一种卡拉八糖的制备方法及其应用.pdf

本发明涉及生物化学、微生物和酶工程领域，具体涉及一种卡拉八糖的制备方法及其应用。本发明是利用卡拉胶降解酶作为工具，该酶可专一性的作用于卡拉胶1，α-3，β糖苷键，降解卡拉胶获得产物均一的聚合度为4的卡拉八糖，其分子结构式如上。本发明制备的卡拉八糖具有具有抑制肿瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治疗糖尿病的作用。

1、  一种卡拉八糖，其特征在于，分子结构式如下：

其中n代表聚合度，n＝4，分子量为1642。

2、  权利要求1所述的一种卡拉八糖的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：
(1)培养微生物N52 24小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；
(2)将粗酶按照粗酶∶蒸馏水＝1∶10～50的体积比稀释，调pH为6.0-7.0，制备酶解工作液；
(3)按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例，向酶解工作液中加入卡拉胶，然后在35℃下进行酶解，酶解效果与酶解时间相关，时间越长酶解效果越好，酶解半小时后体系中就出现卡拉八糖的产物，酶解24小时后，卡拉胶完全被降解为卡拉八糖，酶解过程中可以通过控制酶解时间获得不同分子量的产物；
(4)酶解完成后，用95％的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95％以上的产物是卡拉八糖；或者70℃减压浓缩后，将浓缩液冷冻，然后冷冻干燥，收集粗品，粗品中95％以上的产物是卡拉八糖；
(5)对步骤(4)收集的沉淀物或粗品进行分离纯化，获得卡拉八糖纯品。

3、  权利要求1所述的一种卡拉八糖的应用，其特征在于，具有抑制肿瘤血管生成、抗菌、抗氧化和降血糖的作用。

一种卡拉八糖的制备方法及其应用
技术领域：
本发明涉及生物化学、微生物和酶工程领域，具体涉及利用卡拉胶降解酶生产聚合度为3-6的卡拉胶寡糖的方法，尤其涉及利用卡拉胶酶生产聚合度为4的卡拉八糖的方法，该方法制备的卡拉八糖具有具有抑制肿瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治疗糖尿病的作用。
技术背景：
卡拉胶是一种来源于海洋红藻的以1，3-β-D半乳糖和1，4-α-D半乳糖交替连接形成骨架的硫酸半乳聚糖，由于卡拉胶带有大量的硫酸根，表现出很多生理活性，例如抗病毒作用、抗溃疡、抗凝和抗血栓作用等。但是由于卡拉胶属于高分子化合物，粘度大，扩散困难，很难吸收，且有一定的毒性，因此严重限制了卡拉胶在生物医药领域的应用。因而通过制备卡拉寡糖，降低分子量，提高产品的稳定性和安全性，增强其生物活性和溶解性，可作为开发海洋功能食品、海洋新药的重要资源，增加产品的技术含量和附加值，对促进海藻化学工业的蓬勃发展、海洋经济发展、提高海洋生物产业技术水平具有重要意义。
但目前卡拉胶的降解有化学法和酶法两种，其中化学法降解产物不均一，工艺难以控制，因此难以产业化；酶法降解虽然专一性较强，反应条件温和，工艺易于控制，产业化前景好，但是目前酶解产物多是聚合度较低的卡拉二糖和卡拉四糖，而且由于酶活性较低，产物得率低。
发明内容：
本发明的目的是提出一种降解专一性较强、反应条件温和、工艺易于控制、产业化前景好，产物得率高的一种卡拉八糖的酶法制备方法。
本发明的原理是：利用卡拉胶降解酶为工具，该酶可专一性作用于卡拉胶的1，α-3，β糖苷键，降解卡拉胶获得产物均一的卡拉寡糖，主要为卡拉八糖，分离后得到卡拉八糖纯品。
本发明的技术方案是：一种卡拉八糖，其分子结构式如下：

其中n代表卡拉胶寡糖的聚合度，n＝4，分子量为1642。
上述卡拉八糖的制备方法，具体步骤如下：
(1)培养微生物N5224小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；
(2)将粗酶按照粗酶∶蒸馏水＝1∶10～50的体积比稀释，调pH为6.0-7.0，制备酶解工作液；
(3)按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例向酶解工作液中加入卡拉胶，然后在35℃下进行酶解，酶解效果与酶解时间相关，时间越长酶解效果越好，酶解半小时后体系中就出现卡拉八糖的产物，酶解24小时后，卡拉胶完全被降解为卡拉八糖。酶解过程中可以通过控制酶解时间获得不同分子量的产物；
(4)酶解完成后，用95％的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95％以上的产物是卡拉八糖；或者70℃减压浓缩后，将浓缩液冷冻，然后冷冻干燥，收集粗品，粗品中95％以上的产物是卡拉八糖；
(5)对步骤(4)收集的沉淀物或粗品进行分离纯化，获得卡拉八糖纯品。
本发明制备的卡拉八糖具有抑制肿瘤血管生成、抗菌、抗氧化和降血糖的作用。
本发明的有益效果是：卡拉胶降解酶活性较高，专一作用于卡拉胶的1，α-3，β糖苷键，生成产物均一，制备方法简单易行、可产业化；该制备方法获得的卡拉八糖具有非常广阔的医药领域应用前景。
附图说明
图1是卡拉胶降解酶降解卡拉胶的情况示意图；
图中：A、B、C、D、E分别代表卡拉胶酶作用于卡拉胶24、12、6、3、0.5小时的薄层结果，1代表卡拉八糖的薄层结果。
图2是卡拉八糖抑制肿瘤细胞培养液诱导血管内皮细胞迁移的结果。
图中：A：没有肿瘤细胞培养液诱导；B：存在肿瘤细胞培养液的诱导作用；C：卡拉八糖抑制肿瘤细胞培养液的诱导作用。
图3是卡拉八糖抑制肿瘤血管生成的结果。
图中：A：阴性对照；B：阴性对照小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，箭头所示为毛细血管；C：经卡拉胶八糖(200mg/Kg)干预后，小鼠肿瘤表面情况；D：经卡拉胶八糖干预后(200mg/Kg)，小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片。
图4是卡拉八糖对小鼠SOD活性的影响。
图5是卡拉八糖对小鼠血液MDA含量的影响。
图6是卡拉八糖对小鼠血液中GSH-Px活性的影响。
图7是卡拉八糖对小鼠血糖浓度的影响。
具体实施方式
实施例1
卡拉八糖的制备：
以海洋微生物N52分泌的卡拉胶降解酶为工具，培养微生物N5224小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；将粗酶按照粗酶∶蒸馏水＝1∶50的体积比稀释，调pH为6.0-7.0，制备酶解工作液；按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例向酶解工作液中加入卡拉胶，然后在35℃下进行酶解，降解时间为24小时，95％的乙醇沉淀降解产物，收集后冷冻干燥，以DNS法检测分子量为1642，经薄层层析检测，降解产物均一，经sperdexG250分离可获得纯品，结果见图1，由图1可以看出半小时后在卡拉胶酶的作用下，卡拉胶降解产物已经出现，主要为卡拉胶八糖，同时还有很多卡拉胶没有被降解，随着时间的延长，卡拉胶被酶降解的程度增强，24小时后卡拉胶基本上被卡拉胶酶降解完全，产物均一，主要是卡拉胶八糖。
实施例2：
卡拉八糖抑制肿瘤血管生成的作用：
以实施例1中获得卡拉八糖体外作用于血管内皮细胞，通过划痕实验发现卡拉八糖具有抑制血管内皮细胞迁移的作用结果见图2；由图2可以看出，A：没有肿瘤细胞培养液诱导，血管内皮细胞迁移效果较小；B：在肿瘤细胞培养液的诱导作用下，细胞迁移效果明显；C：在肿瘤细胞培养液存在的同时，加入200ug/mL卡拉八糖，明显抑制了血管内皮细胞的迁移。以肺癌细胞对小鼠进行荷瘤，通过给小鼠用200mg/Kg的卡拉八糖灌胃进行干预，发现卡拉八糖具有抑制肿瘤小鼠血管生成的作用，结果见图3，由图3可以看出，A：阴性对照未用卡拉八糖进行干预的小鼠皮下的乳腺癌肿瘤，瘤体表面长满血管；B：阴性对照未用卡拉八糖进行干预的小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，箭头所示为毛细血管；C：经卡拉胶八糖干预后，肿瘤表面没有血管存在；D：经卡拉胶八糖干预后，小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，几乎看不到血管的存在。
实施例3
卡拉八糖的抗氧化作用：
以不同剂量的卡拉八糖灌胃小鼠，连续灌胃30天后，以溴化苯对小鼠造成损伤，12小时后，处死小鼠，检测小鼠血液中丙二醛的含量、超氧化物歧化酶的活性和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，发现卡拉胶八糖具有降低小鼠血液中丙二醛含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的作用，表现出抗氧化的作用，结果见图4、5、6。由图4可以看出卡拉八糖可以显著的提高动物血液中SOD的活性，其中卡拉八糖剂量为50mg/Kg时的作用最强，可以将小鼠血液中SOD活性提高40％，随着浓度的增高，这种作用逐渐降低；由图5可以看出卡拉八糖可以显著降低小鼠血液中丙二醛的含量，表现出抗氧化的作用，其中卡拉八糖剂量为50mg/Kg时的作用最强，相对于对照组可以使血液中丙二醛的含量降低40％；由图6可以看出卡拉八糖可以显著提高小鼠血液中GSH-Px的活性，表现出较强的抗氧化能力，这种提高GSH-Px活性的作用随剂量的增高而增高。
实施例4
卡拉八糖的降血糖作用：
通过四氧嘧啶处理小鼠，建立糖尿病小鼠模型，以实施例1制备的卡拉八糖灌胃糖尿病小鼠14天后，通过0-TB法检测小鼠血液中的血糖含量，结果标明卡拉八糖具有降低小鼠血糖含量的作用，结果见图7。由图7可以看出模型小鼠的血糖相对于对照未处理的空白小鼠的血糖明显升高，血糖值达空白小鼠的160％，不同剂量卡拉八糖都可以显著降低模型小鼠的血糖含量，表现出降血糖作用，其中卡拉八糖剂量为25mg/Kg时的作用最好，处理后小鼠血糖值几乎恢复正常。