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本发明公开了一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法。该木波罗提取物为从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇和黄酮，乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物，粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，然后纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮。所得到的提取物具有抗血栓、抑制血小板聚集、降低血粘度和保护心肌细胞的作用。

1.  一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物，其特征在于，它是从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇和黄酮。

2.  一种权利要求1所述木波罗提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物。
(2)粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。
(3)纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮。

3.  根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：取木波罗叶子，阴干。然后用体积百分比为75％的乙醇溶液加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子。合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物。

4.  根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬，每100克提取物用水10～12升，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3～5次，每次溶剂用量与水的体积相同。各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。

5.  根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：把石油醚提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，然后用体积比为15：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：β-谷甾醇。把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，用体积比为3：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：黄酮。

治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别地，涉及一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法。
背景技术
木波罗属桑科Moraceae，俗称菠萝蜜，生长在热带地区，包括印尼、泰国、越南和柬埔寨，常用做碳水化合物食用资源。木波罗含有必需氨基酸，如组胺酸、异亮氨酸、甜菜碱、蛋氨酸、色氨酸和缬氨酸，对健康具有特殊效用。
虽未经过科学证明，但是，印尼已有利用木波罗叶治疗疾病的传统，如用于肝炎、心脏病、肾炎、牙齿病和发痒的治疗。据报道，台湾也利用木波罗的根和茎治疗肝脏病、肝硬化和高血压。有关木波罗研究的大多数结果显示这种植物对健康很有利。Kan等(1978年)发现木波罗的茎具有抗炎和去毒作用。Chen等(1993年)发现木波罗茎含有Prenylflavon等三种新化合物，分别是isocyclomorusin、isocyclomulberrin和cycloaltilisin。Patil等(2002年)成功分离cycloatilisin和cycloaltilisin两种新化合物，能够防止骨质疏松。Lin等(1993年)从几种桑科植物的根皮中分离得到prenylflavonoid化合物，兔子试验表明其有抗血小板作用。与此同时，Liou等(1993年)证明木波罗含有的gamma-pyrones、artomunoxanthotrioneepoxide、cyclocommunol、cyclomulberrin和cyclocommunin能够防止人PLC/PRF/5细胞和人KB细胞的生长。Wei等(2005年)研究发现木波罗含有的类黄酮具有抗炎作用，如dihydroisocycloartomunin与P-methoxy-N-methylphenethylamine刺激之后能够防止大鼠腹腔肥大细胞产生葡萄糖甘酸酶及组胺。在Artocarpone与formyl-Met-Leu-Phe刺激之后，能够有效地防止溶菌酶和超氧化离子的出现。此外，这种化合物与脂多糖(LPS)进行刺激也能够防止在巨噬细胞内NO的产生，在RAW2647细胞导致iNOS蛋白质的出现。
实际上，桑科植物含有许多具有特殊生物活性的新化合物，特别是异戊酰化黄酮(isoprenylated flavones)的类黄酮。从尖蜜拉分离的类黄酮(cyclochampedol)对卤虫无节幼体具有毒性作用(Achmad，1996年)。从Artocarpus rotunda的Artoindonesianin L(Suhartatia，2001年)及坚硬面包果的Artoindonesianin P(Hakim，2002年)对P388型鼠科白血病细胞显示毒性作用。与此同时，Artoindoneisanin X及Y化合物对卤虫无节幼体具有毒性作用(Soekamto等，2003年)。从尖蜜拉树杆分离的Artoindonesianin U及V对P-388细胞显示很强的毒性(Syah等，2004年)。
根据研究显示，桑科植物含有的类黄酮成分对健康具有特殊的效用。已经有利用木波罗和同种类植物化合物的专利，从木波罗提取的2-genaryl-3，4，2’，4’-tetrahydroxychalcone，作为治疗癌症的药物，能做为口服或注射用药物(1987年第JP62270544号权利)；二氢查耳酮针对抗过敏症(第JP19860167288号权利)。木波罗的有效成分也用做头发催长剂(于1989年第JP1313414号权利)和抗菌药(于2000年第JP2000136141号权利)。但是，根据现有的文献资料，尚未发现有关木波罗生物活性化合物治疗心血管病的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法
本发明的目的是通过以下技术方案实现：一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物，它是从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇和黄酮。
一种上述木波罗提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物：取木波罗叶子，阴干；然后用体积百分比为75％的乙醇溶液加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子；合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物。
(2)粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位：取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬，每100克提取物用水10～12升，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3～5次，每次溶剂用量与水的体积相同；各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。
(3)纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮：把石油醚提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，然后用体积比为15：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：β-谷甾醇；把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，用体积比为3：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：黄酮。
本发明的有益效果是：本发明采用硅胶柱层析精制方法制备木波罗提取物，提取物中有效成分含量显著提高，总黄酮含量不低于50％，谷甾醇提取物中β-谷甾醇含量不低于70％。该提取物具有抗血栓、抑制血小板聚集、降低血粘度和保护心肌细胞的作用。这种药物的药效和具有抗血栓作用的阿司匹林以及在中国已销售的地奥及银杏心血管病中药相当。
附图说明
图1为木波罗总提物的粗分离过程示意图；
图2为木波罗提取物血栓形成时间图。
具体实施方式
下面详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。
本发明的制备方法包括以下步骤：
一、乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物。
取木波罗叶子，阴干；然后用体积百分比为75％的乙醇溶液(其余25％是水)加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子；合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物，得率为10～15％。该提取物为黄褐色粉末，成分复杂。
二、粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。
如图2所示，取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬(每100克提取物用水10—12升)，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别进行萃取3～5次，每次的溶剂用量与水的体积相同。各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。
三、纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮。
把石油醚提取部位拌入硅胶(石油醚提取部位与硅胶比例约为1：1)，用200～300目硅胶柱进行分离精制(拌样硅胶与装柱硅胶的比例约为1：20)，然后用石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)混合溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的4—5倍。依次用体积比为15：1、12：1、10：1、6：1、4：1、2：1、1：1比例的溶液洗脱，可分别得到样品A1、A2、A3、A4、A12、A5、A6和A7。其中用石油醚：乙酸乙酯＝15：1洗脱得到得样品A1为甾醇，其有效部位是β-谷甾醇，β-谷甾醇的含量为石油醚提取部位质量的70％—80％。
把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶(乙酸乙酯提取部位与硅胶比例约为1：1)，用200—300目硅胶柱进行分离精制(拌样硅胶与装柱硅胶得比例约为1：20)，用石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)混合溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的4—5倍。依次用体积比为5：1、3：1、1：1、1：2、1：5、1：8、1：10比例的溶液洗脱，可分别得到样品A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14和A15。其中用石油醚：乙酸乙酯＝3：1洗脱得到得样品A9为总黄酮，其有效部位是黄酮，黄酮含量为乙酸乙酯提取部位质量的15％—20％。
通过硝酸铝比色法，测试波长500nm，测定所获得的提取物中总黄酮含量达到50％—65％。
用HPLC测定总黄酮里活性化合物含量，使用Diamonsil C18色谱柱(200 x 4.6mm，5μm)。流动相乙腈-磷酸溶液(pH2.0)，梯度洗脱时间0-90分钟，乙腈浓度从15％提高到85％，流速1.0毫升/分钟，检测波长为210nm。在总黄酮提取物里活性化合物含量是：
(2-geranyl-2、3、4、4’-tetrahydroxychalcone)含量15—20％
(8-geranyl-4、5、7-tirhydroxyflavone)含量10—15％
((1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-(8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl)-1-propanone)含量5—8％。
使用硅胶树脂的柱层析分离石油醚提取部位，用15:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到β-谷甾醇提取部位。利用HPLC方法测定该部位β-谷甾醇的含量，使用Diamonsil C18色谱柱(200 x 4.6，5μm)，流动相甲醇，流速1.0毫升/分钟，检测波长为210nm。β-谷甾醇标准品浓度为1.0mg/ml，测试样品的浓度为1.37mg/ml，HPLC外标测定。结果：该部位中β-谷甾醇的含量范围70—80％。
实施例
取木波罗干叶子3公斤，用75％乙醇水溶液加热回流提取3次，每次溶剂用量为30升。合并提取液，蒸干得到乙醇总提取物335克。
把乙醇提取物加入33升水混悬，然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取部位62g、乙酸乙酯提取部位131g和正丁醇提取部位38g。
总黄酮的提取过程是把木波罗的乙酸乙酯提取部位(131克)用200-300目硅胶柱进行层析。使用石油醚和乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，用石油醚：乙酸乙酯＝3：1洗脱，样品约20克，为总黄酮有效部位。
通过硝酸铝比色法，测试波长500nm，测定所获得的总黄酮有效部位中总黄酮含量达到62.4％。
用HPLC测定总黄酮里活性化合物含量为：(2-geranyl-2、3、4、4’-tetrahydroxychalcone)16.5％，(8-geranyl-4、5、7-tirhydroxyflavone)13.1％.((1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-(8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl)-1-propanone)5.5％。
利用HPLC方法测定使用硅胶树脂柱层析分离石油醚提取部位得到的β-谷甾醇提取部位中的β-谷甾醇含量为76.55％。
本发明公布了作为心血管病药品的木波罗有效部位总黄酮与β-谷甾醇的制备方法和药效试验。木波罗提取物用做心血管病药物，人使用的剂量是每天40至80mg总黄酮/体量及β-谷甾醇剂量达每天8-16mg/体量。
木波罗提取物药效实验
应用了3种细胞模型，即内皮细胞、U937细胞—衍生泡沫细胞(derived foamcells)和心肌细胞模型，对所获得的各提取组分进行体内生物活性研究，以了解木波罗提取物抗心脑血管病的作用。
1、抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致人脐静脉内皮细胞损伤实验
从人脐带静脉获取内皮细胞，然后在含有20％胎牛血清、100U/ml青毒素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，放在37℃、5v％CO₂培养箱里培养4至5天，直至融合。用0.25％胰酶作用5分钟，将细胞消化下来。加以上培养基(5 x 5体积)中断胰蛋白酶的消化反应，离心(1200rpm，5分钟)，去掉含有胰酶的培养基。底部的内皮细胞中加入新的培养基，并把细胞吹匀，然后将细胞悬浮液分配到96孔培养板中，每孔细胞密度约为2 x 10⁵cell/ml，分为4组，即：
a)正常组：只有培养基；b)模型组-氧化修饰低密度脂蛋白组(0x-LDL)：含有100μg/ml ox-LDL；c)阳性药物组：含有100μg/ml ox-LDL和Simvastatin10μM；d)样品组：含有100μg/ml ox-LDL、木波罗有效部位>10μg/ml，100μg/ml为好。
在5v％CO₂培养箱里24小时后，每孔加10μl(0.1％)WST-1试剂，然后在同样条件再培养2小时。使用酶标仪测量光密度值OD 440nm(λref：700nm)。
2、抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致人U937细胞泡沫化损伤实验
在含有20％胎牛血清、100U/ml青毒素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和12mM碳酸钠的RPMI 1640培养基中U937细胞，放在37℃、5v％CO₂培养箱里培养。融合后，细胞先在96孔培养板里生长，每孔板密度2 x 10⁵cell/ml，分成4组，a)对照组：只含有培养基；模型组：含有100μg/ml ox-LDL；c)阳性：含有100μg/ml ox-LDL和阳性药物Simvastatin>10μM；d)样品组：含有100μg/ml ox-LDL和木波罗有效部位100μg/ml。
在37℃、5v％ CO₂培养箱里24小时后，每孔加10μl(0.1％)WST-1试剂，再放在CO₂培养箱中培养2小时，应用酶标仪测量波长440nm的吸收率在(λref：700nm)。
3、抗大鼠心肌肥厚细胞实验
从1天新生鼠心脏分离得到的心肌细胞，在96孔板中培养，然后在37℃、5v％ CO₂培养箱里，孵化48个小时，分成4个组：a)对照组：只含有培养基；b)模型组：含有血管紧张素II1μM；c)阳性对照：含有Angiotensin II 1μM和阳性药物Saralasin 1μM；d)药物组：含有Angiotensin II 1μM和木波罗提取物1001μg/ml。
在37℃、5v％ CO₂培养箱里24小时后，取胰蛋白酶消化每孔细胞，用0.1％SDS裂解细胞，采用Bradford法测定蛋白含量实验，波长595nm(λref：700nm)，由此确定蛋白质含量。
16种提取物的细胞实验结果见表1：木波罗中A1、A9、A20三种提取物在三种细胞模型中均有效，继续分离提取物中得出总黄酮和β-谷甾醇对以上三种模型均有效。
表1  木波罗提取物体内生物活性研究结果