土鳖干粉提取物的制备及其应用.pdf

本发明公开了土鳖干粉提取物的制备方法。本发明方法包括水提法或酶解法，土鳖干粉先水提或酶解，将水提液或酶解液通过Sephadex G25柱层析分离，得到系列多肽组分，再将所分离的多肽组分经冷冻干燥制备成冻干粉。经小鼠耳肿胀模型评价表明，本发明的土鳖干粉提取物系列多肽组分对于疼痛均有显著的抑制作用。小鼠1个月喂养实验表明，本发明的多肽组分既无毒性也无依赖性。本发明提供了土鳖干粉提取物系列多肽组分在制备镇痛药物中的应用。

1、  土鳖提取物的制备方法，其特征在于该方法为水提法，包括下列步骤：
(1)土鳖水提多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按3:100w/v的比例悬浮、50℃±3℃恒温搅拌60分钟、过滤、滤液冷冻干燥、得到的水提多肽粗粉4℃保存；
(2)土鳖水提多肽粗粉的分离与纯化：将水提多肽粗粉与蒸馏水按6:1w/v的比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/L乙酸胺缓冲液洗脱，流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、冷冻干燥、得到W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分；
(3)得到的W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分制成冻干粉。

2、  根据权利要求1所述土鳖提取物的制备方法，其特征在于其中水提多肽组分W_IV的多肽序列采用LC-MS技术确定为：
H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH。

3、  土鳖提取物的制备方法，其特征在于该方法为酶解法，包括下列步骤：
(1)土鳖酶解多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按1:10w/v的比例悬浮、得到的悬浮液与模拟胃液2.0gNaCl，3.2g胃蛋白酶，7ml浓HCl，双蒸水定容于1000ml，pH值为1.2按1:1的比例混合、46℃±3℃恒温振荡4小时、减压过滤、滤液用固体NaHCO₃调pH7.0、3000转离心5分钟、收集上清液、冷冻干燥，得到的酶解多肽粗品4℃保存；
(2)土鳖酶解多肽粗粉的分离与纯化：将上述酶解多肽粗粉与蒸馏水按5:1w/v的比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/L乙酸胺缓冲液洗脱流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、冷冻干燥、得到E_I、E_II和E_III多肽组分；
(3)得到的E_I、E_II和E_III三种多肽组分制成冻干粉。

4、  根据权利要求3所述土鳖提取物的制备方法，其特征在于其中酶解多肽组分E_I、E_II和E_III采用LC-MS技术确定的多肽序列为：
E_I：
1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH和
2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH；
E_II：
3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro-Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr-Thr-OH
和
4)H-Phe-Thr-Ser-Asp-His-Ser-Tyr-Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH；
E_III：
5)H-Pro-Gly-Ala-Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH
和
6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH.-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。

5、  一种如权利要求1所述的土鳖提取物在制备镇痛药物中的应用，其特征在于所述的土鳖提取物含有W_I、W_II、W_III和W_IV水提多肽组分。

6、  一种如权利要求3所述的土鳖提取物在制备镇痛药物中的应用，其特征在于所述的土鳖提取物含有E_I、E_II和E_III酶解多肽组分。

7、  根据权利要求5或6所述的土鳖提取物在制备镇痛药物中的应用，其特征在于所述药物为土鳖提取物与药用辅料组成的制剂。

土鳖干粉提取物的制备及其应用
技术领域
本发明涉及中药，具体涉及从土鳖虫干粉中提取镇痛有效部位的工艺，以及由该提取工艺所得到的一系列多肽组分，以及该多肽组分在制备镇痛药物中的应用。
背景技术
疼痛不仅是许多疾病的并合症，而且已经被看作是一类疾病。从疾病层面上讲，由各种各样的疼痛造成的生活质量下降波及了最大量的人群。由于有效的镇痛剂往往与依赖性相联系，所以发明新的无依赖性的镇痛剂具有重要价值。
土鳖及土鳖干粉在我国传统医学中广泛应用于治疗带状疱疹。发明人根据带状疱疹伴随激烈疼痛及土鳖干粉的治疗效果，推断土鳖干粉中存在镇痛组分。土鳖及土鳖干粉在我国传统医学中应用时都是口服给药，土鳖及土鳖干粉经口服给药的一次剂量在10g左右。这样大的剂量使病人感到不便。依据土鳖及土鳖干粉的蛋白质性质、蛋白质经口服进入胃可被胃蛋白酶降解为多肽的性质，以及多肽的良好水溶性，发明人推测土鳖及土鳖干粉的直接水提物和酶解物有可能在不减弱治疗效果的前提下减少服药量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于依据土鳖及土鳖干粉的蛋白质性质、蛋白质经口服进入胃可被胃蛋白酶降解为多肽的性质，以及多肽的良好水溶性，研究设计土鳖干粉的提取物的制备和用途。
本发明提供了一种土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括水提法或酶解法。
1、水提法土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)土鳖水提多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按3∶100w/v的比例悬浮、50℃±3℃恒温搅拌60分钟、过滤、滤液冷冻干燥、得到的水提多肽粗粉W₀4℃保存；
(2)土鳖水提多肽粗粉的分离与纯化：将水提多肽粗粉W₀与蒸馏水按6∶1w/v的比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/L乙酸胺缓冲液洗脱，流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、冷冻干燥、得到W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分。
(3)得到W_I、W_II、W_III和W_IV四种水提多肽组分制成冻干粉。
2、酶解法土鳖干粉提取物的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)土鳖酶解多肽粗粉的制备：将土鳖干粉与蒸馏水按1∶10w/v的比例悬浮、得到的悬浮液与模拟胃液2.0gNaCl，3.2g胃蛋白酶，7ml浓HCl，双蒸水定容于1000ml，pH值为1.2按1∶1的比例混合、46℃±3℃恒温振荡4小时、减压过滤、滤液用固体NaHCO₃调pH7.0、3000转离心5分钟、收集上清液、冷冻干燥，得到的酶解多肽粗品(E₀)4℃保存；
(2)建立土鳖酶解多肽粗粉的分离与纯化将酶解多肽粗粉与蒸馏水按5:1w/v的比例溶解、10000转离心10分钟、上清液加载到Sephadex G25层析柱上、以0.007mol/L乙酸胺缓冲液洗脱流速0.8mL/min，紫外检测波长280nm、收集的馏份按峰合并、冷冻干燥、得到E_I、E_II和E_III三种多肽组分；
(3)得到E_I、E_II和E_III三种多肽组分制成冻干粉。
通过测定分离得到的水解多肽组分W_IV的HPLC指纹图谱和HPLC-ESI-MS指纹图谱，以及E₀、E_I、E_II和E_III四种酶解多肽组分的HPLC指纹图谱和HPLC-ESI-MS指纹图谱，确定水解多肽组分W_IV和酶解多肽组分E_I、E_II和E_III多肽的氨基酸序列。
镇痛活性最强的W_IV水提多肽组分测定HPLC-ESI-MS之后，选择适宜的峰测定ESI-MS，根据互补原理分析图谱(图4)，得到一种序列：
H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.
采用LC-MS技术确定E_I、E_II和E_III三种酶解多肽组分的特征多肽序列.
其中E_I为：
1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH和
2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH；
EII为：
3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro-Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr-Thr-OH和
4)H-Phe-Thr-Ser-Asp-His-Ser-Tyr-Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH；
EIII为：
5)H-Pro-Gly-Ala-Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH和
6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH.-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。
本发明另一目的是提供了土鳖提取物在制备镇痛药物中的应用。
本发明用小鼠耳肿胀模型评价本发明分离得到的水解多肽组分W₀、W_I、W_II、W_III、W_IV和酶解多肽组分E₀、E_I、E_II和E_III对疼痛的抑制作用。
本发明用小鼠1个月喂养实验评价本发明分离得到的水解多肽组分W₀、W_I、W_II、W_III、W_IV和酶解多肽组分E₀、E_I、E_II和E_III的毒性和依赖性。
结果表明本发明的土鳖提取物具有镇痛活性，未出现任何毒性反应症状和耐受性症状及成断反应症状。
本发明提供的土鳖提取物在制备镇痛药物中的应用，所述药物为土鳖提取物与药用辅料组成的制剂。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
附图说明：
图1.具体实施过程描述。
图2.W_IV的HPLC指纹图谱。
图3.W_IV的HPLC-ESI-MS指纹图谱。
图4.W_IV的组分之一的HPLC-ESI-MS图谱。
图5.E_I的HPLC指纹图谱。
图6.E_II的HPLC指纹图谱。
图7.E_III的HPLC指纹图谱。
图8.E_I的HPLC-ESI-MS指纹图谱。
图9.E_II的HPLC-ESI-MS指纹图谱。
图10.E_III的HPLC-ESI-MS指纹图谱。
图11.E_I的组分之一的HPLC-ESI-MS图谱。
图12.E_I的组分之二的HPLC-ESI-MS图谱。
图13.E_II的组分之一的HPLC-ESI-MS图谱。
图14.E_II的组分之二的HPLC-ESI-MS图谱。
图15.E_III的组分之一的HPLC-ESI-MS图谱。
具体实施方式
实施例1 土鳖水提多肽粗粉的制备
将15g土鳖干粉(由干土鳖研磨而得)悬浮于500ml蒸馏水中。得到的悬浮液于50℃恒温搅拌60分钟。悬浮液常压自然过滤，滤液冷冻干燥，得到3.0g(20％)土鳖水提多肽粗粉，4℃保存待用。
实施例2 土鳖水提多肽粗粉的分离与纯化
Sephadex G25经处理后装柱(2.6×60cm)，将0.007mol/L乙酸胺经0.45nm微孔滤膜过滤后作为缓冲液平衡。3.0g土鳖水提多肽粗粉用0.5ml蒸馏水溶解，10000转离心10分钟。上清液上Sephadex G25层析柱，以0.007mol/L乙酸胺缓冲液洗脱，流速0.8mL/min，8min收一管，每管均选用紫外分光光度计光度测量，波长280nm，记录数据，用Microsoft Excel做出曲线，按峰形合并馏份，冷冻干燥。得到0.20g(6.7％)W_I、0.50g(17％)W_II、0.99g(33％)W_III和0.30g(10.0％)W_IV四种水提多肽组分。
实施例3W_I、W_II、W_III和W_IV的镇痛活性测定
将雄性ICR小鼠(22±2g)分为对照组(W₀)，以及W_I、W_II、W_III和W_IV治疗组，每组10只小鼠。W_I、W_II、W_III和W_IV分别用0.3ml生理盐水溶解。W_I、W_II、W_III和W_IV的灌胃剂量按照剂量(mg/kg)＝9.01×38mg/只×收率计算，即0.4mg/0.3ml/只W_I、9.1mg/0.3ml/只W_II、12.5mg/0.3ml/只W_III和3.2mg/0.3ml/只W_IV。W₀组0.3ml/只生理盐水。将小鼠置于特制塑料圆筒内，尾部暴露在筒外，室内温度保持在(20±1℃)，待动物稳定30min后，以辐射热甩尾法测痛，采用一特制灯罩使其发出直径为2mm的光束照在距尾端部约2-3cm处，调节光源电压使甩尾潜伏期在6.5-8.5s，两次测甩尾潜伏期的间隔为5min，共测4次，取平均值作为基础阈值。给药后30min、60min、90min、120min、150min和180min各测一次阈值。测得值与基础值比较，以变化率表示痛阈变化，即(给药后的痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％，痛阈超过15s者按15s计算。测定的数据列入表1。
表1.服W_0-IV后小鼠痛阈的变化(M±SD％)

W₀＝生理盐水，n＝10，a)与W₀组比较P<0.05，b)与W₀组比较P<0.01.
实施例4 W_IV的量效关系测定
按照实施例3的方法，将雄性ICR小鼠(22±2g)分为对照组(W₀)，以及W_IV高剂量组、W_IV中剂量组和W_IV低剂量组，每组10只小鼠。灌胃剂量为：3.2mg/0.3ml/只W_IV(高剂量组)、32μg/0.3ml/只W_IV(中剂量组)、3.2μg/0.3ml/只W_IV(低剂量组)、0.3ml/只生理盐水(W₀组)。测定的数据列入表2。
表2.服不同剂量W_IV后小鼠痛阈的变化(M±SD％)

W₀＝生理盐水，n＝10，a)与W₀组比较P<0.05，b)与W₀组比较P<0.01.
实施例5 W_IV的HPLC指纹图谱
将1mg具有明显镇痛活性的W_v用1ml三蒸水溶解，得到的样品溶液过0.2μm微孔滤膜。然后进行HPLC分析。色谱柱为Kromasil C18柱，粒径5μm，4.6mm×250mm。流动相为甲醇-水(5:95)。检测波长为280nm。柱温为室温。进样量为10μl。流速为1ml/min。得到的HPLC指纹图谱见图2。
实施例6 W_IV的HPLC-ESI-MS
将1mg具有明显镇痛活性的W_v用1ml三蒸水溶解，得到的样品溶液过0.2μm微孔滤膜。然后进行HPLC分析。色谱柱为Kromasil C18柱，粒径5μm，4.6mm×250mm。流动相为甲醇-水(5:95)。检测波长为280nm。柱温为室温。进样量为10μl。流速为1ml/min。得到的HPLC-ESI-MS指纹图谱见图3。
实施例7W_IV中多肽的序列
按照实施例5的方法测定W_IV的HPLC-ESI-MS之后，选择适宜的峰测定ESI-MS，根据互补原理分析图谱(图4)，得到一种序列：
H-Thr-Thr-Cys-Asn-Ser-Pro-Met-Leu(Ile)-Glu-Asp-Phe-Ala-Pro-OH.
实施例8 土鳖酶解多肽粗粉的制备
根据1995年美国药典提供的模拟胃液配方(2.0gNaCl，3.2g胃蛋白酶，7ml浓HCI，双蒸水定容于1000ml，pH值约为1.2)配制200ml模拟胃液。将10g土鳖干粉悬浮于100ml蒸馏水中。将得到的悬浮液与100ml模拟胃液混合、46℃±3℃恒温振荡器中振荡4小时、用布氏漏斗抽滤。滤液用固体NaHCO₃调pH值7.0(有不溶物出现)、3000转离心5分钟、收集上清液、冷冻干燥。得到酶解多肽粗品(5.5g，收率55％)、命名为Pr-E、4℃保存。
实施例9 土鳖酶解多肽粗粉的分离与纯化
按照实施例8的方法，从2g酶解多肽粗品分离到180mg(9％)E_I、1440mg(72％)E_II和380mg(19％)E_III三种多肽组分。
实施例10E_I、E_II和E_III的HPLC指纹图谱
按照实施例5的方法，得到E_I、E_II和E_III的HPLC指纹图谱(图5-7)
实施例11 E_I、E_II和E_III的HPLC-ESI-MS
按照实施例6的方法，得到E_I、E_II和E_III的HPLC-ESI-MS指纹图谱(图8-10)实施例12E_I、E_II和E_III中多肽的序列
按照实施例6的方法测定W_IV的HPLC-ESI-MS之后，选择适宜的峰测定ESI-MS，根据互补原理分析图谱(图11-15)，E_I、E_II和E_III得到六种序列。
其中E_I为：
1)H-Asn-Ser-Tyr-Cys-Met-Asn-Met-Met-Cys-OH和
2)H-Gln-Cys-Ala-Pro-Gly-Asp-Arg-Met-Asn-Thr-OH；
EII为：
3)H-Ala-Gln(Lys)-Phe-Pro-Ala-Pro-Gly-Phe-Gln(Lys)-Thr-Ser-His-Met-Thr-Thr-OH和
4)H-Phe-Thr-Ser-Asp-His-Ser-Tyr-Asn-Phe-Leu(Ile)-Val-Gln(Lys)-Gln(Lys)-OH；
EIII为：
5)H-Pro-Gly-Ala-Gln(Lys)-Met-Gly-Pro-Thr-Ser-Ala-Val-Gly-Gln(Lys)-Ala-Pro-OH和
6)H-His-Gly-Val-Met-Arg-His-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH.-Met-Asp-Phe-Ala-Ala-Tyr-Met-OH。
实施例13 E_I、E_II和E_III的镇痛活性测定
按照实施例3的方法，将雄性ICR小鼠(22±2g)分为对照组(W₀)，以及E_I组、E_II组和E_III组，每组10只小鼠。灌胃剂量为：0.14mg/0.3ml/只E_I、5mg/0.3ml/只E_II、0.31mg/0.3ml/只E_III、0.3ml/只生理盐水(W₀组)。测定的数据列入表3。
表3.服W₀、E_I-III后小鼠痛阈的变化(M±SD％)

W₀＝生理盐水，n＝10，a)与W₀组比较P<0.05，b)与W₀组比较P<0.01.
实施例14 E_III的量效关系测定
按照实施例3的方法，将雄性ICR小鼠(22±2g)分为对照组(W₀)，以及E_III高剂量组、E_III中剂量组和E_III低剂量组，每组10只小鼠。灌胃剂量为：0.31mg/0.3ml/只E_III(高剂量组)、3.1μg/0.3ml/只E_III(中剂量组)、0.3.1μg/0.3ml/只E_III(低剂量组)、0.3ml/只生理盐水(W₀组)。测定的数据列入表4。
表4.服不同剂量W_IV后小鼠痛阈的变化(M±SD％)

W₀生理盐水，n＝10，a)与W₀组比较P<0.05，b)与W₀组比较P<0.01.
实施例15 W_IV和E_III的急性毒性评价
20只雄性ICR小鼠(23±1g)分为2组，每组10只，用W_IV和E_III1次性灌胃，W_IV的灌胃剂量为47mg/0.3ml/只，相当于最高有效剂量的15倍。E_III的灌胃剂量为34mg/0.3ml/只，大约相当于最高有效剂量的100倍。小鼠按正常条件饲养7天，期间未观察到任何行为异常。第7天小鼠处死，解剖之后未观察到任何脏器异常。
实施例16 EI、EII、EIII和WIV的耐受性评价
50只雄性ICR小鼠(31±1g)分为5组，每组10只，用EI、EII、EIII和WIV灌胃，EI灌胃单剂量为0.02184mg/0.3ml/只、EII灌胃单剂量为0.19121mg/0.3ml/只、EIII灌胃单剂量为0.04645mg/0.3ml/只、WIV灌胃单剂量为0.00648mg/0.3ml/只。均相当于中等有效剂量。连续灌胃30天，未见小鼠出现任何毒性反应症状、耐受性症状。小鼠停止给药7天，未见小鼠出现任何戒断反应症状。