快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110314558.3	申请日：	2011.10.17
公开号：	CN102329883A	公开日：	2012.01.25
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20120125\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20111017\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12Q1/04	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心
发明人：	陈信忠; 郭书林; 龚艳清; 林立; 陈垚; 杨俊萍; 孔繁德; 徐淑菲; 叶妍妍
地址：	361026 福建省厦门市海沧区建港路2165号
优先权：
专利代理机构：	厦门市新华专利商标代理有限公司 35203	代理人：	李宁
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内容摘要

本发明公开了一种快速检测鉴定李斯特菌的PCR-RFLP方法及检测用试剂盒，包括如下步骤：1）基因组DNA模板的制备；2）PCR扩增反应：通过李斯特菌iap基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3）PCR产物检测：凝胶电泳检测PCR产物；4）限制性内切酶消化反应：用DdeⅠ内切酶对PCR产物进行酶切；5）酶切产物检测：凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

权利要求书

1：一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于：包括如下步骤： 1）基因组 DNA 模板的制备； 2） PCR 扩增反应：通过李斯特菌 iap 基因特异引物对，进行 PCR 扩增反应； 3） PCR 产物检测：凝胶电泳检测 PCR 产物； 4）限制性内切酶消化反应：用 Dde Ⅰ内切酶对 PCR 产物进行酶切； 5）酶切产物检测：凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。
2：如权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于：所述的步骤 5）中比对方法为：当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。
3：如权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述步骤 2）中 PCR 扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为：上游引物 5’ -ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3’ ；下游引物 5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。
4：如权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述步骤 2）中 PCR 扩增反应的反应液组成如下： 10× 扩增缓冲液　 5 μL ；　 4 种 dNTP 混合物　各 200 μmol/L ；引物对　各 0.5 μmol/L ；　　 DNA 模板　　 2 μg ；　　 Taq DNA 聚合酶　 2 u；　　 MgCl2　　　　　 1.5 mmol/L ；　加 ddH2O 至　 50 μL。
5：如权利要求 4 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述 PCR 扩增反应条件如下： 95 ℃变性 3 min ； 95 ℃变性 15 S、 58 ℃变性 30 S、 72 ℃变性 45 S，进行 35 个循环扩增； 72 ℃延伸 5 min。
6：如权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述步骤 4）中限制性内切酶消化反应体系按 20 μL 计如下所示： PCR 扩增后的产物 DNA 0.2-1 μg ；10× 酶切 buffer 2.0 μL ；限制性内切酶 Dde Ⅰ 1-2 u ；加 ddH2O 至 20 μL。
7：如权利要求 6 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述限制性内切酶 Dde Ⅰ消化反应的反应条件如下：按上述配比先加入 PCR 扩增后的产物 DNA， 10× 酶切 buffer，加 ddH2O 至 20 μL，最后加入限制性内切酶 Dde Ⅰ，轻轻混匀，稍加离心，放置于水浴温育。
8：如权利要求 7 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，其特征在于所述水浴温度为 37 ℃，温育时间为 1 h。
9：如权利要求 1 所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法所用的试剂盒，其特征在于包括如下组成：李斯特菌 iap 基因特异引物对，限制性内切酶 Dde Ⅰ，酶切标准图 2 谱和阳性对照液。

说明书

快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法及检测用试剂盒
    【技术领域】
     本发明涉及一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法及检测用试剂盒。背景技术目前国际上公认的李斯特菌共有 6 种：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes ，简称单增李斯特菌）、绵羊李斯特菌 (Listeria ivanovii )、英诺克李斯特菌 (Listeria innocua )、威尔李斯特菌 (Listeria welshimeri )、格氏李斯特菌 (Listeria grayi ) 和西尔李斯特菌 (Listeria seeligcri )。其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在 4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一， 2000 年被 WHO 食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一；绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；近期有国内外报道，英诺克李斯特菌存在于食品中，当其发生由非溶血性变为溶血性的变异时，对人类具有一定的潜在致病性；其余 3 种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。目前，人们对这几种李斯特菌的分布状况不甚明了，为了能调查清楚不同李斯特菌的分布环境，首先需要发展适宜的检测鉴定几种李斯特菌的方法。
     掌握食品被李斯特菌污染状况是获得安全食品的重要一步，也是防止食物中毒，保障人民健康的最有效的一步。
     按传统的生化鉴定方法检测鉴定李斯特菌时，有时会造成漏检，国内外已有多次非典型菌株缺少典型特征的报道；同时通过传统生化鉴定方法不易于做 6 种李斯特菌的种间区分。鉴于此，通过分子生物学方法鉴定李斯特菌得到了广泛的发展，然而目前这些方法主要是做李斯特菌属的鉴定。PCR-RFLP（PCR-restriction fragment length polymorphism）方法常被用来做鉴定物种的方法。，该方法将 PCR 技术、 RFLP 分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶 DNA 片段进行复制扩增，然后应用 DNA 限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶 DNA 片段是否被切割而分型。该方法操作简单，结果容易判定。
     发明内容为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种检测和鉴别单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌的 PCR-RFLP 方法及检测用试剂盒。本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
     为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案，
     一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，包括如下步骤： 1）基因组 DNA 模板的制备； 2） PCR 扩增反应：通过李斯特菌 iap 基因特异引物对，进行 PCR 扩增反应； 3） PCR 产物检测：凝胶电泳检测 PCR 产物； 4）限制性内切酶消化反应：用 Dde Ⅰ内切酶对 PCR 产物进行酶切； 5）酶切产物检测：凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。
     所述的步骤 5）中比对方法为：当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。
     所述步骤 2）中 PCR 扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为：上游引物 5'-ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3’ ；下游引物 5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。
     所述步骤 2）中 PCR 扩增反应的反应液组成如下： 10× 扩增缓冲液　 5 μL ；（购于 FERMENTAS 公司）　 4 种 dNTP 混合物　各 200 μmol/L ；（购于生工生物工程（上海）有限公司）　引物对　各 0.5 μmol/L ；　　 DNA 模板　　 2 μg ；　　 Taq DNA 聚合酶　 2 u；　（购于生工生物工程（上海）有限公司）　 MgCl2　 1.5 mmol/L ；　加 ddH2O 至　 50 μL。
     所述 PCR 扩增反应条件如下： 95 ℃变性 3 min ； 95 ℃变性 15 S、 58 ℃变性 30 S、 72 ℃变性 45 S，进行 35 个循环扩增； 72 ℃延伸 5 min。
     所述步骤 4）中限制性内切酶消化反应体系按 20 μL 计如下所示： DNA（PCR 扩增后的产物）0.2-1 μg ； 10× 酶切 buffer 2.0 μL ；（购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司）限制性内切酶 Dde Ⅰ 1-2 u ；（购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司）加 ddH2O 至 20μL。
     所述限制性内切酶 Dde Ⅰ消化反应的反应条件如下：按上述配比先加入 DNA（PCR 扩增后的产物）， 10× 酶切 buffer，加 ddH2O 至 20 μl，最后加入限制性内切酶 Dde Ⅰ，轻轻混匀，稍加离心，放置于水浴温育。
     所述水浴温度为 37℃，温育时间为 1h。
     一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法所用的试剂盒，包括如下组成：李斯特菌 iap 基因特异引物对，限制性内切酶 Dde Ⅰ，酶切标准图谱（见图 3）和阳性对照液（iap 基因标准品） iap 基因标准品序列见 GenBank。试剂盒中其它组成，可按本领域常规进行选择。试剂盒实施步骤按上述的快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法的步骤进行。
     本发明的有益效果是：本发明建立了检测和鉴定 5 种李斯特菌的 PCR-RFLP 方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用 PCR 扩增技术，使得检测 5 种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用 RFLP 技术，一次即可对 5 种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述：本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通 PCR 更为快速、简便，可实现对 5 种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。附图说明图 1 为本发明具体实施例 1 中标准菌珠的 PCR 扩增产物电泳图； M、 Marker， 1、格氏李斯特菌， 2、单增李斯特菌， 3、威尔李斯特菌， 4、绵羊李斯特菌， 5，英诺克李斯特菌；图 2 为本发明具体实施例 1 中标准菌珠的 PCR-RFLP 产物电泳图； M、 Marker， 1、格氏李斯特菌， 2、单增李斯特菌， 3、威尔李斯特菌， 4、绵羊李斯特菌， 5，英诺克李斯特菌；图 3 为酶切标准图谱； M、 Marker， 1、格氏李斯特菌， 2、单增李斯特菌， 3、威尔李斯特菌， 4、绵羊李斯特菌， 5，英诺克李斯特菌。
     具体实施方式实施例 1 本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法，包括如下步骤： 1）基因组 DNA 模板的制备；取疑似菌落的细菌培养液 1 ml，置于无菌的 Eppendorf 管中， 12000 rpm 离心 1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入 400μL 裂解液（40 mmol/ L Tris- 醋酸， 20 mmol/L 醋酸钠， 1 mmol/L EDTA， 1%SDS， pH7.8）混匀，置于 37 ℃水浴 1 h； . 然后加入 200μL 5mol/L 的氯化钠溶液，混匀后于 13000 rpm 离心 15 min。取上清液，用苯酚抽提 2 次，氯仿抽提 1 次；加两倍体积无水乙醇， 1/10 体积醋酸钾 (3 mol/L ,pH8.0)， -20 ℃保存 1 h 后， 13000 rpm 离心 15 min，弃上清液，沉淀用 70% 乙醇洗 2 次；置于室温干燥后，溶于 50μL TE 溶液中，置 4℃保存备用。
     2） PCR 扩增反应：通过李斯特菌 iap 基因特异引物对，进行 PCR 扩增反应；（1）引物：根据相关文献，选择一对引物为李斯特菌属的特异性扩增反应引物。用于 PCR 反应的引物对的序列为：上游引物： 5’ -ATGAATATGAAAAAAGCAAC-3’ ，下游引物： 5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3' ；李斯特菌的特异性 PCR 产物大小均为 1400 bp 左右。
     （2）PCR 反应： PCR 反应液组成如下： 10× 扩增缓冲液 5 μL （；购于 FERMENTAS 公司）　 4 种 dNTP 混合物　各 200 μmol/L ；（购于生工生物工程（上海）有限公司）　引物对各 0.5 μmol/L ；　　 DNA 模板　　 2 μg ；　　 Taq DNA 聚合酶　 2 u；　（购于生工生物工程（上海）有限公司）　 MgCl2　　　 1.5 mmol/L ；　加 ddH2O 至　 50 μL。
     PCR 扩增反应条件如下： 95 ℃变性 3 min ； 95 ℃变性 15 S、 58 ℃变性 30 S、 72 ℃ 变性 45 S，进行 35 个循环扩增； 72 ℃延伸 5 min。
     （3） PCR 产物电泳检测：取扩增后的产物 5 μL 点样于 1% 琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/ml 溴化乙锭），以 2000 bp Marker 为标准分子参照，以 5 V/cm 的电场强度于 0.5×TBE 电泳缓冲液中电泳 30 min ；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；见图 1，从图 1 可得： 5 种李斯特菌均产生 1400 bp 左右的特异性扩增条带。根据待检样品的电泳图是否出现 1400 bp 左右的特异性扩增条带可初步判定是否含为 5 种李斯特菌。
     PCR 产物的序列鉴定：切下带有所需 DNA 片段的凝胶，用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（TAKARA）（购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司）从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段； DNA 测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明， PCR 扩增片段与预期一致。
     4）限制性内切酶 Dde Ⅰ消化反应限制性内切酶消化反应体系如下所示： DNA（PCR 扩增后的产物）0.2-1 μg ； 10× 酶切 buffer 2.0 μL ；（购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司）限制性内切酶 Dde Ⅰ 1-2 u ；（购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司）加 ddH2O 至 20 μL。限制性内切酶 Dde Ⅰ消化反应条件如下：按上述配比先加入 DNA（PCR 扩增后的产物）， 10× 酶切 buffer，加 ddH2O 至 20 μL，最后加入限制性内切酶 Dde Ⅰ，轻轻混匀，稍加离心，放置于温度为 37 ℃水浴温育 1 h。
     PCR-RFLP 的消化产物电泳鉴定：取消化反应后的产物 10 μL 点样于 1% 琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/ml 溴化乙锭），以 2000 bpMarker 为标准分子参照，以 5 V/cm 的电场强度于 0.5×TBE 电泳缓冲液中电泳 30 min ；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；其中利用标准菌株进行上述 PCR-RFLP 的消化反应后电泳图为标准菌珠的 PCR-RFLP 产物电泳图，见图 2，从图 2 可得：经限制性内切酶 Dde Ⅰ消化后， 5 种李斯特菌产生特异的酶切谱带。格氏李斯特菌具有 250 bp 和 1200 bp 左右的酶切片段；单增李斯特菌不被酶切，保持 1400 bp 左右的 PCR 产物片段；威尔斯李斯特菌具有 600 bp、 560 bp、 400 bp、 260 bp 和 200 bp 左右的酶切片段；绵羊李斯特菌具有 1200 bp 和 400 bp 左右的酶切片段；英诺克李斯特菌具有 710 bp、 550 bp、 260 bp 左右的酶切片段。通过标准菌珠的 PCR-RFLP 产物电泳图构建酶切标准图谱，见图 3。
     所以鉴定并区分这 5 种李斯特菌：为当阴性对照无条带，阳性对照出现与酶切标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；此时，被检测样品与酶切标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。
     本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的 PCR-RFLP 方法所用的试剂盒，包括如下组成：上述李斯特菌 iap 基因特异引物对，限制性内切酶 Dde Ⅰ，酶切标准图谱和阳性对
     照液。本实施例建立了检测和鉴定 5 种李斯特菌的 PCR-RFLP 方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用 PCR 扩增技术，使得检测 5 种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用 RFLP 技术，一次即可对 5 种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。所以说本实施例所述的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通 PCR 更为快速、简便，可实现对 5 种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。

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1、10申请公布号CN102329883A43申请公布日20120125CN102329883ACN102329883A21申请号201110314558322申请日20111017C12Q1/68200601C12Q1/0420060171申请人厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址361026福建省厦门市海沧区建港路2165号72发明人陈信忠郭书林龚艳清林立陈垚杨俊萍孔繁德徐淑菲叶妍妍74专利代理机构厦门市新华专利商标代理有限公司35203代理人李宁54发明名称快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒57摘要本发明公开了一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒。

2、，包括如下步骤1）基因组DNA模板的制备；2）PCR扩增反应通过李斯特菌IAP基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3）PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4）限制性内切酶消化反应用DDE内切酶对PCR产物进行酶切；5）酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图1页CN102329893A1/2页21一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于包括如下步骤1）基因组DNA模板的制备；2）PCR扩增反应通过李斯特。

3、菌IAP基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3）PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4）限制性内切酶消化反应用DDE内切酶对PCR产物进行酶切；5）酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。2如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述的步骤5）中比对方法为当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性。

4、；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。3如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述步骤2）中PCR扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为上游引物5ATGAATATGAAAAAAGCAAC3；下游引物5TTATACGCGACCGAAGCCAAC3。4如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述步骤2）中PCR扩增反应的反应液组成如下10扩增缓冲液5L；4种DNTP混合物各200MOL/L；引物对各05MOL。

5、/L；DNA模板2G；TAQDNA聚合酶2U；MGCL215MMOL/L；加DDH2O至50L。5如权利要求4所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下95变性3MIN；95变性15S、58变性30S、72变性45S，进行35个循环扩增；72延伸5MIN。6如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述步骤4）中限制性内切酶消化反应体系按20L计如下所示PCR扩增后的产物DNA021G；10酶切BUFFER20L；限制性内切酶DDE12U；加DDH2O至20L。7如权利要求6所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRF。

6、LP方法，其特征在于所述限制性内切酶DDE消化反应的反应条件如下按上述配比先加入PCR扩增后的产物DNA，10酶切BUFFER，加DDH2O至20L，最后加入限制性内切酶DDE，轻轻混匀，稍加离心，放置于水浴温育。8如权利要求7所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，其特征在于所述水浴温度为37，温育时间为1H。9如权利要求1所述的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法所用的试剂盒，其特征在于包括如下组成李斯特菌IAP基因特异引物对，限制性内切酶DDE，酶切标准图权利要求书CN102329883ACN102329893A2/2页3谱和阳性对照液。权利要求书CN10232988。

7、3ACN102329893A1/5页4快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒技术领域0001本发明涉及一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒。背景技术0002目前国际上公认的李斯特菌共有6种单核细胞增生李斯特菌（LISTERIAMONOCYTOGENES，简称单增李斯特菌）、绵羊李斯特菌LISTERIAIVANOVII、英诺克李斯特菌LISTERIAINNOCUA、威尔李斯特菌LISTERIAWELSHIMERI、格氏李斯特菌LISTERIAGRAYI和西尔李斯特菌LISTERIASEELIGCRI。其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病。

8、，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一；绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；近期有国内外报道，英诺克李斯特菌存在于食品中，当其发生由非溶血性变为溶血性的变异时，对人类具有一定的潜在致病性；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，。

9、但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。目前，人们对这几种李斯特菌的分布状况不甚明了，为了能调查清楚不同李斯特菌的分布环境，首先需要发展适宜的检测鉴定几种李斯特菌的方法。0003掌握食品被李斯特菌污染状况是获得安全食品的重要一步，也是防止食物中毒，保障人民健康的最有效的一步。0004按传统的生化鉴定方法检测鉴定李斯特菌时，有时会造成漏检，国内外已有多次非典型菌株缺少典型特征的报道；同时通过传统生化鉴定方法不易于做6种李斯特菌的种间区分。鉴于此，通过分子生物学。

10、方法鉴定李斯特菌得到了广泛的发展，然而目前这些方法主要是做李斯特菌属的鉴定。PCRRFLP（PCRRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM）方法常被用来做鉴定物种的方法。，该方法将PCR技术、RFLP分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。该方法操作简单，结果容易判定。发明内容0005为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种检测和鉴别单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔李斯特菌和格氏李斯特菌的PCRRFLP方法及检测用试剂盒。本发明的李。

11、斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。0006为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案，说明书CN102329883ACN102329893A2/5页5一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，包括如下步骤1）基因组DNA模板的制备；2）PCR扩增反应通过李斯特菌IAP基因特异引物对，进行PCR扩增反应；3）PCR产物检测凝胶电泳检测PCR产物；4）限制性内切酶消化反应用DDE内切酶对PCR产物进行酶切；5）酶切产物检测凝胶电泳检测酶切产物，并与酶切标准图谱比对。0007所述的步骤5）中比对方法为当阴性对照无条带，阳性对照出现与标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；。

12、被检测样品与标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。0008所述步骤2）中PCR扩增反应所用的李斯特菌基因特异引物对的序列为上游引物5ATGAATATGAAAAAAGCAAC3；下游引物5TTATACGCGACCGAAGCCAAC3。0009所述步骤2）中PCR扩增反应的反应液。

13、组成如下10扩增缓冲液5L；（购于FERMENTAS公司）4种DNTP混合物各200MOL/L；（购于生工生物工程（上海）有限公司）引物对各05MOL/L；DNA模板2G；TAQDNA聚合酶2U；（购于生工生物工程（上海）有限公司）MGCL215MMOL/L；加DDH2O至50L。0010所述PCR扩增反应条件如下95变性3MIN；95变性15S、58变性30S、72变性45S，进行35个循环扩增；72延伸5MIN。0011所述步骤4）中限制性内切酶消化反应体系按20L计如下所示DNA（PCR扩增后的产物）021G；10酶切BUFFER20L；（购于天根生化科技北京有限公司）限制性内切酶DDE。

14、12U；（购于天根生化科技北京有限公司）加DDH2O至20L。0012所述限制性内切酶DDE消化反应的反应条件如下按上述配比先加入DNA（PCR扩增后的产物），10酶切BUFFER，加DDH2O至20L，最后加入限制性内切酶DDE，轻轻混匀，稍加离心，放置于水浴温育。0013所述水浴温度为37，温育时间为1H。0014一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法所用的试剂盒，包括如下组成李斯特菌IAP基因特异引物对，限制性内切酶DDE，酶切标准图谱（见图3）和阳性对照液（IAP基因标准品）IAP基因标准品序列见GENBANK。试剂盒中其它组成，可按本领域常规进行选择。试剂盒实施步骤按上述的快速。

15、检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法的步骤进行。0015本发明的有益效果是本发明建立了检测和鉴定5种李斯特菌的PCRRFLP方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用RFLP技术，一次即可对5种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了说明书CN102329883ACN102329893A3/5页6检出速度。综上所述本发明的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，。

16、可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。附图说明0016图1为本发明具体实施例1中标准菌珠的PCR扩增产物电泳图；M、MARKER，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；图2为本发明具体实施例1中标准菌珠的PCRRFLP产物电泳图；M、MARKER，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌；图3为酶切标准图谱；M、MARKER，1、格氏李斯特菌，2、单增李斯特菌，3、威尔李斯特菌，4、绵羊李斯特菌，5，英诺克李斯特菌。具体实施。

17、方式0017实施例1本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法，包括如下步骤1）基因组DNA模板的制备；取疑似菌落的细菌培养液1ML，置于无菌的EPPENDORF管中，12000RPM离心1MIN，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400L裂解液（40MMOL/LTRIS醋酸，20MMOL/L醋酸钠，1MMOL/LEDTA，1SDS，PH78）混匀，置于37水浴1H；然后加入200L5MOL/L的氯化钠溶液，混匀后于13000RPM离心15MIN。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3MOL/L,PH80，20保存1H后，1300。

18、0RPM离心15MIN，弃上清液，沉淀用70乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50LTE溶液中，置4保存备用。00182）PCR扩增反应通过李斯特菌IAP基因特异引物对，进行PCR扩增反应；（1）引物根据相关文献，选择一对引物为李斯特菌属的特异性扩增反应引物。用于PCR反应的引物对的序列为上游引物5ATGAATATGAAAAAAGCAAC3，下游引物5TTATACGCGACCGAAGCCAAC3；李斯特菌的特异性PCR产物大小均为1400BP左右。0019（2）PCR反应PCR反应液组成如下10扩增缓冲液5L；（购于FERMENTAS公司）4种DNTP混合物各200MOL/L；（购于生工生物工程。

19、（上海）有限公司）引物对各05MOL/L；DNA模板2G；TAQDNA聚合酶2U；（购于生工生物工程（上海）有限公司）MGCL215MMOL/L；加DDH2O至50L。说明书CN102329883ACN102329893A4/5页70020PCR扩增反应条件如下95变性3MIN；95变性15S、58变性30S、72变性45S，进行35个循环扩增；72延伸5MIN。0021（3）PCR产物电泳检测取扩增后的产物5L点样于1琼脂糖凝胶（含05G/ML溴化乙锭），以2000BPMARKER为标准分子参照，以5V/CM的电场强度于05TBE电泳缓冲液中电泳30MIN；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍。

20、照；见图1，从图1可得5种李斯特菌均产生1400BP左右的特异性扩增条带。根据待检样品的电泳图是否出现1400BP左右的特异性扩增条带可初步判定是否含为5种李斯特菌。0022PCR产物的序列鉴定切下带有所需DNA片段的凝胶，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TAKARA）（购于天根生化科技北京有限公司）从琼脂糖凝胶中回收纯化目的片段；DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成；测序证明，PCR扩增片段与预期一致。00234）限制性内切酶DDE消化反应限制性内切酶消化反应体系如下所示DNA（PCR扩增后的产物）021G；10酶切BUFFER20L；（购于天根生化科技北京有限公司）限制性内切酶DDE12U。

21、；（购于天根生化科技北京有限公司）加DDH2O至20L。0024限制性内切酶DDE消化反应条件如下按上述配比先加入DNA（PCR扩增后的产物），10酶切BUFFER，加DDH2O至20L，最后加入限制性内切酶DDE，轻轻混匀，稍加离心，放置于温度为37水浴温育1H。0025PCRRFLP的消化产物电泳鉴定取消化反应后的产物10L点样于1琼脂糖凝胶（含05G/ML溴化乙锭），以2000BPMARKER为标准分子参照，以5V/CM的电场强度于05TBE电泳缓冲液中电泳30MIN；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析、拍照；其中利用标准菌株进行上述PCRRFLP的消化反应后电泳图为标准菌珠的PCRRFLP。

22、产物电泳图，见图2，从图2可得经限制性内切酶DDE消化后，5种李斯特菌产生特异的酶切谱带。格氏李斯特菌具有250BP和1200BP左右的酶切片段；单增李斯特菌不被酶切，保持1400BP左右的PCR产物片段；威尔斯李斯特菌具有600BP、560BP、400BP、260BP和200BP左右的酶切片段；绵羊李斯特菌具有1200BP和400BP左右的酶切片段；英诺克李斯特菌具有710BP、550BP、260BP左右的酶切片段。通过标准菌珠的PCRRFLP产物电泳图构建酶切标准图谱，见图3。0026所以鉴定并区分这5种李斯特菌为当阴性对照无条带，阳性对照出现与酶切标准图谱一致的酶切片段时，说明实验有效；。

23、此时，被检测样品与酶切标准图谱中格氏李斯特菌的酶切谱带一致，说明为格氏李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中单增李斯特菌的酶切谱带一致，说明为单增李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中威尔李斯特菌的酶切谱带一致，说明为威尔李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中绵羊李斯特菌的酶切谱带一致，说明为绵羊李斯特菌阳性；被检测样品与酶切标准图谱中英诺克李斯特菌的酶切谱带一致，说明为英诺克李斯特菌阳性。0027本实施例的一种快速检测鉴定李斯特菌的PCRRFLP方法所用的试剂盒，包括如下组成上述李斯特菌IAP基因特异引物对，限制性内切酶DDE，酶切标准图谱和阳性对说明书CN102329883ACN10。

24、2329893A5/5页8照液。0028本实施例建立了检测和鉴定5种李斯特菌的PCRRFLP方法及试剂盒，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度显著提高。本方法采用RFLP技术，一次即可对5种李斯特菌进行筛查，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。所以说本实施例所述的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的检测和鉴定。可应用于检验检疫、临床诊断、公共卫生等实验室检测部门。说明书CN102329883ACN102329893A1/1页9图1图2图3说明书附图CN102329883A。

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