一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途.pdf

本发明涉及一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途，所述嵌合型腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig重组基因及CD40Ig重组基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。本发明成功构建含有CD40Ig-CTLA4Ig双基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，能够同时阻断CD40/CD40L和B7/CD28通道，既抑制细胞免疫排斥反又抑制体液免疫排斥反应，以此腺病毒载体对猪皮组织进行转染，大大提高了猪皮组织移植存活时间和转染效率。本发明提供的嵌合型腺病毒载体可用于制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤，用以覆盖临床烧伤病人的烧伤创面。

1、  一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述嵌合型腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig重组基因及CD40Ig重组基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。

2、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述CTLA4Ig重组基因中的CTLA4是全长的CTLA4或CTLA4片段。

3、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述CD40Ig重组基因中的CD40是全长的CD40或CD40片段。

4、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述CTLA4Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：1所示。

5、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示。

6、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，CTLA4Ig重组基因和CD40Ig重组基因之间连接一段来源于核糖体的非编码序列。

7、  根据权利要求6所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述非特异编码序列如SEQ ID NO：3所示。

8、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，含有CTLA4Ig重组基因及CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：4所示。

9、  根据权利要求1所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述启动子包括CMV、CAG、SV40或K14。

10、  权利要求1-9任一项所述的嵌合型腺病毒载体在制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤中的用途。

11、  根据权利要求10所述的嵌合型腺病毒载体，其特征在于，所述猪皮肤是4-6月龄的巴马香猪皮肤。

一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体及其用途。
背景技术
烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究的热点及难点。
深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。
专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。
但是Ad5腺病毒载体对猪皮肤组织细胞的感染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。
再有，上述发明(专利申请号为00103528)通过表达CTLA4Ig蛋白，与CD28竞争性结合B7分子，阻断T细胞活化的第二信号，从而抑制T细胞活化，抑制细胞免疫排斥反应。但皮肤移植排斥除了细胞免疫排斥外，还会发生体液免疫排斥。因此，通过表达CTLA4Ig蛋白单纯阻断T细胞活化，虽然可以减缓细胞免疫排斥的发生，但不能减缓体液免疫排斥，因此延长移植皮肤存活时间有限，不能满足长期覆盖创面的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于转染猪皮肤的转染效率高并能够延长移植皮肤存活时间的嵌合型腺病毒载体。
本发明的另一目的是提供该嵌合型腺病毒载体的用途，可用于制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤。
本发明的技术方案如下：
一种用于转染猪皮肤的嵌合型腺病毒载体，所述嵌合型腺病毒载体是含有与启动子有效连接的CTLA4Ig重组基因及CD40Ig重组基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体。
所述Ad5F35嵌合型腺病毒载体是一种″改外壳″的嵌合型腺病毒载体(Chimeric adenovirus)，即用Ad35的纤毛小节(Fiber)替代第一代腺病毒5型腺病毒的纤毛小节所致。所述CTLA4Ig重组基因是将CTLA4基因或其片段与Ig部分编码基因融合形成的重组基因。所述CD40Ig重组基因是CD40基因或其片段与Ig部分编码基因融合形成的重组基因。
所述CTLA4Ig重组基因中的CTLA4是人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4分子胞外区部分。用于本发明的CTLA4可以是该分子胞外区全长的CTLA4，也可以是具有其相应功能的CTLA4片段。本发明的CTLA4最好还包括信号肽。与CTLA4融合的Ig是人免疫球蛋白IgGγ1，其核昔酸序列包括人IgGγ1铰链区、CH1及CH2区；CTLA4与Ig的相连方式是铰链区连接。优选的用于本发明的CTLA4Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：1所示。
所述CD40Ig重组基因中的CD40基因可以是全长CD40，也可以选取具有其相应功能的CD40片段，与CD40基因融合的Ig包括人IgGγ1铰链区、CH1及CH2区，CD40与Ig的相连方式是铰链区连接。优选的用于本发明的CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示。
为了使CTLA4Ig重组基因和CD40Ig重组基因在被转化的组织中进行表达，该基因应与可驱动基因表达的启动子有效连接。所说有效连接是指启动子与重组基因的连接方式可以使该启动子能够引导该重组基因在皮肤细胞中进行表达。本发明中可以使用任何已知的可以在皮肤细胞中引导外源基因表达的启动子。能够引导CTLA4Ig重组基因和CD40Ig重组基因表达的启动子包括CMV、CAG、SV40或k14等等。
优选的，CTLA4Ig基因和CD40Ig基因之间连接一段来源于核糖体的非编码序列，以使CTLA4Ig重组基因和CD40Ig重组基因共用一个启动子表达。所述非特异编码序列为IRES2序列，IRES2序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，本发明含有CTLA4Ig重组基因及CTLA4Ig-CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：4所示。
基于CD40/CD40L途径是除B7/CD28途径外又一共刺激信号转导途径，参与免疫活化阶段B/T细胞间接触依赖的相互作用。CD40分子主要表达在B细胞表面，属于B细胞活化抗原，其与结合活化辅助T细胞表面表达的CD40L分子相结合，激活体液免疫反应的发生。一旦外源性给予CD40蛋白或CD40L蛋白，可以阻断B细胞表面的CD40分子与辅助T细胞表面表达的CD40L分子的结合，从而抑制体液免疫排斥反应的发生。
本发明成功构建含有CD40Ig-CTLA4Ig双基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，同时阻断CD40/CD40L和B7/CD28通道，既抑制细胞免疫排斥反又抑制了体液免疫排斥反应，以此腺病毒载体对猪皮组织进行转染，大大提高了猪皮组织移植存活时间和转染效率。
本发明提供的嵌合型腺病毒载体可用于制备覆盖烧伤创面的转染猪皮肤，用以覆盖临床烧伤病人的烧伤创面。在本发明中所述猪皮肤可以是任何一种品系、任何年龄的猪皮肤，优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香猪皮肤。
具体地说，本发明使用的Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体在体外可对0.1-1.0毫米厚的猪皮肤组织进行有效转染；其转染效果和动物试验的移植效果显著优于Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染的离体猪皮组织。Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体对猪皮肤成纤维细胞抑制效率为45.3％，Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体的抑制效率为32.9％。本发明的Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体的体外免疫抑制效果明显优于Ad5-CTLA4Ig，有极显著性差异(P＜0.01)。
附图说明
图1为pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切鉴定图。其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。
图2为pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定图。其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：EcoRI单酶切pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。
图3为正常293细胞图片(A)和Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体感染293细胞出毒照片(B)。
图4为Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体模式图。其中CMV为启动子，启动子之后依次是CTLA4Ig重组基因、IRES2序列和CD40Ig重组基因。
具体实施方式
以下通过实施例详细说明本发明。在下面的实施例中所涉及的实验材料如无特别说明均可通过市场购得或通过本领域常规的制备方法获得。
实施例1：Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体的制备
步骤1：CTLA4Ig融合蛋白表达载体的构建
按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开的实施例1构建pUC19-CTLA4Ig质粒。其中CTLA4Ig重组基因表达系列如SEQ ID NO：1所示。
步骤2：CD40Ig融合蛋白表达载体的构建
1)、常规方法从人的外周血中分离单个核细胞；
2)、常规方法提取单个核细胞的RNA；并逆转录为cDNA；
3)、特异性引物PCR扩增CD40的胞外区；并将产物克隆到T载体；
引物1的序列如SEQ ID NO：5，引物2的序列如SEQ ID NO：6。
引物1：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’
引物2：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’
4)、Ig片段来源同实施例1，也可以按照常规的分子克隆技术制备。将回收的Ig序列与CD40序列连接，得到CD40Ig。其中，CD40Ig重组基因的表达序列如SEQ ID NO：2所示。
步骤3：CTLA4Ig及CD40Ig双基因克隆载体的构建
1)、设计重叠延伸的PCR引物，去除CTLA4Ig中的末尾的非编码区，保留CD40Ig末尾的非编码区；引物3的序列如SEQ ID NO：7，引物4的序列如SEQ ID NO：8。
引物3：5’-ATATGGCCACAACCATGGTTCGTCTGCCT-3’
引物4：5′-AGGCTCTAGAAGCATCCTCGTG-3’
2)、用重叠延伸PCR的引物扩增CTLA4Ig与IRES2，并将产物CTLA4Ig-IRES2回收纯化；CTLA4Ig重组基因如SEQ ID NO：1所示，IRES2序列如SEQ ID NO：3所示。
3)、用重叠延伸PCR的引物扩增CTLA4Ig-IRES2和CD40Ig，将产物克隆入T载体，得到CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig基因，其序列如SEQ ID NO：4所示。由于IRES2是一段连接序列，为便于表述，以下的CTLA4Ig-IRES2-CD40Ig都表述为CTLA4Ig-CD40Ig。
步骤4：构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒
1)、HindIII+BamHI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pcDNA3(invitrogen，USA)，回收pcDNA3质粒酶切产物。
2)、HindIII+BamHI双酶切目的基因CTLA4Ig-CD40Ig，回收CTLA4Ig-CD40Ig酶切产物。
3)、连接1)、2)两片段，转化，挑取单克隆培养，提取转化后的pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。
4)、HindIII+XhoI(TAKARA，JAPANES)双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig，回收目的基因条带；
5)、HindIII+SalI(TAKARA，JAPANESE)双酶切载体质粒pDC316(Miscrobix biosystems，Inc)，回收pDC316质粒酶切产物。
6)、连接4)、5)回收的两片段，转化，提取转化后的pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。
7)、酶切鉴定。
图1为pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切鉴定图。其中，DNA分子量标准(M)从小到大依次为：250bp、1000bp、2500bp、5000bp、7500bp、10000bp、15000bp；1：HindIII和XhoI双酶切pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒。pcDNA3-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经HindIII和XhoI双酶切预期能产生大小分别5.4kb和3.1kb两条带，而电泳结果与预期相符，该质粒经酶切鉴定正确。
图2为pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定图。pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒经EcoRI单酶切鉴定，正确则可切出约3.1kb的一条带和3.9kb的pDC316载体片段，实验结果与预期相符，该质粒经酶切鉴定正确。
步骤5：含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因的Ad5F35嵌合型腺病毒载体的构建
1)、转染前一天，将293细胞(ATCC，USA)接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞，培养基为DMEM+10％Hyclone胎牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。
2)、转染当天换液，用新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取嵌合腺病毒Ad5F35(骨架质粒)和pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒(穿梭质粒)，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：
(1)每个转染孔取骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，混和均匀。
(2)质粒用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(3)取10μl的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。
(4)将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到293细胞中。
3)、转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm²细胞培养瓶中，用含5％胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。参见图3所示正常293细胞图片(A)和Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体感染293细胞出毒照片(B)。
4)、将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合腺病毒载体第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。
5)、在25cm²细胞瓶中培养293细胞，待细胞生长至90％满时，取上述第一代毒种500μl接种于细胞上，待细胞完全病变时按前述方法冻融细胞三次，离心收集病毒上清液，此即为Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合腺病毒载体第二代毒种(P2)。图4为Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体模式图。其中CMV为启动子，启动子之后依次是CTLA4Ig重组基因、IRES2序列和CD40Ig重组基因。
实施例2：Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体体外转染猪皮组织的目的基因实时定量PCR检测
1.猪皮片准备：在超净工作台内，将猪皮剪成2cm×2cm小块，用将5％碘伏消毒10分钟后，大量灭菌生理盐水清洗后备用。
2转染：用DMEM培养基调Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体滴度至10⁸PFU，Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体滴度至5×10⁸PFU，取相同面积的猪皮片(6月龄巴马猪)，分别加入相同体积的10⁸PFU Ad5F35-CTLA4Ig嵌合型腺病毒液和5×10⁸PFU的Ad5-CTLA4Ig腺病毒液，置于细胞培养箱中37℃培养。另取面积相同来源相同的猪皮肤在无病毒载体培养基内转染、培养作为对照。
3.Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体体外转染猪皮组织的目的基因实时定量PCR检测。
1)DNA的提取
取经Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体和Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染后的猪皮及空白对照猪皮，剪刀剪碎后转入1.5ml离心管，加入1ml组织裂解液和终浓度为100-200μl的蛋白酶K，充分混匀。将其放入振荡培养箱或水浴锅中，56℃消化10-16个小时。5000转/分钟离心5分钟，将上清转移入另一干净1.5ml离心管。加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，室温振荡30分钟。10000转/分钟离心10分钟，将上清(不要取到沉淀)转移入有相同体积异丙醇的1.5ml离心管，轻轻颠倒约10次，白色絮状沉淀即为DNA。10000转/分钟离心10分钟，弃上清。加入1ml75％酒精颠倒数次。5000转/分钟离心5分钟，弃上清。放入干燥箱烘干后，用双蒸水或Tris缓冲液溶解DNA沉淀，4℃保存备用。
对提取出的样品DNA进行实时定量PCR分析，用目的引物与内参引物分别对样品DNA进行扩增。
目的引物：5’AGGTCAAGTTCAACTGGTACG 3’，如SEQ ID NO：9所示。
          5’CTTGTACTCCTTGCCATTCA 3’，如SEQ ID NO：10所示。
内参引物：5’TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC 3’，如SEQ ID NO：11所示。
          5’GGTGGAATCATACTGGAACAT 3’，如SEQ ID NO：12所示。
定量PCR反应程序：
95℃    3min
94℃    30s
60℃    30s
读板
40个循环
72℃    3min
95℃    1min
55℃    1min
熔解曲线从55℃到95℃，每0.5℃循环一次10s
结果表明：10⁸PFU Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体与5×10⁸PFU Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染猪皮组织的DNA样品相对量比值为1.3，说明Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体在体外转染猪皮组织比Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染效率高。
实施例3.Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体介导体外免疫抑制功能检测
将猪成纤维细胞以1.0×10⁴cell/孔(96孔板)传代培养于100μl高糖型DMEM+10％胎牛血清培养基，培养条件均为37℃，5％CO₂，4-12h待细胞贴壁后，以0.01M/LPBS洗涤3次，Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体、Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体分别以MOI＝100，100μl转染2h，吸除转染液。用人淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。用200μl含体积分数为10％小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬2.0×10⁵个/孔(96孔板)与成纤维细胞共培养。48h后1000rpm×5min离心，加入0.5mg/mlMTT溶液20μl，继续培养4h，吸除后加入100μlDMSO室温气浴摇床孵育10min，570nm测定OD值。以未进行转染的猪成纤维细胞和人淋巴细胞共培养作为阳性对照。
阳性对照(淋巴细胞+猪成纤维细胞)：重复3次测量OD值的结果依次是1.07，1.06，1.03，OD值平均数＝1.05。
阴性对照(淋巴细胞)：重复3次测量OD值的结果依次是0.25，0.28，0.28，OD值平均数＝0.27。
处理1(淋巴细胞+Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体处理猪成纤维细胞)：重复3次测量OD值的结果依次是0.52，0.51，0.54，OD值平均数＝0.52。
处理2(淋巴细胞+Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体处理猪成纤维细胞)：重复3次测量OD值的结果依次是0.63，0.61，0.61，OD值平均数＝0.62。
抑制率＝1-(阳性-处理)/(阳性-阴性)×100％。腺病毒转染猪皮肤成纤维细胞抑制效果如下：
Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体的抑制效率为45.3％，Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体的抑制效率为32.9％。Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体的体外免疫抑制效果明显优于Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体，有极显著性差异(P＜0.01)。
实施例4.Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig转染猪皮在鼠创面的应用
将实施例2中的两种转染猪皮与未经转染的普通对照猪皮移植于烧伤Wistar大鼠背部2cm×2cm刃厚皮创面。实验发现Ad5F35-CTLA4Ig-CD40Ig嵌合型腺病毒载体转染的猪皮肤存活时间平均为23天，Ad5-CTLA4Ig腺病毒载体转染的猪皮肤存活时间平均为17天，而普通猪皮对照组存活时间为8到9天。
                序列表