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用于检测受体配体模拟物的方法和组合物
发明领域
本发明涉及确定小分子作为受体配体模拟物的效用的方法及其治疗性应用。
发明背景
发现受体配体模拟物的困难。通过激动性或拮抗性受体配体调节生物学功能，其目的通常在于阻断或缓和活性明显的生物化学途径，或者激活或恢复被认为与某种疾病有关或是其病因的途径。
与往往表现出高特异性生物学活性的内源或生物异源蛋白和抗体不同，小分子的特异性低得多。由于它们的大小有限，小分子与多种不同的靶结合，这可导致不需要的副作用，使得将它们开发成治疗有用的药剂是一种挑战。例如，为了建立起治疗有用的剂量窗、为了发现脱靶效应(off-target effect)以及它们在药物开发中的牵连，需要进行仔细的临床前和临床研究。特别是开发作为蛋白受体配体的功能性模拟物的选择性小分子，对药物开发提出了挑战，因为受体与其天然配体之间的相互作用位点及其区域远远超过小分子所提供的相互作用区域(P.Chene，Chem.Med.Chem 2006，1：400-411)。在初级生物学筛选中发现的原型分子通常也具有与其它受体相互作用的能力，在细胞水平上是非特异的。
此外，尽管发现作为给定受体/配体相互作用的拮抗剂的小分子是有可能的，但鉴定激动剂被认为更具有挑战性。因此，对于可以从“混杂的”、与多种靶以不需要的方式结合的分子中辨别出选择性和功能性小分子受体配体模拟物的方法，存在着明显的需求。
发现有用的联合疗法的困难。尽管在许多疾病、特别是肿瘤的治疗中已经取得了显著的进展，但单一疗法的单一药剂通常仍只能提供有限的益处。这并不令人意外，因为造成疾病的分子途径通常是很多的，并且在患者个体之间或同一患者的细胞亚克隆之间是不定的。因此，在大多数患者中，集中于单一靶的治疗通常不可能提供持久的疾病控制或治疗(J.E.Dancey和H.X.Chen，Nat.Rev.Drug Discov.2006，5：649-659)。运用药物组合提供了明确的治疗原则，特别是在癌症治疗中，为患者提供了更好的治疗和益处。除了少数例外，可用于癌症的药物疗法使用活性已知和毒性重叠谱最小的药剂组合，以它们的最适剂量并按照与正常细胞恢复相容的计划。那些化疗组合中仅有少数进行了严格的临床前评价，这些组合中是协同性的则更少，——即它们的组合提供的益处比它们个体活性的累加效应更大。当前的许多联合疗法首先在临床研究中进行尝试，——采用以人类患者的试错法(trial-and-error approach)来进行。
由于缺少鉴定的手段，在临床开发中这种针对联合治疗的主要是经验性的方法被证明是有效的，肿瘤可能对个体药剂的组合敏感：由于体外和体内疾病模型的固有局限性，实验室的体外和体内实验与人类临床研究的结果之间明显缺乏关联性。此外，永久性的癌细胞系，例如由ATCC这样的组织提供的或国立癌症研究院(National CancerInstitute)使用的癌细胞系，在与它们所来源的原始肿瘤进行比较时，显示出在生物学性质和化学敏感性模式的显著改变。两项研究显示，细胞毒性药剂在国立癌症研究院的60种细胞系组的体外测试、体内异体移植物和临床功效之间，关联性有限(J.I.Johnson，Br.J.Cancer 2001，84：1424-1431；T.Voskoglou-Nomikos等，Clin.Cancer Res.2003，9：4227-4239)。
其次，还需要方法来提供关于组合疗法最佳顺序的信息。例如，实验室研究揭示，EGFR抑制剂吉非替尼与标准的细胞毒性药剂组合，在紫杉醇之前高剂量“脉冲”给药，与连续的同时给药方式相比，体外作用更强(D.B.Solit，Clin.Cancer Res.2005，11：1983-1989)。
因此，对于合理设计的方法和实验验证协同性药物组合的方法存在着迫切的需求，因为预期它们可以为癌症患者提供更大的和持久的治疗益处。
凋亡是通过膜结合受体介导的。被称为凋亡的程序化细胞死亡，介导了组织稳态的维持，调节从皮肤和胃肠道除去细胞，以及对环境引发物作出响应重塑骨骼。凋亡还通过抑制全身性病毒感染、删除自身反应性T细胞和B细胞以防止自身免疫、以及消除获得了潜在致癌性的细胞，来防止疾病。凋亡的调节异常在许多疾病过程中发挥着作用。不适当激活凋亡与神经变性疾病例如帕金森氏病和阿茨海默氏病有关，或者与心肌梗塞后心脏组织再灌注后观察到的心肌损伤有关。此外，如果在细胞表面上检测到外源表位，则凋亡可以被免疫系统的自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)选择性诱导。对凋亡的抗性或细胞经历凋亡的阈值较高与许多基因的突变有关，例如p53肿瘤抑制基因。在凋亡途径中有缺陷的过度增殖的细胞可被证明具有存活优势，导致进一步的恶性发展以及最终成为癌症。
内在的(或线粒体的)和外在的凋亡(或受体介导的)途径是可能发生凋亡的两种机制。
在内在途径中，促凋亡信号传导的功能性结果是扰乱线粒体膜并将细胞色素c释放到细胞质中。在这里，细胞色素c与凋亡蛋白酶活化因子1(APAF1)和失活形式的胱天蛋白酶(caspase)-9形成复合物，命名为凋亡体。该复合物水解腺苷三磷酸以裂解和活化胱天蛋白酶-9。这种起始剂胱天蛋白酶进一步裂解和活化处决者分子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7。细胞色素c从线粒体中的释放是凋亡的早期事件，在胱天蛋白酶和内切核酸酶活化之前。细胞色素c的释放也导致活性氧类别(ROS)的形成。
由外在凋亡途径诱导的凋亡通过活化细胞表面死亡受体来介导。在配体介导活化死亡受体之后，保守的细胞内死亡结构域吸引了细胞内适配体分子、Fas相关的死亡结构域(FADD)。适配体分子将胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10召集到死亡受体上，形成死亡诱导信号复合物(DISC)，在其中将它们裂解和活化。在某些细胞中，这些起始剂胱天蛋白酶足以裂解和活化终末处决者分子胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7。但是，某些细胞液还需要活化基于线粒体的凋亡系统，以放大死亡受体信号。胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10裂解并活化细胞质促凋亡因子Bcl-2相互作用结构域(BID)，它易位到线粒体中并诱导凋亡起始因子细胞色素c(EK Rowinsky，Clin.Oncol.2005，23：9394-9407)。死亡受体家族的许多不同受体以及它们的天然配体是已知的(表1)：
表1：死亡受体及其配体

  受体  配体  TNFR1(DR1)  TNF-α，  LT-α  FAS(CD95，APO-1，  DR2)  FasL  TRAIL-R1(DR4)  TRAIL  TRAIL-R2(DR5)  TRAIL  DR3(APO2)  TL1，VEGI  DR6  ？  NGFR  NGF
尽管许多细胞毒性药剂例如顺铂或阿霉素以及放射疗法显示出活化内在凋亡途径，但通过外在凋亡途径定向诱导凋亡代表了尚未开发但新兴的破坏癌细胞的治疗性策略。通过肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)活化细胞表面受体，导致了对凋亡信号传导途径的直接刺激(外在刺激)。直接活化这些受体的分子，例如针对TRAIL或Fas受体(例如CH-11)的激动性单克隆抗体(agonistic monoclonalantibodies)以及重组TRAIL或Fas配体(FasL)，作为可能的单一疗法以及作为与现有的化疗药物和其它治疗模式的联合治疗的一部分，正在被评估。
TRAIL、TNFβ、FasL以及其它TNF超家族配体证明具有发动凋亡和杀死转化的细胞、病毒感染的细胞以及慢性活化的T细胞和B细胞的能力(S.R.Wiley等，Immunity 1995，3：673-682；P.T.Daniel和P.H.Krammer，J.Immunol.1994，152：5624-5632)。
但是，在癌症患者中全身治疗性施用重组TNFα(以及在动物研究中类似地施用TRAIL)，导致了严重的炎症反应以及直接的肝毒性(A.L.Jones和P.Selby，Cancer.Surv.1989，8：817-836)。
一种形式的TRAIL——Apo2L/TRAIL(PRO1762)，目前正在I期临床试验中进行研究(A.Almasan和A.Ashkenazi，Cytokine GrowthFactor Rev.2003，14：337-348)。
HGS-ETR1(mapatumumab；Human Genome Sciences)，一种靶向TRAIL-R1的完整人激动性单克隆抗体，正在晚期恶性肿瘤患者中进行II期评估。针对TRAIL-R2的完整人单克隆抗体(HGS-ETR2；HumanGenome Sciences)例如HGS-TR2J，也已经进入临床，目前正处于I期临床开发中。HGS-ETR2和HGS-TR2J的生理化学和动力学情况略有不同，这保证了二者在临床中进行探查(R Humphreys等，Ann.Oncol.2004，15：iii102，abstr.383PD；R.Humphrey等，Presented at the 16thEORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and CancerTherapeutics(第16届分子靶和癌症治疗的EORTC-NCI-AACR研讨会内容)，摘要204，2004年9月28日-10月1日，瑞士日内瓦)。
看来特别有希望的治疗策略是将活化外在和内在途径的药剂组合起来。因此ETR1或ETR2在体外展现出与顺铂、喜树碱、拓扑替康、阿霉素、吉西他滨、FU、长春新碱或紫杉醇的协同性，甚至在用任何单一药剂处理时不会进入凋亡的细胞系中也显示出了活性(E.K.Rowinsky，Clin.Oncol.2005，23：9394-9407)。
因此，非常希望发现作为FAS受体激动剂的小分子，并且该受体及其激动性抗体CH11将提供一个实例，用于验证发现本发明的小分子受体配体模拟物的方法。
多药抗性(MDR)。MDR是有效治疗癌症的主要障碍。抗药的癌症或是本身不可治疗的(固有抗性)，或者它们在治疗过程中逐渐发展出了对各种各样抗癌药剂的抗性(获得性抗性)。术语MDR被用于描述暴露于单一细胞毒性药剂的肿瘤细胞发展出对广范围的结构和功能不相关的药物的抗性的能力。已知有许多机制作用于这种现象，包括药物外排泵的过表达、DNA修复机制的活性增加、药物靶酶的变化、以及参与药物脱毒和消除的酶的过表达。因为大多数化疗方法最终通过凋亡来引发它们的效能，因此，凋亡控制水平上的变化也提供了另一种可能由此发生药物抗性的机制。本回顾将集中在某些已经被用于试图通过操纵异常调节的凋亡途径来使抗性肿瘤化学致敏的策略。
药物抗性的机制可由凋亡途径中的变化所介导：决定细胞是经历凋亡还是继续通过细胞周期发展要取决于相互作用以调控细胞周期进展的一组复杂的基因和蛋白的相互影响。如果细胞改变了调控细胞受到攻击、例如化疗而产生的信号传播的蛋白表达，以保护细胞免于凋亡，则能够出现药物抗性。尽管凋亡途径的许多细节仍未被完全了解，但已知有几种蛋白是该过程的重要调控因子。
小分子原型。为了验证发现本发明的小分子受体配体模拟物的方法并证明其效用，我们进一步选择了本技术领域中已经确立的小分子。该分子在本文中被称为“AP-121”(其它命名是依地福新、ET-18-OCH3、1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱、消旋型1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱，或有时称为烷基溶血磷脂或ALP)。AP-121是一种醚脂，更准确来说是一种烷基溶血磷脂，具有下面的化学式：

AP-121是血小板活化因子(PAF；1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的合成类似物，一般相信该活化因子参与了多种生理过程，例如炎症、免疫应答、过敏性反应、生殖，并还显示出在哺乳动物中是有效的抗肿瘤药剂。
癌症的化疗法一般目的在于减缓癌细胞的生长或破坏癌细胞，同时避免附带损伤到周围的细胞和组织。因此，最有效的抗癌药剂是能够选择性靶向癌细胞、同时使正常细胞相对不受影响的药剂。
已知醚脂在体外和动物模型中是有效的抗癌药剂。对于醚脂对癌细胞的毒性已经提出了几种作用机制，包括细胞缺少烷基裂解酶。由此导致的醚脂不能代谢使得它们在细胞内积累，从而破坏细胞膜的脂质组织。醚脂作用的其它可能机制包括对细胞内蛋白磷酸化水平的影响和破坏细胞脂类代谢。正常细胞一般具有避免或克服醚脂的潜在毒性作用的手段，而癌细胞不具有。
AP-121看起来显示出多种生物学活性，包括抑制PI3K-Akt/PKB存活途径、与蛋白激酶C相互作用、细胞内活化Fas/CD95死亡受体、细胞内酸化作用、促进细胞因子产生、以及改变质膜功能和脂类合成(G.Arthu和R.Bittman，Biochim.Biophys.Acta 1998，1390：85-102；DBerkovic，Gen.Pharmacol.1998，31：511-517)。
已经发现，AP-121的脂质体制剂ELL-12，在较低的和无毒性的剂量安排下，比游离的AP-121更有效对抗白血病、肺癌转移瘤和黑素瘤(I.Ahmad等，Cancer Res.1997，57：1915-1921)。
在另一个例子中，在II期试验中，将AP-121溶解在牛奶中，向晚期非小细胞肺癌患者口服给药(P：Drings等，Onkologie 1992，15：375-382)。
具体来说，体外和某些动物数据表明在肿瘤范围内有非常广泛的“非特异性”活性，这在已发表的人类试验中显然不能得到证明。此外，获得的某些生物学数据也是矛盾的，这可能是由于分析系统不同，例如使用的细胞系不同，或者实验条件或参与的科学人员的技能不同。
例如，AP-121已经有描述并作为实验分子销售，它在20μg/ml浓度下是HL-60细胞中膜结合的蛋白激酶C(PKC)的活化剂(E.C.Heesbeen等，FEBS Lett.1991，290：231-4)。已经发现AP-121与磷酯酰丝氨酸竞争与PKC的调控结构域结合。AP-121也被描述为PKC的抑制剂(L.W.Daniel等，Cancer Res.1995，55：4844-9)。其他人发现，PKC在中等AP-121浓度下被抑制，但在低和高浓度下被激活(J.D.Aroca等，Eur.J.Biochem.2001，268：6369-78)。其他人描述了PKC不参与AP-121在HL-60和K562细胞中的细胞毒性作用(E.C.Heesbeen等，Biochem.Pharmacol.1994，47：1481-8)。随着浓度增加到最高为总脂类的30mol％时，AP-121进行性抑制PKCα的活性，高于此浓度后，效应是一种激活。对于PKCε来说，AP-121具有三相效应，在低浓度下激活酶，在稍微高些的浓度下抑制它，然后在较高的浓度下再次激活它(P.Conesa-Zamora等，Biochim.Biophys.Acta 2005，1687：110-9)。
还已有描述AP-121抑制Ras和Raf-1之间的结合，这是一种已知的促进肿瘤生长的蛋白相互作用(P.Samadder等，Anticancer Research2003，23：2291-5)。亚微摩尔剂量的AP-121在A431细胞中诱导已知的抗癌靶表皮生长因子受体(EGFR)的内化，但不激活它，并同时激活MAPK/ERK(G.A.Ruiter等，Int.J.Cancer 2002，102：343-50)。在乳腺癌MCF-7和ZR-75-1细胞系中，AP-121减少受体位点的数量而不影响EGF受体的亲和性。当以微摩尔浓度(5-25μM)加入时，AP-121以nM剂量(10-500nM)抑制生长因子诱导的MAPK/ERK活化。在A431细胞中MAPK/ERK途径被AP-121活化而不刺激细胞增殖：显然，在A431细胞中，AP-121(500nM)也引发了EGFR的快速群集和内化(H.Kosano和O.Takatani，Cancer Research 1988，48：6033-6)。
也已有描述AP-121在MCF-7细胞中抑制了p70S6激酶的磷酸化和活化(G.Arthur等，Anticancer Research 2005，25：95-100)。其他人描述了AP-121对Na，K-ATP酶和钠泵的抑制(K.Oishi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，157：1000-6)。A-121对c-Jun NH2-末端激酶的活化和随后对凋亡的刺激也有描述(C.Gajate等，Mol.Pharmacol.1998，53：602-12)。
AP-121对P13K-AKT/PKB途径的抑制看来是重要的，因为Akt和P13K的活性增加及其负调控因子PTEN中的突变与恶性肿瘤有关并使得细胞对凋亡诱导不敏感性(M.I.Berggren等，Cancer Research 1993，53：4297-302)。因此，AP-121可以通过胰岛素抑制功能性P13K的活化。在AKT的下游，AKT使SAPK/JNK级联的激活剂SEK-1失活。因此，用AP-121失活AKT允许促凋亡性SAPK/JNK蛋白活化(参见表2，G.A.Ruiter等，Anticancer Drugs 2003，14：167-73)。
表2：在人类上皮癌细胞系A431和HeLa中ALP的AP-121、HePC和哌立福新诱导凋亡的ED50值(μM)(三次独立实验的平均值±SD)。
  AP-121  HePC  哌立福新  A431  15.47±2.9  17.27±3.0  23.17±2.7  HeLa  5.17±1.6  8.17±0.4  9.27±1.8
AP-121抑制磷脂酶C已有记载，导致蕈毒碱受体1和阿片受体δ的阻断，使得AP-121在抗伤害感受中具有潜在的应用(L.F.Horowitz等，J.Gen.Physiol 2005，126：243-62)。
AP-121引发的凋亡被磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CTP)的表达增加所阻止(I.Baburina和S.Jackowski，J.Biol.Chem.1998，279：2169-2173)，表明CTP是AP-121的首要靶。
关于抑制鞘氨醇-1-磷酸(S1P)S1P1受体介导抑制T细胞迁移建立了关联(G.Dorsam等，J.Immunol.2003，171：3500-7)。S1P阻止了由TNFα、抗Fas抗体、神经磷脂酶或细胞透性的神经酰胺诱导的神经酰胺水平升高所产生的凋亡标志。负责其产生的鞘氨醇激酶的上调，可能通过保护细胞免于凋亡而对MDR有贡献(O Cuvillier等，Nature1996，381：800-3)。用抗Fas单克隆抗体(克隆CH-11)处理的Jurkat细胞在3小时内经历了大量的细胞死亡。Fas连接在Jurkat T细胞中诱导SAPK/JNK活化。Fas连接通过显著增加胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7的蛋白水解PARP活性，诱导PARP裂解，而S1P显著降低胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6和胱天蛋白酶-7的活性(OCuvillier等，J.Biol.Chem.，1998，273：2910-16)。
Gajate发表了AP-121在脂筏中诱导FAS受体群集的能力，推断这将导致AP-121诱导凋亡的能力(C.Gajate等，J.Exp.Med.2004，200：353-365)。在淋巴细胞和细胞系中也显示了这种推测的AP-121靶(CGajate和F Mollinedo，Blood 2001，98：3860-3863)。另一方面，Spiegel及合作者将这些促凋亡性质归因于细胞色素c从线粒体中的释放(OCuvillier等，Blood 1999，94：3583-3582)，而不依赖于FAS受体。AP-121通过胞吞作用内化到肿瘤细胞的脂筏中(A.H.van der Luit等，J.Biol.Chem.2002，277：39541；A.H.van der Luit等，J.Biochem.2003，374：747)。一旦进入细胞，AP-121开始召集与Fas相关的死亡结构域蛋白、胱天蛋白酶原-8和胱天蛋白酶原-10、c-Jun N-末端激酶和Bid，这些分子对于凋亡的启动是关键的(C Gajate等，Exp.Med.2004，200：353)。因此，死亡受体(FAS-R)和线粒体凋亡途径被广泛关联，导致线粒体跨膜电位破坏、活性氧类别产生、胱天蛋白酶-3活化、多(ADP-核糖)聚合酶的裂解以及DNA的片段化(C.Gajate等，Int.J.Cancer 2000，86，208.)。
与所报道的细胞系中低微摩尔范围内的AP-121生物学活性相比，迄今为止描述的、在我们当前了解范围内的最强有力的效应是60纳摩尔对HMEC1内皮细胞的抗血管生成活性(D.Candal，Cancer Chemother.Pharmacol.1994，34：175-178)。
根据这些关于各种不同细胞和细胞系的生物学数据，显然需要能够发现AP-121的生物学效应的方法，这种方法如果存在的话，对于具体的治疗指征来说有治疗相关性。
尽管其生物学效应具有不确定性，US 5,149,527仍描述了含有醚脂作为适合药剂的免疫增强性组合物，该药剂在以前接受过破坏肿瘤并刺激细胞毒性巨噬细胞的成功治疗的受试者中导致肿瘤坏死和/或消退。药剂将在之前的疗法已经产生了对肿瘤具有特异细胞毒性的巨噬细胞形成之时施用。但是，没有提供支持AP-121的这种活性的数据。
AP-121作为可用于治疗癌症的化合物已有记载(DE 02 619 686)，通过给哺乳动物施用药物有效量的AP-121以减小肿瘤的大小，也已经描述在US 6,514,519和EP 1 079 838中，特别适合治疗原发和继发恶性脑肿瘤。
US 6,235,729涉及减缓或抑制肿瘤浸润和转移来抑制肿瘤发展的方法，包括给所述个体施用药物有效剂量的磷脂酶C抑制剂例如AP-121的步骤。优选，该磷脂酶C抑制剂减少磷脂酶Cγ。一般来说，这样的磷脂酶C抑制剂将以大约0.1mg/kg到大约2mg/kg的剂量给药。尽管没有提供数据来支持这种主张，但报道的剂量将不会反映在其它体外试验中发现的AP-121的低活性。
已经报道AP-121通过抑制活化的CD4+或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，可用于治疗多发性硬化症(MS；EP 2 363 901，DE 03 530767)或类风湿性关节炎(RA)或强直性脊柱炎(AS；EP 474 712)。
发明概述
本发明包含了确定小分子是否是治疗有用的受体配体功能性模拟物的方法。本发明还涉及治疗有用的疗法和诊断方法，以及含有单独的或与其它治疗有用的化合物组合的AP-121的组合物，以及确立它们治疗效用的方法。
根据本发明，功能性受体配体例如内源的或人工制造的蛋白、肽或抗体的生物学效应，是针对一组至少两种不同的原代人类细胞或永久的细胞系单独或与一组其它的化合物组合起来进行测量的，给出了生物学结果的一个数组。推定的小分子配体模拟物，也平行地针对同样一组至少两种不同的原代人类细胞或永久的细胞系单独或与同样一组其它化合物组合起来测量，给出生物学结果的第二个数组。当通过常用的数学算法计算时，如果这两个数组的相似性高于预定的阈值，则小分子可以被认为是真正的受体配体模拟物，可以用作治疗药剂。此外，本发明的方法还投送了有治疗效用的小分子组合，所述组合在调节所述受体可以提供治疗效应的疾病中可发挥协同作用。
发明详述
本发明涉及新的方法，用于确定小分子是否是受体配体的功能性和治疗有用的模拟物。
本文使用的“小分子”特别包括肽、蛋白、核酸分子、碳水化合物、脂类以及低分子量化合物。
可用于本发明的肽和蛋白包括天然存在的以及人工设计的分子，例如通过重组DNA技术或通过化学合成。它们的最终长度通常为800个氨基酸，优选为最终600个氨基酸，更优选为最终400个氨基酸，并最优选为最终200个氨基酸。
能够用于本发明的核酸的例子包括天然存在的核酸例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，以及核酸类似物。这样的核酸可以是任何长度的，并可以是单链或双链分子。
可以用于本发明的碳水化合物的例子包括单糖例如葡萄糖或果糖，二糖例如乳糖或蔗糖，以及寡糖和多糖例如淀粉，其中优选为单糖。
可以用于本发明的脂类的例子包括脂肪酸、甘油三酯、鞘脂和磷脂。在本发明的优选实施方案中，小分子选自醚脂，优选为烷基溶血磷脂，其中AP-121是特别优选的。
本文中使用的术语“低分子量化合物”是指分子，优选有机分子，含有至少两个碳原子，但是优选不超过七个碳键，分子量在100到2000道尔顿之间，优选在100到1000道尔顿之间，并且任选包含一个或两个金属原子。这样的分子的例子特别包括咪唑、吲哚、异噁唑、噁唑、吡啶、嘧啶和噻唑。
作为本发明的方法的第一步，必须筛选治疗相关的受体靶以及执行调节效应的适当配体，其中这里使用的术语“调节效应”，包括对选定受体的下游信号传导的拮抗(即阻断或抑制)和激动(即激活)效应。该选定的配体可以是选定的受体的内源配体或是已知表现出这种效应的任何其它蛋白或肽，例如抗体。该配体不需要表现出可用作药物类分子的性质，相反，重要的是配体选择性表现其效应，并且不具有使它难以或不可能用作基于细胞的筛选工具的性质。此外，作为推定的受体配体模拟物的小分子，必须与一组至少一种、优选至少两种、更优选至少三种已知表现出生物学活性的其它分子一起进行筛选。
在本方法的第二步中，必须筛选一组至少两种、但是更优选至少三种不同人类来源的原代细胞和/或永久的、人类来源的细胞系。优选这些细胞系将以不同的水平、和/或具有不同的突变状态和/或在细胞膜中的不同浓度表达选定的受体，确保从测量到的生物学效应中可以推演出生物学效应与这些受体水平之间的相关性。
在第三步中，测量选定的各种化合物的生物学效应。按照本发明，在术语“生物学效应”之下，可以使用多种基于细胞的生物学分析方法来测量这类效应。例如，可以测量基因表达例如RT-PCR、蛋白水平检测、或者更复杂的生物学事件例如抑制增殖、集落形成、血管形成或凋亡，但不限于此。
本发明的“生物学效应”也可以是通过重复实验、使用不同的浓度或涉及不同性质的分析方法的几个生物学分析的概括或平均的结果。因此，生物学效应可以是50％抑制浓度(IC50)、有效剂量(ED50)、组合指数(CI)等。根据本发明的方法，化合物现在以下面的方式进行测量，获得生物学结果的两个数组：首先，测量受体配体对每个个体细胞系(从1到N，其中N是不同细胞的数量)的生物学效应，优选通过重复同样的实验多次以获得可靠的结果。接下来，将受体配体以预定的比率与每一种其它个体化合物混合，获得两种化合物的混合物。
这些两种化合物的混合物也可以含有同样的配体和化合物的混合物，但是比率不同(1到M，其中M是不同化合物混合物的数量)。然后，测量每种混合物对每种个体细胞系(从1到N，其中N是不同细胞的数量)的生物学效应，优选通过重复同样的实验多次以获得可靠的结果。结果，我们获得了生物学结果的二维数组(A1)。
在第四步中，用推定的小分子代替受体配体重复第三步，这些小分子也以同样的方式，针对同一组至少两种不同的原代人类细胞或永久细胞系单独和与同一组其它化合物的组合来测定，以给出生物学结果的第二个二维数组(A2)。出于说明的目的，数组A1和A2可以采取下面的格式：
A1
  配体(L)  配体+  化合物1  配体+  化合物2...  配体+ 化合物M  细胞1  0.50  0.40  0.30  0.30  细胞2  1.80  2.90  0.40  5.00  ...  细胞N  0.10  0.10  0.00  0.20
A2
  小分子(SM)  SM+  化合物1  SM+  化合物2...  SM+ 化合物M  细胞1  0.40  0.30  0.35  0.40  细胞2  1.20  3.00  0.20  4.00  ...  细胞N  0.40  0.20  0.20  0.40
在本发明方法的第五步中，将数组A1和A2归一化，使得每个生物学效应被表示成它与每种不同细胞中观察到的最大生物学效应的比率，产生衍生的数组B1和B2。
这些归一化的二维数组B1和B2可以采取下面的格式：
B1
  配体(L)  配体+  化合物1  配体+  化合物2... 配体+  化合物M  细胞1  0.17  0.14  0.10  0.10  细胞2  0.62  1.00  0.14  1.72   ...  细胞N  0.03  0.03  0.00  0.07
B2
  小分子(SM)  SM+  化合物1  SM+  化合物2... SM+  化合物M  细胞1  0.10  0.08  0.09  0.10  细胞2  0.30  0.75  0.05  1.00  ...  细胞N  0.10  0.05  0.05  0.10
在本发明方法的第六步中，建立了数组B1和B2之间的相似性。有许多常用的数学算法可以计算这种相似性，这些算法不是本发明的一部分，但是可以从任何现有技术的数学教科书或已建立的用于评估基因表达情况相似性的软件工具得到。还可以使用不同的相似性指数来计算这种相似性，例如在(J.D.Holliday等，Combinatorial Chemistryand High Throughput Screening(组合化学和高通量筛选)2002，5：155-166)中描述的Cosine、Dice、Euclid、Forbes Hamman、Jaccard、Kulczynski、Manhattan、Pearson、Rogers-Tanimoto、Russel-Rao、Simpson、Tanimoto或Yule系数。
作为该计算的中间步骤，我们可以获得一维的相似性数组(S)，从中可以确定针对每种细胞系的相似性：
  S  相似性  细胞1  0.96  细胞2  0.65  ...  细胞N  0.960
如果计算出的相似性高于预定的阈值，小分子可以被认为是真正的受体配体模拟物，可用作治疗药剂。该预定的阈值可以通过测量已知具有生物学活性但不是受体配体的小分子来确定。
此外，本发明的方法还投送了有治疗效用的小分子组合，所述组合在调节受体来提供治疗效应的疾病中可以协同发挥作用。
本发明还涉及治疗有用的疗法、诊断方法、以及含有单独的或与其它治疗有用的化合物组合的AP-121作为CH-11FAS受体配体模拟物的组合物，以及建立它们的治疗效用的方法。优选，本发明的组合物是可以口服应用的药物剂型，特别优选固体剂型，例如片剂、丸剂、胶囊和颗粒。此外，并且与CH-11不同，AP-121与CH-11或类似的抗体相比，给患者提供了治疗益处，因为它有口服生物利用性且耐受性好(P.Drings等，Onkologie 1992，15：375-382)。
下面的图和实施例对本发明进行了进一步的描述，它们的目的仅仅是说明本发明的具体实施方案，而不应该被解释为以任何方式限制本发明的范围。在下面的试验中使用的材料或是可以商购的，或是本技术领域的专业人员容易从可商购的材料制备的。
附图
图1描述了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱(终浓度10μM)、(电离)辐射(吸收剂量为5Gray单位，表示为“RT”)及其组合对LNCaP雄激素敏感性人类前列腺腺癌细胞的程序化细胞死亡(凋亡)和存活率的体外效应。凋亡使用Apo-ONE^TM同源胱天蛋白酶-3/7分析，Promega，Inc.，Madison，WI，USA，按照制造商的说明书来测定。活的癌细胞的百分率所记载的锥虫蓝染料排斥法来估算(Freshney，R.I.(1994)《动物细胞培养：基本技术手册》第三版(Culture of AnimalCells：A Manual of Basic Technique.3rd Ed.)Wiley-Liss.New York.USA)。将细胞在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱给药后6小时(图1A)、给药同时(图1B)和给药前6小时(图1C)暴露于辐射。胱天蛋白酶分析在暴露于辐射后12小时进行。显示的相应数据代表了两次独立实验的平均值。
图2描述了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱(以30mg/kg体重/天腹膜内给药15天；图2A)、(电离)辐射(吸收剂量为5Gray单位，在第7天施用；图2C)及其组合(图2B)对原位生长在裸鼠(7只小鼠/组)前列腺中的LNCaP细胞的体内效应。肿瘤的生长通过使用可商购的测试试剂盒测定前列腺特异性抗原(PSA)的血清水平和通过磁共振成像测定肿瘤体积来评估。
实施例1：筛选步骤
为了证实方法的实践应用性，作为一个例子，我们选择了FAS受体来寻找其激活性小配体，激动性抗体CH-11作为适合的受体配体，AP-121作为推定的CH-11模拟物。已知药物喜树碱、替莫唑胺、阿霉素和特罗凯被选作一组用于组合测量的其它化合物。
作为生物学测试组，我们选择了脑肿瘤细胞系U87MG、A172、LN-18、LN-229、U118MG和T98G，它们在p53和PTEN中有不同水平的突变以及FAS受体表达：
  #  细胞系  p53  pTEN  FasL  Fas  ATCC#  1   2   3  4  5   6  U87   A172   LN18  LN299  T98G   U-118MG  野生型   野生型   突变型  突变型  突变型   突变型  突变型  (缺失)  突变型  (缺失)  野生型  野生型  突变型  (缺失)  突变型  (缺失)  +   +   +  +  +   ？  野生型   野生型   野生型  野生型  野生型   野生型  HTB-14   CRL-1620   CRL-2610  CRL-2611  CRL-1690   HTB-15
在大多数胶质母细胞瘤细胞中鉴定到了Fas死亡受体，其表达水平与肿瘤的恶性级别相对应(O Tachibana等，Cancer Res.1995，55：5528-30)。在高级别星形细胞瘤中，凋亡和存活率与肿瘤的Fas(APO-1/CD95)表达相关(Frankel等，Neurooncol.2002，59：27-34)。
Fas受体、Fas配体(FasL)、Bcl-2和TGFh2的蛋白表达与初发和复发人类胶质瘤的存活率有关(R.J.Strege等，J.Neurooncol.2004，67：29-39)。在恶性胶质肿瘤和细胞系中已经描述有Fas和Fas配体的共表达(N.Husain等，Acta Neuropathol.(Berl)1998，95：287-90)。
但是，因为大部分胶质母细胞瘤细胞对Fas配体诱导的凋亡有抗性，因此在胶质瘤中利用死亡诱导的途径需要通过其它方法致敏：离体小儿脑肿瘤表达Fas(CD95)和FasL(CD95L)，并对凋亡诱导有抗性(C.D.Riffkin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：14871-14876)。对于患有颅内恶性胶质瘤的大鼠来说，肿瘤Fas(APO-1/CD95)的上调导致凋亡和存活时间增加(B.Frankel等，Neurosurgery 2001，49：168-75)。
活化性人类抗Fas抗体克隆CH-11来自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY，USA(目录号#05-201))小鼠免疫亲和纯化的IgM；该抗体识别Fas(43kD)，并对表达Fas的人类细胞具有细胞裂解活性。用编码人类FasL的cDNA转染的鼠类WR19L和L929细胞对抗体作出响应，经历凋亡。该抗体不识别TNF，不与小鼠FasL发生交叉反应。24小时后，86％的人类Jurkat细胞被杀死。
在一篇研讨会论文中(A Algeciras-Schimnich等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100：11445-50)，人类细胞系如果可溶性FasL是细胞毒性的话就被分类为II型，如果不是细胞毒性的话被分类为I型。但是，与可溶性FasL不同的CH-11对某些II型细胞也具有细胞毒性。FasL和CH-11均能够对细胞发挥协同活性。
因此，我们得出结论，在肿瘤细胞对内源FasL完全不敏感或不够敏感的情况下，或者当患病组织中没有表达足够FasL的情况下，发现作为CH-11模拟物的小分子可能是有治疗用途的。
实施例2：细胞系和试剂
U-118MG(胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，p53突变，PTEN突变)、T98G(多形性胶质母细胞瘤，p53突变，PTEN突变)、A172(胶质母细胞瘤，p53野生型，PTEN突变)和U87MG(胶质母细胞瘤/星形细胞瘤，p53野生型，PTEN突变)从ATCC购买。
按照ATCC的推荐，将U-118MG和A172在添加有10％FBS和P/S的DMEM培养基中温育，将T98G和U87MG在添加有0.1mM非必需氨基酸溶液(Gibco)、10％FBS和P/S的MEM培养基中温育。AP-121用无菌蒸馏水配制成5mM储液；替莫唑胺(TMZ)(HaoruiPharma-Chem，Inc.，Edison，NJ)用无菌过滤的DMSO配制成100mM；阿霉素(ADR)(Sigma)用无菌蒸馏水配制成1mM；喜树碱(CTP)(Sigma)用0.1N NaOH配制成10mM的溶液；特罗凯(蛋白激酶，德国)用无菌DMSO配制成5mM溶液。所有化合物储液保存在-20℃。
实施例3：WST-1增殖分析
将2000个细胞铺于96孔平底板的每个孔中，在37℃和5％CO2下温育过夜。通过在3个对照孔中加入7.5μM的WST-1试剂(RocheApplied Sciences，德国)，并使用SpectraMax250读板器分别测量在650nm和450nm处的吸光度，从而对铺板细胞的生长进行测定。如果OD650-OD450值高于0.5，可以将板的剩余孔用于与AP-121、其它药剂或溶剂对照温育96小时。
温育后，将WST-1试剂加入到孔中，按前述计算OD650-OD450值。对于每种条件分析6个孔，并确定标准偏差：所有实验至少独立进行三次。在阐明了每种化合物的个体IC50值后，使用AP-121和化疗药剂以它们的IC50比率进行同时组合处理；组合指数(CI)通过Calcusyn软件包(Biosoft，Ferguson，MO)确定。数据通过计算组合指数(CI)的平均值来评估，其中分别是CI＜0.3表示强协同效应，0.3＜CI＜0.7表示协同效应，0.7＜CI＜0.9表示中等协同效应，0.9＜CI＜1表示累加效应，CI＞1表示拮抗效应。
为了进行AP-121细胞增殖的药物组合测量，测定了每种药物的ED50。在组合指数测量中使用了每种药物的6个不同浓度，并与+/-细胞比较，并与不含化合物的对照比较。每种组合在两个不同时间点(24和96小时)重复6次，上述每个实验重复3次，以获得有效的结果。
例如，下面显示了一个这样的测量，使用了U118细胞系以及AP-121与替莫唑胺(TMZ)的混合物，测量的是450nm与650nm的光吸收差值。上面两行表示在6种不同比率中的AP-121或TMZ的微摩尔浓度，行A含有培养基和化合物但没有添加细胞，行B到G中加入了细胞和相应的化合物混合物，行H1-H3含有细胞但不含化合物混合物，加入水代替化合物混合物，H4-H6与H1-H3相同，只是水中含有1％DMSO，WST试剂被加入到除了H1-H3之外的所有孔中。

从这个实验，以及以前测定的每种个体化合物对每个细胞系的ED50，可以使用Calcusyn程序计算出组合指数，显示在下面对于每种化合物混合物和细胞系的实验汇总中。
实验汇总：下面仅仅描述了从全部实验中选出的一些数据。
实施例4：AP-121组合指数(CI)






实施例5：CH-11组合指数



在进一步分析中，对于使用的不同AP-121组合测定了下面的IC50(μM)值。
  细胞系  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  突变状态  U87MG  A172  LN-18  LN-229  U118MG  T98G  8.5  4,6  1,3  4,3  3.6  4,1  0,04  0,02  0,04  0,02  0,004  0,02  425,2  38,3  553,5  278,4  381,5  608,3  0,11  0,07  0,09  0,13  0,12  0,17  854  ＞1000  ＜31.25  521,5  490,7  517,8  5,9  18,8  20  3,9  18,8  14,4 p53野生型，pTEN突变型 p53野生型，pTEN突变型 p53突变型，pTEN野生型 p53突变型，pTEN野生型 p53突变型，pTEN突变型 p53突变型，pTEN突变型
为了计算IC50值，给相应细胞系施用的AP-121组合如下：
U87MG组合
  AP-121/  1  250∶1  1∶40  100∶1  1∶100  2∶1  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,625  1,25  2,5  5  10  20  0,0025  0,005  0,01  0,02  0,04  0,08  25  50  100  200  400  800  0,00625  0,0125  0,025  0,05  0,1  0,2  62,5  125  250  500  1000  2000  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  10
A172组合
  AP-121/  1  250∶1  1∶10  50∶1  1∶200  1∶5  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  10  0,00125  0,0025  0,005  0,01  0,02  0,04  3,125  6,25  12,5  25  50  100  0,00625  0,0125  0,025  0,05  0,1  0,2  62,5  125  250  500  1000  2000  1,5625  3,125  6,25  12,5  25  50
LN-18组合
  AP-121/  1  20∶1  1∶100  10∶1  1∶100  1∶20  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,15625  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  0,00781  0,01562  0,03125  0,0625  0,125  0,25  15,625  31,25  62,5  125  250  500  0,01562  0,03125  0,0625  0,125  0,25  0,5  31,25  62,5  125  250  500  1000  3,125  6,25  12,5  25  50  100
LN-229组合
  AP-121/  1  200∶1  1∶50  50∶1  1∶100  1∶1  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  10  0,00156  0,00313  0,00625  0,0125  0,025  0,05  15,625  31,25  62,5  125  250  500  0,00625  0,0125  0,025  0,05  0,1  0,2  31,25  62,5  125  250  500  1000  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  10
U118MG组合
  AP-121/  1  2500∶1  1∶40  100∶1  1∶50  1∶2  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,625  1,25  2,5  5  10  20  0,00025  0,0005  0,001  0,002  0,004  0,008  25  50  100  200  400  800  0,00625  0,0125  0,025  0,05  0,1  0,2  31,25  62,5  125  250  500  1000  1,25  2,5  5  10  20  40
T98G组合
  AP-121/  1  200∶1  1∶100  25∶1  1∶100  1∶5  化合物  AP-121  CPT  TMZ  ADR  CH11  特罗凯  6  5  4  3  2  1  0,3125  0,625  1,25  2,5  5  10  0,0015625  0,003125  0,00625  0,0125  0,025  0,05  31,25  62,5  125  250  500  1000  0,0125  0,025  0,05  0,1  0,2  0,4  31,25  62,5  125  250  500  1000  1,5625  3,125  6,25  12,5  25  50
总结：相对于使用细胞的突变状态来说AP-121与其它化合物的协同性
    AP121-组合       p53      PTEN    细胞系
1   协同/累加       野生型   突变型   U87MG，A172
2   协同/累加/拮抗  突变型   突变型   U118MG，T98G
3   拮抗            突变型   野生型   LN229，LN18
实施例6、受体配体和小分子的生物学ED50数据的数组
从这些数据，使用AP-121和相应的化合物混合物的各自ED50数据，可以得出下面的数据数组A2和A1：
细胞/ED50，μMAP-121  CPT+AP121  TMZ+AP121  ADR+AP121  特罗凯+AP121  U87MG  A172  U118MG  6.8  4.2  4.8  0.016  0.009  0.002  75.3  9.3  176  0.04  0.04  0.04  4.9  9.6  15.5
对于CH-11来说
细胞/ED50,μM  CH11  CPT+CH11  TMZ+CH11  ADR+CH11  特罗凯+CH11  U87MG  A172  U118MG  854  1055  320.6  0.007  0.007  0.004  4.1  1.7  83.6  0.026  0.025  0.02  0.54  3.3  4.6
因此，计算了归一化的数组B2：
细胞/ED50，μM  AP-121  CPT+AP121  TMZ+AP121  ADR+AP121特罗凯+AP121  U87MG  A172  U118MG  1.00  0.62  0.71  1.00  0.56  0.13  0.43  0.05  1.00  1.00  1.00  1.00  0.32  0.62  1.00
以及B1：
细胞/ED50，μM  CH11  CPT+CH11  TMZ+CH11  ADR+CH11  特罗凯+CH11  U87MG  A172  U118MG  0.81  1.00  0.30  1.00  1.00  0.57  0.05  0.02  1.00  1.00  0.96  0.77  0.12  0.72  1.00
从B1和B2，可以通过将每种细胞的每种化合物或化合物混合物的相似性值进行简单的平均，计算出相似性数组S
  细胞/ED50，μM  相似性  U87MG  A172  U118MG  0.85  0.80  0.78  总相似性：  0.81
其中相似性值为1.00对应于可能的最高相似性，0.00对应于生物活性可能的最低重叠。
总的来说，实施例6的数据证实了通过使用本发明的方法，以特异性针对Fas受体CH-11的激动性抗体作为选择性受体配体，AP-121作为小分子推定受体配体模拟物，以及在相应化合物混合物中的几种其它的化合物，可以显示出AP-121的生物学效应与CH-11所执行的效应相似。
同样的评估方法也可用于将实施例4和5的组合指数数组代替ED50数组作为生物学效应，由此得出了CH-11和AP-121之间大约0.6的高相似性值。
此外，在所有三种细胞系中，观察到了与替莫唑胺的强协同效应，替莫唑胺是目前对多形性胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤的标准治疗。
实施例7：
使用实施例4和5中概述的步骤，在非小细胞肺癌细胞系中也观察到了顺铂(DDP)/AP-121和吉西他滨(GMZ)/AP-121的强烈协同效应。DDP和GMZ都购自Sigma-aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA。使用了下列细胞系：A549(FAS阴性)、NCI-H460(FAS阳性)和HCC827(FAS阳性)，它们都从ATTC，Rockville，MD，USA获得。



实施例8：
已知前列腺癌细胞系表达FAS受体，它们中的某些对FAS不敏感(OW Rokhlin等，Cancer Res.1997，57：1758-68)。LNCaP是对辐射敏感性降低的前列腺癌细胞系，而激动性FAS抗体CH-11使细胞对辐射诱导的凋亡敏感(K.Kimura和E.P.Gelmann，Cell Death andDifferentiation 2002，9：972-980；也参见下面的实施例)。因此，我们通过将LNCaP细胞注射到小鼠的前列腺中进行了动物实验，在肿瘤生长后，应用0-30mg/kg的不同剂量AP-121腹膜内注射，同时进行辐射。
在治疗的动物中，观察到了剂量依赖性效应，在治疗后几天，PSA(前列腺特异性抗原)水平降低，在治疗后一周，肿瘤尺寸缩小，这显示了AP-121在治疗相关性的体内实验中模拟激动性抗体CH-11的生物学效应的有效性。
实施例9：1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱在前列腺癌治疗中的效应
前列腺癌是一种在男性生殖系统腺体——前列腺中发生的癌症。前列腺癌最通常是通过体检或通过筛查性血检例如PSA(前列腺特异性抗原)检验中发现的。PSA检验测量血液中前列腺特异性抗原的水平，这是一种类似激肽释放酶的丝氨酸蛋白酶。它的正常功能是在射精后液化凝胶状的精液，允许精子更容易地通过子宫颈。PSA水平高于大约4ng/ml一般认为是发生前列腺癌风险的指征。但是，PSA不是完善的检验，因此应该通过其它分析进行印证，例如检测尿液中细胞相关的PCA-3mRNA。
局部晚期的或高风险性前列腺癌的两种最常用疗法是放射疗法(RT)和雄激素剥夺(AD)，后者是激素疗法。
分别研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱单独以及与RT、AD或RT+AD相组合，对前列腺癌细胞的程序化细胞死亡(凋亡)程度和存活的影响。
首先，测量了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱、(电离)辐射及其组合对LNCaP雄激素敏感性人类前列腺腺癌细胞的程序化细胞死亡(凋亡)和存活率的体外效应。LNCaP细胞系是从腺癌的转移灶建立起来的。细胞用终浓度为10μM的1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱和相当于5Gray单位吸收剂量的(电离)辐射进行处理。
凋亡使用Apo-ONE^TM同源胱天蛋白酶-3/7分析，Promega，Inc.，Madison，WI，USA，按照制造商的说明书来测定。活肿瘤细胞的百分率按照记载利用锥虫蓝染料排斥法来估算(Freshney，R.I.(1994)《动物细胞的培养：基本技术手册》第三版(Culture of Animal Cells：A Manualof Basic Technique.3rd Ed.)Wiley-Liss.New York.USA)。
将细胞在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱给药后6小时(图1A)、给药同时(图1B)和给药前6小时(图1C)暴露于辐射。胱天蛋白酶分析在暴露于辐射后12小时进行。显示的相应数据代表了两次独立实验的平均值。
当在将细胞暴露于辐射之前6小时施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱时，组合治疗导致肿瘤细胞的存活率仅仅为大约45％，与此相比，在未处理的对照中为大约85％。因此，在处理过的细胞中，观察到了凋亡反应的显著增加(＞2.5倍)(通过胱天蛋白酶-3/7分析测定)。使用辐射或1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱进行单独处理导致中等水平的存活率，分别为大约75％和大约60％(图1A)。
在对细胞同时施用辐射和1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱的情况下，测定到的存活率为大约55％，这与单独化学处理时观察到的范围(大约50％)相同。将细胞只暴露于辐射导致存活率为大约80％，与未处理的对照(大约86％)相当。令人吃惊的是，对于单独和组合处理来说，胱天蛋白酶-3/7分析的结果是相似的(图1B)。
当在将细胞暴露于辐射之后6小时施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱时，组合处理导致细胞的存活率为大约40％，与单独化学处理时观察到的范围(大约45％)相同。将细胞只暴露于辐射导致存活率为大约70％。在仅暴露于化学物质的细胞中观察到的凋亡程度与暴露于组合处理的细胞相比，增加了大约25％。
根据上面的结果，看来似乎在将细胞暴露于辐射之前施用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱，对细胞的存活率和凋亡反应产生最显著的影响。
在另一种方法中，对LNCaP细胞同时施用10μM 1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱(终浓度；“CHEM”)和(电离)辐射(5Gray单位；“RT”)，但是随后的温育时间被延长到24小时。凋亡按照前面的描述使用Apo-ONE^TM同源胱天蛋白酶-3/7分析进行测定，并表示成相对荧光单位(RFLU)。通过对膜联蛋白V-PE阳性染色和7-AAD(7-氨基放线菌素D)阴性染色的细胞(都购自BD Biosciences，San Jose，CA，USA)按照已建立的标准方案进行流式细胞术分析，测定了凋亡细胞的百分率。结果总结在下面的表中。数据代表了三次独立实验的平均值±SEM。
  处理  ％膜联蛋白V-PE阳性细胞胱天蛋白酶-3/7活性  (RFLU)  对照  3.6±0.2  193±39  CHEM  18.6±1.0  580±207  RT  5.0±0.6  242±36  CHEM+RT  31.7±1.0^*  1514±102^*
结果的统计学显著性使用单向ANOVA、LSD检验来计算。^*分别与每个单独的CHEM和RT处理相比，p＜0.0001。
在雄激素不敏感的LNCaP C4-2和LNCaP-Res细胞中，也观察到了“CHEM+RT”处理的细胞中凋亡增加(数据未显示)。
接下来，研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱给药(“CHEM”)和雄激素剥夺(“AD”)之间的相互作用。按照本技术领域熟知的确认程序，通过2天的血清木炭吸附，对LNCaP细胞进行雄激素剥夺。加入CHEM至终浓度分别为5μM和10μM。此外，测试了在CHEM给药之前两天加入合成雄激素R1881(“R1881”)是否导致了效应的逆转。
凋亡按照前面的描述使用Apo-ONE^TM同源胱天蛋白酶-3/7分析进行测定，并表示成相对荧光单位(RFLU)。凋亡细胞的百分率按照前面的描述，通过膜联蛋白V-PE/7-AAD染色进行测定。胱天蛋白酶-3/7分析和膜联蛋白染色在CHEM处理后22小时进行。结果概述在下面的表中。
  处理  ％膜联蛋白V-PE阳性细胞  胱天蛋白酶-3/7活性  (RFLU)  对照  9.6  235  对照+5μM CHEM  13.0  380  对照+10μM CHEM  17.5  436  AD  12.6  81  AD+5μM CHEM  15.4  126  AD+10μM CHEM  27.4  115  AD+R1881  7.0  130  AD+R1881+5μM CHEM  14.6  453  AD+R1881+10μM  CHEM  21.6  962
从上面的结果可以明显看出，对剥夺了雄激素的LNCaP细胞使用1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱，导致了凋亡反应的剂量依赖性显著增加。此外，该效应不能通过在1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱处理之前在培养基中加入合成的雄激素来逆转。
此外，在初步研究中，研究了1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱、(电离)辐射及其组合对裸鼠(7只小鼠/组)前列腺中原位生长的LNCaP细胞的体内效应。
1-O-十八烷基-2-O-甲基-甘油-3-磷酸胆碱以30mg/kg体重/天的剂量腹膜内给药15天(图2A；使用不同的给药途径例如口服或管饲法的研究目前正在进行中)。对应于5Gray单位吸收剂量的(电离)辐射在第7天施用(图2B)。组合处理描述在图2C中。通过使用可商购的测试试剂盒测定血清中前列腺特异性抗原(PSA)的水平，以及通过磁共振成像测量肿瘤的体积，来评估肿瘤的生长。
可以看到，组合处理与任一单独处理(“PBS”代表磷酸盐缓冲盐水)相比，导致了PSA血清水平的显著降低，证明了体外结果也可以转移到体内环境中。
在这里说明性描述的本发明，可以在不存在本文没有具体公开的任何成分、限制的情况下，恰当地实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广义和不加限制地理解。此外，本文使用的术语和表述是用作描述的术语而不是限制的，这些术语和表述的使用并不打算排除所显示和描述的特点或其部分的任何等价物，但是，应该认识到，在要求权利的本发明范围内可能有各种不同的修改。因此，应该理解，尽管本发明已经被优选的实施方案和任选特征进行了具体的公开，但本技术领域的专业人员可以对发明进行其中体现了本文描述的特点的修改和改变，这些修改和改变被认为处于本发明的范围之内。
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