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一种淫羊藿甙注射剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制备及应用领域，更具体涉及一种淫羊藿甙注射剂及其制备方法和在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。
背景技术
淫羊藿是常用的中药，是Berberridaceae科淫羊藿属(Epimedium genus)植物。中华人民共和国药典(2000年版)收载了如下五种淫羊藿药材，药材为干燥的地上部分。即淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等。淫羊藿主要含有异戊烯基取代的黄酮甙(淫羊藿甙)。其主要药效为补肾壮骨、增强内分泌，具有激素作用，可促进骨髓细胞DNA含成，促进骨细胞的生长。
淫羊藿甙均有3个糖基，即多糖基淫羊藿甙。多糖基淫羊藿甙活性较低，而低糖基淫羊藿甙(即淫羊藿单甙)或淫羊藿甙元活性却较高。这一研究为从事植物药提取活性成分的企业指明了方向，目前市场已有淫羊藿单甙供应。
在淫羊藿应用方面，基本上是依据其：补肾壮阳，怯风除湿等功用主治作用。如《中华人民共和国药典》(2005年版，一部)淫羊藿条中〔功能与主治〕为：补肾阳，强筋骨，怯风湿。用于阳萎遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛；更年期高血压。
检索淫羊藿甙中国专利，共有公开专利19件，其中涉及到提取纯化方面的制备方法专利3件，涉及用于减肥制剂专利2件，涉及用于性功能调节制剂专利4件，涉及抗排异，抗风湿，抗骨质增生制剂专利各1件，其它专利7件。未发现淫羊藿甙用于制备治疗心脑血管疾病药物方面的专利。
发明内容
根据我们的研究，发现淫羊藿甙具有扩张血管的作用，可以用于制备治疗心脑血管疾病药物。
由于淫羊藿甙难溶于水，作为口服制剂，利用率较低，为了提高其利用率，首先要解决淫羊藿甙难溶于水的问题，使其能用于注射制剂；其次要解决注射制剂的制备问题；还要解决它对心脑血管疾病的药理效果问题。
基于上述问题，根据我们的研究结果，确定其剂型为注射制剂。因此
本发明的目的是提供一种淫羊藿甙注射剂及其制备方法。
本发明的另一目的是提供一种淫羊藿甙注射剂在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
本发明的一种淫羊藿甙注射剂，其特征在于它是由淫羊藿甙：非水溶剂按重量/体积比例为1∶5-30，溶解后加入适量注射用水和/或注射剂用辅料制备而成的静脉注射剂；
所述的淫羊藿甙的纯度为90％-99％；
所述的非水溶剂是吐温-80、聚乙二醇(200，400)、乙醇、丙二醇、甘油、中的一种或几种的混合溶剂；
所述的注射剂用辅料是填充剂，选自甘露醇、乳糖中的一种；
所述的静脉注射剂，包括水针，输液和冻干粉针剂，每支注射液中含淫羊藿甙30-100mg。
本发明的一种淫羊藿甙注射液，其特征在于它是由淫羊藿甙：非水溶剂按重量/体积比例为1∶8-20，溶解后加入适量注射用水和注射剂用辅料制备而成。本发明的的一种淫羊藿甙注射液，其特征在于其制备方法按以下步骤进行：
(1)取适量淫羊藿甙，在40-80℃溶于适量体积的非水溶剂中；
(2)加入适量注射用水溶解，加或不加注射剂用辅料，补足注射用水；
(3)用灭菌垂熔玻璃漏斗或其他配制注射液用过滤方法过滤，灌封、灭菌后摇动，即得；
(4)将加注射剂用辅料的注射液经除菌过滤，灌注于西林瓶，每瓶1-2ml，盖塞，冷冻干燥，压塞即得冻干粉针剂。
本发明的的一种淫羊藿甙注射剂，其特征在于其在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
特别需要强调的是淫羊藿甙与非水溶剂的比例，这点对于制备保持溶液澄明度，符合注射给药要求的注射液来说是至关重要的。如淫羊藿甙所占比例过大，则原料药在非水溶剂中会达到饱和浓度，当制备过程中加处方量的水稀释时溶液即会出现不同程度的浑浊现象，导致过滤困难和不必要的原料浪费以及影响注射液中药物含量恒定等情况，增加生产难度；淫羊藿甙比例过小，则会不必要地增加非水溶媒用量，影响临床用药安全性。我们通过大量的处方筛选试验，摸索出既可提高淫羊藿甙溶解性，又可以满足注射用药要求的合理的制剂处方和制备方法，通过使用适量的非水溶剂，增加淫羊藿甙的溶解度和保持溶液的稳定性，避免在临床稀释使用时出现溶液浑浊、无法给药等问题的发生，尽可能降低非水溶剂的用量，提高了原药浓度，增加了临床使用的安全性。本发明提供的处方和技术生产的注射剂，可以用任意比例的注射用水，氯化钠或葡萄糖输液稀释，而保持溶液的澄明度，适合静脉注射给药。
本发明提供淫羊藿甙注射液规格为10ml、20ml、50ml、100ml，每种规格注射液淫羊藿甙含量为6、3、1.2、1mg/ml。
本发明提供淫羊藿甙冻干粉针剂规格为2ml、1ml，每种规格注射液淫羊藿甙含量为30、60mg/ml。
本发明所用的淫羊藿甙原料为从市场购进，经HPLC检测，淫羊藿甙的含量在90％-99％。
步骤(3)中的灭菌后摇动，目的是克服一些非水溶剂的坛点问题。
为进一步说明淫羊藿甙注射液的积极效果，本发明人对所制备的注射液和冻干粉针分别进行了加速稳定性实验、过敏性试验、全身用药刺激性试验、溶血试验等实验，结果表明：本发明的淫羊藿甙注射液质量稳定，安全性符合注射剂质量要求，可满足临床用药需要。现分述如下：
1.淫羊藿甙注射液加速稳定性实验：
对本发明的方法制备而得的淫羊藿甙注射液按加速稳定性试验法(国家药品监督局《中药新药研究的技术要求》)进行了稳定性研究。稳定性试验考察的项目分别为性状、pH值、澄明度、含量测定等项，供加速稳定性试验的淫羊藿甙注射液样品由北京天瑞祥云科技有限公司提供，样品批号分别为注射液：060604；淫羊藿甙冻干粉针060718。
材料与方法
样品批号：060604、060718(北京天瑞祥云科技有限公司提供)
1)试验条件：37-40℃，相对湿度75％。
2)考察时间：0月、2个月、3个月、6个月。
3)试验开始时间：060604批为2006年6月4日，060718批为2006年7月18日
4)考察项目：性状、pH值、澄明度、含量测定；
试验结果：如表2-1和2-2所示，淫羊藿甙注射液在本试验条件下很稳定。
表1样品加速稳定性试验报告
样品：淫羊藿甙注射液(批号：060604)

表1样品加速稳定性试验报告
样品：淫羊藿甙冻干粉(批号：060718)

注：澄明度为加如注射用水后检查；含量测定为测定每支冻干粉中淫羊藿甙含量。
二、淫羊藿甙注射液全身用药刺激性试验
试验材料：受试药淫羊藿甙注射液，规格：10ml/支，每支含淫羊藿甙60mg，由北京天瑞祥云科技有限公司提供。批号：060604，临用时用无菌生理盐水溶解配制成所需浓度。
动物：西兰种白兔，雄性，由广州第一军医大学动物室提供，符合二级标准。
试验方法：选取4只健康的新西兰种白兔，体重为3-3.2kg，饲养一周后供试验用。分别于兔子的左耳耳缘静脉推注TD，右耳注射无菌生理盐水作为参比对照，每次3mg/kg，药液浓度为6mg/ml，连续给予3天。在末次给药后肉眼观察血管的外观状况，然后在距离注射部位1cm处向耳根部方向取一段1.5cm左右的血管，用1％的福尔马林溶液固定，进行病理组织学检查。
试验结果：给药一侧与生理盐水一侧的耳尖部病变皆一致，皮下组织内有轻度慢性炎细胞浸润，以淋巴细胞为主。表皮完好，无损伤，无增生，皮下附属腺无病变。给药侧软骨正常，软骨外有空泡空隙，两旁血管充血，一只充血较严重，另三只充血较轻。皮肤表皮完好，无缺损，皮下组织无炎症，附属腺无病变。给生理盐水侧，耳中部仅见软骨外有空泡空隙，血管不充血，表皮上皮完好无损，皮下组织无炎症，附属腺无病变。
结论：本品连续给药后，给药侧与对照侧的耳尖部均有轻度的炎症，可能是注射操作不当引起，与用药无关；给药一侧耳中部出现充血，但未见炎症。病理检查未出现异常的变化。在本试验中，连续应用淫羊藿甙注射液未见有血管刺激性。
三、淫羊藿甙的过敏性试验
试验材料：淫羊藿甙注射液，规格：10ml/支，每支含淫羊藿甙60mg，由北京天瑞祥云科技有限公司提供。批号：060604，临用时用无菌生理盐水溶解配制成3mg/ml的浓度。阳性药：卵白蛋白(Albimin egg)，Sigma公司产品，华美生物工程公司分装，批号：BP0034。用无菌生理盐水配制成4％的浓度。
动物：豚鼠，由广州第一军医大学动物室提供，符合二级标准。试验方法：选取体重250、350g的豚鼠20只，随机分成两组，每组10只。每只豚鼠隔日尾静脉注射药液0.5ml，共注射3次，其中5只在第1次注射药物后14天再从股静脉注射原药液1ml，进行抗原攻击，另外5只在第1次注射药物后21天再从颈静脉注射药液1ml，进行抗原攻击。在抗原攻击后，如有过敏反应，则在注药后几分钟内发生，根据豚鼠表现进行平分，平分标准见下表。如果高于2分为有过敏反应，2分以下表明该药无致敏作用。试验设两组，一组为淫羊藿甙注射液组，给予淫羊藿甙注射液，一组为阳性对照组，给予卵白蛋白。

试验结果：抗原攻击后的动物表现评分见下表

  序号 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  淫羊藿甙注射液 1  1  1  0  0  1  0  0  0  0  卵白蛋白组 4  4  4  4  4  4  4  3  4  3
结论：本试验中，淫羊藿甙注射液没有引起动物的过敏反应。
四、淫羊藿甙溶血试验
2％细胞混悬液的制备：取兔血20ml，用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加5、10ml的生理盐水，摇匀，2000、2500rpm离心5分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用5-10ml生理盐水如法洗涤3-次，至上清液不显红色为止。将所得红血球用生理盐水配成2％的悬液，供试验用。取淫羊藿甙冻干粉用生理盐水配制成9mg/ml的溶液备用。
试验方法：取试管7只，按表3配比量依次加入2％红细胞悬液和生理盐水，混匀后，于37℃恒温箱放置半小时，然后分别加入不同量的药液(第六管为对照管)，摇匀后，置37℃恒温箱中。开始每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，共观察2小时，如溶液呈透明红色，即表示溶血，如溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，表示有红细胞凝聚作用。
表3淫羊藿甙冻干粉溶血反应试验


试验结果显示1-5号试管未出现溶血反应或凝集反应，说明淫羊藿甙冻干粉在本试验条件下不产生溶血反应和凝集反应。
具体实施方式：
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明。但不以任何方式限制本发明。
实施例1
处方：淫羊藿甙6g
吐温-80 100ml
水补足至1000ml
制法：取淫羊藿甙，在50-60℃下溶于处方量吐温-80中，搅拌下加入部分水，溶解后，补水至1000ml，用灭菌垂熔玻璃漏斗过滤，灌封，灭菌后摇动，即得10ml规格淫羊藿甙注射液100支。以本制备方法制备而得的样品，经加速稳定性试验证明在试验条件下有很好的稳定性，各项指标均符合注射剂标准(中国药典2005年版附录IB)。本注射液2支(6mg/ml)加入到250、500ml规格的5％葡萄糖输液和氯化钠输液中未出现浑浊等异常现象，动物溶血试验、热源检查(按中国药典2005版一部附录XID进行)、刺激性试验以及过敏性试验(中国药典2005年版附录XIK)表明完全符合规定标准。
实施例2
处方：淫羊藿甙12g
吐温-80 100ml
水补足至2000ml
制法：取淫羊藿甙，在50-60℃下溶于处方量吐温-80中，搅拌下加入部分水，溶解后，补水至2000ml，用灭菌垂熔玻璃漏斗过滤，灌封，灭菌摇动，即得10ml规格淫羊藿甙注射液200支。
实施例3
处方：淫羊藿甙12g
乙醇100ml
甘油10ml
水补足至1000ml
制备方法：取处方量的淫羊藿甙，室温下溶于处方量的乙醇和甘油中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，搅匀后，加入葡萄糖，搅拌溶解，再补注射用水至1000ml，过滤，灌封，灭菌，即得10ml规格淫羊藿甙注射液100支。
实施例4
处方：淫羊藿甙12g
乙醇100ml
聚乙二醇-200 100ml
甘露醇20g
水补足至2000ml
制备方法：取处方量的淫羊藿甙，室温下溶于处方量的乙醇和聚乙二醇-200的混合溶剂中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，再加入甘露醇，溶解后补注射用水至2000ml，过滤，灌封，灭菌，即得10ml规格淫羊藿甙注射液200支。
实施例5
处方：淫羊藿甙12g
乙醇100ml
聚乙二醇-400 100ml
甘露醇20g
水补足至2000ml
制备方法：取处方量的淫羊藿甙，室温下溶于处方量的乙醇和聚乙二醇-400的混合溶剂中，搅拌溶解后，加入部分注射用水，再加入甘露醇，溶解后补注射用水至2000ml，过滤，灌封，灭菌，即得10ml规格淫羊藿甙注射液200支。
实施例6
处方：淫羊藿甙12g
吐温-80 100ml
甘露醇200g
水补足至800ml
制法：取淫羊藿甙，在50-60℃下溶于处方量吐温-80中，搅拌下加入部分水，再加入甘露醇，溶解后，补水至800ml，用0.20μm滤膜过滤，分装于10ml西林瓶中，每瓶4ml，盖塞，冷冻干燥，压塞，即得淫羊藿甙冻干粉200支。
实施例7
处方：淫羊藿甙10g
吐温-80 100ml
水补足至10000ml
制法：取淫羊藿甙，在50-60℃下溶于处方量吐温-80中，搅拌下加入部分水，溶解后，补水至10000ml，用灭菌垂熔玻璃漏斗过滤，灌封，灭菌后摇动，即得100ml规格淫羊藿甙输液剂100瓶。
需要说明的是用吐温-80为非水溶剂，需要克服吐温-80的坛点问题，灭菌后摇动是克服这一问题的有效方法。，
一种淫羊藿甙注射剂，其特征在于在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
根据我们研究发现，淫羊藿甙能应用于制备治疗心脑血管疾病的药物，其作用机制是其直接对血管的调节作用。
本发明药物适用于心脑血管病的治疗，包括脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛、心肌缺血、心衰、心律失常等。
本发明的有益效果是：
(1)利用淫羊藿甙的直接调节血管作用，将淫羊藿甙用于制备治疗心脑血管疾病的药物，开辟了淫羊藿的新的应用领域。
(2)经药效学试验证明其疗效显著，为心脑血管性疾病的治疗提供了新药物。
以下对本发明药物的有益效果通过药效学试验作进一步明：
设计了犬大脑中动脉结扎所致脑缺血模型试验，测定犬大脑中动脉结扎后的脑组织缺血区重量，犬大脑中动脉血流速度；以犬冠状动脉前降支结扎法所致心肌梗塞模型试验，考察淫羊藿甙注射液对心肌缺血酶学指标及左室梗塞范围的影响，从而考察淫羊藿甙注射液对心脑血管疾病的治疗作用。
材料：
动物：中国草种犬(杂种犬)，体重8.5-10.5kg。
器材：ACS-0-6T型天平，Model-820型组织切片机，OLYMPUS PM-10AD摄影显微镜，ES-1000SPM多谱勒超声血流探测仪，Basic型半自动生化分析仪，泰盟BL-420型生物机能信号系统，R0DENT VENTILATOR DH-150型呼吸机，BB6220型CO₂培养箱，OLYMPUS IX70型倒置相差显微镜，DU64O型紫外可见分光光度计，眼科剪、眼科摄及常用手术器械、0号手术丝线、血管夹等。
药品及试剂：淫羊藿甙注射液(自制)，按成人与动物体表面积折算等效剂量换算，中剂量为淫羊藿甙20mg，高剂量为淫羊藿甙40mg，低剂量为淫羊藿甙10mg；以市售灯盏花素注射液、银杏叶注射液为阳性药对照，用量按成人与动物体表面积折算等效剂量换算；戊巴比妥钠，中国医药集团(上海)化学试剂公司进口分装；龙胆紫，成都科龙化工试剂厂；CPK试剂盒，北京中生生物工程高技术公司产品；LDH试剂盒，北京中生生物工程高技术公司产品；DMEM培养液，Hyclone公司，试验时加入小牛血清20％、青、链霉素各100U/ml使用；0.25％胰蛋白酶，HyClone公司，试验时用D-Hanks液稀释为0.08％使用；D-Hanks，实验室自己配置，-20℃保存，用时恢复至室温；LDH测试盒，南京建成生物工程研究所；AST测试盒，南京建成生物工程研究所；CK测试盒，南京建成生物工程研究所；小牛血清，HyClone公司。
试验方法：
1、犬大脑中动脉结扎所致脑缺血模型试验：草犬60只，随机分成6组，每组10只，腹腔注射3％戊巴比妥钠1.0ml/kg(30mg/kg)麻醉，固定于犬手术台上，然后在犬右外眼角与右耳根部1/2处(中点)，用电刀切开皮肤，分离肌肉，用手术专用颅骨钻钻开颅骨，以咬骨钳扩大颅骨孔，切开硬脑膜，找到大脑中动脉。先用多谱勒超声血流探测仪测定大脑中动脉血流速度，然后静脉注射给药，给药15min后，再次同前法测定大脑中动脉血流速度，随后立即将大脑中动脉结扎造成脑缺血。大脑中动脉结扎6小时后，分离双侧颈总动脉并夹闭之，即刻从右侧颈总动脉夹闭处的远心端灌注20ml龙胆紫饱和溶液对脑组织进行染色，然后处死动物，开颅取出脑组织，称全脑重，遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重，求出其占全脑重量的百分率，并进行病理组织学检查(按常规取脑组织，10％甲醛固定1周，H.E染色，石腊包埋切片，光学显微镜下观察)，以判断其是否属于脑缺血性损伤，结果见表1、表2。
2、犬冠状动脉前降支结扎法所致心肌梗塞模型试验：
健康犬60只，雌雄兼用，用戊巴比妥纳30mg/kg静脉麻醉后气管插管(备作开胸时人工呼吸用)，分离左侧颈总动脉，插入适当口径的聚乙稀管(内充满肝素生理盐水)，连接压力换能器测定外周血压(AP)，股静脉插管接输液管以备给药，同时测定心电图(BCGII)。从胸骨左缘沿第四或第五肋间开胸，切开一根肋骨并用撑开器撑开使全心充分暴露。剪开心包作心包吊篮，插入适当口径的聚乙稀管(内充满肝素生理盐水)，连接压力换能器测定左室内压(LVP)，左心室舒张未期压(LVEDP)及左心室内压最大上升速率(LV+dp/dt)和最大下降速率(LV-dp/dt)；分离深主动脉根部，用多谱勒超声血流探测仪侧定主动脉血流速度(用于折算心输出量C₀)。除直接测取上述参数外，按公式1〔1〕计算，间接测定左心室心肌耗氧量。以上指标均同步记录于泰盟BL-420型生物机能信号系统上，等各项指标稳定后，经静脉恒速滴注药物，注射容量均为2ml/kg，注射前、注射后15min两个时间点，均记录上述各项参数一次。然后于左冠状动脉前降支(LAD1/3处，供应心室前壁及心尖部的第一级血管分支起始部)双重结扎，结扎后5、10、15、30、60和120min分别开机记录上述各项参数。并在结扎LAD前和结扎后3h，取静脉血测定乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)含量；然后迅速放血摘取心脏，NBT染色法称重并计算心室梗塞范围。用配对T检验对模型组给药前后差异进行显著性比较，用组间T检验对各试验组间结扎LAD增减比率(按公式2计算)进行显著性比较，结果见表3。
公式1：左心室心肌耗氧量
MV02＝K1(BPs×HR)+K2〔(0.8BPs+0.2BPd)×HR×SV/BW〕+1.43
MV02＝左心室心肌耗氧量(ml 02/min/100g)，
K1＝4.08×10^-4，K2＝3.25×10^-4，
BPs＝收缩压(mmHh)，BPd＝舒张压(mmHh)
HR＝心率(beat/min)，SV＝每搏输出量(ml/beat)，BW＝体重(kg)
公式2：结扎LAD增减比率＝增减比率给药后数值一给药前数值给药前数值
结扎LAD增减比率＝〔给药后数值一给药前数值〕/给药前数值
表1不同剂量的淫羊藿甙注射液对实验性犬脑缺血的影响(x土SD)
  组别  n(只)  全脑重(g)  脑缺血区重(g)  脑缺血区重/全脑重(％)  对照组  10  69.63±3.60  18.90±4.82  27.14±6.92  灯盏花素注射液  10  56.96±6.92  13.64±4.92⁺  23.96±4.73⁺  银杏叶注射液  10  58.99±6.92  12.98±3.92⁺  22.01±6.63⁺  淫羊藿甙40mg  10  69.69±3.20  9.63±2.38⁺⁺  13.81±4.39⁺⁺  淫羊藿甙20mg  10  58.69±6.29  10.50±3.09⁺⁺  17.89±6.09⁺⁺  淫羊藿甙10mg  10  59.69±3.82  11.68±2.09⁺  19.56±2.69⁺⁺
注：各给药组与对照组比较⁺P＜0.05；⁺⁺P＜0.01.
表1结果显示，对照组缺血区重/全脑重(％)为29.30±6.92，说明动物模型造模成功。各给药组均可不一同程度地降低犬大脑中动脉结扎后的脑组织缺血区重量(P＜0.01和P＜0.05)，其中以淫羊藿甙注射液高，中剂量组(P＜0.01)效果最好，淫羊藿甙注射液低剂量组效果次之，效果均优于市售灯盏花素注射液及银杏注射液。
表2：不同剂量的淫羊藿甙注射液对犬大脑中动脉血流速度的影响

注：各给药组与对照组比较⁺P＜0.05；⁺⁺P＜0.01.
表2结果显示，各给药组均可明显和显著升高犬大脑中动脉平均血流速度，(P＜0.05和P＜0.01)，其中以淫羊藿甙注射液高，中剂量组效果最好(P＜0.01)，淫羊藿甙注射液低剂量组效果次之，且效果均优于市售灯盏花素注射液及银杏注射液。
表3对麻醉犬结扎LAD心肌缺血酶学指标及左心室梗塞范围的影响(X±SD)

注：n＝10；与生理盐水组比较⁺P＜0.05；⁺⁺P＜0.01
由表三可见，各给药组均可使左心室梗塞范围明显缩小(P＜0.05)，显著和明显降低模型动物的LDH和CPK(P＜0.01和P＜0.05)，其中以淫羊藿甙注射液高，中剂量组效果最好(P＜0.01)，淫羊藿甙注射液低剂量组效果次之(P＜0.05)，且效果均优于市售灯盏花素注射液及银杏注射液。