一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法 ( 一 ) 技术领域
本发明涉及一种从羊小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法， 特别涉及一种利用 羊小肠生产肝素钠的制备方法。 ( 二 ) 背景技术
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药， 是从猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚 糖的钠盐， 属粘多糖类物质， 天然存在于肥大细胞中， 具有降血脂的作用， 被广泛用于治疗 动、 静脉血栓和肺栓塞、 缺血性脑卒中、 不稳定型心绞痛、 急性心肌梗塞等。目前， 肝素钠主 要是从猪、 羊小肠粘膜和牛肺、 腌肠衣盐水中提取。肝素钠为天然抗凝血物质， 是我国主要 的出口药物之一 . 随着研究的深入， 人们发现肝素钠不但有抗凝、 抗血栓形成和调节血脂 的作用， 还具有抗炎、 抗过敏、 抗病毒、 抗癌等功能。中国是一个畜牧大国， 每年羊小肠的供 应量非常巨大， 但由于羊小肠粘膜中肥大细胞的数量比猪小肠粘膜中的数量少很多， 生产 1 亿个单位的肝素钠往往需要 10000-12000 根羊小肠粘膜， 且制备出的肝素钠产率低， 活性 也不够稳定， 实际操作过程相对严格且工序复杂， 达不到工业化生产的要求， 以至于对于羊 小肠粘膜的利用长期不合理， 而且在生产过程中会产生大量的废水污染环境。 ( 三 ) 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足， 提供了一种收率高、 肝素钠活性损失小的利用 羊小肠生产肝素钠的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的 ：
一种利用羊小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 包括如下步骤 ：
(1) 肠粘膜的制备 ： 在羊小肠内灌入清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池 ；
(2) 酶解 ： 用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 往酶解罐中加水， 粘膜与水的 重量比为 1 ∶ 1.7-1.9， 搅拌均匀后加入 2709 碱性蛋白酶调节 PH 值为 8-9， 加热使温度达 到 55℃ -60℃， 再加入重量百分比为 3％ -5％的肠衣专用盐， 测其盐度达到 2％ -2.5％， 保 温 2-3 小时， 继续加热使温度达到 80℃ -85℃， 保温 30-40 分钟后， 用 80 目尼龙布过滤， 收 集过滤液 ；
(3) 吸附 ： 将上述过滤液打入吸附罐中， 搅拌， 待温度降到 58℃ -60℃时加入树脂， 搅拌 7-9 小时， 继续冷却到 40℃ -45℃， 放出废液， 收集过滤树脂 ；
(4) 洗脱 ：
①： 将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中， 加入质量分数为 4.5％ -5％的盐水， 温度保持在 55℃ -58℃， 搅拌 30-40 分钟后将废液倒掉， 加入质量分数为 22％ -25％的盐 水， 温度保持在 55℃ -58℃， 搅拌 3-4 小时后， 收集洗脱液 ；
②： 重复①的步骤， 将两次收集的洗脱液合并待用 ；
(5) 沉淀脱盐 ：
①： 将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 80％ -85％的乙醇， 调 PH 值至 7-8， 搅匀密封沉淀 23-25 小时， 虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待 用；
②： 重复①的步骤， 将两次收集的沉淀物合并待用 ；
(6) 脱水干燥 ： 将上述沉淀物滤干脱水， 放入烘箱干燥后即得肝素钠。
步骤 (2) 酶解中 2709 碱性蛋白酶的添加量按每根羊小肠加入 1 克 2709 碱性蛋白 酶的比例添加 ； 步骤 (3) 吸附中树脂的添加量按每根羊小肠加入 2-3 克树脂的比例添加 ； 步骤 (4) 洗脱中， 树脂与加入的质量分数为 4.5％ -5％盐水的重量比为 1 ∶ 1.1-1.3， 树脂 与加入的质量分数为 22％ -25％盐水的重量比为 1 ∶ 1.1-1.3 ； 步骤 (5) 沉淀脱盐中搅拌 加入预冷过的乙醇， 洗脱液与乙醇的体积比为 1 ∶ 1.8-2.2 ； 步骤 (6) 脱水干燥中烘箱的温 度为 85℃ -95℃， 干燥时间为 6-8 小时。
上述步骤 (3) 吸附中， 所加树脂为德国朗盛树脂 ； 步骤 (4) 洗脱中， 盐水是指用肠 衣专用盐所配制的水溶液。
为了使粘膜刮制容易， 常习惯将小肠浸泡 24-48 小时， 这样能保护肠衣免受破损， 但长时间浸泡会发酵产生肝素酶， 分解肝素钠， 此外发酵还会产生一些有害物质， 使树脂中 毒， 因此在浸泡时间上一定要准确把握， 夏季适当缩短时间， 冬季可适当延长时间， 在弱碱 性或质量分数为 4％的盐水条件下， 能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性， 可以放于低温 处作短期贮存。 乙醇沉淀时， 必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇， 以避免局部乙醇浓度突然增高， 而 且乙醇要用预冷过的， 否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏， 从而降低其活性。
酶解、 吸附肝素钠过程中的废液 ( 煮锅废水 )， 气味恶臭， 致使生产车间空气质量 不好， 使人难以忍受， 甚至影响工作人员的身心健康， 为此本发明采用车间废气净化处理装 置， 大大减少了空气中的恶臭气味， 极大改善了工作环境。
因此本发明的有益效果是 ： 收率高， 肝素钠活性损失小， 质量稳定， 特别是采用车 间废气净化处理装置， 解决了肝素钠车间气味恶臭的问题 ； 利用旧工艺生产 1 亿个单位的 肝素钠， 需要 10000 ～ 12000 根羊小肠粘膜， 而利用本发明的制备方法生产 1 亿个单位的肝 素钠， 只需要 6000 ～ 8000 根羊小肠粘膜， 且肝素钠效价和活性都有大幅度提高， 从而使生 产成本大大降低， 利润可提高 40％以上。
( 四 ) 具体实施方式
实施例 1 ：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤 ：
(1) 肠粘膜的制备 ：
①取 200 根羊小肠灌水洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净， 打把冷冻储存 ；
②将羊小肠常温自然解冻， 肠内灌入清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜， 操作用力均 匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ；
③刮制过程中的肠头、 碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 120 公斤 ；
(2) 酶解 ：
①打开粘膜泵， 将 120 公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将 216 公斤水加入酶解罐 中， 打开搅拌机进行搅拌， 转速为 55r/min， 搅拌均匀， 再加入 200 克 2709 碱性蛋白酶添加到酶解罐中， 调节 PH 值为 8.5 ；
②打开蒸汽阀门使温度达到 58℃， 加入 13 公斤肠衣专用盐， 用盐度计测其盐度达 到 2.3％， 保温 2.5 小时 ；
③恒温结束后， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 83℃， 停止加温， 保温 35 分 钟；
④保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解 ；
(3) 吸附 ：
①将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 55r/min， 使罐中的温度自然 降到 59℃， 保持溶液的 PH 值为 7.5， 盐度 2.3％ ；
②将 500 克树脂加入吸附罐中， 搅拌 8 小时 ；
③自然冷却温度到 43℃， 放出废液， 用尼龙丝袋收集过滤树脂 ；
(4) 洗脱 ：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入质量分数为 4.8％的盐水， 加入盐水的量 刚好没过树脂， 温度保持在 57℃， 开启搅拌机转速为 35r/min， 搅拌 35 分钟 ；
③随后将废液倒掉， 加入质量分数为 24％的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 57℃， 搅拌 3.5 小时后， 收集洗脱液 ；
④重复③的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ；
(5) 沉淀脱盐 ：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 83％的乙醇， 加入乙醇 的体积量为洗脱液的两倍， 使乙醇浓度降到 43％， 调 PH 值至 7.5， 搅匀密封沉淀 24 小时 ；
②虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ；
③重复上述步骤一次， 将两次收集沉淀物合并待用 ；
(6) 脱水干燥 ：
①将收集的沉淀物滤干脱水 ；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在 90℃下用蒸汽干燥 7 小时， 即得肝素钠。
实施例 2 ：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤 ：
(1) 肠粘膜的制备 ：
①取 100 根羊小肠灌水洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净， 打把冷冻储存 ；
②将羊小肠常温自然解冻， 肠内灌入清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜， 操作用力均 匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ；
③刮制过程中的肠头、 碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 70 公斤 ；
(2) 酶解 ：
①打开粘膜泵， 将 70 公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将 119 公斤水加入酶解罐 中， 打开搅拌机进行搅拌， 转速为 50r/min， 搅拌均匀， 再加入 100 克 2709 碱性蛋白酶添加到 酶解罐中， 调节 PH 值为 8 ；
②打开蒸汽阀门使温度达到 55℃， 加入 6 公斤肠衣专用盐， 用盐度计测其盐度达到 2％， 保温 2 小时 ；
③恒温结束后， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 80℃， 停止加温， 保温 40 分 钟；
④保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解 ；
(3) 吸附 ：
①将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 50r/min， 使罐中的温度自然 降到 58℃， 保持溶液的 PH 值为 7， 盐度 2％ ；
②将 200 克树脂加入吸附罐中， 搅拌 7 小时 ；
③自然冷却温度到 40℃， 放出废液， 用尼龙丝袋收集过滤树脂 ；
(4) 洗脱 ：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入质量分数为 4.5％的盐水， 加入盐水的量 刚好没过树脂， 温度保持在 55℃， 开启搅拌机转速为 30r/min， 搅拌 40 分钟 ；
③随后将废液倒掉， 加入质量分数为 22％的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 55℃， 搅拌 3 小时后， 收集洗脱液 ； ④重复③的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ；
(5) 沉淀脱盐 ：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 80％的乙醇， 加入乙醇 的体积量为洗脱液的 2.2 倍， 使乙醇浓度降到 40％， 调 PH 值至 7， 搅匀密封沉淀 23 小时 ；
②虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ；
③重复上述步骤一次， 将两次收集沉淀物合并待用 ；
(6) 脱水干燥 ：
①将收集的沉淀物滤干脱水 ；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在 85℃下用蒸汽干燥 8 小时， 即得肝素钠。
实施例 3 ：
利用羊小肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤 ：
(1) 肠粘膜的制备 ：
①取 300 根羊小肠灌水洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净， 打把冷冻储存 ；
②将羊小肠常温自然解冻， 肠内灌入清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜， 操作用力均 匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ；
③刮制过程中的肠头、 碎肠皮应绞碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 150 公斤 ；
(2) 酶解 ：
①打开粘膜泵， 将 150 公斤粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将 285 公斤水加入酶解罐 中， 打开搅拌机进行搅拌， 转速为 60r/min， 搅拌均匀， 再加入 300 克 2709 碱性蛋白酶添加到 酶解罐中， 调节 PH 值为 9 ；
②打开蒸汽阀门使温度达到 60℃， 加入 22 公斤肠衣专用盐， 用盐度计测其盐度达 到 2.5％， 保温 3 小时 ；
③恒温结束后， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 85℃， 停止加温， 保温 30 分
钟； ④保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ；
⑤肠渣粉碎后再进行二次酶解 ；
(3) 吸附 ：
①将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 60r/min， 使罐中的温度自然 降到 60℃， 保持溶液的 PH 值为 8， 盐度 2.5％ ；
②将 900 克树脂加入吸附罐中， 搅拌 9 小时 ；
③自然冷却温度到 45℃， 放出废液， 用尼龙丝袋收集过滤树脂 ；
(4) 洗脱 ：
①将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ；
②将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入质量分数为 5％的盐水， 加入盐水的量刚 好没过树脂， 温度保持在 58℃， 开启搅拌机转速为 40r/min， 搅拌 30 分钟 ；
③随后将废液倒掉， 加入质量分数为 25％的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 58℃， 搅拌 4 小时后， 收集洗脱液 ；
④重复③的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ；
(5) 沉淀脱盐 ：
①将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 85％的乙醇， 加入乙醇 的体积量为洗脱液的 1.8 倍， 使乙醇浓度降到 45％， 调 PH 值至 8， 搅匀密封沉淀 25 小时 ；
②虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ；
③重复上述步骤一次， 将两次收集沉淀物合并待用 ；
(6) 脱水干燥 ：
①将收集的沉淀物滤干脱水 ；
②将脱水后的沉淀物移入烘箱在 95℃下用蒸汽干燥 6 小时， 即得肝素钠。
上述步骤 (3) 吸附中， 所加树脂为德国朗盛树脂 ； 步骤 (4) 洗脱中， 盐水是指用肠 衣专用盐所配制的水溶液。
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