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本发明公开了一种预防和治疗用的疫苗，其中的抗原组成为吸附于可生物降解聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，所述的颗粒的平均粒径为0.1～20μm，所述的抗原结构明确，具有抗病毒作用，优选为乙肝表面抗原和人用狂犬病疫苗抗原，通过以下方法制备：将聚合物颗粒与抗原溶液进行混合，通过聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。在所得的悬液状疫苗中加入冻干保护剂，可制备疫苗的冻干粉剂。本发明疫苗能够在机体内迅速诱导免疫应答，诱导机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，通过分泌抗体或细胞因子等来清除或控制病毒，而且本发明疫苗的制备工艺简单，制备过程温和。

1、  一种疫苗，其中的抗原组成为吸附于可生物降解聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，所述的颗粒的平均粒径为0.1～20μm，所述的抗原结构明确，具有抗病毒作用。

2、  如权利要求1所述的疫苗，通过以下方法制备：将聚合物颗粒与抗原溶液以重量比10～5000进行混合，通过聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。

3、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的吸附作用是通过抗原与聚合物颗粒在盐溶液中以疏水作用来实现。

4、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的吸附作用是通过抗原与聚合物颗粒以静电作用来实现。

5、  如权利要求1所述的疫苗，所述的抗原为乙肝表面抗原，优选为通过重组汉逊酵母表达体系得到的乙肝表面抗原。

6、  如权利要求1所述的疫苗，所述的抗原为人用狂犬病疫苗抗原。

7、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗产品中的抗原总浓度根据需要可调节为1～50μg/0.2～1ml，聚合物颗粒的浓度为0.5～5mg/0.2～1ml。

8、  如权利要求1-7中任一种所述的疫苗，其特征在于，在抗原与聚合物颗粒吸附前，所述的抗原浓度为5μg～1000μg/ml，优选为10μg～500μg/ml，更优选的抗原浓度为20μg～200μg/ml。

9、  如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所制备得到的疫苗产品中，吸附于聚合物颗粒上的抗原与吸附前的抗原总量的重量比为在1％～30％，优选为3％～25％，更优选的是5～20％。

10、  如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所制备得到的疫苗产品中，吸附于聚合物颗粒上的抗原与吸附前的抗原总量的重量比为在5％～75％，优选为5％～50％，更优选的是10～30％。

11、  如权利要求1-7中任一种所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物的材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物。

12、  如权利要求1-7所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒与抗原的重量比为优选为50～1000，更优选的重量比为100～500。

13、  如权利要求1-7所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒的粒径大小为0.15～5μm，优选为0.25～1.5μm。

14、  如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的盐为氯化钠，其浓度为0.3～5mg/ml，优选的浓度为0.5～1.5mg/ml。

15、  如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的聚合物颗粒在溶液中pH值为5～8时表面带有正电荷。

16、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的包含有聚合物颗粒为空白颗粒，未包埋有抗原。

17、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的包含有聚合物颗粒中包埋有抗原，其中包埋的抗原为聚合物的重量的1～3％。

18、  如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，在所制备得到的包含有聚合物颗粒和抗原溶液的疫苗产品中加入冻干保护剂，制备得到疫苗的冻干制剂。

19、  如权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述的冻干保护剂为蔗糖，其浓度为5～10mg/ml。

20、  上述权利要求中任意一种疫苗，在选用乙肝表面抗原时在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。

21、  上述权利要求中任意一种疫苗，在选用人用狂犬病疫苗抗原时在制备预防狂犬病药物中的应用。

疫苗
技术领域
本发明涉及一种疫苗，更具体地说，涉及一种以可生物降解聚合物颗粒作为佐剂的疫苗。
背景技术
乙型肝炎(Hepatitis B)是由乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的全球性传染病，具有感染性强、携带率高和流行面广等特点，严重危害着人类健康。根据世界卫生组织(WHO)统计，迄今为止全球有20亿人感染过乙型肝炎病毒，其中约3.5亿人为慢性乙肝感染者，我国乙肝病毒总感染率60％，携带率约为10％(即约1.3亿)，属乙型肝炎高流行区。对于乙型肝炎尚无有效的治疗药物，目前抗病毒治疗上常用的干扰素和拉米呋啶，虽然能迅速抑制病毒复制，但是停药后易反跳，也易导致变异株的产生。近年来，由于基因重组技术的发展与应用、免疫学理论和技术的新进展等使得利用疫苗来治疗慢性HBV感染已成为研究的热点。
在慢性HBV感染者体内由于免疫耐受的存在，特异性T细胞反应低下。传统观点认为，治疗性疫苗的目的是发挥清除病毒作用的细胞免疫反应主要特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的溶细胞作用，即CTL通过释放穿孔素、颗粒酶杀伤感染的肝细胞或通过Fas介导的途径来诱导感染的肝细胞凋亡。但是近年来研究显示，Th1类细胞和CTL分泌的细胞因子参与的非溶细胞机制在抗病毒免疫中起着主导作用。IFN-γ、TNF-a等细胞因子都可以通过非细胞病变的方式来抑制病毒复制，甚至清除病毒DNA。尤其是IFN-γ在多种动物模型中的研究表明其具有抑制HBV复制中间产物和HBV特异mRNA的作用，在病毒清除中发挥着重要作用，通过激发自身的细胞免疫应答促进以IFN-γ为主的细胞因子的分泌来清除病毒。检测这些细胞因子的分泌水平可以衡量抗原特异性T细胞的活化程度，从而对疫苗的免疫效果进行准确的评价。
目前研究中的治疗性乙肝疫苗主要分为蛋白疫苗、免疫复合物型疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗或佐剂治疗性疫苗等。疫苗设计为考虑如何有效的激发或增强特异性多表位的细胞免疫应答，达到清除体内病毒的目的。以聚合物微球作为疫苗佐剂，能够增强抗原被树突状细胞吞噬的能力，增强抗原诱导的细胞免疫。中国专利号为011118448.5公开了一种以聚乳酸-聚乙二醇为佐剂的乙肝疫苗，将抗原包埋于该材料制备的微球中，注射免疫小鼠，25天后能够显著增强T细胞的功能，提高机体内抗原的特异性诱导的细胞免疫。但是作为一种治疗乙型肝炎的药物来说，需要在机体内迅速诱导细胞免疫应答，而且抗原在微包埋过程中，不可能完全被包埋于微球中，抗原会有相当量的损失，制备过程中也涉及的剪切力及有机溶剂也会影响抗原的生物活性，因而该方法从实际应用的角度来看不大可行。
此外，狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的世界性人兽共患性疾病，它能侵蚀人、家畜和野生动物的中枢神经系统。人类感染狂犬病毒后，一旦发病，死亡率为100％。我国狂犬病发病率和死亡率仅次于印度，并且近年来呈不断上升趋势，因此对于狂犬病的预防也是刻不容缓。目前对狂犬病尚无有效治疗方法，接种人狂犬病疫苗后，可刺激机体产生抗狂犬病病毒免疫力，用于预防狂犬病。狂犬病疫苗可采用免疫5针用于暴露后免疫，也可接种3针暴露前免疫，按是否添加佐剂可分为佐剂疫苗和无佐剂疫苗，使用Al(OH)₃佐剂能够增强疫苗的免疫原性而提高免疫效果，有利于抗体持续产生。但是狂犬病是致死性疾病，早期抗体产生在防止发病中起到了重要的作用，注射狂犬病疫苗后抗体产生的越早越好，因此需要一种新型佐剂疫苗，能快速在机体内迅速诱导抗原的特异性的免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种以可生物降解聚合物颗粒作为佐剂的疫苗，能够在机体内迅速诱导抗原的特异性诱导的免疫应答，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，分泌抗体或细胞因子等来清除或控制疾病。
本发明提供的疫苗包含吸附于聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)两种形式，聚合物颗粒表面吸附有一定量的抗原溶液，增强了抗原被抗原提呈细胞吞噬的能力，从而达到增强免疫效果的作用。
在本发明中，所提供的疫苗包含有平均粒径为0.1～2μm的可生物降解的聚合物颗粒和乙肝表面抗原溶液，其中聚合物颗粒与抗原的重量比为10～5000，通过聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用制得的悬液即为疫苗产品。
在本发明中，在抗原与聚合物颗粒混合前，比较优选的抗原浓度为5μg～100μg/ml，优选的抗原浓度为10μg～50μg/ml，更优选的抗原浓度为20μg～20μg/ml，还可以是30μg～100μg/ml。
在本发明中，所述的聚合物颗粒与抗原溶液的吸附作用使得所得疫苗产品的悬液中包含有两种形式的抗原：吸附于聚合物颗粒上的抗原与未吸附的抗原(游离抗原)，两者的比例依赖于具体选择的吸附方式，通过控制制备过程的工艺条件，就能制备得到满足要求的疫苗产品。
在本发明中，将聚合物颗粒加入至与抗原溶液中，所述的吸附作用可通过在盐溶液存在的条件下聚合物颗粒的疏水性与抗原蛋白分子的疏水作用来完成。在一定盐浓度存在的条件下，将聚合物颗粒抗原溶液混合后振荡吸附一定时间，抗原与聚合物颗粒通过疏水作用相互作用，就能制备得到可快速诱导抗原的特异性细胞免疫应答的治疗性疫苗。
抗原通常在有利于疏水作用的条件下吸附至疏水性的材料上，影响抗原与聚合物颗粒的因素有多种，如盐种类、盐浓度、溶液的pH及一些添加剂对于抗原与聚合物颗粒之间的吸附都有影响。本领域技术人员可以根据需要，选择具体的制备工艺。可选择的盐的种类有多种，如氯化钠、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵等，作为一种注射用疫苗的辅料，优选的实施方式是选用氯化钠。盐的浓度也对吸附作用有影响，抗原在聚合物颗粒中的吸附量随盐浓度的提高而增加，但过高的盐浓度会使得聚合物颗粒之间发生明显的聚集，同时过高的盐浓度也使得注射用疫苗的渗透压超过机体的耐受范围。作为本发明提供的一个优选的实施方式，选用氯化钠作为吸附用盐时，其浓度可在0.1～10mg/ml调节，优选的浓度为0.3～5mg/ml，更优选的浓度为0.5～1.5mg/ml。抗原与聚合物颗粒吸附时，溶液的pH值影响抗原的吸附效率，同时影响抗原的生物活性保持。在本发明中，抗原与聚合物颗粒吸附溶液的pH优选作为5～8，更优选的pH值为5.5～6.5。此外，作为疏水作用的吸附方式，抗原与聚合物颗粒吸附的温度也对所得的疫苗产品有影响，过低的温度不利于抗原的吸附，而过高的温度不利用抗原的生物活性保持，一般可在室温下进行疫苗产品的制备。通过抗原与聚合物颗粒在盐溶液中以疏水作用来制备疫苗产品，离心测上清液中抗原的残留量，计算聚合物颗粒对抗原的吸附效率，吸附于聚合物颗粒上的抗原相对于吸附前的抗原用量，重量比一般在1％～30％，优选的为3％～25％，更优选的是5～20％，可以是5-15％，还可以是10％左右，其比例依赖于具体选择的吸附方式。
在本发明中，可以用做疫苗佐剂的材料很多，可选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈及其与聚乙二醇共聚所得的聚合物材料中的一种或者几种。它们都是可生物降解、生物相容性很好的聚合物材料，而且都具有疏水基团，能呈现一定程度的疏水作用，可与抗原通过疏水作用制备得到满足要求的疫苗产品。其中作为经美国FDA批准的药用辅料聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)是其中比较优选的疫苗佐剂的材料。本领域技术人员可根据需要来选择作为疫苗佐剂的材料的分子量。过高的分子量，作为疫苗载体的材料的降解周期过长，不利用机体的长期使用。对于本发明的优选实施方式中，PLA和PLGA的分子量大小的选择范围优选在3k～100k道尔顿，更优选的是5k～20k。
在本发明中，聚合物颗粒的粒径大小影响制备得到的疫苗的免疫效果，优选的聚合物颗粒的粒径大小为0.15～5μm，更优选的为0.25～1.5μm。在本发明的一个实施例中，粒径为0.35μm微球诱导的IFN-γ分泌水平最高，其次为1.5μm粒径的微球，两者的免疫效果都显著高于单纯的汉逊抗原组，免疫小鼠后脾细胞的ELISPOT阳转比例均为100％。随着微球佐剂的粒径的增大，佐剂的免疫效应随之降低，IFN-γ分泌的水平降低，不同粒径大小的聚合物颗粒被抗原提呈细胞吞噬的情况各不相同，聚合物颗粒的粒径越小越容易被吞噬，但乙肝表面抗原分子的水合半径就为22nm，作为吸附佐剂的聚合物颗粒的大小最好应在数百纳米左右以上。
在本发明中，聚合物颗粒与抗原的重量配比也影响制备得到的疫苗的免疫效果，聚合物颗粒与抗原的重量配比影响颗粒佐剂对于抗原的吸附效率。同时，聚合物颗粒作为佐剂，其用量也影响制备得到的疫苗产品的免疫效果。本发明的优选的实施方式中，聚合物颗粒与抗原的重量比为25～2500，优选的为重量比为50～1000，更优选的为100～500。
在本发明中，还可调节聚合物颗粒的表面性质，选择与抗原所带电荷相反的聚合物颗粒通过静电作用来吸附抗原，这也是本发明提供的另一可使抗原与聚合物微球之间相互作用以达到本发明要解决问题的实施方式。乙肝表面抗原的等电点为4.7左右，利于抗原活性保持的pH值的pH一般为5.0～8.0，在此条件下，抗原呈现的为负电荷，此时可选择在该pH值条件下具有正表面的聚合物颗粒来制备疫苗产品，所选的聚合物材料可选自聚赖氨酸或壳聚糖等。也可对在一些在该pH值条件下具有不呈现正电荷的聚合物颗粒进行表面电荷修饰，使之表面带有正电荷，来制备满足要求的疫苗产品。在选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈及其与聚乙二醇共聚所得的聚合物材料中的一种或者几种的时，可在聚合物颗粒的制备过程中，通过表面阳离子物质来修饰微球，所述的表面阳离子物质可选自壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、聚乙烯亚胺和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在制备得到表面具有正电荷的聚合物颗粒后，将所得的聚合物颗粒混合与乙肝表面抗原混合，使抗原与聚合物颗粒之间主要以静电作用达到抗原在聚合物颗粒上的吸附。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的制备工艺，如pH和温度等。离心测上清液中抗原的残留量，计算聚合物颗粒对抗原的吸附效率，相对于通过疏水作用方式得到的疫苗产品，主要通过静电作用吸附制备的疫苗产品中，吸附于聚合物颗粒上的抗原相对于吸附前的总抗原用量，其重量比更高，一般在5％～75％，优选的是5％～50％，更优选的是10～30％，其比例依赖于具体选择的吸附方式。
在本发明中，制备所得的疫苗产品根据需要可稀释调节其中的抗原总浓度为1～50μg/0.2～1ml。所述疫苗产品中聚合物颗粒的优选浓度为0.5～5mg/0.2～1ml。本发明所述的0.2～1ml的疫苗是本领域技术人员公知的每人份的疫苗使用剂量。
本发明提供的疫苗中，选用的抗原是一类结构稳定、功能明确的抗原，该抗原具有抗病毒的作用，优选选用乙肝表面抗原、人用狂犬病疫苗抗原(Vero)。
就乙肝表面抗原而言，可做选择的抗原类型也有多种，可选择酿酒酵母和汉逊酵母表达的乙肝表面抗原，也可选择哺乳动物细胞系统表达的CHO乙肝表面抗原，但优选的抗原类型为通过汉逊酵母表达体系得到的乙肝表面抗原。来源不同的HBsAg在结构和性质上有较大差别，即使具有相同或相似的基因编码，由不同表达系统表达的HBsAg颗粒仍可能具有不同的分子大小、分子量以及不同的亚基数，进而表现出不同的电荷性、疏水性以及免疫原性等。重组(汉逊酵母)乙肝表面抗原，相对于其它抗原，具备免疫小鼠后脾细胞的ELISPOT阳转比例高、特异性的IFN-γ分泌水平高的特点，更适用于开发本发明的疫苗产品。
在本发明中，为降低抗原在微包埋过程中的生物活性和收率的降低，采用的聚合物微粒为单纯的空白微粒。作为本发明的另外实施方式，所选的聚合物微粒也可为包埋有抗原的微粒或空白微球与包埋有抗原的微粒的复配，其中包埋的抗原优选为聚合物的重量的1～3％，可进一步增强疫苗产品的免疫效果。本领域技术人员可根据需要选择合适的抗原的聚合物微包埋工艺。
在本发明的疫苗产品中，还可加入冻干保护剂，制备疫苗的冻干制剂，有利于疫苗的保寸和运输。冻干保护剂可选用蔗糖，当蔗糖的浓度达到5～10mg/ml时能很好的保持抗原在冻干过程中的生物活性，在一具体的实施例中，制备得到的以PLA微球作为佐剂制备的乙肝疫苗的冻干粉剂能显著增强抗原诱导的小鼠脾MNC IFN-γ分泌水平。
本发明的疫苗产品的作用机制可能为，微粒表面吸附有一定量的抗原溶液，增强了抗原的提呈能力。而且在本发明中以微粒作为佐剂开发的治疗性乙肝疫苗中，一定量游离抗原的复配是必须的，游离的抗原可能迅速激活体内特异性的免疫反应，之后再由微球作为抗体载体增强抗原提呈的能力，从而增强抗原诱导的细胞免疫应答。
本发明的疫苗产品微球能够增强抗原诱导的特异性CTL杀伤作用，在一具体的实施例中，平均粒径为0.35μm和1.5μm的PLA微球制剂均诱导了较强的对P815-S_28-39的杀伤，诱导的抗原特异性杀伤率分别为36％和32％，高于汉逊抗原组和汉逊铝佐剂疫苗组的23.1％和19.1％。
在本发明的另一具体的实施例中，以0.35μm的PLA微球制剂在体液免疫的效果达到铝佐剂疫苗的效果，免疫小鼠28天后，铝佐剂疫苗(总抗原用量为4μg)的抗体滴度为156.39mIU/ml，体液免疫的阳转比例为6/8，而以PLA微球作为佐剂的复配制剂来免疫小鼠(总抗原用量为4μg)的抗体滴度达到了193.85mIU/ml，体液免疫的阳转比例为7/8。而铝佐剂疫苗经过多年的临床实践，在体液免疫方面已显示出很好的效果。
本发明疫苗能够在机体内迅速诱导免疫应答，比如在选用乙肝表面抗原时，制备得到的疫苗该疫苗具有治疗乙型肝炎的作用，以聚乳酸微球为佐剂能显著增强HBsAg诱导的IFN-γ分泌，并同时增强HBsAg诱导的特异性CTL杀伤作用，呈现出较强佐剂作用，而且以PLA为佐剂的微球抗原制剂的体液免疫的效果达到了铝佐剂疫苗的效果。而且本发明疫苗的制备工艺简单，制备过程温和，抗原的生物活性保持好，而且对抗原的利用也不存在损失。还可以下两种策略制成冻干制剂：将预先制备好的冻干微球与适量NaCl装于西林瓶中备用，使用时加入抗原的溶液，振荡吸附一定时间就能满足要求；也可将抗原溶液制成冻干粉，与冻干微球装于西林瓶中备用，使用时加入生理盐水，振荡吸附一定时间就能制备得到治疗性疫苗。冻干粉剂的制备能解决现有铝佐剂商品化疫苗不能冻干而难以保寸和运输的缺点。
附图说明
图1不同PLA微球与抗原重量比对免疫小鼠的IFN-γ分泌的影响
图2不同粒径大小的PLA微球佐剂的电镜照片
图3微球佐剂的粒径大小对免疫小鼠7天后的IFN-γ分泌的影响
图4不同抗原制剂免疫小鼠7天后脾细胞和CD8⁺T细胞的ELISPOT结果
图5不同抗原制剂加强免疫小鼠脾细胞的ELISPOT结果
图6不同抗原制剂对抗原诱导的特异性CTL杀伤作用的影响
图7微球与抗原的吸附时间对复配制剂免疫小鼠脾细胞的影响
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于该实施例中。
无特定病原体BALB/c小鼠(H-2^d)，6-8w，16-18g，雌性，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心；乙型肝炎表面抗原：汉逊酵母(Hansenular Polymorpha)表达的抗原(adw2亚型)，浓度为1.9mg/ml，由华兰生物工程股份有限公司惠赠；重组汉逊酵母疫苗(批号：2006010301)，大连汉信生物制药有限公司惠赠。
(1)小鼠的免疫方案
采用背部皮下注射的免疫方式，每只小鼠注射100μl含一定量的微粒佐剂的混悬液，其中抗原量为4μg，另设单纯汉逊抗原组，免疫40μg/ml汉逊抗原100μl与微球组对比，阴性对照组小鼠每只注射100μl生理盐水，每组5只小鼠。免疫后7天摘眼球放血处死，无菌条件下取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，直接以ELSPOT法检测脾MNC经HBsAg MHCI类多肽S_28-39刺激分泌IFN-γ的水平；
CD8⁺T细胞分泌抗原特异性IFN-γ的测定，需在上述分离出单个核细胞的操作步骤后，用CD8⁺、MHCII微型磁珠标记，通过全自动磁性细胞分选仪(autoMACs)分选出小鼠脾细胞中CD8⁺、MHCII⁺细胞，将分离的MHCII⁺细胞作为抗原递呈细胞，加至CD8⁺T细胞中，ELISPOT检测脾MNC、CD8⁺T细胞经HBsAg MHCI类多肽S_28-39刺激后产生IFN-γ的水平。
HBsAg诱导的特异性CTL杀伤作用的测定是在小鼠免疫后14天，摘眼球放血处死，无菌条件下取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，经培养后测定CTL的杀伤能力。
小鼠免疫的试验操作
(一)ELISPOT法测定IFN-γ的操作步骤：
第一天(杀鼠取脾前一天)：
用IFN-γ抗体包被PVDF膜96-孔板，在10ml无菌PBS中加入浓度为1mg/ml PurifiedAnti-mouse IFN-γ(BD NA/LE^TM)50μl，使终浓度为5μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜。
第二天(杀鼠取脾)：
(1)脾淋巴细胞制备
①摘眼球放血处死小鼠，浸入75％乙醇中浸泡1-2分钟，无菌操作取出小鼠脾脏。
②将脾放置在400目不锈钢筛网上，用无菌注射器内芯轻轻研磨并用6ml生理盐水冲洗分散脾细胞，得到脾细胞悬液。
③把脾细胞悬液缓慢加入到已放置3ml淋巴细胞分离液的15ml离心管中，600g离心20分钟。
④吸出单个核细胞层，加入10ml1640培养基，400g离心10分钟，洗涤2次。用1640完全培养基重悬细胞，计数，浓度调至4×10⁶cells/ml。
(2)封闭：弃去包被抗体，用含10％胎牛血清的1640完全培养基200μl/well洗涤1次，弃去液体拍干，每孔加入200μl完全培养基，加盖于室温静置2小时。
(3)细胞孵育：取出封闭板，加入脾MNC，100μl(4×10⁵cell)/well，实验组设复孔，为脾MNC+刺激物(100μl多肽S_28-39，终浓度为10μg/ml)，对照组设单孔，为脾MNC+100μl完全培养基。阳性对照孔加入脾淋巴细胞+100μl ConA(浓度5μg/ml)，阴性对照孔加入200μl完全培养基。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养20小时。第一、第二天的步骤均要保持无菌。
第三天(洗板显色)：
(1)弃去孔内细胞及培养基，用超纯水洗板2次，PBST洗涤3次，每次洗涤时浸洗4分钟。
(2)将抗体(Biotinylated Anti-mouse IFN-γ)加至稀释缓冲液中，终浓度为2μg/ml，每孔加入100ul，室温静置2小时。
(3)PBST洗涤3次，按1∶100的比例将链霉亲和素(Streptavidin-HRP)加至稀释缓冲液中稀释，每孔加入100μl，室温静置1小时。
(4)PBST洗涤4次后，用PBS洗涤2次，每孔加入100μlAEC显色液。避光室温放置10-30分钟。待斑点形成至适合的大小之后，蒸馏水洗涤，终止显色过程。避光放置，待膜自然晾干。
(5)将ELISPOT板放置于CTL ImmunoSpot Analyzer自动读板仪内，调节好参数，采集图像，计数斑点。
(二)MACs分选小鼠脾细胞MNC操作步骤
(1)原理：把细胞用超级顺磁性的MACS MicroBeads(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱内而未被标记的细胞则随缓冲液流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就可以获得标记和未标记的两个细胞组份。
(2)按照10μl/10⁷小鼠脾单个核细胞(MNC)的比例加入CD8微型磁珠，4℃避光孵育15分钟。
(3)用细胞分选缓冲液洗涤细胞，400g离心10分钟，重悬细胞于500μl的细胞分选缓冲液中。
(4)用autoMACs分选标记的细胞，得到CD8⁺和CD8^-的细胞。
(5)将CD8^-的细胞用MHCII微型磁珠标记，重复(2)、(3)、(4)的步骤，得到MHCII⁺细胞。
(6)将CD8⁺T细胞计数后，取少量CD8⁺T细胞荧光抗体标记，流式细胞仪检测其细胞分离纯度均为90％。
(7)将分离的MHCII⁺细胞作为抗原递呈细胞，加入至CD8⁺细胞中，用完全培养基调CD8⁺细胞浓度为2×10⁶cell/ml。
(三)ELISPOT检测法测定IFN-γ的阳转判断标准：
①对照孔斑点数≤5SFC时，样本孔斑点数应≥10SFC；
②对照孔斑点数在5SFC和10SFC之间时，样本孔斑点数/对照孔斑点数应≥2；
③对照孔斑点数＞10SFC，样本孔斑点数/对照孔斑点数应≥3。
(四)CTL杀伤实验操作步骤：
(1)脾细胞的制备，见ELSPOT操作步骤。
(2)刺激细胞的制备
①制备正常同源小鼠的脾细胞，方法同(一)。用1640完全培养基调细胞浓度为5×10⁶cell/ml。
②加入丝裂霉素C(MMC)至终浓度为25μg/ml，37℃、5％CO₂培养2小时。
③加入无血清1640培养基30ml，400g离心10分钟，洗涤3次，去除残余的丝裂霉素C。
④用含有20U/ml rIL-2的1640完全培养基调细胞浓度为5×10⁶cell/ml，加入HBsAg MHCI类多肽S_28-39，终浓度为20μg/ml。
⑤于5％CO₂培养箱中37℃培养4小时后调细胞浓度为1×10⁶cell/ml。
(3)效应细胞的制备
①免疫小鼠的脾细胞与刺激细胞按10∶1的比例混合。
②在含有20U/ml rIL-2的1640完全培养基中，37℃、5％CO₂培养箱中培养6天，每两天换液一次，最终调效应细胞浓度为5×10⁶cell/ml。
(4)靶细胞的制备
①对数生长期的P815细胞用无血清1640培养基洗涤1次后计数，加入HBsAg MHC I类多肽S_28-39，终浓度为20μg/ml。
②完全培养基调浓度至5×10⁶cell/ml，于37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时。
③加入1mCi/ml的⁵¹Cr(放射性浓度为37MBq，1mCi/ml)于37℃，5％CO₂培养箱中培养90分钟，使⁵¹Cr标记靶细胞，每1×10⁷细胞⁵¹Cr加入量约为7.5×10⁶Bq。
④用无血清1640培养基将⁵¹Cr标记的靶细胞充分洗涤3次，去除残留的同位素，以1640完全培养基重悬细胞，调节靶细胞浓度至1×10⁵cell/ml。
(5)CTL杀伤靶细胞的检测
①调节效应细胞浓度为5×10⁶cell/ml，设50∶1、25∶1、10∶1三个不同的比例稀释效应细胞。
②于96孔U型底培养板中每孔加入100μl已稀释的效应细胞，每个效应细胞浓度设3个复孔。同时设最大释放对照6孔，最小释放对照6孔。
③每孔加入100μl⁵¹Cr标记的P815靶细胞，最大释放孔加入100μl 20％的Triton X-100，最小释放孔加入100μl完全培养基。
④400g离心1分钟，以促进效应细胞与靶细胞之间的接触，于5％CO₂培养箱中37℃培养6小时。
⑤400g离心10分钟，每孔取上清100μl，γ计数器测定cpm值。
⑥计算每个效应细胞浓度的修正溶解百分数，应为3孔cpm的平均值。最小释放应小于最大释放的30％，对照组的杀伤率在10％以下。
⑦结果以特异性杀伤率表示：
特异性杀伤率为＝(实验孔cpm均值-最小释放孔cpm均值)/(最大释放cpm均值-最小释放孔cpm均值)×100％。
实施例1
将10mg的PLGA空白微球(平均粒径为1.5μm，分子量为10kDa)加入到1ml浓度分别为10μg/ml、40μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.5，并调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，室温条件下振荡吸附12h，得到疫苗产品，免疫小鼠前用生理盐水将上述浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的抗原稀释至40μg/ml，各批次微球抗原复配制剂连同单纯的汉逊抗原均以4μg的抗原用量来免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况见图1，纵坐标表示每4×105脾MNC在HBsAg MHC I类多肽S28-39刺激下分泌IFN-γ的细胞数，即斑点形成细胞数(SFC)；横坐标表示不同微球与抗原配比对免疫小鼠7天后的IFN-γ分泌的影响，1-10μg/ml；2-40μg/ml；3-100μg/ml；4-200μg/ml；5-400μg/ml。在不同条件下，PLA微球都呈现出一定程度的佐剂效应，IFN-γ分泌水平(SFC均值分别为14.2、33、28.5、23.5和18.9)。微球组所诱导的IFN-γ分泌水平优选汉逊抗原组(SFC均值为9.5)的效果。
实施例2
采用三种不同粒径的PLA(分子量15kDa)空白微球作为疫苗佐剂，平均粒径分别为0.35μm、1.9μm和12.1μm，不同粒径大小的PLA微球佐剂的电镜照片见图2。分别将10mg的上述三种微球加入到1ml浓度为45μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.9，调节溶液中的NaCl的浓度为1.5％w/v，25℃条件下振荡吸附5h，各批次微球抗原复配制剂均以4μg的抗原用量来免疫小鼠，7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况见图3。纵坐标表示每4×105脾MNC在HBsAg MHC I类多肽S28-39刺激下分泌IFN-γ的细胞数，即斑点形成细胞数(SFC)；横坐标表示微球的粒径大小对免疫小鼠7天后的IFN-γ分泌的影响，其中1-0.35μm微球；2-1.9μm微球；3-12.1μm微球；4-铝佐剂疫苗；5-抗原。在三种不同粒径大小的微球复配制剂中，粒径为0.35μm微球诱导的IFN-γ分泌水平最高，其SFC均值分别为39.3，其次为1.5μm粒径的微球，两者SFC均值均显著高于汉逊抗原组(P＜0.01)，免疫小鼠后脾细胞的ELISPOT阳转比例均为100％。
实施例3
将10mg平均粒径分别为0.25μmPLA(分子量20kDa)空白微球加入到1ml浓度为40μg/ml的汉逊抗原中，调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，抗原溶液的pH为6.3，25℃条件下振荡吸附7h，得到疫苗产品，各批次微球抗原复配制剂均以4μg的抗原用量来免疫小鼠，7天后ELISPOT检测脾MNC和通过全自动磁性细胞分选仪分选出的小鼠脾CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌水平，见图4。纵坐标表示每4×10⁵脾MNC或2×10⁵CD8⁺T细胞在HBsAg MHC I类多肽S28-39刺激下分泌IFN-γ的细胞数，即斑点形成细胞数(SFC)；横坐标：1-0.35μm微球制剂疫苗组，2-汉逊抗原组，3-为汉逊疫苗组，4-生理盐水。1-3组诱导的脾MNC细胞IFN-γ分泌水平的SFC均值分别为31.1、10.3和26.1，分选出的CD8⁺T细胞分泌的SFC均值分别为76.9、29.1和55.6。
实施例4
将15mg平均粒径分别为0.9μmPLGA(分子量15kDa)空白微球加入到1ml浓度为40μg/ml的汉逊抗原中，调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，抗原溶液的pH为5.9，20℃条件下振荡吸附12h，得到疫苗产品，各批次均以4μg的抗原用量来免疫小鼠，7天后再次以同等剂量的抗原用量加强免疫小鼠，同时选用单纯的抗原与铝佐剂的疫苗作为比较，14天后用ELISPOT方法检测小鼠细胞免疫应答的水平。不同抗原制剂加强免疫小鼠的脾MNC IFN-γ分泌情况如图5，纵坐标表示每4×105脾MNC在HBsAg MHC I类多肽S28-39刺激下分泌IFN-γ的细胞数，即斑点形成细胞数(SFC)；横坐标表示不同类型的抗原制剂，1-微球制剂疫苗；2-铝佐剂疫苗；3-单纯抗原。免疫小鼠7天后的IFN-γ分泌值分别为33.3、22.6和10.6，加强免疫14天后的IFN-γ分泌值分别为55.9、40.1和20.3。
实施例5
将10mg平均粒径分别为0.35μm和1.5μmPLA(分子量10kDa)空白微球加入到1ml浓度为40μg/ml的汉逊抗原中，调节溶液中的NaCI的浓度为0.9％w/v，抗原溶液的pH为5.9，25℃条件下振荡吸附9h，各批次微球抗原复配制剂均以4μg的抗原用量来免疫小鼠。以P815-S28-39为靶细胞，通过51Cr释放法检测在优选条件下制得的微球复配制剂及铝佐剂疫苗免疫小鼠后诱导的CTL活性，免疫小鼠14天后检测CTL的HBsAg特异性杀伤作用。图6显示微球作为汉逊抗原佐剂能够增强抗原诱导的特异性CTL杀伤作用，其中，1-0.35μm微球制剂；2-1.5μm微球制剂；3-铝佐剂制剂；4-抗原；5-生理盐水。与铝佐剂汉逊疫苗相比，平均粒径为0.3μm和1.3μm的PLA微球制剂均诱导了较强的对P815-S28-39的杀伤，诱导的抗原特异性杀伤率分别为36％和32％，高于汉逊抗原组和汉逊铝佐剂疫苗组的23.1％和19.1％。
实施例6
将10mg平均粒径分别为0.3μm分子量10kDa空白微球加入到1ml浓度为50μg/ml的汉逊抗原中，调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，抗原溶液的pH为5.9，25℃条件下振荡吸附9h，得到疫苗产品，均以4μg的抗原用量来免疫小鼠。分别在14天和28天测定小鼠体内的抗体滴度，从体液免疫的角度考察以PLA为佐剂的治疗性疫苗的免疫效果。小鼠在初次接触抗原后，体液的免疫应答的效价都不高，包括铝佐剂在内的疫苗制剂免疫14天后抗体滴度都在10mIU/ml以下，免疫28天后，单纯抗原的抗体滴度仍不高，为5.01mIU/ml，铝佐剂疫苗的抗体滴度为156.39mIU/ml，体液免疫的阳转比例为6/8，而以PLA纳米微球作为佐剂的复配制剂来免疫小鼠(总抗原用量为4μg)的抗体滴度达到了193.85mIU/ml，体液免疫的阳转比例为7/8，因而可以说，以PLA微球作为佐剂的治疗性疫苗在体液免疫的效果达到铝佐剂疫苗的效果，而铝佐剂疫苗经过多年的临床实践，在体液免疫方面已显示出很好的效果。
实施例7
在采用单乳法制备微球的过程中，外水相中添加1％w/v的壳聚糖盐酸盐或CTAB，使微球的表面带有正电荷，制备得到的PLA微球(分子量3万，平均粒径为1.3μm)的表面电荷各不相同，空白微球表面带有-2.01mV的负电荷，壳聚糖盐酸盐微球表面带有+1.13mV的正电荷，CTAB修饰的微球表面带有+1.93mV的正电荷。将10mg的不同微球加入到1ml浓度为50μg/ml的抗原中，抗原溶液的pH为5.9，对于空白微球则调节溶液中的NaCl的浓度为1.0％w/v，25℃条件下振荡吸附5h，得到疫苗产品，离心测上清液中抗原的残留量，计算微球的吸附效率。空白微球对抗原的吸附仅通过疏水作用，抗原的吸附效率为5.9％，采用壳聚糖盐酸盐修饰的微球抗原的吸附效率为24.3％，CTAB修饰的微球对抗原的吸附效率为27.1％。将所制的疫苗产品来免疫小鼠，每只小鼠的抗原总用量均为4μg，免疫小鼠7天后，用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况，采用的空白的微球复配抗原所诱导的IFN-γ分泌水平的SFC均值为29.4，采用壳聚糖盐酸盐修饰的微球复配抗原所诱导的IFN-γ分泌水平的SFC均值达到41.9，采用CTAB修饰的微球复配抗原所诱导的IFN-γ分泌水平的SFC均值达到39.1。
实施例8
将10mg平均粒径为0.5μm PLA空白微球(分子量10kDa)入到1ml浓度为40ug/ml HBsAg溶液中，抗原溶液的pH为5.9，并在其中添加了NaCl，使得溶液中的NaCl含量为1％w/v，分别振荡0h、0.5h、1h、2h、4h和12h后，以0.1ml的用量(4μg抗原)免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况见图7。纵坐标表示每4×10⁵脾MNC在HBsAg MHC I类多肽S28-39刺激下分泌IFN-γ的细胞数，即斑点形成细胞数(SFC)；横坐标表示不同的微球与抗原的吸附时间对复配制剂免疫小鼠脾细胞的影响。不同的微球与抗原的吸附时间制备所得的疫苗产品免疫小鼠后的IFN-γ分泌水平的SFC均值分别为9.7、40.3、36.3、35.9和33.9。吸附时间对疫苗产品的免疫效果有一定程度的影响。
实施例9
将10mg平均粒径分别为0.5μm PLA空白微球(分子量10kDa)入到1ml浓度为40ug/mlHBsAg溶液中，抗原溶液的pH为5.9，并在其中添加了NaCl，使得溶液中的NaCI含量为1％w/v，振荡12h后，再在其中添加浓度为10％w/v的蔗糖作为冻干保护剂，以两种方式冷冻抗原溶液：①快速冷冻法，将微球抗原悬液直接加入到液氮中；②分步冷冻法，将微球抗原悬液置于-20℃条件下，冷冻2h，再转入液氮冷冻。制备冻干粉剂，再加入生理盐水，各批次微球抗原复配制剂均以4μg的抗原用量来免疫小鼠，7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况。分步冷冻法得到的抗原冻干粉的免疫产生的IFN-γ分泌的均值SFC达到37.3，快速冷冻法得到的抗原冻干粉的免疫效果IFN-γ分泌的均值SFC达到35.1。冻干粉剂的免疫效果已经优于商品化的铝佐剂疫苗(该疫苗不能冷冻)，而且可以冷冻干燥，易于保持和运输。
实施例10
将15mg的聚乳酸-聚乙二醇共聚物空白(平均粒径为1.9μm，其中共聚物中聚乳酸分子量为38kDa，聚乙二醇分子量为2kDa)微球加入到1ml浓度分别为50μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.5，并调节溶液中的MgCl₂的浓度为0.9％w/v，室温条件下振荡吸附12h，得到疫苗产品，以4μg的抗原用量来免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况，所诱导的IFN-γ分泌水平均值SFC达到21.1。
实施例11
将20mg的聚己内酯(平均粒径为1.3μm，分子量为30Da)空白微球加入到1ml浓度分别为100μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.5，并调节溶液中的NaCl的浓度为2％w/v，室温条件下振荡吸附5h，得到疫苗产品，以4μg的抗原用量来免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况，所诱导的IFN-γ分泌水平均值SFC达到27.1。
实施例12
将10mg的聚原酸酯(平均粒径为0.9μm，分子量为10Da)空白微球加入到1ml浓度分别为200μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.9，并调节溶液中的NaCl的浓度为1％w/v，室温条件下振荡吸附5h，得到疫苗产品，以4μg的抗原用量(0.1ml)来免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况，所诱导的IFN-γ分泌水平均值SFC达到19.3。
实施例13
采用复乳溶剂法将3.9mg汉逊抗原包埋于200mg PLA(分子量为15kDa)中，制备成冻干制剂，抗原的包埋效率为70％，其中被包被的乙肝表面抗原与PLA的比例为1.37％(重量比)。将上述所得的10mg的PLA微球(平均粒径为1.9μm)为40μg/ml的汉逊抗原中，抗原溶液的pH为5.5，并调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，室温条件下振荡吸附9h，得到疫苗产品，以(0.1ml)的悬液用量来免疫小鼠。7天后用ELISPOT方法检测小鼠脾MNC IFN-γ分泌情况，所诱导的IFN-γ分泌水平均值SFC达到39.3。
实施例14
在选用人用狂犬病疫苗抗原作为疫苗用抗原时，主要采用的是人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的有效成分灭活狂犬病病毒抗原，人狂犬病疫苗原液蛋白质含量优选不超过200μg/ml。
将10mg的PLA空白微球(平均粒径为0.5μm，分子量为10kDa)加入到1ml人狂犬病疫苗原液中(人狂犬病疫苗蛋白质含量120μg/ml)，并调节溶液中的NaCl的浓度为0.85％w/v，室温条件下振荡吸附12小时，得到疫苗产品，所得微球抗原复配制剂连同单纯的抗原也及铝佐剂抗原均以相同含量人狂犬病疫苗的抗原量来免疫小鼠，小鼠免疫用量是每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次，小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100的LD₅₀的CVS病毒量进行脑内攻击，每只0.3ml，同时将攻击毒稀释成10⁰、10^-1、10^-2和10^-3进行毒力测定，每个稀释度均不小于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录试验小鼠死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。计算供试品和参考疫苗ED₅₀值，计算相对效价。单纯的抗原的是效价是6.9IU/ml，铝盐为佐剂时效价是7.1IU/ml，而微球抗原复配制剂的效价则是10.2IU/ml，效果明显优于单纯的抗原和铝盐佐剂。
实施例15
将15mg的PLGA空白微球(平均粒径为0.9μm，分子量为15kDa)加入到1ml人狂犬病疫苗原液中(人狂犬病疫苗蛋白质含量159μg/ml)，并调节溶液中的NaCl的浓度为0.9％w/v，室温条件下振荡吸附9小时，得到疫苗产品，所得微球抗原复配制剂连同单纯的抗原也及铝佐剂抗原均以相同含量人狂犬病疫苗的抗原量来免疫小鼠，小鼠免疫用量是每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次，小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100的LD₅₀的CVS病毒量进行脑内攻击，每只0.3ml，同时将攻击毒稀释成10⁰、10^-1、10^-2和10^-3进行毒力测定，每个稀释度均不小于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录试验小鼠死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。计算供试品和参考疫苗ED₅₀值，计算相对效价。单纯的抗原的是效价是7.4IU/ml，铝盐为佐剂时效价是7.9IU/ml，而微球抗原复配制剂的效价则是10.9IU/ml，效果明显优于单纯的抗原和铝盐佐剂。
实施例16
将10mg的PLA空白微球(平均粒径为0.5μm，分子量为10kDa)加入到1ml人狂犬病疫苗原液中(人狂犬病疫苗蛋白质含量200μg/ml)，并调节溶液中的NaCl的浓度为0.85％w/v，室温条件下振荡吸附12小时，得到疫苗产品，所得微球抗原复配制剂连同单纯的抗原也及铝佐剂抗原均以相同含量人狂犬病疫苗的抗原量来免疫小鼠，小鼠免疫用量是每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次，小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100的LD₅₀的CVS病毒量进行脑内攻击，每只0.3ml，同时将攻击毒稀释成10⁰、10^-1、10^-2和10^-3进行毒力测定，每个稀释度均不小于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录试验小鼠死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。计算供试品和参考疫苗ED₅₀值，计算相对效价。单纯的抗原的是效价是8.0IU/ml，铝盐为佐剂时效价是8.6IU/ml，而微球抗原复配制剂的效价则是11.2IU/ml，效果明显优于单纯的抗原和铝盐佐剂。