一种菌根食用菌菌根苗的生产方法.pdf

本发明涉及一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征为：将目的菌根菌的菌丝体与无竞争性杂菌的菌根合成培养基质混匀，平铺于经高锰酸钾溶液表面消毒或经高温高压灭菌的下部垫有一层无竞争性杂菌或经高温高压灭菌的基质的容器中，在适宜菌丝生长的条件下培育；将经表面消毒处理的无菌的已发芽的宿主植物种子与上述培育有目的菌丝的培养基质混合，在适宜的生态条件下培育，直到树苗根部菌根形成。本发明的方法经多种菌根食用菌菌根苗的合成实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，很适宜于在大量生产中推广应用，并可在一年中的任何时候生产菌根苗，具有显著的经济效益。

1、  一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：所述的菌根食用菌菌根苗的生产方法包括如下步骤：a、将目的菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将重量百分比为10％-30％的矿粉混合物、40～60％的泥炭土或腐殖质土和10～30％的珍珠岩或石英砂混合组成无菌的菌根合成培养基质；c、将上述培养的菌丝体与无菌的菌根合成培养基质充分拌匀，平铺于垫有一层无菌的基质的培养容器中进行培育；d、将经灭菌处理的发芽的宿主植物种子直接播于上述的培养容器中，并使其与混有菌丝体的菌根合成培养基质混合均匀，经培育，得到菌根苗。

2、  根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：b步骤中，矿粉混合物是以下一种物质或几种物质的混合物：海泡石、滑石粉、膨润土矿粉和沸石矿粉。

3、  根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：c步骤中，培养容器中设有至少一层混合有菌丝体的无菌的菌根合成培养基质和一层无菌的基质，无菌的基质是指以下一种或几种物质的混合物：土壤、泥炭藓、蛭石、珍珠岩、石英砂、木炭、堆肥、腐殖质和泥炭；菌丝体的培育条件为：日间光照时间为14～16小时，照度25～65lux，晚间暗光时间为8～10小时，温度15～28℃，湿度65-85％，菌丝体在菌根合成培养基质中需培育1～10天。

4、  根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：d步骤中，发芽的宿主植物种子采用常规的崔芽方法获得，宿主植物种子芽长为0～1cm，培育的条件是指日间光照时间为14～16小时，照度1500lux～36000lux，或全光照的5～70％，晚间暗光时间为8～10小时，温度15～30℃，湿度65-85％。

5、  根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：a步骤中，将目的菌根菌的孢子或子实体组织放在琼脂培养基中，放入培养室中培养，直到长出目的菌丝体，培养室的温度为15-25℃，1～2个月继代培养1次，转管2次培养后即应用或放入1-5℃的冰箱中保存备用，使用时再将菌丝体接入液体培养基中，放在往返式摇床上培养，使菌丝体达到培养要求为止。

一种菌根食用菌菌根苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及食用菌的技术领域，具体地说是一种用于生产菌根食用菌子实体为目的的菌根苗的生产方法；以及菌根合成基质的配方，本发明也适用于以促进宿主植物生长、提高植物抗性为目的的菌根苗的生产方法。
背景技术：
目前菌根食用菌的大多数菌的可食用子实体都是著名的食用菌，如松口蘑(Tricholoma matsutake)、黑孢块菌(Tubermelanosporum Vitt.)、意大利白块菌(Tuber magnatum)、松乳菇(Lactarius deliciosus)、红汁乳菇(L.hatsudake)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、橙盖鹅膏菌(Amatanita caesarea)、中华块菌(Tuber sinense K.Tao et Liu)、印度块菌(Tuberindicum Cooke et Massee)、鸡油菌(Cantharellus cibariusFr.)、干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)、紫红拟锁瑚菌(Clavulinopsis miyabeana(Ito.)Ito.)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus(L.：Fr.)Gray)、厚环乳牛肝菌(Suillusgreviller(KL.)sing.)、变绿红菇(Russulavirescens(schaeff.)Fr.)、橙盖鹅膏(Amanita caesarea(Scop：Fr.)Pers.ex schw.)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji(kawam.)Hongo)、烟色离褶伞(Lyophyllum fumosum(Pers.：Fr.)Orton)等，还有灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea Hongo)、亚稀褶黑菇(Russula subnigricans Hongo)等极具经济价值的毒菌。都必须在有活共生植物存在的情况下，与共生植物的根系形成菌根，才能生产出子实体。因此，用目的菌种接种宿主植物产出菌根苗成为松口蘑等菌根食用菌栽培的关键环节，许多研究不得不到此打止，到目前为止，全世界仅有黑孢块菌等块菌进行商业化栽培，还有鸡油菌、玉蕈离褶伞、松乳菇、红汁乳菇等少数几种菌根食用菌正在寻求商业化栽培的可能。
菌根食用菌菌根苗的接种方法一般分为两大类：孢子接种法，如黑孢块菌菌根苗的繁殖方法；菌丝接种法，如鸡油菌等。孢子接种法是一种比较直接的方法，但仅在子囊菌和腹菌类的菌种比较成功；在担子菌的接种方面，有许多科学家发明了不少其它基于菌丝接种法的方法，如用菌丝体接种宿主植物生产出菌根食用菌菌根苗的方法就有许多(Danell，E.，1994.Cantharellus cibarius：Mycorrhiza formation and Ecology.Acta Univ.Ups.，Comprehensive Summaries of UppsalaDissertations from the Faculty of Science and Technology35～75；鈴木和夫等，マッタケ菌根の迅速人工合成法，日本公開特許公報，P2001-169659A；谭著明，松乳菇培养基及人工栽培方法，中国专利，98112527.1；朴武昌等，制备感染松口蘑菌的幼松树的方法，中国专利，03156616.2)。他们具有以下共同的特点：①接种用培养基中都要加入一定量的菌丝培养用的含有碳水化合物的营养物质；②宿主植物芽苗根长在2cm以上或已长出侧根形成根系统的幼苗；③接种时，菌根合成培养基中的矿质营养全由人工合成化合物组成；④而且均需完全在无菌环境下合成菌根。这些方法虽然也可以生产出菌根菌与宿主植物的菌根苗，但其操作过程繁琐，成本高，效率低，不利于在大批量生产中应用，在菌根合成培养基中含有人工合成化合物，大多数类似的培养基质中含有对植物生长及人体有害的物质，如“Cl^-”。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种改进的菌根食用菌菌根苗的生产方法，它可克服现有技术中操作过程繁琐，成本高，效率低的一些不足。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：所述的菌根食用菌菌根苗的生产方法包括如下步骤：a、将目的菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将重量百分比为10％-30％的矿粉混合物、40～60％的泥炭土或腐殖质土和10～30％的珍珠岩或石英砂混合组成无菌的菌根合成培养基质；c、将上述培养的菌丝体与无菌的菌根合成培养基质充分拌匀，平铺于垫有一层无菌的基质的培养容器中进行培育；d、将经灭菌处理的发芽的宿主植物种子直接播于上述的培养容器中，并使其与混有菌丝体的菌根合成培养基质混合均匀，经培育，得到菌根苗。
使用时，本发明的方法经多种菌根食用菌菌根苗的合成实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，很适宜于在大量生产中推广应用，并可在一年中的任何时候生产菌根苗，具有显著的经济效益。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明一种菌根食用菌菌根苗的生产方法，其特征在于：所述的菌根食用菌菌根苗的生产方法包括如下步骤：a、将目的菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将重量百分比为10％-30％的矿粉混合物、40～60％的泥炭土或腐殖质土和10～30％的珍珠岩或石英砂混合组成无菌的菌根合成培养基质；c、将上述培养的菌丝体与无菌的菌根合成培养基质充分拌匀，平铺于垫有一层无菌的基质的培养容器中进行培育；d、将经灭菌处理的发芽的宿主植物种子直接播于上述的培养容器中，并使其与混有菌丝体的菌根合成培养基质混合均匀，经培育，得到菌根苗。a步骤中，将目的菌根菌的孢子或子实体组织放在琼脂培养基上，放入培养室中培养，直到长出足够量的目的菌丝体，培养室的温度为15-25℃，1～2个月继代培养1次，转管2次培养后即应用或放入1-5℃的冰箱中保存备用，使用时再将菌丝体接入液体培养基中，放在往返式摇床上培养，使菌丝体达到培养要求为止。液体培养基是指在MMN培养基(Marx，1969)中不添加琼脂、麦芽汁、牛肉汁和蛋白胨，并加入占液体培养基重量百分比为2-3％的FeCl₃溶液。
b步骤中，矿粉混合物是以下一种物质或几种物质的混合物：海泡石、滑石粉、膨润土矿粉和沸石矿粉和其它含有植物和菌根菌生长所必须的营养元素的矿石粉。其中，矿粉混合物、泥炭土或腐殖质土、珍珠岩或石英砂的最佳组成比为0.5∶2∶1。c步骤中，培养容器中设有至少一层混合有菌丝体的无菌的菌根合成培养基质和一层无菌的基质，无菌的基质是指以下一种或几种物质的混合物：土壤、泥炭藓、蛭石、珍珠岩、石英砂、木炭、堆肥、腐殖质和泥炭。d步骤中，发芽的宿主植物种子采用常规的崔芽方法获得，宿主植物种子芽长为0～1cm，培育的条件是指日间光照时间为14～16小时，照度1500lux～36000lux，或全光照的5～70％，晚间暗光时间为8～10小时，温度15～30℃，湿度65-85％。其共同培育3天，即可在幼苗主根的尖端形成明显的菌丝套，50天时间即可在显微镜下观察到菌根的全部特征，90天即可形成典型的外生菌根外部形态，获得菌根苗。
本发明者在试验过程中发现，人工合成菌根是否取得成功的关键是菌丝与宿主植物接触的初期的生态环境是否有利于菌丝侵入宿主植物的根皮层，因此在用接种体接种宿主植物产生菌根苗的过程中，所使用的基质及培养生态条件，不仅应该适应菌丝的生长，也应适应于宿主植物的生长，更应该有利于共生菌丝侵入宿主植物幼根皮层。本发明者在试验中发现，海泡石矿粉和(或)滑石粉等是一种很好的物质，其不仅含有除C、N、P以外的植物生长和真菌生长所必需的近20种矿物质和丰富的氧元素，尤其适合好氧性的菌根菌生长，能增强共生菌丝的活性，提高其侵染力。海泡石矿粉或滑石粉等还具有其它天然物质、合成混合基质所无法比拟的优点，如吸附性能、分散性能、流变性能等，对共生菌丝侵入宿主植物幼根皮层有明显的促进作用。本发明者利用海泡石矿粉和(或)滑石粉的这些特性在菌根性食用菌菌根苗的合成过程中进行了利用，与泥炭土或腐殖质土、珍珠岩或石英砂等组成一个完美的有利于菌根合成的土壤基质系统，本发明创造性的将菌根合成的土壤基质系统分成两层，上层基质有利于共生菌丝侵入宿主植物的根皮层，形成菌根，下层基质有利于侧根的形成和共生菌丝的外延菌丝的形成，即共生菌丝功能的表达，整个系统形成了类似于自然界中菌根形成的生态环境。我们的发明证明，在自然界中，共生菌丝感染宿主植物幼芽的过程如下，落在正在腐烂的枯枝落叶上的孢子逐渐发芽长出菌丝，或存活于其中的菌丝，在周围适宜的环境中延伸，直到碰到宿主植物已发芽的种子，菌丝便包裹住嫩种芽的根尖部，在根部外围形成一层菌丝层，在适宜的生态环境下，便逐渐侵入到嫩根的皮层中，在细胞间形成哈蒂氏网，侵入进出后，根表层颜色变黑褐色，但这个生态环境不利于侧根的发生，根继续向下生长直到接触到合适的土壤，菌便促进侧根的发生，产生侧根，外延菌丝也随之伸出。因此我们看到的天然松树苗从根茎处到侧根发生处之间有一段较长的距离。我们根据这一发现发明设计了这样一种接种菌根苗的方法。
上述合成菌根苗的方法，也适用于以促进宿主植物的生长为目的。
实施例1红汁乳菇菌根苗的培育
(1)菌丝体培养
母株由湖南吉首市场购得子实体组织分离得来，用修改过的MMN琼脂培养基(Marx，1969)(其中去掉麦芽汁和牛肉汁+蛋白胨，FeCl₃(1％溶液)加至2～3ml)在培养室中(23±2℃)培养，1～2个月继代培养1次，转管2次培养后即应用或放入3±2℃的冰箱中保存备用。将上述菌种接入已修改过的MMN琼脂培养基中，放在摇床(120～130转/min)上继续培养7天后即达到培养要求，即可用于接种宿主植物。
(2)外生菌根合成基质(基质1)的准备
将海泡石矿粉(200目，含海泡石25％)、泥炭藓(市售)、石英砂(市售)在温度为126℃、蒸汽压力为0.14MPA的条件下2次间隙灭菌130min，冷却后按0.5∶2∶1的比例混合均匀。
(3)外生菌根苗培育基质(基质2)的准备
采于湖南省林业科学院后山森林中70cm深以下心土层，蛭石(市售，河北)按上述方法灭菌。将土壤、泥炭藓、蛭石、珍珠岩按2∶0.5∶1∶0.5的比例混合均匀。
(4)外生菌根合成操作过程
在一已经用75％酒精表面消毒的木质容器中放入一层基质2，将上述培育好且分散均匀的液体菌丝体过滤，将过滤菌丝体与上述菌根合成用基质(基质1)混合均匀，平铺于基质2上面，浇水后，用灭过菌的布质材料覆盖，放入培养室中培养，培养室环境条件：白天光照40lux，光周期为白天16小时，晚上8小时，温度20±5℃，湿度为70±5％，每天用纯净水喷洒2次。培养7天后，将已发芽芽长0.2～0.8cm的种芽(种子采用常规催芽方法)播于培养容器中，并使其与混有菌丝体的合成用基质混合均匀，并用少量合成基质覆盖，白天光照1500lux，其它环境条件不变，共同培养7天后，苗高约1cm时，将培养容器移至培养室窗户边，开窗通风，但不造成对流，给予自然光照20％的光照。播种后第29天取马尾松芽苗根段于修改的MMN培养基上培养，23小时后观察即发现有旺盛的白色的菌丝体长出。
播种后第43天马尾松芽苗根部变红至黑褐色，一级侧根还未生出或刚破皮时，将部分马尾松芽苗移出至装有菌根苗培育基质的透明玻璃容器，移出7天(第50天)后，取马尾松芽苗在解剖镜下进行观察发现旺盛的外延菌丝，90天时，形成典型二叉状分枝的外生菌根，切片在复合显微镜下进行观察发现明显的哈蒂氏网和厚厚的菌丝套。
实施例2松口蘑菌根苗的培育
(1)菌丝体培养
本试验采用的菌株，来自于云南。母株由菌根组织分离得来，用修改过的MMN琼脂培养基(Marx，1969)(其中去掉麦芽汁和牛肉汁+蛋白胨，FeCl₃(1％溶液)加至2～3ml)。在培养室中(20±2℃)培养，转管2次培养后即应用或放入3±2℃的冰箱中保存备用。将上述菌种接入已修改过的MMN液体培养基中，放在摇床(120～130转/min)上继续培养15天后即达到培养要求，即可用于接种宿主植物。
(2)外生菌根合成基质(基质1)的准备
将海泡石矿粉(200目，含海泡石25％)、腐殖质土(市售)、珍珠岩(市售)在温度为126℃、蒸汽压力为0.14MPA的条件下2次间隙灭菌130min，冷却后按0.5∶2∶1的比例混合均匀。
(3)外生菌根苗培育基质(基质2)的准备
采于湖南省林业科学院后山森林中表土层，蛭石(市售)按上述方法灭菌。将土壤、泥炭藓、蛭石、珍珠岩按2∶0.5∶1∶0.5的比例混合均匀。
(4)外生菌根合成操作过程
在一已经用75％酒精表面消毒的木质容器中放入一层基质2，将上述培育好且分散均匀的液体菌丝体过滤，将过滤菌丝体与上述菌根合成用基质混合均匀，平铺于土壤上面，浇水后，用灭过菌的布质材料覆盖，放入培养室中培养，培养室环境条件：白天光照40lux，光周期为白天16小时，晚上8小时，温度20±5℃，湿度为70±5％，每天用纯净水喷洒2次。培养15天后，将已发芽芽长0.2～0.8cm的种芽(种子采用常规催芽方法)播于培养容器中，并使其与混有菌丝体的合成用基质混合均匀，并用少量合成基质覆盖，白天光照1500lux，其它环境条件不变，共同培养10天后，苗高约1cm时，将培养容器移至培养室窗户边，开窗通风，但不造成对流，给予自然光照20％的光照。
播种后第40天马尾松芽苗根部变红至黑褐色，一级侧根还未生出或刚破皮时，将部分马尾松芽苗移出至装有菌根苗培育基质的透明玻璃容器，移出7天(第47天)后，取马尾松芽苗在解剖镜下进行观察发现旺盛的外延菌丝，100天时，形成典型二叉状分枝的外生菌根，切片在复合显微镜下进行观察发现明显的哈蒂氏网和菌丝套。
实施例3美味牛肝菌与马尾松菌根苗的培育
(1)菌丝体培养
母株由云南市场购得子实体组织分离得来，用修改过的MMN琼脂培养基(Marx，1969)(其中去掉麦芽汁和牛肉汁+蛋白胨，FeCl₃(1％溶液)加至2～3ml)在培养室中(20±5℃)培养，1～2个月继代培养1次，转管2次培养后即应用或放入3±2℃的冰箱中保存备用。将上述菌种接入已修改过的MMN液体培养基中，放在摇床(120～130转/min)上继续培养7天后即达到培养要求，即可用于接种宿主植物。
(2)外生菌根合成基质的准备
将海泡石矿粉(200目，含海泡石25％)、腐殖质土(市售)、珍珠岩(市售)在温度为126℃、蒸汽压力为0.14MPA的条件下2次间隙灭菌130min，冷却后按0.5∶2∶1的比例混合均匀。
(3)外生菌根苗培育基质的准备
采于湖南省林业科学院后山森林中70cm深以下心土层，蛭石(市售，河北)按上述方法灭菌。将土壤、泥炭藓、蛭石、珍珠岩按2∶0.5∶1∶0.5的比例混合均匀备用。
(4)外生菌根合成操作过程
在试管(30mm×200mm)中放入一层菌根苗培育基质土，用透气性封口膜封口，并在温度为126℃、蒸汽压力为0.14MPA的条件下2次间隙灭菌130min，在超净工作台上，将上述培育好且分散均匀的液体菌丝体过滤，将过滤菌丝体与上述菌根合成用基质混合均匀，装入试管中，放入培养室中培养，培养室环境条件：白天光照40lux，光周期为白天16小时，晚上8小时，温度20±5℃，湿度为70±5％，每天用纯净水喷洒2次。培养3天在基质表面即可见白色象棉絮状的菌丝，培养7天后，将已发芽芽长0.2～0.8cm的种芽(种子采用常规催芽方法)播于培养容器中，并使其与混有菌丝体的合成用基质混合均匀，并用少量合成基质覆盖，白天光照1500lux，逐渐加大到8000lux，其它环境条件不变。播种后第30天取马尾松芽苗根段于修改的MMN培养基上培养，33小时后观察即发现有旺盛的白色的菌丝体长出。90天时，形成典型的外生菌根，切片在复合显微镜下进行观察发现明显的哈蒂氏网和菌丝套。