花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用.pdf

本发明公开了一种花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用。该方法：(1)是将花脸蘑子实体粉与pH值为6-9的磷酸缓冲液混合，在0-4℃浸提，离心取上清液得到花脸蘑粗提物；(2)上清液加入硫酸铵至饱和度为50％，在0-4℃放置8-16小时后离心；(3)上清液加入硫酸铵至饱和度为70％，在0-4℃放置8-16小时后离心。(4)用蒸馏水溶解沉淀得到花脸蘑抗TMV的蛋白。本发明的花脸蘑提取物属于天然提取物，对人类和环境均无害，属于环境友好型。且本发明的花脸蘑提取物的纯化方法简单，步骤精略，容易操作。

1、  一种花脸蘑提取物的制备方法，是将花脸蘑子实体粉与pH值为6-9的磷酸缓冲液混合，在0-4℃浸提，离心取上清液得到花脸蘑提取物溶液。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述花脸蘑子实体粉与所述磷酸缓冲液的混合比例为1g花脸蘑子实体粉干重：10—20ml磷酸缓冲液。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液的pH值为8，所述浸提的时间为2-6小时。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述花脸蘑子实体粉的粒径为60目以下。

5、  根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述花脸蘑子实体干粉为将花脸蘑子实体在20—40℃烘干，粉碎，过60目筛得到的花脸蘑子实体粉末。

6、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述离心得到的沉淀还可以1g：10—20ml的比例与pH值为6-9的磷酸缓冲液混合，在0-4℃浸提，得到花脸蘑提取物溶液。

7、  根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述花脸蘑蛋白提取物溶液还经过下述步骤的提取：
1)将所述花脸蘑提取物溶液中加入硫酸铵至饱和度为50％，在0-4℃放置8-16小时后，离心，收集上清液；
2)将步骤1)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，在0-4℃放置8-16小时后，离心，收集沉淀得到花脸蘑蛋白提取物。

8、  权利要求1-7中任意一项所述的方法获得的花脸蘑蛋白提取物。

9、  权利要求8所述的花脸蘑蛋白提取物在防治烟草花叶病毒中的应用。

花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用，特别涉及到一种花脸蘑抗植物病毒蛋白提取物及它的制备方法与其在防治植物病毒病中的应用。
背景技术
植物病毒病是生产中很难防治的一类病害，素有“植物癌症”之称。据估计，全世界每年因植物病毒病害造成的损失超过150亿美元，其中烟草花叶病毒病(Tobacco mosaicvirus)的危害每年造成的损失达1亿多美元(吴云峰.世界农业，1995，(5)：35～36)。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是一种非常重要的植物病毒，寄主范围广泛，可危害多种植物。目前，对于烟草花叶病毒病害还没有非常有效的防治方法。近年来，从天然提取物中发现某些蛋白能对这种病毒有一定的防治效果，尤其是从高等真菌中提取的抗病毒蛋白引起了广泛的关注。且这种天然提取物对人类和环境的危害性极小，属于环境友好型。
食用菌作为一种食品被人们所广泛了解，其所含蛋白质种类多样且含量丰富，是抗病毒蛋白筛选的较好源材。但到目前为止食用菌中的活性成分在植物病毒病的防治方面研究还比较少，国内外的几个特例报道操作都异常复杂，不利于实际生产应用，且菌种来源主要是人工栽培种，缺少从野生食用菌种天然产物筛选的广泛性。花脸蘑(Lepista sordida)，属担子菌亚门(Basidiomycotina)香蘑属(Lepista)。其子实体一般中等大小，蛋白质含量丰富，在夏秋季节的产量较高，主要野生于内蒙古、东北黑龙江和福建等地，目前尚未有关于花脸蘑内活性物质抗植物病毒的任何报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种花脸蘑提取物以及其它的制备方法与应用。
本发明所提供的花脸蘑提取物的制备方法，是将花脸蘑子实体粉与pH值为6-9地磷酸缓冲液混合，在0-4℃浸提，离心取其上清液即得到花脸蘑粗提物溶液。
所述方法中，花脸蘑子实体粉干重与磷酸缓冲液的混合比例为1g花脸蘑子实体粉干重：10-20ml磷酸缓冲液。
所述方法中，磷酸缓冲液的pH值优选为8.0；所述浸提的时间优选为2-6小时。
所述方法中，花脸蘑子实体粉的粒径为60目以下。所述花脸蘑子实体粉为将花脸蘑子实体在20-40℃烘干，粉碎，过60目筛得到的花脸蘑子实体粉末。
所述方法中，所述离心得到的沉淀还可以1g：10—20ml的比例与pH值为6-9的磷酸缓冲液混合，在0-4℃浸提，得到花脸蘑粗提物溶液。
所述方法中，花脸蘑提取物溶液还经过下述步骤提取：
1)将所述花脸蘑粗提物溶液中加入硫酸铵至饱和度为50％，在0-4℃放置8-16小时后，离心，收集上清液；
2)将步骤1)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70％，在0-4℃放置8-16小时后，离心，收集沉淀得到花脸蘑蛋白提取物。
本发明所提供的花脸蘑提取物为上述方法制备的花脸蘑蛋白提取物。
本发明花脸蘑蛋白提取物可用于防治烟草花叶病毒。
本发明首次以花脸蘑为材料，对其子实体进行了活性成份分析，并对其抗TMV的活性物质进行了纯化和性质研究，为抗TMV的生物源农药开发提供了另一条全新的途径。本发明的花脸蘑蛋白提取物对TMV具有很好的抑制效果，在提取物调至蛋白浓度为60μg/ml后，采用茎叶喷雾的方式处理烟草植株，可以诱导烟草对TMV的抗性，对烟草花叶病毒的侵染抑制率可达77％以上。本发明的花脸蘑提取物属于天然提取物，对人类和环境均无害。本发明花脸蘑蛋白提取物的制备方法简单容易操作。
附图说明
图1为本发明的花脸蘑蛋白提取物获得方法的流程示意图
图2为本发明的花脸蘑蛋白提取物抗TMV实验照片
具体实施方式
下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所示的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、一种花脸蘑提取物的获得及其效果实验
一、花脸蘑粗提物的获得
1、将上述获得的花脸蘑子实体于30℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到花脸蘑子实体粉末。
2、将10g步骤1)得到的花脸蘑子实体粉末与0.025mol/L pH8.0的磷酸缓冲液按照1g/10ml的比例混合；在4℃，浸提4小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液，将沉淀再于0.025mol/L pH8.0的磷酸缓冲液按照1g/10ml的比例混合，离心收集上清液，合并两次得到的上清液，得到200ml花脸蘑粗提物。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该花脸蘑粗提物的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。
二、花脸蘑提取物的抗TMV活性物质分离
1、将步骤一得到的花脸蘑粗提物，进行如下分级沉淀：
1)0-30％硫酸铵分级沉淀：将步骤一得到的花脸蘑缓冲液提取液加入硫酸铵至饱和度为30％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为0-30％硫酸铵沉淀蛋白。同时收集上清液留待后续操作。
2)将步骤1)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为40％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为30％～40％硫酸铵沉淀蛋白。同时收集上清液留待后续操作。
3)将步骤2)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为50％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为40％～50％硫酸铵沉淀蛋白。同时收集上清液留待后续操作。
4)将步骤3)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为50％～60％硫酸铵沉淀蛋白。同时收集上清液留待后续操作。
5)将步骤1)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为70％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为60％～70％硫酸铵沉淀蛋白。同时收集上清液留待后续操作。
6)将步骤1)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为85％，放置4℃下沉淀12h，10000rpm/min离心20min沉淀即为70％～85％硫酸铵沉淀蛋白。
2、分别将步骤一得到的花脸蘑粗提物以及上述各个分级沉淀得到的组分，用0.025mol/L，PH＝8.0的磷酸缓冲液稀释至总蛋白浓度均为60μg/ml。按照下述方法处理烟草，并检测它们对TMV的抑制率。
1)植株处理：将上述得到的提取物及各分级沉淀溶液(总蛋白浓度均为60μg/ml)，分别对苗龄一致(3-4叶)的枯斑三生烟(Nicotiana tabacum Samsun NN)进行整株喷雾，每个处理做三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。同时设置对照(CK)(对照只用清水进行喷雾处理)。
2)病毒接种液的制备：病毒为TMV普通株系(以普通烟(Ncotiana tabacumHawana 38)为繁殖寄主，本研究室活体保存)，其接种液获取方法是：将感染TMV的普通烟的烟叶去除主脉，与0.01mol/L pH＝8.0的磷酸缓冲液以1:20(g/ml)混合，每20ml磷酸缓冲液加0.015g金刚砂，将叶片研磨，得到接种液。
3)接种：将按步骤1)的方法喷雾72小时后得到的烟草，用步骤2)得到的接种液进行摩擦接种(植病研究方法第三版，方中达，中国农业出版社)，接种后立即用清水冲洗，在温室培养。培养条件为28℃光照12小时，18℃无光照12小时，交替进行。
(4)抑制率计算：接种72小时后调查发病情况，调查每张叶片的的枯斑数量，按下式计算出枯斑抑制率。
X＝(CK-Y)/CK×100    (式I)
式I中，X为枯斑抑制率，单位：％；CK为清水对照叶片的平均枯斑个数，单位：个；Y为经花脸蘑子实体粗提物诱导处理后叶片的平均枯斑个数，单位：个。
结果如表1所示，结果表明，50-60％硫酸铵分级沉淀组分和60-70％硫酸铵分级沉淀组分对TMV抑制率最高。
表1.花脸蘑提取物的TMV抑制实验结果

3、花脸蘑提取物进一步提取
根据上述步骤1和步骤2得到的结论，按照下述方法对将步骤一得到的花脸蘑提取物进一步提取：
1)在步骤一得到的花脸蘑粗提物中加硫酸铵至饱和度为50％，在4℃放置12小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液。
2)在步骤1)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70％，在4℃放置12小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集沉淀，即得到花脸蘑抗TMV蛋白提取物。
按照步骤2的方法对该步得到的花脸蘑蛋白提取物进行TMV抑制检测，结果如表2和图2所所示，结果显示该饱和度的硫酸铵沉淀对TMV的抑制效果较好，在浓度为60ug/ml时可达77.1％。图2中A为步骤一得到的花脸蘑粗提物抗烟草花叶病毒抑制实验照片，其中左图为清水喷雾72小时后摩擦接种的对照(CK)植株叶片照片，右图为步骤一得到的花脸蘑粗提物喷施72小时后摩擦接种的植株的叶片照片；图2中B为上述步骤3得到的花脸蘑蛋白提取物的TMV抑制实验照片，其中左图为清水喷雾72小时后摩擦接种的对照植株叶片照片，右图为上述步骤3得到的花脸蘑蛋白提取物喷施72小时后摩擦接种的植株叶片照片。
表2.花脸蘑提取物的TMV抑制实验结果

实施例2、一种花脸蘑提取物的提取方法及其TMV抑制实验
本发明的花脸蘑提取物的提取流程图如图1所示，具体方法如下所述：
1)将上述获得的花脸蘑子实体于20℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到花脸蘑子实体粉末。
2)将10g步骤1)得到的花脸蘑子实体粉末与磷酸缓冲液(0.02M，pH7.0)按照1g/20ml的比例混合；在4℃，浸提2小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液，将沉淀再与磷酸缓冲液(0.02M，pH7.0)按照1g/20ml的比例混合，离心收集上清液，合并两次得到的上清液，得到400ml花脸蘑粗提物。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该花脸蘑粗提物的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的花脸蘑粗提物粗提液中加硫酸铵至饱和度为50％，在4℃放置8小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液。
4)在步骤1)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70％，在4℃放置8小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集沉淀，即得到花脸蘑抗TMV蛋白提取物。
按照实施例1的步骤二的步骤3的方法，分别对步骤2)、步骤4)获得的花脸蘑粗提物进行抗TMV抑制率检测实验，结果如表3所示。
表3.本实例的花脸蘑提取物的TMV抑制实验结果

实施例3、一种花脸蘑提取物的提取方法及其TMV抑制实验
本发明的花脸蘑提取物的提取流程图如图1所示，具体方法如下所述：
1)将上述获得的花脸蘑子实体于35℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到花脸蘑子实体粉末。
2)将10g步骤1)得到的花脸蘑子实体粉末与磷酸缓冲液(0.03M pH＝6.0)按照1g/10ml的比例混合；在4℃，浸提6小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液，将沉淀再与磷酸缓冲液(0.03M PH＝6.0)按照1g/10ml的比例混合，离心收集上清液，合并两次得到的上清液，得到200ml花脸蘑粗提物。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该花脸蘑粗提物的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的花脸蘑粗提物中加硫酸铵至饱和度为50％，在4℃放置16小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液。
4)在步骤1)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度为70％，在4℃放置16小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集沉淀，即得到花脸蘑抗TMV蛋白粗提液。
按照实施例1的步骤二的步骤3的方法，分别对步骤2)、步骤4)和步骤6)获得的花脸蘑提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表4所示。
表4.本发明的花脸蘑提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果

实施例4、一种花脸蘑提取物的获得及其TMV抑制实验
本发明的花脸蘑提取物的提取流程图如图1所示，具体方法如下所述：
1)将上述获得的花脸蘑子实体于40℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到花脸蘑子实体粉末。
2)将10g步骤1)得到的花脸蘑子实体粉末与磷酸缓冲液(0.025mol/L，PH＝9.0)按照1g/10ml的比例混合；在4℃，浸提3小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液，将沉淀再与磷酸缓冲液(0.025mol/L，pH＝9.0)按照1g/10ml的比例混合，离心收集上清液，合并两次得到的上清液，得到200ml花脸蘑粗提物。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该花脸蘑粗提物的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的花脸蘑粗提物中加硫酸铵至饱和度为50％，在4℃放置12小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液。
4)在步骤1)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70％，在4℃放置8小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集沉淀，即得到花脸蘑抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤二的步骤3的方法，分别对步骤2)、步骤4)和步骤6)获得的花脸蘑提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表5所示。
表5.本发明的花脸蘑提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果

实施例5、本发明的花脸蘑蘑提取物的获得及其效果实验
本发明的花脸蘑提取物的提取流程图如图1所示，具体方法如下所述：
1)将上述获得的花脸蘑子实体于30℃烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到花脸蘑子实体粉末。
2)将10g步骤1)得到的花脸蘑子实体粉末与磷酸缓冲液(0.02M，pH8.0)按照1g/10ml的比例混合；在4℃，浸提4小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液，将沉淀再与磷酸缓冲液(0.02mol/L，pH＝8.0)按照1g/10ml的比例混合，离心收集上清液，合并两次得到的上清液，得到200ml花脸蘑粗提物。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该花脸蘑粗提物的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。
3)在步骤2)得到的花脸蘑提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为50％，在4℃放置12小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液。
4)在步骤1)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70％，在4℃放置12小时后，10000rpm/min离心20分钟，收集沉淀，即得到花脸蘑抗烟草花叶病毒蛋白提取物。
按照实施例1的步骤二的步骤3的方法，分别对步骤2)、步骤4)获得的花脸蘑提取物进行抗烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表6所示。
表6.本发明的花脸蘑蘑提取物的TMV抑制实验结果