用于外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物 【技术领域】
本发明涉及用于外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物，特别是涉及用于由脊髓损伤引起的外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物。
背景技术
据报道，浅利等人研究发现如下式所示的L4，硫酸角质素二糖对白细胞介素-12(IL-12)表达具有抑制作用(非专利文献1)。
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)
(其中，Gal表示半乳糖残基，GlcNAc表示N-乙酰基氨基葡萄糖残基，6S表示在6位的羟基是6-O-硫酸酯形式，β1-4表示β1-4糖苷键。)
已知IL-12在MRL-1pr/1pr小鼠中以高水平表达，使T淋巴细胞(CD4-CD8-)无限增殖化，以及使淋巴器官(淋巴结及脾脏)肿胀(非专利文献2)。另外，根据报道，在将L4给药后，发现血中IL-12浓度降低，诱导T淋巴细胞细胞死亡，并引起淋巴器官缩小(非专利文献1)。
另一方面，据报道，脊髓损伤患者的精液含有高水平的IL-12(非专利文献3)。然而，IL-12在脊髓损伤中的作用尚不清楚。
参考文献：
专利文献1：特开平2-57182号公报
专利文献2：国际公开第WO 96/16166号小册子
专利文献3：国际公开第WO 96/16973号小册子
专利文献1：特开2001-89493号公报
非专利文献1：Xu H，Kurihara H，Ito T，Kikuchi H，Yoshida K，Yamanokuchi H，Asari A.The keratan sulfate disaccharide Gal(6SO3)beta-1，4-GlcNAc(6SO3) modulates interleukin 12 production bymacrophages in murine Thy-1 type autoimmune disease(硫酸角质素二糖Gal(6SO3)β-1，4-GlcNAc(6SO3)在患有Thy-1型自身免疫性疾病的鼠中通过巨噬细胞调节白细胞介素12产生).J.Biol.Chem.2005 May 27；280(21)：20879-86.
非专利文献2：Xu H，Kurihara H，Ito T，Nakajima S，Hagiwara E，Yamanokuchi H，Asari A.IL-12 enhances lymphoaccumulation bysuppressing cell death of T cells in MRL-1pr/lpr mice(IL-12在MRL-1pr/lpr小鼠中通过抑制T细胞的细胞死亡来增强淋巴细胞积聚).J.Autoimmun.2001 Mar；16(2)：87-95.
非专利文献3：Basu S，Aballa TC，Ferrell SM，Lynne CM，Brackett NL.Inflammatory cytokine concentrations are elevated in seminal plasma of menwith spinal cordinjuries(在脊髓损伤患者的精液浆中炎性细胞因子浓度升高).J.Androl.2004 Mar-Apr；25(2)：250-4.
非专利文献4：Kubota，M.，Yoshida，K.，Tawada，A.，and Ohashi，M.(2000)Eur.J.Mass Spectrom.6，193-203.
非专利文献5：Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive andreliable locomotor rating scale for open field testing in rats(在大鼠中进行旷场试验的灵敏可靠的运动等级量表).J.Neurotauma，1995 Feb，12(1)，p1-21.
非专利文献6：Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.Gradedhistological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using theNYU weight-drop device versus transection(在脊髓挫伤后，对横断面使用NYU自由落体打击装置的分级组织学结果和运动结果).Exp.Neurol.，1996 Jun，139(2)，p244-56.
【发明内容】
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物，特别是用于由脊髓损伤引起的外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物。
解决问题的方法
根据本发明的第一方面，提供了含有有效量的硫酸角质素寡糖或其衍生物的用于外伤性神经障碍的治疗药物。根据本发明的另一方面，提供了含有有效量的硫酸角质素寡糖或其衍生物的用于运动功能障碍的治疗药物。
发明的有益效果
本申请的发明人采用大鼠脊髓损伤模型，研究了硫酸角质素寡糖或其衍生物对脊髓损伤的作用。结果出乎人们意料，下面将进行详细说明，硫酸角质素寡糖或其衍生物对由脊髓损伤引起的运动功能障碍具有改善作用，可用作用于外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物。
附图的简要说明
图1表示在采用钳夹伤法获得的大鼠脊髓损伤模型中，L4对后肢运动功能的作用，该图显示了脊髓损伤处理及L4给药后的天数与后肢运动功能(BBB评分)之间的关系。
图2表示在采用钳夹伤法获得的大鼠脊髓损伤模型中，L4对后肢运动功能的作用，该图显示了在脊髓损伤处理及L4给药后第7天的后肢运动功能(BBB评分)。
图3表示在采用钳夹伤法获得的大鼠脊髓损伤模型中，L4对脊髓诱发电位的作用，该图显示了在脊髓损伤处理及L4给药后第7天的脊髓诱发电位。
优选实施方案的详细说明
下面将阐述本发明的实施方案。然而，本发明不受以下说明的实施方案的限制。
如上所述，根据本发明，提供了含有有效量的硫酸角质素寡糖或其衍生物的用于外伤性神经障碍和/或运动功能障碍的治疗药物。
在本发明中，“硫酸角质素寡糖”(下文也称为KS寡糖)是指含有硫酸角质素的基本结构(一般来说，但不限于，为半乳糖残基或半乳糖-6-O-硫酸酯残基与N-乙酰基氨基葡萄糖残基或N-乙酰基氨基葡萄糖-6-O-硫酸酯残基交替地通过糖苷键连接的结构)的二糖或更多糖的寡糖。另外，KS寡糖也可含有唾液酸残基(神经氨酸的酰基衍生物)和/或岩藻糖残基。通常，唾液酸残基通过α-2，3-或α-2，6-糖苷键与半乳糖残基连接，岩藻糖残基通过α-1，3糖苷键与N-乙酰基氨基葡萄糖残基连接。
在本发明中，所述寡糖通常含有在多糖领域中被称为寡糖的构成糖物质。特别是，所述寡糖优选为2～10个糖单元的糖聚合物，更优选2～6个糖单元，再更优选2～4个糖单元。其中，特别优选2个糖单元的寡糖。
KS寡糖可以是例如由酶降解或化学降解硫酸角质素得到的产物，还可以是例如通过将与1个或多个N-乙酰基氨基乳糖单元连接的寡糖硫酸化得到的化合物。在这些硫酸角质素寡糖中，通过降解硫酸角质素得到的寡糖(来源于硫酸角质素的寡糖)是优选的，通过用endo-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶型硫酸角质素水解酶将硫酸角质素降解得到的降解产物是更优选的。
对于天然来源的硫酸角质素，N-乙酰基氨基葡萄糖残基的6位羟基基团的大部分被硫酸化，半乳糖残基的6位羟基基团的一部分被硫酸化。虽然KS寡糖可以是通过将上述的硫酸角质素降解得到的硫酸角质素寡糖，但是本发明的KS寡糖中，N-乙酰基氨基葡萄糖的6位羟基可以被硫酸化也可以不被硫酸化，优选地，半乳糖残基的6位羟基被硫酸化。
换言之，所述KS寡糖优选为如下式所示的任一二糖，或者为含有该如下式所示的任一二糖或两者作为重复结构单元的偶数糖的寡糖：
Gal(6S)-GlcNAc(6S)或
Gal(6S)-GlcNAc
(其中，Gal表示半乳糖残基，GlcNAc表示N-乙酰基氨基葡萄糖残基，6S表示6位的羟基是6-O-硫酸酯形式，-表示糖苷键。)
所述KS寡糖更优选为由下述式1～式3表示的任何一种寡糖：
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式1
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) 式2
Gal(6S)β1-4GlcNAc 式3
(其中，Gal表示半乳糖残基，GlcNAc表示N-乙酰基氨基葡萄糖残基，6S表示6位的羟基是6-O-硫酸酯形式，β1-4表示β1-4糖苷键，β1-3表示β1-3糖苷键。)
另外，式1所示的寡糖也称为L4L4，式2所示的寡糖称为L4，式3所示的寡糖称为L3。上文所述的式1～式3所示的寡糖可与诸如N-乙酰神经氨酸等唾液酸连接，作为含有这样的唾液酸的硫酸角质素寡糖，列举如下实例：
SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)和
SA-Gal(6S)-GlcNAc(6S)-Gal(6S)-GlcNAc(6S)
(其中，SA表示唾液酸残基，Gal表示半乳糖残基，GlcNAc表示N-乙酰基氨基葡萄糖残基，6S表示6位的羟基是6-O-硫酸酯形式，-表示糖苷键。)
在本说明书中，所述硫酸角质素寡糖的“衍生物”(下文也称为KS寡糖衍生物)通常包括这样的化合物，其中KS寡糖中的羟基基团的至少一个氢原子(优选全部羟基的10％或更多)被酰基取代(部分或完全的O-酰化衍生物)。
另外，所述的KS寡糖及KS寡糖衍生物包括电离状态的KS寡糖及KS寡糖衍生物，也包括具有加入的质子或阳离子的结构的KS寡糖及KS寡糖衍生物。因此，(阳离子加合物)KS寡糖及KS寡糖衍生物也包括它们的药物可接受的盐。
所述药物可接受的盐包括但不限于，药物可接受的碱金属盐，如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐，如钙盐；与无机碱形成的盐，如铵盐；以及与有机碱形成的盐，如二乙醇胺盐、环己胺盐和氨基酸盐。
KS寡糖衍生物中，取代KS寡糖的羟基基团的氢原子的酰基优选为1～10个碳原子的酰基，更优选为1～10个碳原子的脂肪族酰基或芳香族酰基，即可以含有杂原子的烷酰基或芳酰基。这些基团的实例包括乙酰基，氯乙酰基，二氯乙酰基，三氟乙酰基，甲氧基乙酰基，丙酰基，n-丁酰基，(E)-2-甲基丁烯酰基，异丁酰基，戊酰基，苯甲酰基，O-(二溴甲基)苯甲酰基，O-(甲氧基羰基)苯甲酰基，2，4，6-三甲基苯甲酰基，p-甲苯酰基，p-甲氧苯甲酰基，p-氯苯甲酰基，p-硝基苯甲酰基等等。当所述KS寡糖衍生物具有多个酰基时，这些酰基彼此可以相同，也可以不同。当所述KS寡糖的还原性末端糖的1位羟基的氢原子被酰基取代时，其O-酰基的构型可以为α-糖苷构型或β-糖苷构型，优选α-糖苷构型。
酰化的KS寡糖是特别优选的，因为其具有如下优点，如在有机溶剂和脂质中的溶解性提高，生物膜渗透性增加，口服给药后增加胃肠吸收。
在本发明中，所述KS寡糖或KS寡糖衍生物优选为下述通式4表示的化合物。为了方便起见，下述通式4显示了加入M的结构。然而，该化合物可在溶液中发生电离，以及当电离时，磺酸基团变成阴离子状态。
通式4
(其中，X1～X5各自独立地表示氢原子或酰基基团，Y表示氢原子或SO3M，M表示氢原子或1价～3价的金属阳离子或1价～3价的碱基，由波浪线表示的键表示处于α-糖苷构型或β-糖苷构型的单键。)
被酰基基团取代的KS寡糖优选为上述通式4中的X1～X5全部为乙酰基的KS寡糖。特别优选下述通式5所示的衍生物。
通式5
(其中，Ac表示乙酰基，Y表示氢原子或SO3Na，由波浪线表示的键表示处于α-糖苷构型或β-糖苷构型的单键。)
本发明的治疗药物可包含单一种类的KS寡糖或其衍生物，也可包含KS寡糖或其衍生物的混合物，例如，对于上述通式4中波浪线表示的部分，包含为α-糖苷构型的物质，也可包含为β-糖苷构型的物质，还可包含这些物质的混合物。
例如，所述KS寡糖可通过如下方法获得：通过采用endo-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶型硫酸角质素水解酶的处理，如来自杆菌属细菌的角质素酶II(专利文献1，特开平2-57182号公报)，或来自环状芽孢杆菌KsT202株的硫酸角质素水解酶(专利文献2，国际公开第WO96/16166号)的处理，使得硫酸角质素的缓冲溶液，优选高度硫酸化的硫酸角质素的缓冲溶液降解，随后将所得到的降解产物进行分离来获得KS寡糖。通过对所获得的寡糖实施常规的分离纯化方法，例如，乙醇沉淀，凝胶过滤及阴离子交换色谱法，可将所需要的寡糖分离纯化出。
这类制备方法已在专利文献3中(国际公开第WO96/16973)公开。用作原料的硫酸角质素可以由主要由半乳糖或半乳糖-6-O-硫酸酯和N-乙酰基氨基葡萄糖或N-乙酰基氨基葡萄糖-6-O-硫酸酯构成的二糖重复单元组成。虽然硫酸角质素的硫酸化比率取决于动物种类、器官等因素而变化，但是可通常使用由生物原材料产生的硫酸角质素，该生物原材料例如鲨鱼等软骨鱼类以及鲸、牛等哺乳动物的软骨，骨和角膜。
用作原料的硫酸角质素可以是任何容易获得的硫酸角质素，且没有特别的限制，但优选使用高度硫酸化的硫酸角质素，其中构成糖的半乳糖残基被硫酸化(将对于每个组成二糖单元，含有1.5～2分子的硫酸酯基团的高度硫酸化的硫酸角质素有时称为多硫酸角质素)。另外，硫酸酯基团在半乳糖残基中的位置优选为6位。这样的高度硫酸化的硫酸角质素可例如从诸如鲨鱼等软骨鱼类的蛋白聚糖中获得。另外，也可以使用市售的产品。
可对这种方式获得的KS寡糖实施已知的将糖链脱硫酸化或硫酸化的方法来调节硫酸酯基团的含量以用作本发明的KS寡糖。
制备所述KS寡糖衍生物时，可根据通常使用的酰化方法将硫酸角质素中的羟基基团的氢原子用酰基基团取代以保护糖链上的羟基基团。例如，可通过使KS寡糖与待引入的酰基基团的反应性衍生物(羧酸酸酐(如，引入乙酰基时采用醋酸酐，引入丙酰基时采用丙酸酐)，羧酸卤化物等等，每一种与酰基基团相对应)在适当的溶剂(吡啶、二噁烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、水、及其混合物等等)中反应，以常规方法引入酰基基团。必要时，还可在诸如吡啶等碱性催化剂的存在下实施所述反应。
另外，必要时，还可调控酰化程度，此调控可根据上述酰化方法进行部分酰化或者可从酰化了的KS寡糖中部分去除酰基来实施。酰基的去除可通过使用甲醇氨、浓氨水、甲醇钠、乙醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾等进行水解来实施。所得到的衍生物采用反相高效液相色谱等方法纯化。
优选地，本发明的治疗药物的有效成分KS寡糖或其衍生物被纯化至足以作为医药品使用的程度，并且作为医药品使用时不含有不允许混入的物质。
本发明的治疗药物可对人、狗、牛、马、小鼠、大鼠等哺乳动物的外伤性神经障碍和/或运动功能障碍进行有效的治疗、抑制进展或预防。特别是，本发明的治疗药物适用于由神经病引起的运动功能障碍。另外，本发明的治疗药物同样适用于由脊髓损伤引起的神经病。脊髓损伤包括：外伤性脊髓损伤(锥体关节的脱臼或亚脱臼、锥体骨折(线状骨折、压迫骨折、压挫性骨折、完全横断损伤、不完全横断损伤、Brown-Sequard(布朗塞卡尔)型损伤、急性脊髓前半部损伤、急性脊髓中心部损伤、高位颈髓损伤等)、脊椎变性性疾病(脊椎关节强直等)、脊椎炎症性疾病(脊椎炎，慢性类风湿性关节炎等)、肿瘤(脊髓肿瘤、脊椎肿瘤等)、血管性疾病(脊髓出血，髓外血管病症引起的脊髓麻痹等)、脊髓炎(蛛网膜炎、病毒性脊髓炎、细菌性脊髓炎等)、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症等。脊髓损伤引起的神经病包括：下半身的运动功能障碍、半身不遂、下半身麻痹、知觉障碍、自律神经功能障碍、反射消失、性功能低下等。由神经病引起的运动功能障碍包括：基于神经病的休克、呼吸麻痹、知觉麻痹、运动麻痹、反射消失、自律神经麻痹等。另外，应注意的是本发明的治疗药物不仅可应用于治愈性治疗，还适用于疾病的预防、维持(防止恶化)、减轻(改善症状)等。
本发明中，可根据目标疾病的性质及进展状况、给药方法等恰当地选择任何剂型。本发明的治疗药物可通过注射(静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内等)、经鼻、口服、或经皮给药、吸入等方式给药，以及可根据这些给药方式进行适宜地配制。可广泛地选择适用的剂型，例如但不限于注射剂(溶液、悬浊液、乳液、使用时溶解的固形制剂等)、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液剂、脂质体制剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、糊剂、贴剂、凝胶制剂、栓剂、外用散剂、喷雾剂、吸入剂等。另外，当制备这些制剂时，可使用通常用于药物中的添加剂，如常用的赋形剂、稳定剂、粘合剂、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂、pH调节剂、着色剂、崩解剂等。
本发明的治疗药物中的有效成分KS寡糖或其衍生物在制剂中的含量及剂量应根据药物制剂的给药方法、剂型、使用目的、患者的具体状况、患者的体重、年龄和性别等因素来具体决定。KS寡糖的临床应用剂量通常为成人每天一次50～5000mg，但不特别限于此剂量。
本发明的治疗药物的有效成分KS寡糖的安全性已在专利文献3(国际公开第WO 96/16973号)中公开，其衍生物的安全性可以从专利文献4(特开2001-89493号公报)记载的实施例中推断出。
实施例
下面将参照附图阐述本发明的实施例。然而，本发明并不限于下文阐述的实施例。
[材料及方法]
[L4的制备]
如下所述，采用Xu等人的方法，L4通过用角质素酶II降解硫酸角质素，随后采用阴离子交换色谱法进行分离来制备。
KS寡糖(L4)是通过实施阴离子交换色谱法及凝胶渗透色谱法的一系列步骤，从来自鲨鱼鳍的硫酸角质素(生化学工业)的角质素酶II的降解产物中分离出。该寡糖采用毛细管电泳及质谱法进行鉴定(非专利文献4)。
采用具有紫外线检测器的Quanta 4000毛细管电泳系统(Waters)实施毛细管电泳。毛细管电泳系统中，样品装载在阳极，使用普通的极性。电泳缓冲液采用50mM的四硼酸钠(pH9.0)。该样品采用得自Waters公司的石英玻璃毛细管进行分离并分析(除了该样品通过上述检测器的区域外，将毛细管的外部区域覆盖：内径75μm，长度60cm)。加入样品前，将毛细管用0.5M的氢氧化钠、蒸馏水及电泳缓冲液进行手动冲洗。所述样品在10秒的注入时间内在静水压下被负载。实验在恒定电压(12kV)下进行。溶出物在185nm处进行监测。数据分析采用Waters公司的软件程序Millenium 32(版本3.06.01)来进行。
采用Toxicolor Ls set(生化学工业)，根据血细胞提取物试验(Limulusamebocyte lysate(鲎变形细胞溶解物试验))测定所得到的寡糖的内毒素。L4含有的内毒素等于或小于0.03pg/mg。
[脊髓损伤模型的制备及试验物质的给药]
按照以下操作，制备脊髓损伤模型(钳夹伤模型)。实验动物采用12周龄的雄性Wistar大鼠。将动物用戊巴比妥(50mg/kg体重)进行麻醉，用电动剃刀除去从颈部到臀部的毛发，用70％乙醇及Isodine(聚乙烯吡咯酮碘)(明治制药株式会社制)擦拭皮肤。切开背部皮肤后，暴露T5至T10胸椎，对第六胸椎(T6胸椎)实施半锥板切除术，在硬膜处引入小切口。用利多卡因(阿斯利康制)进行局部麻醉后，在T6位置处将钳子刺入直到其顶端达到椎体(钳子的顶端被加工至0.3mm)，通过从两侧把脊髓夹在中间10秒，对脊髓进行夹伤。
损伤后，立即将管的顶端(OD：0.3mm)留置在损伤部位头部侧的硬膜下，采用微量调节注射器(25μL，(株)伊藤制作所)将L4(6μL)在硬膜内给药。为了使损伤部位与周围组织分离，在损伤部位放置明胶海绵(Gelform，Pharmacia Corp.的产品)，缝合伤口，将大鼠放回饲养笼中。
[行为学的评价]
脊髓损伤后，7天内每天对后肢的运动功能进行评估。按照Basso等人的方法(参照非专利文献5和6)，采用Basso-Beeattie-Bresnahan(BBB)标准，由2名试验者进行独立地评估，将其平均分作为最终评分。另外，BBB标准是采用21个等级细分化的衡量标准，并允许动物在旷场内自由步行来评估后肢运动功能恢复的测量方法。当完全观察不到后肢的自发运动时，评分为0分，当观察到正常的后肢运动时，评分为21分。
[脊髓诱发电位的测定]
脊髓损伤后第7日，采用三氟乙烷进行麻醉(开始时注入4.0％，维持时注入1.0％)，对实验动物进行气管内插管。对实验动物给与肌肉松弛剂以防止其活动，以俯卧位固定头部，随后依靠呼吸器维持。将实验动物从第2/3颈椎间及第13胸椎/第1腰椎间插入导管电极，在使用超最大刺激(刺激频率：1Hz，持续时间：0.05ms)后，使用肌电图仪(Counterpoint，Dantech)测定脊髓诱发电位(SCEP)。所得电位的评价以第1电位的振幅作为指标。脊髓诱发电位的上升代表损伤部位的恢复。
[统计学的评价]
采用非参数Tukey的多重比较检验评价BBB评分。
[结果]
在使用BBB标准的后肢运动功能的测试中，与生理盐水给药组相比较，在脊髓损伤后第7日时观察到通过将L4以60μg/只动物的量给药后，可获得明显的后肢运动功能的恢复(P<0.001)(图1和2)。脊髓诱发电位中，与盐水-给药组相比较，通过将L4以60μg/只动物的量给药后，观察到SCEP振幅具有恢复趋势(图3)。