1×SSC/0.1％ SDS，在62℃下每次冲洗30分钟。也如本文所用，在优选的实施方案中，短语“严谨条件”指在6×SSC溶液中65℃下杂交。在另一个实施方案中，“高度严谨条件”指65℃下在10×Denhart氏溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA中杂交过夜。继续将印迹以3×SSC/0.1％ SDS，随后以1×SSC/0.1％ SDS，并最后以0.1×SSC/0.1％ SDS，在65℃下每次冲洗30分钟。在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing andWiley-Interscience，纽约，1995；以及Tyssen，1993，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization with Nucleic AcidProbes.第I部分，第2章，Elsevier，纽约，1993中描述了核酸杂交的方法。因此，由本文所用的核酸编码的RGS21蛋白包括与在SEQ ID NO：1中所列的多聚核苷酸序列具有至少60％同源性，优选75％同源性，更优选85％同源性，优选90％同源性，最优选95％、96％、97％、98％、99％同源性的核酸，所述多聚核苷酸序列编码具有如在SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列的RGS21蛋白。
此外，本文所用的RGS21蛋白还可以是嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效与第二多肽相连的第一多肽。嵌合蛋白可选择性地包含与第一或第二多肽有效相连的第三、第四或第五或其它多肽。嵌合蛋白可包含两个或更多个不同的多肽。嵌合蛋白可包含同样多肽的多个拷贝。嵌合蛋白还可在一个或多个多肽中包含一个或多个突变。在本领域中已知用于制备嵌合蛋白的方法。在本发明的一个实施方案中，嵌合蛋白是RGS21蛋白与其它的RGS蛋白的嵌合体。在本发明的又一个实施方案中，嵌合蛋白是Gαi和其它Gα蛋白的嵌合体。
本发明提供了筛选大量化合物的方法，所述化合物选择性并特异性地与RGS21蛋白相互作用来调节味觉信号。这种方法包含：从宿主细胞中分离并纯化RGS21蛋白；体外测定纯化的RGS21蛋白与测试化合物的结合；在有结合于纯化的RGS21蛋白的测试化合物存在的情况下测定纯化的RGS21蛋白与纯化的Gα蛋白的结合；进一步在有结合于纯化的RGS21蛋白并调节纯化的RGS21蛋白与纯化的Gα蛋白的结合的测试化合物存在的情况下测定RGS21蛋白对于纯化的Gα蛋白的活性；以及鉴定结合于纯化的RGS21蛋白、改变纯化的RGS21蛋白与纯化的Gα蛋白的结合而且进一步调节RGS21蛋白活性的测试化合物。在一个优选实施方案中，RGS21蛋白活性是RGS21 GAP活性。
在又一个优选实施方案中，本发明提供了在宿主细胞中筛选抑制RGS21基因表达的大量化合物的方法。这种方法包含：制备选择性表达RGS21基因的宿主细胞；在缺少和存在测试化合物的条件下测定RGS21基因在所述宿主细胞中的表达；以及鉴定抑制RGS21基因在所述宿主细胞中表达的化合物。可以如vonBuchholtz等人，2004，Eur.J.Neurosci.，19，1535-1544所述应用反转录酶PCR来测定RGS21基因的表达。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供了在宿主细胞中筛选抑制RGS21蛋白表达的大量化合物的方法。这种方法包含：制备选择性表达RGS21基因的宿主细胞；在缺少和存在测试化合物的条件下测定RGS21蛋白在所述宿主细胞中的表达；以及鉴定抑制RGS21蛋白在所述宿主细胞中表达的化合物。
如本文所用，“分离的”或“纯化的”蛋白多聚核苷酸或分子指除掉其天然存在的环境，或基本上不含细胞物质，例如来自取得蛋白多聚核苷酸或分子的细胞或组织来源的其它污染蛋白，或当化学合成时基本上不含化学制剂前体或其它化学制剂。术语“基本上不含细胞物质”包括从细胞的细胞组分中分离的制剂，其中细胞组分为分离的或重组制备的或人工合成的。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞物质”包括与其它蛋白(此处还称为“污染蛋白”)具有小于大约30％(以干重计)的目的蛋白，更优选小于大约20％，进一步更优选小于大约10％，并且最优选小于大约5％的其它蛋白的制剂。当重组制备蛋白或多聚核苷酸时，还优选基本上不含培养基，即：培养基表现为小于大约20％，更优选小于大约10％，并且最优选小于大约5％的目的蛋白制剂的量。
本发明进一步提供了测定RGS21 GAP活性的方法。如本文所用，术语“GAPs”指GTP酶活化蛋白。包括RGS21蛋白的所有RGS蛋白是异源三聚体G蛋白的Gi和/或Gq类的α亚基的GAP。在本领域已知测定RGS GAP活性的方法，并且已经报道通过磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸(LPA)和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)，而不是通过其它的磷脂、磷酸肌醇或甘油二酯来抑制RGS GAP活性。
在一个优选实施方案中，通过测定GTP水解来体外测定RGS21 GAP活性。本发明表明将纯化的RGS21加入结合到GTP的Gαi蛋白中增加了GTP的水解率。因此，本发明提供了体外测定GTP水解的方法。在本领域已知体外测定GTP水解的方法。在一个优选的实施方案中，如果来自膜结合Gα蛋白的放射性损失提供了GTP水解的测定的话，本发明提供了结合放射性GTP的水解方法。在又一个优选实施方案中，本发明提供了-种用于RGS结构域GTP酶促进活性的直接基于荧光的试验(Willard等人，2005，Anal Biochem.15；340(2)：341-51)。该方法使用核糖共轭的荧光鸟苷酸类似物BODIPYFL-GTP作为光谱探针来测定由Gα的固有和RGS蛋白催化的核苷酸水解(Wiilard等人，2005，Anal Biochem.15；340(2)：341-51)。本发明表明当加入RGS21时，从Gα蛋白发射的BODIPY荧光的损失提供了GTP水解的测定。在又一个优选实施方案中，本发明提供了用于Gα和RGS21相互作用的时间分辨的荧光共振能量转移(TR-FRET)试验(Leifert等人，Anal Biochem.印刷中)。TR-FRET试验表现用于激酶活性定量的高灵敏和加强的高通量筛选(HTS)方法(Moshinsky等人，2003，J.Biornol.Sere.8(4)：447-452)。本发明表明了抑制Gα和RGS21相互作用的调节化合物降低了TR-FRET信号。本发明进一步表明了通过测定GTP水解来测定RGS21 GAP活性的方法不限于本文所介绍的方法，用于测定GTP水解的其它众所周知的方法也适于测定由于RGS21 GAP活性的GTP水解。
本发明进一步提供了筛选调节RGS21 GAP活性的化合物的文库的方法，即：本发明提供了鉴定RGS21蛋白调节子的方法或筛选试验。RGS21蛋白调节子包括含有以下部分(例如：肽、模拟肽、类肽、多聚核苷酸、小分子或其它药物)的化合物或试剂：(a)结合到如上定义的RGS21基因或蛋白，或(b)对于RGS21蛋白与其一个或多个其天然基质(例如：Gαi)的的相互作用有调节作用，或(c)对于如上定义的RGS21基因或蛋白的表达有抑制作用。这种试验一般包含在RGS21基因或蛋白与一种或多种试验组分之间的反应。另一个组分可为测试化合物自身，或测试化合物与RGS21基因或蛋白的结合伴侣的组合。
本发明的测试化合物通常是小分子或生理活性试剂。在一个优选实施方案中，测试化合物是小分子。在另一个优选实施方案中，测试化合物是生理活性试剂。生理活性试剂包括但不限于在哺乳动物中具有生物活性的天然存在或化学合成的化合物或分子(“生物分子”)，以及蛋白、肽、寡肽、多糖、核苷酸和多聚核苷酸。优选地，生理活性试剂是蛋白、多聚核苷酸或生物分子。本领域技术人员懂得该测试化合物的性质可依赖由RGS21基因所编码的蛋白或如上定义的蛋白的性质而改变。可从任何可利用的资源(包括天然和/或化学合成的化合物的系统文库)中获得本发明的测试化合物。
一般而言，用于筛选蛋白抑制剂或活化剂的方法和组分，以及体外和/或体内的蛋白-蛋白和蛋白-配体结合的研究为本领域所知，并可与本发明的方法组合应用。在一个实施方案中，本发明提供了筛选能抑制RGS21蛋白与G α蛋白结合的测试化合物的方法，所述方法是通过将测试化合物、分离和/或纯化的RGS21蛋白和分离和/或纯化Gα蛋白联合在一起，和测定在测试化合物存在的条件下RGS21蛋白和Gα蛋白的结合是否发生和/或改变。测试化合物可为小分子或生理活性试剂。如以下所述，可由本领域众所周知的各种文库提供测试化合物。在又一个实施方案中，本发明提供了涉及检测测试化合物抑制RGS21蛋白结合到Gα蛋白的能力的筛选试验。在又一个实施方案中，本发明也提供了RGS21表达、活性或结合能力的抑制子/调节子用于调控RGS21所调节的味觉信号。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供了筛选能够干扰RGS21蛋白与Gα蛋白结合的测试化合物的方法。该方法包括将分离和/或纯化的RGS21蛋白、测试化合物和分离和/或纯化的Gα蛋白组合；测定RGS21蛋白与Gα蛋白的结合；以及关联测试化合物干涉结合的能力，其中同缺少测试化合物相比较，在有测试化合物存在的条件下RGS21蛋白与Gα结合减少，表明测试化合物能够抑制结合。在一个优选实施方案中，在达到TR-FRET平衡同时或之后，将测试化合物在体外加入到分离和/或纯化的Gαi和RGS21蛋白，或其包含如上所定义的蛋白的生物学活性部分的功能性片段的孵化中。然后测定TR-FRET信号。本发明表明抑制Gα和RGS21相互作用的调节化合物降低了TR-FRET信号。
本发明还提供了实施高通量筛选能够抑制RGS21基因和/或如上所述的蛋白的活性或表达的测试化合物的方法。在一个具体实施方案中，高通量筛选的方法涉及在有适当的Gα蛋白存在的条件下将测试化合物与RGS21基因和/或蛋白组合，并应用如上所述的功能性试验来检测测试化合物对于RGS21基因和/或蛋白的作用。可将本领域众所周知的各种高通量功能性试验组合用于筛选和/或研究不同类型活化测试化合物的活性，但是因为该结合体系常常难以预测，所以可能需要设置大量试验来检测各种结合机制。本领域已知各种基于荧光的技术，并能高通量和极高通量进行活性筛选。以高灵敏度来筛选大量和各种测试化合物的能力容许分析潜在的RGS21抑制剂。本发明提供了通过在本领域已知的高通量试验或基于荧光的试验中将测试化合物与基因和/或蛋白组合，高通量筛选能抑制RGS21基因和/或蛋白的活性的测试化合物的方法。在一个实施方案中，高通量筛选试验检测了大量测试化合物结合RGS21基因和/或蛋白的能力。在另一个实施方案中，高通量筛选试验检测了大量测试化合物抑制RGS21蛋白结合伴侣(例如：Gα蛋白)结合到RGS21蛋白的能力。在又一个实施方案中，高通量筛选试验检测了大量测试化合物调节通过味觉信号转导的味觉信号的能力。
在又一个优选实施方案中，本发明提供了筛选大量化合物来增强甜味的方法。这种方法包含鉴定抑制RGS21蛋白活性的化合物(RGS21蛋白抑制剂)；测定由甜味剂单独的和与化合物(RGS21蛋白抑制剂)组合时通过甜味剂受体活化的甜味信号；以及鉴定增加所述甜味剂的甜味信号的化合物(RGS21蛋白抑制剂)。
本发明进一步提供了测定以上鉴定的调节化合物对于味觉细胞中的RGS21GAP活性的作用的方法。在优选的实施方案中，应用了监测甜味剂受体活化的标准信号试验。这种方法包括但不限于测定：a)在第二信使(例如：钙、IP₃、DAG、PIP₂、cAMP、cGMP等)的变化，b)在蛋白激酶活性(例如：PKA、PKC、GRK、ERK、Akt、Src、RTKs等)的变化，c)在甜味剂受体定位的变化，以及d)在味觉细胞膜电位的变化。如本文所用，“甜味剂受体”指涉及味觉信号转导途径的目前已知的以及新近发现的受体蛋白，包括但不限于GPCR的T1R家族和GPCR的T2R家族以及其亚型和同系物。
如本文所述，“甜味剂”包括但不限于：a)碳水化合物甜味剂，包括但不限于：蔗糖、葡萄糖、果糖、HFCS、HFSS、D-塔格糖、海藻糖、D-半乳糖、鼠李糖；b)化学合成的高效甜味剂，包括但不限于：阿斯巴特、纽甜、乙酰磺胺酸钾、三氯半乳蔗糖、环己基氨基磺酸钠、糖精、新橙皮甙二氢查尔酮；c)天然的高效甜味剂，包括但不限于：莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、杜尔可苷A、杜尔可苷B、甜茶甙、甜叶菊苷、罗汉果甙IV、罗汉果甙V、莫那亭(Monatin)、仙茅甜蛋白、甘草甜素、非洲竹芋甜素、莫那灵、马槟榔甜蛋白、Brazzein、莫那亭(Monatin)、Hernandulcin、甘茶素；d)多元醇，包括但不限于：赤藓醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、异麦芽糖醇；以及e)氨基酸，包括但不限于：甘氨酸、D-或L-丙氨酸、D-色氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸。
特别地，将如上定义的甜味剂对于这些信号“读数”的作用与同推测的RGS21调节化合物相结合的甜味剂的作用相比较。本发明表明RGS21蛋白抑制剂增强了观察到的甜味剂的作用。例如，如果单独甜味剂增加了胞内钙的释放，则甜味剂和RGS21抑制剂的组合与单独的甜味剂相比将增加钙释放。在另一个优选实施方案中，本发明还提供了用于筛选RGS21蛋白抑制剂和调节鲜味和苦味的调节子的方法。
此外，本发明提供了在人体中证实RGS21调节子对于人的甜味感觉以及鲜味和苦味感觉的作用的方法。在一个优选实施方案中，本发明提供了单独品尝测试甜味剂所感觉的甜度与品尝测试甜味剂和RGS21调节化合物的组合所感觉的甜度的比较。本发明表明RGS21抑制剂增加测试甜味剂所感觉的甜度，而RGS21增强子降低测试甜味剂所感觉的甜度。
此外，本发明提供了在味觉细胞中筛选特异性与RGS21蛋白相互作用或抑制RGS21蛋白的大量化合物的方法。这种方法包括：制备天然表达一种或多种味觉信号蛋白的味觉细胞，所述味觉信号蛋白包括甜味剂受体，例如：T1R2/T1R3，包含α亚基α-味蛋白的相应G-蛋白，效应子，例如PLCβ2，以及RGS21蛋白；从所述味觉细胞中分离并纯化RGS21蛋白；测定纯化的RGS21蛋白与测试化合物的体外结合；测定在有结合到纯化RGS21蛋白并调节纯化RGS21蛋白与纯化Gα蛋白结合的测试化合物存在的条件下，纯化RGS21蛋白与纯化Gα蛋白的结合；进一步测定在有结合到纯化RGS21蛋白并调节纯化RGS21蛋白与纯化Gα蛋白结合的测试化合物存在的条件下，RGS21蛋白对于纯化Gα蛋白的活性；以及鉴定结合到纯化RGS21蛋白、调节纯化RGS21蛋白与纯化Gα蛋白结合并进一步调节RGS21蛋白活性的测试化合物。在一个优选的实施方案中，RGS21蛋白活性是GAP活性。在另一个优选的实施方案中，味觉细胞起源于人味蕾细胞。在另一个优选的实施方案中，味觉细胞是味觉细胞典型，例如：STC-1细胞、NCI-H716细胞或HuTu-80细胞。
本发明进一步提供了包含用于增强甜味信号的RGS21基因和/或蛋白的抑制剂和/或调节化合物的组合物。本发明还提供了包含用于调节鲜味和苦味，而不仅仅是甜味的RGS21基因和/或蛋白的抑制剂和/或调节化合物的组合物。
当阅读了附加的说明和实施例时，本发明的这些和许多其它的变化和实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1
RGS21和Gα蛋白的重组表达
如von Bucholte等人(2004，Eur.J.Neurosci.19：1535-44)所述，应用RT-PCR从人味蕾mRNA中分离编码RGS21的cDNA(GenBank登录号NM_001039152)。如Willard等人(2005，Anal，Biochem.340：341-51)所述，将编码全长RGS21蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO：1，其编码SEQ ID NO：2)或编码RGS21的RGS盒的cDNA序列(编码在SEQ ID NO：2的位点21到137的氨基酸)克隆入用于重组蛋白表达和纯化的适当载体，例如适当的pGEX载体(GE Healthcare)中。在该实施例中，在大肠杆菌中表达重组RGS21，并加入N-末端胱甘肽S-转移酶标记来便于蛋白纯化。
如Willard等人(2005，Anal.Biochem.340：341-51)所述，将编码适当Gα1蛋白(例如：a-味蛋白、Gα_i2等)的cDNA克隆入pPROEXHTb原核表达载体(Invitrogen公司)。将可切除的的六组氨酸标记(His₆)加到Gα蛋白的N-末端上，并便于蛋白的纯化。
用如上所述的表达质粒转化BL21细菌，并用于制备RGS21和Gα蛋白。使转化的细菌在30-37℃下生长，并与异丙基β-D-硫代半乳糖苷一起孵育来诱导蛋白的表达。通过连续的Ni²⁺-次氮基三乙酸酯(HiTrap Chelating HP，Amersham)、阴离子交换(Source 15Q，Amersham)和体积排阻色谱法(HiPrep 26/60 SephacrylS200，Amersham)纯化His₆-Gα蛋白。应用谷胱甘肽琼脂糖和体积排阻色谱法纯化GST-RGS21(Willard等人，2005，Anal.Biochem.340：341-51)。
将RGS21和Gα蛋白二者择一地在感染杆状病毒群表达载体的Sf9昆虫细胞(von Buchholtz等人，2004，Eur.J，Neurosci.19：1535-44)或用适当的表达质粒转化的酵母细胞(Leifert等人，2006，Anal.Biochem.355，201-212)中表达。在所有情况下，应用如上所述的色谱法来从诱导的细胞溶解产物中分离重组蛋白。
实施例2
RGS21 GAP活性的体外测定和RGS21调节化合物的筛选
纯化的RGS21与结合有GTP的Gα_i蛋白的相互作用增加了GTP的水解率。应用以下方法来测定GTP的水解：
方法1.结合放射性GTP的水解：
在如Snow等人(1998，J.Biol.Chem.，273：17749-55)所述，在溶液中测定Gα GTP酶活性。简短来说，通过在有[γ-³²P]-GTP(500cpm/pmol)存在的条件下20℃下在以下缓冲液(150μl最终容积)中孵化Gα蛋白3小时来制备载有GTP的Gα_i1-3和Gα_味蛋白：10mM GTP、5.5mM CHAPS、50mM HEPES钠、pH7.5，1m MDTT、1mM EDTA、0.1mg/ml牛血清白蛋白、30mM(NH₂)₂SO₄和4％甘油。在负载之后，通过SephadexG-25色谱法将反应混合物交换入1mM CHAPS、50mM HEPES5pH7.5、1mM DTT、1mM EDTA、0.018mg/ml牛血清白蛋白中。然后将蛋白洗脱液用冰冷的OG缓冲液中(0.1％辛烷基葡萄糖苷、20mM HEPES钠，pH7.5，80mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、0.01mg/ml牛血清白蛋白和1mM GTP)稀释4倍。
在存在或缺少推测的RGS21调节化合物和OG缓冲液(补充有9mM MgSO₄)的条件下通过将Gα-GTP加入RGS21蛋白样品来起始GAP活性。定时，取100μl，并且用900ml 50mM NaH₂PO₄中5％(w/v)NoritA活性炭的悬浊液终止反应。沉淀活性炭颗粒，并且计数包含³²P_i的上清液。在上清液中增加的³²P_i表现出增强的GTP酶活性。
方法2.BODIPYFL-GTP的荧光光谱学：
当结合到Gα蛋白时，BODIPYFL-GTP显示了在荧光发射上超过基准200％的增加，而当结合到Gα蛋白时，由水解产生的BODIPYFL-GDP仅仅显示了在荧光发射上超过基准27％的增加(Willard等人，2005，Anal Biochem.340：341-51)。当加入RGS21时来自Gα蛋白的BODIPY荧光发射的损失提供了GTP水解的测定方法。将Willard等人(2005，Anal Biochem.340：341-51)所述的单个核苷酸结合和转换试验形式用于筛选RGS21调节化合物(图4)。
方法3.用于Gα和RGS21相互作用的时间分辨的FRET试验：
RGS21蛋白必须物理地结合到Gα_i上来刺激GTP酶活性(Neubig和Siderovski，2002，Nat.Rev.Drug Discov.1：187-97)。该试验应用时间分辨的FRET试验(TR-FRET)来监测RGS21和Gα蛋白的物理结合。分别使用相对于蛋白五倍摩尔过量的荧光染料，应用Alexa546氟和铽穴状化合物(Tb)螯合物来标记His₆标记的RGS21和His₆标记的Gαi蛋白(Leifert等人，2006，Anal.Biochem.355：201-12)。将固定在Ni-NTA柱上的重组RGS21和Gα蛋白与Alexa546顺丁烯二酰亚胺或铽穴状化合物顺丁烯二酰亚胺在室温下孵化2-3小时。在孵化之后，将包含Gα蛋白的柱用包含5mM咪唑和300mM NaCl(pH8.0)的缓冲液A(20mMHepes、10mM NaCl、1mM MgCl₂、10mM β-巯基乙醇、0.5％(w/v)聚氧乙烯-10-十二烷基醚和10μMGDP，pH8.0)冲洗来除去未结合的Alexa546或铽。应用缓冲液B(20mM Hepes，pH8.0，50mM NaCl，10mM β巯基乙醇、10μMGDP、1％(w/v)胆酸盐、50mM MgCl2、150mM咪唑、10mM NaF和30μM AlCl₃)从柱上洗脱标记的Gα蛋白。将包含His₆-Gα蛋白的洗脱部分汇聚，并用洗脱缓冲液透析(20mMHepes，pH8.0，3mM MgCl₂、10mM NaCl、30mMβ-巯基乙醇、1μM GDP和0.1％(w/v)胆酸盐)。将标记的His₆-RGS21蛋白从柱上用100mM NaCl、300mM咪唑、2mM 2-巯基乙醇、50mM NaH₂PO₄，pH6.0洗脱。将包含His₆-Gα蛋白的洗脱部分汇聚，并用洗脱缓冲液透析。
将Atexa546-RGS21在室温下在多孔盘中(例如：96孔等)与推测的调节化合物预孵化至少10分钟。同时，在FRET缓冲液(50mM Tris，pH8.0，100mMNaCl，1mM MgCl₂和1mM DTT)中将Tb-Gα蛋白与30μM AlCl₃和10mM NaF一起孵化至少10分钟，来形成Tb-Gα_i·GDP·AIF₄^-过渡态的“活化”复合物。在装备有TR-FRET测量系统的荧光读板仪内，通过将Tb-Gα_i·GDP·AIF₄^-与Alexa546-RGS21蛋白混合于100μl反应容积的50mMTris、pH8.0、100mM NaCl、1mM MgCl₂、30μM AlCl₃、10mM NaF和1mM DTT中起始TR-FRET反应，并孵化0-30分钟来。用以下仪器设置进行时间分辨的荧光测定：激发光340nm，发射光572nm，延迟50μs，并计数持续900μs。读数直到荧光发射稳定。在那个时候，加入其它组分例如未标记的Gα蛋白或RGS21，然后继续荧光读数直到荧光再次稳定为止。通过向孵育缓冲液中加入适当浓度的铽标记的蛋白来测定本底荧光，并暴露于相同的TR-FRET条件。将全部数据减去本底荧光以便测定动力学参数。在缺少任何调节化合物的条件下，在该时间段内达到饱和结合，可被观测为FRET信号的平台期作为作用时间(Leifert等人，2006，Anal.Biochem.355：201-12)。抑制Gα和RGS21的相互作用的调节化合物将降低TR-FRET信号，而增强Gα和RGS21的相互作用的调节化合物将增强TR-FRET信号。
实施例3
基于细胞的试验来鉴定通过改变味觉受体活化/脱敏作用来调节RGS21活性的化合物
为了测定推测的RGS21调节化合物在完整细胞中的作用，使用标准信号试验来监控包括甜味、鲜味和苦味受体的G-蛋白偶联受体信号。本文所用的更优选的标准信号试验可选自由以下方法组成的组：a)第二信使变化(例如：钙(Ca²⁺)、环核苷酸、脂类/代谢产物等)，b)蛋白激酶活性的变化(例如：PKA、PKC、GRK、MAP激酶、Akt、Src、受体酪氨酸激酶等)，c)味觉受体定位方面的变化和d)神经递质的释放(例如：ATP、GLP-1、CCK、5-羟色胺、PYY等)。本领域已知这些标准方法，并且详述如下。以下所述基于细胞的技术适用于异源性表达重组T1R2和T1R3味觉受体的细胞(例如：HEK293细胞、CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞等)，并且也适用于天然表达TIR2和T1R3的细胞(例如：培养的味蕾细胞、老鼠STC-1肠内分泌细胞、人NCI-H716肠内分泌细胞和人HuTu-80肠内分泌细胞等)。
基本试验设计是将甜味剂对于这些信号“读数”之一的作用与甜味剂同推测的RGS21调节化合物相结合的作用相比较。RGS21蛋白抑制剂显示观测到的甜味剂的作用的增强。例如，如果单独的甜味剂增加了胞内钙的释放，则甜味剂和RGS21抑制剂的组合使钙释放增加的水平高于单独的甜味剂。
A.基于细胞的胞内第二信使试验
环核苷酸的测定：可通过应用市售的非放射性Alphascreen cAMP试剂(Perkin-Elmer)测量其在细胞提取物中的数量来确定在环核苷酸(例如cAMP和cGMP)方面的变化。AlphaScreen cAMP试剂被设计用来直接测定当通过GPCR调节腺苷酸环化酶活性时产生的cAMP的水平。该试验是基于内源的cAMP和外源加入的生物素标记的cAMP之间的竞争。通过应用共轭到受体珠的特异性抗体来实现cAMP的捕获。该试验对于测定激动剂和拮抗剂对于Gαi-和Gαs-结偶联的GPCR都有效。GPCR的T1R和T2R家族活化味蛋白，其为一种Gαi家族G蛋白。
将表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)与结合受体珠的抗cAMP抗体一起放在多孔板的刺激缓冲液，pH7.4(包含0.5mM IBMX、5mM HEPES、0.1％ BSA)中。然后用经验浓度的佛司可林处理细胞使得超过30分钟时产生50％最大量的cAMP。不同浓度的促味剂(例如：蔗糖、天冬甜素等)与佛司可林和推测的RGS21调节化合物一起加入。在黑暗中孵化细胞30分钟，然后在黑暗中在细胞溶解缓冲液中与结合有生物素标记的cAMP(0.25U/μl)的链亲和素包被珠的混合物一起孵育4小时。在Perkin--Elmer Envision平板读数器中测定荧光信号。在该试验系统中，预计促味剂浓度升高将由于抑制腺苷酰环化酶而增加Alphascreen信号，所述腺苷酰环化酶减少了有效与生物素标记的cAMP和抗cAMP抗体珠竞争的胞内cAMP。
可选择的，可稳定地用质粒DNA转染典型味觉细胞，所述质粒DNA包含在含有cAMP敏感元件(CRE)的启动子序列的控制下编码转录报告蛋白(例如：荧光素酶、β-半乳糖苷酶等)。该试验监控由cAMP-敏感转录因子、cAMP敏感元件结合蛋白(CREB)活化的转录作用。所以，转染的细胞表达的转录报告蛋白与细胞中有效的cAMP量成比例。如Nguyen等人，2004，Cellular Signaling16：1141-51；Lee等人，2004，MoI.Endocrin.18：1740-55所述，将表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)铺在24孔平板上，并应用Lipofectamine试剂(Invitrogen)共转染CRE-荧光素酶(萤火虫)报告子质粒(0.4μg)和pRL-Tk(0.1μg)，其组成性表达Renilla荧光素酶来作为转染效率对照。然后在包含10mM HEPES和0.1％BSA，pH7.4的PBS中用经验浓度的佛司可林处理来使其在5-12小时后产生50％最大量的cAMP。在5-12小时内，不同浓度的促味剂(例如：蔗糖、天冬甜素等)随佛司可林和推测的RGS21调节化合物一起加入。将细胞裂解，应用市售可得的双荧光素酶试验试剂盒(Promega)按制造商的说明书来测定荧光虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性。将荧光虫荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性来使不同的转染效率标准化，并且作为促味剂浓度的log₁₀的参数绘图。
胞内钙的测定：可在整体模型的味觉细胞中通过监控钙敏感染料(例如：FURA-2，Fluo-3等)的荧光强度和发射光的变化来测定胞内钙的改变；这些染料是市售可得的。简短来说，将表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)铺在96孔平板上生长24小时，然后用补充有HEPES(pH7.4)、1.26mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂、0.4mM MgSO₄和0.1％BSA(称为Ca⁺⁺缓冲液)的Hank氏平衡盐液(GlBCO-BRL)漂洗两次，并在37℃下在含有1.0μM fura 2-AM的1ml相同缓冲液中孵化15分钟。然后用Ca++缓冲液冲洗培养物三次，并在Perkin-Elmer荧光平板读数器内在达到荧光反应(480nm激发光和535nm发射光)平均水平之前在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下与不同浓度的促味剂(例如：蔗糖、denatonium等)孵育20到30秒。在加入化合物之前校正测定本底荧光的数据，然后根据对钙离子载体ionomycin(1μM，Calbiochem)的反应标准化。
可选择的，可以通过用编码钙敏感的荧光蛋白：水母发光蛋白的质粒转染表达味觉受体和RGS21(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)来测定胞内钙释放的变化，所述蛋白在存在底物：腔肠动物荧光素(coelenterazine)的条件下当结合钙时荧光发射增加。水母发光蛋白对于钙的亲合力处于低微摩尔的范围，并且酶的活性与在生理学范围内的钙浓度(50nM到50μM)成正比(Brini等人，1995，J.Biol.Chem.270：9896-9903；Rizzuto等人，1995，Biochcm.Biophys.Res.Cornmun.126：1259-1268)。
用传统方法对于磷酸肌醇的测定：甜味剂导致在典型味觉细胞中酶PLC-β₂的活化。该酶将磷脂酰肌醇二磷酸(PIP₂)裂解为第二信使：肌醇三磷酸(IP₃)和二脂酰甘油(DAG)。可以应用阴离子交换色谱法(Paing等人，2002，J.Biol.Chem.277：1292-1300)通过测量放射性标记的磷酸肌醇的水解来监控在PIP₂上的变化。用[³H]标记的肌-D-肌醇标记表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)，并且将细胞培养基替换为10mM HEPES缓冲液和包含1mg/ml BSA的20mM氯化锂。然后在37C下用各种浓度的促味剂(超过2-3对数单位)刺激细胞直至30分钟，在室温下用50mM甲酸提取45分钟，然后用150mM NH₄OH中和。然后直接将细胞提取物上阴离子交换AG1-X8树脂(100-200粒度，Bio-Rad)柱，用H₂O冲洗，然后用50mM甲酸铵冲洗，并且用1.2M甲酸铵、0.1M甲酸洗脱。用闪烁计数法量化在该试验中洗脱的肌醇单、二和三磷酸盐。
可选择地，可应用IP₃ alphascreen试验来测量IP₃的产量，其类似于如上所述的cAMP Aiphascreen试验。IP3 alphascreen试验测定细胞IP₃的能力，其经由PLC-β₂的甜味剂受体活化而应答产生，与生物素标记的IP3珠竞争结合包含IP₃结合蛋白的受体珠。从而，预计增加甜味剂浓度将提高IP₃的细胞浓度，其然后将导致alphascreen信号的剂量依赖性下降。将放在96孔平板上生长的表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下用提高浓度的促味剂(例如：蔗糖、denatonium等)孵育30秒(在PBS/Hepes pH7.4中)。然后裂解细胞，并按制造商的说明书用alphascreen试剂孵育，并用PerkinElmer荧光平板读数器测定荧光信号。
B.蛋白激酶活性的基于细胞的试验
已经表明甜味剂受体的活化是活化经由的丝氨酸/苏氨酸激酶，ERKs 1和2(Ozeck等人，2004，Eur.J.Pharm.489：139-49)。除ERK之外，很多其它的激酶也经由G_i信号途径活化，包括丝氨酸/苏氨酸激酶，例如Akt和受体酪氨酸激酶，如表皮生长因子受体(EGF-R)酪氨酸激酶。可在实验上测定的许多激酶活化中的主要步骤是激酶自身的磷酸化作用。例如，测定ERK1和2活化程度的最普遍方式是使用特异于磷酸化的和因此活化形式的ERK的抗体，通过免疫测定或免疫印迹方法测定。
所以，为了测定甜味剂受体活化作用对于ERK1、ERK2、Akt、MEK和EGF-R活性的作用，通过平板免疫或通过免疫印迹使用磷酸化激酶抗体研究来自处理过的典型味觉细胞的细胞提取物。在由用甜味剂处理的典型味觉细胞制备的细胞提取物中发现的磷酸化激酶量与甜味剂浓度成正比。所以，该体系对于测定推测的RGS21调节化合物对于甜味剂受体活化的作用也有用，其通过用甜味剂和推测的RGS21调节化合物处理典型味觉细胞，然后使用特异于磷酸化激酶的抗体来测定磷酸化激酶在结果细胞提取物中的数值来实现。
C.味觉受体定位上的变化的测定
大多数GPCR(例如：β₂-肾上腺素受体、胰高血糖素样肽受体和GABA(B)受体)的激动剂刺激诱导其经由胞吞作用内化入细胞(Moore等人，2007，Annu.Rev.Physiol，69：451-482)，并且受体内化作用已经广泛用作受体活化的方法。可以应用各种方法测定T1R2/T1R3的内化，包括基于荧光显微术的影像、内涵体的亚细胞分级分离以及细胞表面受体的不同生物化学修饰(例如：用放射性碘的细胞表面生物素标记、碘化作用等)。
通过荧光显微术来测定味觉受体定位：作为基于荧光显微术的影像方法的实例，将T1R2和/或T1R3与荧光蛋白融合(例如：绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(DsRed)或这种荧光蛋白的任何光学变体(例如：黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等))。然后将遗传上修饰的T1R2/T1R3受体对在适当的哺乳动物细胞(例如：HEK293、CHO、HeLa、COS、MDCK、HepG2等)中异源表达。这些细胞在显微镜用载玻片或盖玻片上生长，然后在37℃下在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下用甜味剂刺激0-3小时。使用活细胞或固定细胞的荧光显微术来测定荧光素标记的T1R2和/或T1R3的定位。在未刺激的细胞中，T1R2/T1R3主要定位于质膜，其可用各种荧光染料(例如：FM1-43等)标记。在甜味剂刺激之后，将T1R2/T1R3再分布到内涵体，其可在用活细胞孵化10-30分钟之后用荧光素标记的铁传递蛋白标记。
可选择地，用荧光素标记的探针(例如：抗体、配基等)来标记细胞表面T1R2和/或T1R3。该方法适用于异源表达T1R2/T1R3的细胞或天然表达T1R2/T1R3的细胞。在这种情况下，在显微镜用载玻片或盖玻片上培养细胞，并在4℃下用荧光素标记的探针孵化0-60分钟。然后在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下将细胞与甜味剂一起加热到37℃ 0-3小时。使用活细胞或固定细胞的荧光显微术(例如：落射荧光、共聚焦等)来确定荧光素标记的T1R2和/或T1R3的定位。在未刺激的细胞中，T1R2/T1R3主要定位于质膜，其可用各种荧光染料(例如：FM1-43等)标记。在甜味剂刺激之后，将T1R2/T1R3再分配给内涵体，其可在用活细胞孵化10-30分钟之后用荧光素标记的铁传递蛋白标记。
通过亚细胞分级分离来测定味觉受体定位：在一个实施方案中，使用亚细胞分级分离来测定T1R2/T1R3对内涵体的定位，其中通过机械剪切来破碎，并通过高低速离心的组合以及与密度基质(例如：蔗糖、聚蔗糖等)的应用的可能结合来分离表达T1R2/T1R3(例如：异种表达或天然表达)的细胞。从离心管中收集片段(fraction)，并通过SDS-PAGE和免疫印迹研究T1R2和/或T1R3蛋白的存在。
通过细胞表面受体的差别化学修饰来测定味觉受体定位：在一个实施方案中，在用甜味剂加或不加推测的RGS21调节化合物孵化(0-3小时)之前(时间零点)和之后，用细胞不通透化学试剂(例如：功能化生物素交联剂、放射性碘化剂、标记的甜味剂等)直接标记细胞表面T1R2/T1R3受体。通过如免疫沉淀技术分离T1R2/T1R3受体，并且研究标记的味觉受体的分布量。在休眠细胞中，味觉受体主要存在于细胞表面，而因此预计这些细胞包含标记的表面味觉受体的量最大。当甜味剂刺激时，味觉受体的内化作用将降低细胞表面味觉受体的数值，并且在从休眠细胞(时间零点)中和从用甜味剂处理的细胞中获得的信号之间的差异而提供了受体内化作用的测量方法。
监控荧光标记的β-抑制蛋白易位到质膜上：大多数GPCR变得钝化，并且不能激发进一步的胞内信号(Moore等人，2007，Annu.Rev.Physiol.，69：451-482)。两个主要步骤促进了GPCR的脱敏作用：受体磷酸化和与多功能支架蛋白β-抑制蛋白的结合。在休眠细胞中，β-抑制蛋白主要存在于细胞的细胞质中，但在激动剂刺激之后几分钟内移位到质膜上与磷酸化GPCR结合。在表达荧光素标记的β-抑制蛋白(例如：β-抑制蛋白-GFP嵌合蛋白)的细胞中可以观察到这种β-抑制蛋白向质膜的移位。在一个实施方案中，用编码β-抑制蛋白-GFP的质粒稳定转染表达T1R2/T1R3的细胞(例如：表达这些味觉受体的HEK293细胞、培养的味蕾细胞、培养的人HuTu-80肠内分泌细胞等)。这种细胞在显微用载玻片或盖玻片上生长，并且在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下用甜味剂刺激0-3小时。通过使用荧光显微术在活细胞或固定细胞中确定β-抑制蛋白的定位。将β-抑制蛋白-GFP从细胞质向质膜的移位用作甜味剂受体活化的测量方法。
D.测定神经递质和神经肽的释放
已经证明味觉细胞及其它细胞类型(例如：肠内分泌细胞)应答于促味剂而释放神经肽(包括：GLP-1、CCK、PYY和5-羟色胺)；除ATP之外。使用萤光素/萤光素酶荧光试验体系来定量ATP分泌。使用竞争性ELISA/RIA方法定量神经肽分泌，并且就GLP-1而言举例描述如下。
ATP分泌的测定：味觉细胞信号中最后和最主要的步骤是神经递质的释放，其进一步刺激传入神经纤维。Kinnamon和同事已经表明ATP是关键的“神经递质”，其从味觉细胞分泌，并与特异嘌呤源，ATP-结合的，神经纤维上的受体相互作用(Finger等人，2005，Science 310：1495-99)。将表达味觉受体和RGS21的细胞(例如：人HuTu-80肠内分泌细胞、味蕾细胞、转染的HEK细胞等)放在96孔平板上生长，用包含10mM HEPES和0.1％BSA，pH7.4的PBS漂洗，然后在37℃下在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下在相同的缓冲液中用各种浓度的促味剂(超过2-3对数单位)刺激0-30分钟。收集刺激细胞的培养基的样品，然后使用用于ATP的市售可得的荧光试验(例如：ATPlite试验、Perkin-Eimer)测定ATP的浓度。
胃肠肽分泌的测定：已知肠内分泌细胞(例如HuTu-80细胞)应答于味觉受体刺激而分泌胃肠肽(例如：肽YY(PYY)、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胃促胰岛素肽(GIP)等)(Rozengurt，2006，Am.J.Physiol Gαstrointest Liver Physiol.291：G171-G177)。为了测定G1肽从HuTu-80细胞中的分泌，可以使用竞争性的ELISA或RIA。举例来说，可以使用市售可得的竞争性酶促免疫测定来测定GLP-1的分泌(例如：Cosmo Bio有限公司)。简短来说，HuTu-80细胞在多孔板(例如：6孔、12孔等)中生长，在包含10mM HEPES和0.1％BSA的PBS，pH7.4中漂洗，然后在37℃下在存在或缺少推测的RGS21调节化合物的条件下在相同的缓冲液中用各种浓度的促味剂(超过2-3对数单位)刺激0-30分钟。收集刺激HuTu-80细胞的培养基的样品，并加入96孔平板上，所述平板的表面包被有山羊抗GLP-1抗体、以及生物素标记的GLP-I标准物和兔子抗GLP-1抗体。在4℃下黑暗中孵化平板16-18小时过夜。用PBS，pH7.4冲洗孔，并在室温下黑暗中用链亲和素-HRP孵化1小时。在除去链亲和素-HRP并用PBS，pH7.4冲洗之后，加入o-间苯二胺盐酸盐底物溶液，并在室温下黑暗中进行反应30分钟。终止反应，并在492nm处测定孔的光吸收值。与标准曲线相比来测定分泌的GLP-I的数值，所述标准曲线由平行做的已知量的重组GLP-1来产生。
实施例4
应用基于细胞的试验鉴定通过破坏RGS21蛋白-蛋白的相互作用来调节RGS21活性的化合物
应用FRET测定味觉受体、Gα和βγ蛋白的相互作用：可使用荧光共振能量传递(FRET)方法在活细胞中监控蛋白-蛋白的相互作用。FRET的基础是当两种包含适当的FRET供体和受体荧光团(例如：YFP和CFP)的蛋白彼此结合或彼此在10-100A的区域之内时，在荧光团之间存在能量的辐射传递以致于来自供体荧光团的辐射能量(例如：CFP)刺激受体荧光团(例如：YFP)。结果是观察到受体荧光团(例如：YFP)的荧光发射应答于由供体荧光团(例如：CFP)的激发。因此，正FRET信号表现出两个蛋白之间的紧密的相互作用。因为RGS21必须与活化Gα蛋白相互作用来促进GTP水解，所以FRET可用于监控在RGS21和Gα的活化形式之间的相互作用。
在一个实施方案中，将每个带有用于FRET分析的适当的荧光团(例如：Gα-YFP+RGS21-CFP等)的一对蛋白相互作用对在适当的细胞体系中共表达(例如：HEK293、CHO、HeLa、COS、BHK、Sf9昆虫细胞、酵母等)。使用本领域技术人员已知的标准分子生物学方法来制备嵌合蛋白，借此将YFP融合到Gα_味蛋白，将CFP融合到RGS21中，并将嵌合蛋白克隆入适当的蛋白表达载体(例如：pcDNA3.1等)。将蛋白对稳定地转染入宿主细胞中。就Gα_味蛋白-YFP+RGS21-CFP而言，休眠细胞预计产生低的FRET信号，因为Gα-_味蛋白将处于GDP结合状态，从而与Gβ₃Gγ₁₃形成结合体而非与RGS21形成结合体。用促味剂或用AlF₄-刺激的细胞预计显示出FRET信号上的增加。
在显微镜用载玻片或多孔平皿中培养表达Gα_味蛋白-YFP+Gβ₃-CFP+Gγ₁₃的细胞，并在37℃下用推测的RGS21调节化合物预孵化至少10分钟。然后在存在和缺少推测的RGS21调节化合物的条件下用30μM AlCl₃和10mM NaF(AlF4^-)或用各种浓度的促味剂(超过2-3对数单位)刺激细胞。就单细胞而言，在装有适当的光学滤镜的荧光显微镜下测定FRET来检测活细胞，并且通过用通过适当的图像分析软件控制的冷却的CCD摄像机测定产生FRET的荧光信号来定量FRET信号。就中到高通量化合物筛选而言，将在荧光平板读数器中研究多孔板(例如：96孔等)中细胞的生长。
酵母双杂交试验测定味觉受体、Gα和βγ蛋白的相互作用：在另一个实施方案中，可应用酵母双杂交试验在酵母细胞中测定Gα_味蛋白与Gβ₁₃γ₁₃的相互作用(Young等人，2004，Methods Enzymol，389：277-301)。在一个实施方案中，将RGS21的cDNA插入缺乏内源酵母RGS蛋白Sst2的酵母菌株(例如：S.cerevisiae)中，所述内源酵母RGS蛋白Sst2通常使酵母Gα亚基Gpa1失活。还通过应用本领域技术人员众所周知的分子生物学方法，设计该酵母菌株来表达在FUS1启动子控制下的Renilla荧光素酶报告子基因。在该体系中，经由酵母α-因子受体GPCR的酵母信息素信号途径活化导致信号途径的刺激作用，其促进了FUS1驱动的荧光素酶蛋白的表达。对于亲代Sst2缺失菌株的比较表明当信息素刺激作用时，RGS21给予的抑制水平钝化了在亲代菌株中观察到的荧光素酶的去阻遏活化作用。因此，将表达RGS21和FUS1-荧光素酶DNA构建体的细胞与推测的RGS21调节化合物(例如：化学制剂文库、天然产物文库等)一起孵育，然后用α-因子信息素刺激。RGS21的抑制剂预计减轻信息素诱导的荧光素酶的抑制。
在另一个实施方案中，将RGS21与Gal4转录活化结构域相融合，并将Gα_味蛋白的组成性活化突变体(Q204L)与Gal4的DNA结合结构域相融合。将这些DNA构建体稳定地整合入表达报告子基因(例如：荧光素酶、β-半乳糖苷酶、CAT等)的酵母菌株中，所述报告子基因的表达由基础启动子和一些上游Gal4结合部位控制。预计Gα味蛋白Q204L形成与RGS21的组成性结合，从而产生高水平的报告子基因活性。所以，预计任何降低报告子基因活性的化合物是RGS21的抑制剂。
实施例5
RGS21调节化合物在人味觉测试中的作用的证实
比较了单独品尝测试促味剂(例如：甜味剂、味香的化合物或苦味、促味剂)所感觉的强度同品尝测试促味剂和RGS21调节化合物的组合所感觉的强度。预计候选的RGS21增强子降低了测试促味剂所感觉的强度，而预计RGS21抑制剂增强了测试促味剂所感觉的强度。在一个特定实施方案中，使用评判小组来测量测试促味剂溶液的强度。简短来说，在从样品最初放入口开始直到其吐出之后3分钟内的一些时间点上，评判小组(通常8到12人)被训练来评价味道强度感受，并测定强度。应用统计分析，在包含添加剂的样品和不包含添加剂的样品之间比较结果。在样品清理口腔之后测定的时间点上得分下降，表明存在促味剂感受的降低。
可应用本领域众所周知的程序来训练评判小组。在特定的实施方案中，应用SPECTRUM描述性分析方法(SPECTRUM Descriptive Analysis Method)训练评判小组(Meilgaard等人，Sensory Evaluation Techniques，第三版，第11章)。训练的中心理想地应该识别并测定基本味道；具体地说，甜、咸、酸、鲜和苦味。为了确保结果的精度和再现性，每个评判员将针对每种样品重复测定促味剂强度大约三到大约五次，在每次重复和/或样品之间间隔至少五分钟，并用水冲洗来清洗口腔。
通常，测量促味剂强度的方法包含取10mL样品放入口腔，保持样品在口腔中5秒，并使样品在口腔中轻轻形成漩涡。在5秒之后评估感觉到的促味剂强度，吐出样品(在吐出样品后不吞咽)，喝一口水冲洗口腔(例如：像漱口一样在口腔中有力地使水流动)然后吐出冲洗的水。当吐出冲洗的水时立即评估感觉到的促味剂强度，等待45秒；当等待45秒时，鉴定感觉出的味道强度最大量的时间，并在那个时候评估这个强度(通常移动口腔并按需要吞咽)。在样品之间，取5分钟的间隔，用水冲洗来清洗口腔。
附录
RGS21的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(GenBank登录号NM_001039152)
GGTTACCACTTGGAAAACAATTCATCTGAAAGAAGCACAGATTTTCTCATCTATC
CTGTCAACAAAGAAAGAATCAAGAGAGCAAGGACAGTGATTTCCCCCGCATTGC
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TTGATATTTCTGCTTTTAGATTGTTTGAACATTAAAAAATGGAGGAAAAATAGCA
TGGCTTATTTTATGTTTTCACAAACTACTCATTTGATAGACAAAATTTTGTCTTCC
CTTCATCATGAGAAATAAACATTTAAACATATTCAAA
RGS21的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)(GenBank登录号NM_001034241)
MPVKCCFYRS PTAETMTWSE NMDTLLANQA GLDAFRIFLK SEFSEENVEF
WLACEDFKKT KNADKIASKA KMIYSEFIEA DAPKEINIDF GTRDLISKNI
AEPTLKCFDE AQKLIYCLMA KDSFPRFLKS EIYKKLVNSQ QVPNHKKWLP FL