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一种生物技术领域的中期因子蛋白的用途及含该蛋白的医用装置，本发明公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备促软骨组织生长药物或治疗软骨组织疾病药物中的用途，该蛋白作为促软骨细胞生长因子的用途以及包含该蛋白的医用装置：(a)其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。本发明完全不同于现有技术对MK类蛋白的认识，实验表明MK对体内三种软骨细胞都具有很好的增殖作用，使其可用于制备治疗软骨疾病的药物，为今后临床治疗软骨疾病提供新的选择，同时MK也可能会用于软骨组织工程中软骨细胞的体外扩增。

1、  一种如下(a)或(b)的蛋白在制备促软骨组织生长药物或治疗软骨组织疾病药物中的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
(b)至少与(a)中的氨基酸序列60％同源性的蛋白。

2、  根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述软骨组织为透明软骨组织、弹性软骨组织或纤维软骨组织。

3、  根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述软骨组织疾病为外伤性软骨损伤、骨关节炎、椎间盘退变、软骨发育异常、软骨发育不全症、肋软骨炎或复发性多软骨炎。

4、  根据权利要求3所述的用途，其特征是，所述外伤性软骨损伤为关节软骨损伤、穿透关节软骨下骨的关节软骨损伤或外伤导致的椎间盘软骨损伤。

5、  一种如下(a)或(b)的蛋白作为促软骨细胞生长因子的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。

6、  根据权利要求5所述的用途，其特征是，所述促软骨细胞生长因子为体外扩增软骨细胞数量的生长因子。

7、  根据权利要求5所述的用途，其特征是，所述用途是指氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白在制备促软骨细胞生长因子药物中的用途。

8、  根据权利要求5至7中任一项所述的用途，其特征是，所述软骨细胞为关节软骨细胞、弹性软骨细胞或纤维软骨细胞。

9、  一种药物组合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作为活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
(b)至少与(a)中的氨基酸序列60％同源性的蛋白。

10、  一种包含如下(a)或(b)的蛋白的医用装置：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
(b)至少与(a)中的氨基酸序列60％同源性的蛋白。

11、  根据权利要求10所述的医用装置，其特征是，所述蛋白以层面的形式存在于医用装置上。

12、  根据权利要求10所述的医用装置，其特征是，所述医用装置为支架形式。

中期因子蛋白的用途及含该蛋白的医用装置
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的蛋白的用途及含该蛋白的医用装置，具体是一种中期因子蛋白的用途及含该蛋白的医用装置。
背景技术
软骨是一种无血管的连接组织，分布在全身的各个部位。它由软骨细胞和细胞外基质构成，软骨基质由软骨细胞分泌并由其维持。根据形态学的标准及胶原蛋白和弹性蛋白的含量，可将软骨组织分为三类：透明软骨，弹性软骨和纤维软骨。透明软骨如鼻隔，关节软骨，气管和支气管；弹性软骨如耳和会厌；纤维软骨如半月板，椎间盘。Naumann，A等在《Journalof Histochemistry and Cytochemistry》(组织化学与细胞化学杂志)2002年第50期1049～1058页发表了题为《Immunochemical and mechanicalcharacterization of cartilage subtypes in rabbit》(兔软骨几种组织的免疫组织化学和机械特征研究)一文中，文中评述，透明软骨主要含有II型胶原，弹性软骨则含有弹性蛋白，而纤维软骨主要含有I型胶原。
上述软骨组织中关节软骨和椎间盘在全身运动中发挥重要的作用。关节软骨和椎间盘的细胞外基质平衡依赖于关节软骨细胞和椎间盘细胞的合成代谢和分解代谢。当软骨基质平衡打破时，软骨组织失去软骨基质并逐渐失去正常的生理功能，最终导致关节和椎间盘疾病，例如骨关节炎和椎间盘退变。由于软骨自身修复能力十分有限，目前多种用于改善软骨再生的临床方法和实验手段还不能有效满足修复受损伤软骨的临床治疗需要。
对受损伤软骨组织的生物学治疗方法在将来有可能成为慢性传统治疗方法和主要重建外科手术方法的有效替代。但这些生物治疗方法都依赖于生长因子的使用。目前，很多细胞因子被深入地研究，主要研究其对软骨细胞的生长、分化和对软骨基质的合成等方面的作用，例如成纤维细胞生长因子(FGFs)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，转化生长因子-β(TGF-β)，软骨源形态发生蛋白(CDMPs)，骨形态发生蛋白(BMPs)和连接组织生长因子(CCN2/CTGF)。Shida，J等在《Journal of Orthopaedic Research》(整形外科研究杂志)2002年第277期7493～7500页发表了题为《Regulation of osteoblast，chondrocyte，and osteoclast functionsby fibroblast growth factor(FGF)-18 in comparison with FGF-2andFGF-10》(成纤维生长因子-18与成纤维生长因子-2和成纤维生长因子-10对成骨细胞，软骨细胞和破骨细胞的功能调节的比较)一文，文中评述，如FGF-2和FGF-18通过关节腔注射给药，FGF-2可以促进年轻大鼠的关节软骨增大，但同时也能促进间充质细胞的增殖，并覆盖在关节软骨表面。Ellsworth，J.L等在《Osteoarthritis and Cartilage》(骨关节炎与软骨)2002年第10期308～320页发表了题为《Fibroblast growth factor-18is a trophic factor for mature chondrocyte and their progenitors》(成纤维生长因子18是成熟软骨细胞及其祖细胞的营养因子)一文，文中评述，通过腺病毒表达的FGF-18可以促进注射病毒部位周围软骨细胞的表层形成，但对周围的小鼠耳弹性软骨无影响。因此，尚待发现一种生长因子可以促进体内软骨组织的生长，而不促进其他类型细胞的增殖。
软骨组织工程是一种针对软骨疾病和损伤所出现的技术。软骨细胞自体移植(ACT)技术已用于临床上治疗颅面部和关节软骨损伤。迄今为止，ACT技术在全球范围内已治疗了超过12,000例全层软骨缺陷的病人。对于软骨组织工程来说，主要面临的挑战是要获取足够数量的软骨细胞以填充相应的软骨缺陷部位。由于体内软骨细胞数量较少，只占软骨组织的5～10％，因此在临床使用前需要对其进行体外扩增。Brittberg，M等在《NewEngland Journal of Medicine》(新英格兰医学杂志)1994年第331期889～895页发表了题为《Treatment of deep cart ilage defects in the kneewith autologous chondrocyte transplantat ion》(软骨细胞自体移植治疗膝关节深度损伤)一文，文中评述，目前大多数软骨细胞主要从关节处的透明软骨和耳组织的弹性软骨中的分离获得，继而进行体外培养。目前软骨细胞体外培养主要是通过有限的单层传代培养来进行，培养液中需添加血清。虽然这类方法对软骨细胞的扩增很有效，但软骨细胞在单层培养过程中会导致去分化而变为成纤维细胞，使其失去软骨细胞的特征。由单层传代培养方式所产生的去分化软骨细胞在第一代到第四代可在高密度培养方式和移植到动物体内后重新获得软骨细胞的特征(这一过程称之为再分化)。因此，在单层传代培养中软骨细胞的再分化能力与传代次数密切相关。目前，已知道多种生长因子如FGF-2，TGF-β，BMP-2和IGF-1已应用于软骨细胞的体外培养，以促使软骨细胞扩增，降低去分化作用，促进再分化作用，这些研究成功的可行性较大。目前，寻找一个理想的软骨细胞生长因子是软骨细胞体外培养的重要目标。这个因子可以在有限的传代培养过程中促进三种软骨细胞的体外扩增，同时保持软骨细胞特征基因的表达，合成软骨细胞所特有的软骨基质。
中期因子(midkine，MK)是多效因子(pleiotrophin，PTN)/中期因子家族中的一员，它最初被描述为视黄酸诱导所产生的因子，调节发育的因子，和肝素结合的神经营养因子。MK在妊娠中期的脑组织和其它组织中高度表达，出生后其表达量下降。在成年动物中，MK在小肠中以非常严格的高转录水平形式表达，而在其它组织中则低水平表达。Ohta，S等在《Journalof Bone and Mineral Research》(骨与矿物研究杂志)1999年第14期1132～1144页发表了题为《Midkine is expressed during repair of bonefracture and promotes chondrogenesis》(中期因子在骨折修复过程的表达及其促进软骨形成)一文，文中评述，Ohta等人发现，转染MK基因的小鼠ATDC5细胞可以促进软骨基质合成。但是研究同时指出，并不是所有可高表达MK的转染细胞株都可产生软骨基质；在培养ATDC5细胞时，添加MK蛋白不能促使其合成软骨基质。Dreyfus，J等在《Experimental CellResearch》(实验细胞研究)1998年第241期171～180页发表了题为《HB-GAM/pleiotrophin but not RIHB/midkine enhances chondrogenesisin micromass》(多效因子而不是中期因子可促进微球培养下的软骨形成)一文，文中评述，与此相似的是，Dreyfus等人发现，在对来源于鸡胚胎的间充质细胞进行微团培养时外源添加MK蛋白不能促进软骨基质合成。这些结果表明在培养时外源MK不能促进具有成软骨潜能的细胞向软骨分化。本发明人却发现MK可促进正常动物体内三种软骨组织的生长；外源添加MK蛋白在单层培养过程中可刺激三种软骨细胞的增殖，但不影响软骨特征基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了中期因子蛋白的用途及含该蛋白的医用装置。本发明完全不同于现有技术对MK类蛋白的认识，实验表明MK对体内三种软骨细胞都具有很好的增殖作用，能用于制备治疗软骨疾病的药物，为今后临床治疗软骨疾病提供新的选择；同时，MK也可用于软骨组织工程中软骨细胞的体外扩增。
本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明一方面公开了一种如下(a)或(b)的蛋白在制备促软骨组织生长药物或治疗软骨组织疾病药物中的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。
所述软骨组织为透明软骨组织、弹性软骨组织或纤维软骨组织。
所述软骨组织疾病为外伤性软骨损伤、骨关节炎、椎间盘退变、软骨发育异常、软骨发育不全症、肋软骨炎或复发性多软骨炎。
所述外伤性软骨损伤为关节软骨损伤、穿透关节软骨下骨的关节软骨损伤或外伤导致的椎间盘软骨损伤。
一种如下(a)或(b)的蛋白作为促软骨细胞生长因子的用途：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。
所述促软骨细胞生长因子为体外扩增软骨细胞数量的生长因子。
所述软骨细胞为关节软骨细胞、弹性软骨细胞或纤维软骨细胞。
在一具体实施方式中，本发明所述用途是指氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白在制备促软骨细胞生长因子药物中的用途。
另一方面，本发明公开了一种药物组合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作为活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种包含如下(a)或(b)的蛋白的医用装置：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。
所述医用装置可为支架。
另一方面，本发明公开了所述蛋白作为活性成分可以促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予有效剂量的本发明所述蛋白。
本发明再一方面提供一种治疗可通过促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架包含有效量的本发明所述蛋白。
本发明再一方面提供一种预防可通过促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架负载有包含治疗有效量的本发明所述蛋白的胶原蛋白IIa。
本发明再一方面提供一种促进软骨形成的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架负载包含治疗有效量的本发明所述蛋白的胶原蛋白IIa。
本发明具有如下的有益效果：本发明完全不同于现有技术对MK类蛋白的认识，实验表明MK对体内三种软骨细胞都具有很好的增殖作用，能用于制备治疗软骨疾病的药物，为今后临床治疗软骨疾病提供新的选择；同时，MK也可用于软骨组织工程中软骨细胞的体外扩增。
附图说明
图1rhMK对术后四周兔膝关节软骨全层缺损修复的切片图；
图2rhMK在术后不同时间对兔膝关节软骨全层缺损修复的切片图；
图3rhMK对术后四周兔膝关节软骨部分损伤修复的切片图；
图4rhMK对术后九周兔关节软骨部分损伤修复的切片图；
图5rhMK对术后十八周大鼠膝关节软骨损伤修复的切片图；
图6rhMK对术后十八周大鼠膝关节软骨损伤修复的切片图；
图7rhMK对大鼠软骨细胞去分化和再分化作用的示意图。
具体实施方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在本文，术语软骨指动物或人体的任何软骨，包括但不限于：关节软骨、透明软骨、半月板软骨和耳弹性软骨。
本发明的所述蛋白质指一种如下(a)或(b)的蛋白：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；(b)至少与(a)中的氨基酸序列具有60％同源性的蛋白。
本发明的所述蛋白质是有着上述SEQ ID NO.1的氨基酸序列的物质，优选该物质是rhMK蛋白质及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO.1描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。
术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体、上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。也包括模拟MK结合蛋白活性的合成体。
术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述rhMK的突变体。相比于天然的MK蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。
蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extensionpenalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
本发明涉及的方面还包括MK蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明MK蛋白的稳定性和/或生物活性。
蛋白的表达
本发明包括编码本发明的MK蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。
本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience(1992)和Sambrook et al.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathioneS-transferase，GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-ChelatingSepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得目标蛋白。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology(1986)。
编码本发明的所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95，503或Berent et al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF、Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。
另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的蛋白。
组合物
用于本发明或者含有本发明所述蛋白的组合物。通常，当本发明组合物用于上述用途时，所述蛋白可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。
“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是用于将本发明的融合体蛋白传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
本发明的蛋白可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为：片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括：无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括：调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括：注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括：无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是冻干粉针剂。
本发明的药用组合物可根据熟知的及公认的制药生产要求的方法制备。药用组合物适宜包含本发明的蛋白质以及药学上可接受的载体，并适宜为单位剂量形式。本发明的药用组合物可包含前药形式的本发明的蛋白质，该前药可在接受者宿主体内代谢转化成本发明物的活性形式。
本发明的药用组合物还可与其它疗法(例如二膦酸盐)联合应用，如同时、序贯或分别应用。本发明的药用组合物可包含有其它活性作用物，例如二膦酸盐、PTH、维生素D、BMP和雌激素。
另一方面，我们还提供一种包含本发明蛋白的医用装置。本发明蛋白质适宜以层面的形式存在，例如覆盖在骨连接装置的表面的层面形式。本发明的医用装置适于通过将本发明的蛋白质吸附于如氧化钛或其它金属或多聚物的表面，通过将本发明蛋白质与载体物质结合，然后将载体包附于该医疗装置表面来制备。
在本发明的另一个方面中，我们提供一种用于促进软骨形成的人造支架材料，该支架能与本发明的蛋白质有效地结合。
本发明的支架可以是三维基质或层面(例如连续的薄膜或凝胶)的形式。该基质结构可由纤维或适宜的材料制造，然后通过纺织处理(例如编织、针织、交织或非交织、熔融吹制、粘结、水缠)，并进一步制成所要求的三维形状。该基质结构也可以为其它形式，例如海绵状或泡沫状形式。
适宜的支架材料优选是生物可降解的，而且不会抑制细胞生长或增殖。该材料优选不应该引起患者身体的不良反应，并且应能通过例如环氧乙烷处理灭菌。该材料一般具有骨传导性。
因此，适宜的材料包括生物可降解的聚酯，例如聚乳酸(PLA)、聚乙二醇酸(PGA)、聚二噁酮、多羟基链烷酸酯(例如ICI)和透明质酸衍生物(如HYAFF)。更适合的材料包括在结合到本文中作为参考的专利申请WO91/13638和WO97/06835中公开的那些，例如亲水性聚氨基甲酸酯、聚醚聚酯、聚环氧乙烷、聚醚聚酰胺、羧甲基纤维素、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚丁二烯、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段共聚物等。
其它支架材料是以胶原蛋白为基质的物质，例如交联胶原蛋白/弹性蛋白材料、由酸溶性I型牛胶原蛋白原料制备的交联胶原蛋白、胶原蛋白凝胶(如那些商品名为COLLASTAT和COLETICA的物质)。天然或重组来源的胶原蛋白(如胶原蛋白IIa)均可使用。
本发明还提供了改良或嵌合重组性纤维状胶原蛋白(在此称为“改性胶原蛋白”)，其与本发明蛋白质结合，并具有能增强其装配性、稳定性和作为生物材料的用途的特征。该改性胶原蛋白可以用作上述的支架材料。方法包括使用I型胶原蛋白的C末端球状区域以促进三螺旋的形成；移出或改造该胶原酶裂解位点以抑制退化；掺杂其它的赖氨酸以促进交联，并改造N末端球状区域的裂解位点以促进成熟纤维的N末端区域的保留。例如，可将胶原蛋白IIa的chordin/SOG序列用蛋白质/多肽功能操控剂代替。可采用类似结构域改组方法使本发明的蛋白质结合入其它细胞外的基质组分中(例如纤连蛋白连接蛋白或胶原蛋白IV)或ECM结合分子或序列(例如肝素结合结构域)。参见例如WO97/08311，其整个内容结合到本发明中作为参考。
在其它具体实施方案中，本发明还提供了一种含有一种合成材料的骨替代材料，该合成材料包含任意一种上述的支架材料和与本发明蛋白质结合的晶体相态(例如一种磷灰石，如羟基磷灰石)。
在本发明的适当方面中，本发明的蛋白质作为支架以凝胶形式提供。该凝胶一般包括凝血酶、纤维蛋白原和因子XIII或其它与凝胶交联的转谷氨酰胺酶。
在优选实施方式中，本发明还提供一种促进软骨组织生成的支架，其中该支架包含胶原蛋白IIa；所述支架装置适于完全或主要由胶原蛋白IIa制成，或者主要用胶原蛋白IIa包覆。
本发明提供一种包含胶原蛋白IIa的支架，该支架能够释放本发明所述蛋白，并能控制本发明所述蛋白的释放。
因此，本发明所述蛋白的靶向性得到改善。在具体实施方案中，所结合的本发明所述蛋白可通过正常细胞活动和/或通过一种可以释放MK的操控装置或药物释放。本发明所述蛋白可通过所述支架的降解释放。
本发明适宜能使可溶性本发明所述蛋白与靶细胞(例如在缺损愈合部位)相互作用，在靶细胞能形成软骨的实施方案中，诱发这些靶细胞表达和合成软骨成分，从而使缺损部位复原。
本发明还提供一种制备促进软骨组织生长的支架的方法，该方法包括将支架用本发明所述蛋白包覆盖这一步骤。
在本发明该方面的一实施方案中，已将与软骨接触的表面衍生化或修饰，这样易于通过共价键直接将本发明的胶原蛋白IIa或支架结合于所述表面上。
用途
本发明还公开了所述蛋白作为活性成分可以促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予有效剂量的本发明所述蛋白。
“有效剂量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言，每天施以有效成分的总剂量约为0.01～1000mg。通常，成人临床给药量的范围为0.01～200mg/日，优选为0.05～100mg/日。
本发明另一方面提供一种治疗可通过促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架包含有效量的MK蛋白。
本发明再一方面提供一种预防可通过促进软骨形成而缓解的疾病或临床症状的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架负载有包含治疗有效量的本发明所述蛋白的胶原蛋白IIa。
本发明再一方面提供一种促进软骨形成的方法，该方法包括给予一种支架这一步骤，该支架负载包含治疗有效量的本发明所述蛋白的胶原蛋白IIa。尽管设想本发明有利于软骨修复，但还可以用来治疗其它临床症状和疾病。
本发明促进软骨形成而缓解的临床症状和疾病包括：骨关节炎(OA)、branchypodism、Hunter-Thompson软骨发育异常。也用于治疗关节的软骨病变，包括那些限于软骨和那些穿透软骨下骨的软骨病变，也可以用于治疗OA。
设想在不需高浓度生长因子下，本发明可以用于治疗软骨修复或诱发软骨生长。目前使用高浓度生长因子一直存在一个问题，即高浓度生长因子(如上所提)可引起生物平衡的偏离，从而可能导致该生长因子效能降低这一缺点。
本发明胶原蛋白IIa或支架适宜以层面的形式存在，例如覆盖在软骨接触的装置表面上的层面形式。本发明的医用装置适于通过将本发明的胶原蛋白IIa或支架吸附于如软骨固定凹销的表面上，通过将本发明的胶原蛋白IIa或支架与载体物质结合，然后将载体包覆于该医疗装置表面来制备。
类似地，本发明的特定方面的胶原蛋白IIa或支架可以用于促进软骨的再生。
本发明还公开了所述蛋白作为促软骨细胞生长因子的用途，可用于体内外软骨细胞的增殖，也在软骨组织工程中单独或结合胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及骨形态发生蛋白等用于人工软骨的制备，具体可参见文献《Chung C，Burdick JA.Adv Drug Deliv Rev.200814；60(2)：243-62；陈昌红，王宸国际骨科杂志.2006(2)117～119》。
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施方式中选用的实验动物：
C57BL/6J小鼠和Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)饲养于空气过滤系统的动物笼中，温度和湿度分别保持在23±5℃and55±5％。新西兰大白兔(购自上海医科大学实验动物中心)，体重在2.0～2.5kg。
实施例1
重组蛋白rhMK的制备
参照文献《Zhang Z，Du L，Xiang D，Zhu S，et al.J Zhejiang UnivSci B，2009，10：79～86》编码人MK成熟蛋白的DNA序列(GenBankNM_001012334)与pET30a+(Novagen，USA)载体连接，转化到E.coli(本发明中所涉及的菌株大肠杆菌已在《Zhang Z，Du L，Xiang D，Zhu S，etal.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10：79～86》文献中公开)中表达。重组rhMK蛋白通过离子交换层析进行纯化。纯化后的蛋白经反向高效液相色谱检测，其纯度大于98％。重组rhMK蛋白中内毒素含量低于0.3EU/μg蛋白。重组rhMK蛋白的生物活性通过刺激NIH3T3细胞生长进行检测。
实施例2
重组蛋白rhMK对正常小鼠、大鼠和兔子软骨的作用
步骤一
所有动物都经皮下注射给药，重组蛋白组和生理盐水(NS组)的注射体积均为0.5ml，所用rhMK用生理盐水稀释至所需浓度进行注射。8周龄雄性C57BL/6J小鼠分六组注射：NS组、rhMK组(10，33，100，300，900μg/kg体重)，连续注射一周，每组3只小鼠。3周龄SD大鼠分两组：NS组和rhMK组(注射175μg/kg体重重组蛋白)，连续注射一周，每组3只大鼠。2月龄新西兰大白兔分两组：NS组和rhMK组(注射92.5μg/kg体重重组蛋白)，连续注射两周，每组3只兔子。
步骤二
组织学观察及评价
所有小鼠和大鼠软骨组织样本均置于体积分数为10％的中性甲醛溶液中固定1天，兔软骨组织样本固定2天。固定后，组织样本在脱钙液(含7％AlCl₃·6H₂O，5％甲酸，8.5％HCl，其中各百分数为体积分数)中脱钙，小鼠和大鼠样本脱钙4天，兔样本脱钙10天。脱钙后的组织样本经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡后，进行包埋。样本使用莱卡切片机进行常规石蜡切片，并用苏木精-伊红或固绿-番红O染色。切片样本在显微镜下观察，并分析结果。对三种软骨组织厚度的测量使用光学显微镜上的标尺进行，每个样本取三张切片分别进行测量并取平均值。在股骨髁部1/2处对软骨组织表面至软骨下潮线处的距离进行测量以表示膝关节软骨的厚度；对动物耳中间部分的脂软骨细胞区域厚度进行测量以表示耳弹性软骨的厚度；胸椎间盘(T2-3)的外层部分厚度则用纤维环外层至髓核间的距离来表示。
rhMK对正常动物软骨组织的增殖作用
为了研究重组蛋白rhMK对体内软骨组织的生物学作用，我们表达并纯化了重组蛋白rhMK。通过对rhMK注射小鼠后第15天的组织切片结果进行分析，发现该蛋白对小鼠的关节软骨、耳弹性软骨和椎间盘的纤维软骨组织具有显著的增殖作用，结果如表1所示。对小鼠三种软骨组织都有增殖作用的有效剂量为300μg/kg体重/d，对重组蛋白作用最敏感的软骨组织为关节软骨和耳软骨组织，其最低有效剂量为10μg/kg体重/d。所有剂量组的小鼠股骨周围均未发现长出多余的软骨组织。因此，我们可以得出结论，注射一定剂量的重组蛋白rhMK可以致使小鼠体内三种软骨组织增殖。
重组蛋白注射剂量：连续皮下注射一周重组蛋白，重组蛋白剂量见下表。每组3只小鼠，分析其软骨生长情况。下表所有数据表示为平均值±标准差。该实验重复3次。*和**表示该剂量组与(0)剂量组的差异显著性分析，使用Student t检验。*为P＜0.05，**为P＜0.01。
表1rhMK促进正常小鼠体内软骨的生长

步骤三
为了验证重组蛋白在小鼠体内的有效剂量，我们又在目前软骨疾病模型中较为常用的实验动物大鼠和兔子体内进行相同的实验。对大鼠皮下注射重组蛋白175μg/kg体重/d，连续注射一周，对兔子皮下注射重组蛋白92.5μg/kg体重/d，连续注射两周，通过对注射重组蛋白第15天后的组织切片结果进行分析，发现rhMK可以显著增殖三种动物四种软骨组织，关节软骨、耳软骨、气管软骨和椎间盘软骨，详见表2，
表2rhMK促进不同的正常动物体内软骨生长

重组蛋白rhMK注射剂量：小鼠皮下连续注射一周300μg/kg体重重组蛋白，大鼠皮下连续注射一周175μg/kg体重重组蛋白，新西兰兔连续注射两周92.5μg/kg体重重组蛋白。每组3只动物，分析软骨的生长情况。下表所有数据表示为平均值±标准差。该实验重复3次。*和**值表示该rhMK组与对照组的差异显著性分析，使用Student t检验。*为P＜0.05，**为P＜0.01。
实施例3
兔膝关节软骨全层缺损模型的建立及rhMK对缺损部位的修复
步骤一，取2月龄雄性新西兰大白兔，体重2.0～2.5kg，用3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)经耳缘静脉注射麻醉后，兔两侧膝关节备皮。手术范围常规消毒，无菌条件下，取膝内侧弧形切口，显露股骨髁面，用电钻钻一直径为3mm，深度为4mm的全层软骨缺损，然后用4-0线逐层缝合关闭伤口。术后每天每只兔子注射青霉素40万单位，连续注射一周，以防止伤口部位感染。术后24h，开始注射生理盐水和重组蛋白rhMK，采用关节腔内注射。兔子一侧的缺损膝关节注射医用生理盐水0.5ml，另一侧则注射重组蛋白rhMK 0.5ml。每周注射3次，共注射2周。实验兔放养于兔笼内，让其自由活动，膝关节不固定。术后分别于2、4、6和12周处死兔子，取出关节软骨组织进行常规组织切片、HE及固绿-番红O染色，通过番红O染色后，在光镜下观察新生组织的性质、表面特性以及与正常组织融合情况等。
步骤二，试验结果
如图1所示左列图A，C，E，G和I为rhMK组；右列图B，D，F，H和J为生理盐水组。图A，B，C，D，E，F，I和J为HE染色，图G和H为固绿-番红O染色。图A中黑色矩形框部分被分别放大为图C，E和G；图D中黑色矩形框部分被分别放大为图F和H。图I和J中矩形框中所示部位为缺损部位附近残余的软骨组织，而圆形框中所示部位为原有软骨组织和新生组织的边缘处。
rhMK最显著的效果在于填充在缺损部位的新生细胞特征。术后4周，rhMK组和生理盐水组处理的缺损部位均被新生组织完全填充(图1A和1B)。在rhMK处理的一侧缺损部位，新生的软骨细胞排列整齐呈现栅栏状(图1C)，新生的软骨细胞为肥大软骨细胞并形成陷窝(图1E)，呈典型的软骨细胞特征，且特殊染料番红O染色呈阳性(该染料专一染软骨基质的蛋白多糖)(图1G)。但是，在生理盐水一侧，新生组织内的细胞排列不规则(图1D)，呈分散状，且这些类肥大软骨细胞以单细胞形式存在，未形成陷窝(图1F)，番红O染色呈弱阳性(图1F)。同时发现，rhMK治疗的一侧膝关节，其缺损部位周围的残余软骨组织内还存有大量活的软骨细胞(图1I和1J矩形方框部分)，该软骨细胞向缺损部位生长，并形成明显的软骨细胞串，而在对照生理盐水治疗侧的膝关节则未发现该现象(图1J圆形框部位)。因此，由此可得出结论：在膝关节全层缺损的软骨部位，局部使用rhMK可以促进新生软骨组织形成，其细胞为关节软骨细胞，而不是类软骨细胞；新生软骨细胞至少有一部分来自于缺损部位周围的残余关节软骨细胞。
从对术后不同时间的修复组织进行切片分析，可进一步证明在膝关节全层缺损的软骨部位rhMK对缺损部位周围的软骨细胞有显著的刺激作用。如图2rhMK在术后不同时间对兔膝关节软骨全层缺损的修复。图A和B为术后2周，图C和D为术后4周，图E和F为术后12周。图A，C和E中黑色方框部分被分别放大为图B，D和F。图A和C中箭头所指为损伤部位附近的软骨细胞向缺损部位生长。术后2周，虽然缺损中心区域被纤维样细胞所填充，但圆柱形缺损部位周围出现不完全的透明软骨层(图2A)，该软骨层含有典型的软骨细胞，并形成透明软骨所特有的软骨陷窝(图2B)。术后4周，由陷窝内的软骨细胞组成的新生软骨组织覆盖整个缺损表层，且呈现“U”型，与临近的关节软骨结合紧密，缺损中心区域被新生的软骨部分填充(图2C和2D)。术后12周，缺损处完全被关节软骨所修复，新生的骨髓填充在新生组织的中心部位，并有髓窦形成，软骨下骨形成，下潮线完全恢复(图2E)。新生软骨组织表面被排列规则的陷窝软骨细胞所覆盖(图2F)。上述软骨修复模式在rhMK治疗侧发生几率为72.2％(18个样本中有13个出现该现象)，而对照组生理盐水侧则未出现该现象(P＜0.01by Fisher’s exact test)。所有对照组生理盐水侧表现出相似的修复模式，即被类软骨细胞形成的新生组织所填充(图2B和2D)。因此，在兔膝关节全层缺损软骨模型中，rhMK治疗组中修复组织的细胞特征完全不同于生理盐水对照组，前者缺损处所填充的是关节软骨细胞，而后者则填充类软骨细胞。
实施例4
成年兔膝关节软骨部分缺损模型的建立及rhMK对缺损部位的修复步骤一，取9-10月龄雄性新西兰大白兔，体重3.0～3.5kg，用3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)经耳缘静脉注射麻醉后，兔两侧膝关节备皮。手术范围常规消毒，无菌条件下，取膝内侧弧形切口，显露股骨髁面，用手动钻一直径为约3mm部分软骨缺损，缺损部位以不见血为标准，然后用4-0线逐层缝合关闭伤口。术后每天每只兔子注射青霉素40万单位，连续注射一周，以防止伤口部位感染。术后24h，开始注射生理盐水和重组蛋白rhMK，采用关节腔内注射。兔子一侧的缺损膝关节注射医用生理盐水0.5ml，另一侧则注射重组蛋白rhMK 0.5ml。每周注射3次，共注射2周。实验兔放养于兔笼内，让其自由活动，膝关节不固定。术后分别于4和9周处死兔子，取出关节软骨组织进行常规组织切片、HE及甲苯胺蓝染色，通过甲苯胺蓝染色后，在光镜下观察新生组织的性质、表面特性以及与正常组织融合情况等。
步骤二，试验结果
图3所示为术后4周rhMK对兔膝关节软骨部分损伤的修复。左列图A和B为生理盐水组；右列图C和D为rhMK组。图A，B，C，和D均为甲苯胺蓝染色。图A和图C为低倍镜下观察结果，图B和图D为高倍镜下观察结果，图B和D中箭头所指为缺损部位的软骨组织及其细胞。
图4所示为术后9周rhMK对兔膝关节软骨部分损伤的修复。左列图A和B为生理盐水组；右列图C和D为rhMK组。图A，B，C，和D均为甲苯胺蓝染色。图B和D中箭头所指为损伤部位新生的软骨组织和软骨细胞。
从对术后四周和九周的软骨组织进行切片分析，可证明在成年兔膝关节部分缺损的软骨部位，rhMK对缺损部位的软骨细胞有显著的刺激作用，并能修复受损的软骨组织。术后四周，注射生理盐水一侧的缺损区域未能长出新生的软骨组织，且缺损区域残余的软骨组织中软骨细胞并未出现增殖(图3A和3B)；而注射rhMK一侧的软骨组织中，软骨组织中的存在大量的活细胞，且软骨细胞出现增殖，但软骨组织中的基质染色较浅(图3C和3D)。术后九周，注射生理盐水一侧的缺损区域长出部分新生组织，但新生组织内的细胞较少，软骨基质含量很少，甲苯胺蓝染色呈弱阳性(图4A和4B)；而注射rhMK一侧，软骨组织中的软骨细胞出现大量增殖，且覆盖于受损伤的软骨组织表面，软骨基质染色与附近周围正常软骨组织基本一致(图4C和4D)。因此，在成年兔膝关节软骨部分缺损模型中，rhMK可修复受损伤的软骨组织，而生理盐水组则不能修复缺损区域。
实施例5
ACLT诱发大鼠骨关节炎模型的建立及rhMK对软骨组织的修复
步骤一，取7周龄龄雄性SD大鼠，体重250-330g，用3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉后，大鼠两侧膝关节备皮。手术范围常规消毒，无菌条件下，膝前正中切口切开皮肤皮下组织，找到白色的髌腱，沿其内侧切开关节囊，过伸膝关节致使髌骨外侧脱位(通常都是往膝部的外侧方向脱位)。屈曲膝关节，找到前交叉韧带，用眼科剪剪断。伸直膝关节，复位髌骨，逐层缝合关闭伤口。每只大鼠注射丁胺卡纳霉素(规格为100,000U/ml，注射浓度为10mg/kg，注射剂量为1μl/10g体重)连续注射四天，以防止伤口部位感染。术后14周，开始注射生理盐水或重组蛋白rhMK，采用关节腔内注射。空白组大鼠左侧膝关节未经手术处理，不注射任何溶液，右侧注射重组蛋白rhMK 100μl。对照组大鼠左侧注射医用生理盐水100μl，右侧则注射重组蛋白rhMK 100μl。实验组大鼠左侧注射低剂量重组蛋白rhMK 100μl(注射浓度为58.3μg/kg)，右侧注射高剂量重组蛋白rhMK 100μl(注射浓度为525μg/kg)。每周注射3次，共注射2周。实验大鼠放养于鼠笼内，让其自由活动，膝关节不固定。术后分别于2和6周处死大鼠，取出关节软骨组织进行常规组织切片，HE及Toluidine Blue染色，在光镜下观察软骨生物力学及组织学特征。
步骤二，试验结果
图5所示为对术后十八周大鼠膝关节软骨损伤修复(HE染色)。A，B，C，D分别为sham组，ACLT/生理盐水组，ACLT/低剂量组以及ACLT/高剂量组膝骨关节切片经HE染色后的照片，标尺为200μm。E，F，G和H为A，B，C以及D放大两倍后的照片，标尺为100μm。其中图B，F显示骨关节炎软骨未经修复，将会导致血管刺穿潮线，并出现软骨下囊性变。
图6所示为对术后十八周大鼠膝关节软骨损伤修复(Toluidine Blue染色)。A，B，C，D分别为sham组，ACLT/生理盐水组，ACLT/低剂量组以及ACLT/高剂量组膝骨关节切片经Toluidine B1ue染色后在10倍光镜下的照片，标尺为200μm。E，F，G和H为A，B，C和D放大两倍后的照片，标尺为100μm。其中图B，F显示骨关节炎软骨未经修复，将会导致血管刺穿潮线，并出现软骨下囊性变。
rhMK最显著的效果在于递补到外层软骨的新生细胞特征。关节炎软骨层水分增加，蛋白多糖减少，着色较浅。术后18周，rhMK组较生理盐水组软骨层明显加厚，坏死细胞大多被新生软骨替代，新生的软骨细胞排列整齐呈现栅栏状(图5C和5D)，新生的软骨细胞为肥大软骨细胞并形成陷窝，呈典型的软骨细胞特征，且特殊染料Toluidine Blue染色呈阳性(该染料专一染软骨基质的蛋白多糖)。但是，在生理盐水一侧，细胞排列不规则(图5B)，潮线明显被血管破坏(图5B和5F)，Toluidine Blue染色呈弱阳性(图5F)。因此，由此可得出结论：在手术方法诱发的骨关节炎软骨部位，使用rhMK可以促进软骨组织形成，其细胞为关节软骨细胞。
从对不同剂量rhMK修复的软骨组织进行切片分析，可进一步证明在膝关节软骨损伤的部位，rhMK对软骨细胞有显著的刺激作用。无任何处理的空白组：软骨表面规则，结构正常，无裂隙，细胞排列整(图5A和5E及图6A和6E)；ACLT/生理盐水组：软骨表面不规则，裂隙较多，软骨细胞数量明显减少，散在分布，排列紊乱，表层局部被纤维覆盖，软骨层纤维性成分增多，潮线被血管破坏，出现软骨下囊性变(图5B和5F及图6B和6F)；ACLT/高剂量组：软骨表面较规则，裂隙较多，软骨细胞呈柱状排列，软骨层纤维性成分较多(图5D和5H及图6D及6H)。ACLT/低剂量组：软骨表面较规则，裂隙及纤维性成分均较生理盐水组少，细胞排列较整齐，可见软骨细胞增殖(图5C和5G及图6C和6G)。对病理切片进行评分，三组间的差异有统计学意义(P＜0.05，by Kruskal-wallis Test)，使用重组蛋白rhMK后的修复效果要优于对照组，且低剂量的修复效果要优于高剂量组。
实施例6
rhMK对三种软骨细胞的增殖作用
步骤一，原代软骨细胞的分离
取8周龄雄性SD大鼠，断颈处死后无菌条件下，用手术刀从股骨关节处、半月板和外耳分别分离关节软骨组织、纤维软骨组织和弹性软骨组织。分离出的软骨组织切成1mm的3小块，PBS洗涤两次，37℃胰酶工作液(0.25％(w/v)trypsin/0.02％(w/v)EDTA)消化30min后，PBS洗涤两次；关节软骨和弹性软骨用0.2％II型胶原酶(DMEM培养液配制)消化16h，纤维软骨用0.15％I型胶原酶(DMEM培养液配制)消化16h。待消化结束后，三种软骨细胞消化液分别用孔径为100μm滤器过滤(Falcon，USA)，细胞滤液放入15ml离心管内，室温2000rpm离心5min，细胞沉淀重悬于含10％FBS的DMEM培养液中。取10μl细胞液，加入10μl 0.4％台盼蓝溶液混匀后，光镜下计活细胞数。每次消化后活细胞数大于95％时方可用于后续实验。
步骤二，MTT法测定重组蛋白rhMK对三种软骨细胞的增殖作用
用含10％FBS的DMEM培养液将三种原代软骨细胞液浓度调整至5×10⁴个细胞/ml，向96孔板的每个孔内加入100μl稀释后的细胞悬液，37℃/5％CO₂培养箱内培养48h。吸出孔内培养液，用不含血清的DMEM培养液洗涤一次，每孔加入含不同浓度rhMK(0.5，1.0，3.0，5.0，9.0μg/ml)的DMEM(含0.5％FBS)培养液继续培养48h。培养结束后，吸尽孔内培养液，每孔加入100μl不含血清的DMEM培养液和20μl MTT溶液(0.5mg/ml，PBS配制)，37℃/5％CO₂培养箱内培养4h。吸尽孔内液体，加入120μl DMSO以溶解MTT晶体，微板振荡器上振荡1min，于酶标仪(BIO-TEK，USA)中测定每孔的吸光值，测定波长为490nm。
(1)软骨细胞的单层培养
用含10％FBS的DMEM培养液将三种原代软骨细胞液浓度调整至5×10⁴个细胞/ml，向6孔板的每孔内加入2ml稀释后的细胞悬液，即每孔细胞总数为1×10⁵个，孔板置于37℃/5％CO₂培养箱内培养。实验分为两组：对照组和实验组(添加rhMK，浓度为3μg/ml)。细胞每两天换液一次。待细胞长至汇合度为85～90％时，吸尽孔内培养液，用PBS洗涤一次，加入适量的胰酶工作液消化1min，反复吹打细胞，并将消化后的细胞液放入15ml离心管内，室温2000rpm离心5min，细胞沉淀重悬于含10％FBS的DMEM培养液中。取10μl细胞液，加入10μl 0.4％台盼蓝溶液混匀后，光镜下计活细胞数。部分消化后的细胞用于细胞传代，部分细胞用于RNA抽提，取1×10⁵个细胞/100μl，制作细胞涂片，并保存于-80℃冰箱中。原代细胞(P0)培养时间为7天。消化后的细胞按上述培养方法和实验分组重新接种于6孔板内，培养时间为3天，消化后得到的细胞为P1代，并计数。每代扩增倍数＝消化后的活细胞总数/初始接种的细胞总数。剩余的细胞液，取1×10⁵个细胞/100μl，制作细胞涂片，并保存于-80℃冰箱中。
无血清培养时，原代细胞用含10％FBS的DMEM培养液培养24h后，不含血清的DMEM培养液洗涤一次，加入含ITS+1(成分为insulin-transferrin-selenium，购自Sigma公司)的DMEM培养液，实验分两组：对照组和实验组(添加rhMK，浓度为3μg/ml)。细胞每两天换液一次。细胞长至汇合度为85～90％时，按照上述步骤消化计数，并传代培养。
(2)软骨细胞的高密度培养
传代消化后的软骨细胞，按照4×10⁵个细胞/孔加入24孔板内，培养液为DEME培养液(含10％FBS)，实验分两组：对照组和实验组(添加rhMK，浓度为3μg/ml)。当孔板内的细胞长满时，继续培养14天。细胞每两天换液一次。培养结束后，部分细胞用于RNA抽提，另一部分细胞经胰酶工作液和0.2％II型胶原酶37℃消化30min后，细胞悬液制成细胞涂片，保存于-80℃冰箱中。
(3)免疫组化染色
细胞涂片样本放入冰冷的丙酮溶液中固定10min，PBS浸泡5min，放入3％H₂O₂溶液中(ddH₂O配制)室温孵育10min，ddH₂O孵育5min。滴加5％BSA封闭液，室温孵育20min。甩去多余液体，不洗。滴加稀释的兔抗大鼠II型胶原的抗体溶液(1∶100倍稀释)，37℃孵育1h。PBS洗涤3次，每次2min。滴加生物素化的山羊抗兔IgG溶液(1∶100倍稀释)，37℃孵育30min。PBS洗涤3次，每次2min。滴加SABC溶液，37℃孵育30min。PBS洗涤3次，每次2min。滴加DAB试剂，室温显色，ddH₂O洗涤。苏木精轻度复染30s，脱水，透明，封片。
(4)RNA抽提及半定量PCR
软骨细胞样本中的总RNA抽提使用TRIZOL试剂(Invitrogen，China)，具体操作按照试剂说明书进行。抽提后的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA的第一链并以此为模板，进行目的基因的半定量PCR反应。表3为目的基因名称，GenBank登录号，引物序列，退火温度，PCR循环数和目的片段的大小。扩增条件为95℃预变性2min，94℃变性30s，退火温度下30s，72℃延伸30s，循环数参见表3，72℃末端延伸5min。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度为1.5％)，并用溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照分析。β-actin为看家基因。
表3半定量PCR实验中所用的引物序列