一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法.pdf

一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：①生产用毒种的制备：②制苗用病毒液的制备：③取灭活浓缩后的制苗用NDV LaSota株病毒液1份，IBV M41株病毒液1份、IBDV CL01株病毒液1份，混合均匀，取混合病毒液97～99份(体积份)，吐温-80 1～3份(体积份)，混合制成水相备用；④用白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5～2.5一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；该疫苗具一次接种代替以往的二次接种，节省了生产成本，缩短了生产周期等优点。

1、  一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其特征是：其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；选取鸡传染性法氏囊CL01株毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释后接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，收获；
②、制苗用病毒液的制备：将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，同时接种同一枚易感鸡胚，孵育，收获；鸡传染性法氏囊CL01株生产毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释，接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，冻融1次后收获；将收获后的NDV La Sota株和IBV M₄₁病毒液分别浓缩3倍，将收获后的IBDV CL01病毒液浓缩6倍，灭活；
③、取灭活浓缩后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(体积份)，IBV M₄₁株病毒液1份(体积份)、IBDV CL01株病毒液1份(体积份)，混合均匀，取混合病毒液97～99份(体积份)，吐温-801～3份(体积份)，混合制成水相备用；
④、用白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，混合后加温至121℃、103kPa压力灭菌后制成油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5～2.5一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；后分装，贴签，装箱，入库。

2、  根据权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述对病毒液浓缩是指将三种制苗用病毒胚液从冰箱取出，融化后分别在无菌条件下用灭菌的装有四层纱布和一层100目铜网的无菌漏斗滤过，除去鸡胚液和大的细胞残渣及其他粗颗粒杂质；然后将粗滤的三种病毒液分别倒入浓缩装置的储缸内，反复过滤浓缩。

一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于预防家禽传染病的疫苗，具体地讲涉及一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
鸡新城疫俗称“鸡瘟”，是由鸡新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病。主要经呼吸道和消化道感染，各种年龄的鸡均可感染，以雏鸡最为严重发病率和死亡率可达80％以上。鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道疾病，传播途径主要是经呼吸道感染；发病多集中在冬、春季；6周龄死亡率高，可达20％左右。传染性法氏囊病(IBD)是一种急性高度接触性传染病，是由双链核糖核酸病毒(IBDV)引起的，能引起雏鸡免疫抑制，破坏法氏囊中B淋巴细胞的形成，临床上以法氏囊肿大、肾损害为主要特征。雏鸡或中雏易感性最强，感染率可达100％，死亡率比较高，严重影响养鸡业的发展。为此开发了鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗，该疫苗具有使用简便，接种程序简单，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激。
发明内容：
为了克服现有技术不足，本发明公开了一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，主要预防鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病的发生，工艺方法简单，免疫效果优良，使用安全，易于保存的优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
所述一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；选取鸡传染性法氏囊CL01株毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释后接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，收获；
②、制苗用病毒液的制备：将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，同时接种同一枚易感鸡胚，孵育，收获；鸡传染性法氏囊CL01株生产毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释，接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，冻融1次后收获；将收获后的NDV La Sota株和IBV M₄₁病毒液分别浓缩3倍，将收获后的IBDV CL01病毒液浓缩6倍，灭活；
③、取灭活浓缩后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(体积份)，IBV M₄₁株病毒液1份(体积份)、IBDV CL01株病毒液1份(体积份)，混合均匀，取混合病毒液97～99份(体积份)，吐温-801～3份(体积份)，混合制成水相备用；
④、用白油96份(体积份)、司本-804份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，混合后加温至121℃、103kPa磅压力灭菌后制成油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5～2.5一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；后分装，贴签，装箱，入库。
所述对病毒液浓缩是指将三种制苗用病毒胚液从冰箱取出，融化后分别在无菌条件下用灭菌的装有四层纱布和一层100目铜网的无菌漏斗滤过，除去鸡胚液和大的细胞残渣及其他粗颗粒杂质；然后将粗滤的三种病毒液分别倒入浓缩装置的储缸内，反复过滤至浓缩后的病毒液达到设计的浓缩终点为止。
所述灭活是指NDV La Sota病毒液采用0.05～0.15％甲醛溶液，35～38℃灭活12～17小时，IBV M₄₁病毒液采用2～8℃低温灭活120-145小时，可使病毒彻底灭活，而且不影响其免疫原性。
本发明所用的NDV La Sota株毒种、IBV M₄₁株毒种、鸡传染性法氏囊CL01株毒种均购自中国兽医药品监察所。
所述对成品检验采用血清学的方法判定效力，比常规的攻毒检测方法更为准确结果更可靠，使三种抗原间的免疫干扰问题得到了很好的解决，采用血清学的方法判定步骤方法，具体方法为：取一月龄易感鸡15只，其中10只各颈部皮下注射疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照，21日后采血，分离血清，用传染性支气管炎抗原测定HI抗体。
由于采用了上述的技术方案，本发明具有如下优越性：
本发明在生产工艺中独创的将两种毒珠液同时接种同一鸡胚的方法比起两种毒珠液分别接种鸡胚，节省了鸡胚的使用数量，减少了疫苗生产的操作步骤，避免了毒种污染机会，而且省去了疫苗制作中的浓缩环节，节省时间，提高效率。
本发明经过大量试验最终找到了二种病毒液最佳的接种比例，并解决了两种病毒之间的互相干扰问题.使一次接种代替以往的二次接种，收获和灭活也改两次完成为一次完成，节省了生产成本，缩短了生产周期。
本发明的三联灭活疫苗可以简化接种程序，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，从而减少接种动物应激反应的次数，此外对于产蛋鸡，尤其是种鸡应尽可能避免或减少在产蛋期间做免疫接种，达到事半功倍的效果。
本发明采用了纤维膜超滤浓缩法，可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度达3倍以上。纤维膜超滤浓缩装置，设有二级孔径不同的纤维滤柱。一级滤柱的纤维可滤除部分细菌和杂质。二级超滤株的中空纤维可截留病毒粒子。
具体实施方式：
实施例1：
一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，分别接种SPF鸡胚，孵育，收获；选取鸡传染性法氏囊CL01株毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释后接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，收获；②、制苗用病毒液的制备：将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，将IBV M₄₁株生产毒种用灭菌生理盐水作10^-3稀释，同时接种同一枚9～10日龄易感鸡胚，孵育，收获；鸡传染性法氏囊CL01株生产毒种用灭菌的PBS作10^-2稀释，接种在已长成良好单层的鸡胚成纤维细胞，孵育，冻融1次后将病毒胚液从冰箱取出，融化后分别在无菌条件下用灭菌的装有四层纱布和一层100目铜网的无菌漏斗滤过，除去鸡胚液和大的细胞残渣及其他粗颗粒杂质；然后将粗滤的三种病毒液分别倒入浓缩装置的储缸内，反复过滤至浓缩，使NDV La Sota株和IBV M₄₁病毒液分别浓缩3倍，将IBDV CL01病毒液浓缩6倍；然后对NDV La Sota病毒液采用0.1％甲醛溶液，37℃灭活16小时；对IBV M₄₁病毒液采用4℃低温灭活144小时，可使病毒彻底灭活，而且不影响其免疫原性；③、取灭活浓缩后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(体积份)，IBV M₄₁株病毒液1份(体积份)、IBDV CL01株病毒液1份(体积份)，混合均匀，取混合病毒液97份(体积份)，吐温-803份(体积份)，混合制成水相备用；④、用白油96份(体积份)、司本-804份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，混合后加温至121℃、103kPa压力灭菌后制成油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；后分装，贴签，装箱，入库。
实施例2：
一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：其制备步骤①、步骤②同实施例1制备步骤①、步骤②；步骤③、④改为：
③、取灭活浓缩后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(体积份)，IBV M₄₁株病毒液1份(体积份)、IBDV CL01株病毒液1份(体积份)，混合均匀，取混合病毒液98份(体积份)，吐温-80 2份(体积份)，混合制成水相备用；
④、用白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，混合后加温至121℃、103kPa压力灭菌后制成油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶2.0一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；后分装，贴签，装箱，入库。
实施例3：
一种鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：其制备步骤①、步骤②同实施例1制备步骤①、步骤②；步骤③、④改为：
③、取灭活浓缩后的制苗用NDV La Sota株病毒液1份(体积份)，IBV M₄₁株病毒液1份(体积份)、IBDV CL01株病毒液1份(体积份)，混合均匀，取混合病毒液99份(体积份)，吐温-80 1份(体积份)，混合制成水相备用；
④、用白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2份(体积份)混合均匀，混合后加温至121℃、103kPa压力灭菌后制成油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶2.5一起乳化，即制得鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗；后分装，贴签，装箱，入库。