喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法及其专用培养基 【技术领域】
本发明涉及植物的组织培养及繁殖技术领域，具体涉及“喜临门”杜鹃品种的组织培养和快速繁殖方法。
背景技术
“喜临门杜鹃”是该杜鹃品种的品种名称。“喜临门杜鹃”品种属杜鹃花科，杜鹃花属的常绿小灌木，由锦绣杜鹃(R.pulchrum sweet)芽变培育而成。该品种于2007年9月7日获得中国植物新品种权，其品种权号：20070023，品种名称：喜临门杜鹃，品种权人：云南绿大地生物科技股份有限公司，该公司也是本专利申请的申请人。
“喜临门杜鹃”品种因其具有外植体均带有糙伏毛等生物特征，造成对其组织培养时进瓶建立无菌体系难度大，无菌体系建立后，分生苗的诱导时间长、增殖率低；分化的幼苗细弱、生根难度较大、移栽过渡成活率低等问题，用现有技术的常用组织培养基及其培养方法对其进行组培快繁不能解决上述技术难点，因而本申请人专门研究出适宜“喜临门”杜鹃新品种的组织培养专用培养基及其组培快繁方法。
“喜临门杜鹃”高60-80cm，幼枝粗壮、分枝多，叶革质、叶色深绿，伞形花序顶生，有花1-3朵，花冠红色、阔漏斗状、花瓣厚实、花期1-4月。“喜临门”杜鹃生长势强、抗性好，花色独特、是市场前景十分看好的盆栽及露地园林花卉。由于其种源来自于芽变枝条，进行扦插缺乏采穗材料，且扦插繁殖受季节及生根成活率的影响，扩繁速度缓慢，难以进行规模化生产和满足大面积推广应用的需求；靠种子繁殖的后代分离严重，不能再现“喜临门”杜鹃的品种特性，因此，对这类优良品种研究出组培专用培养基及其组培快繁方法具有重要意义。
目前关于“喜临门杜鹃”品种的组培研究还未见报道。针对该品种特性，通过有针对性的反复试验和研究解决了上述技术瓶颈，现针对其中的技术诀窍，申请本发明专利。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是克服了现有技术中对“喜临门杜鹃”品种在组织培养快繁中进瓶建立无菌体系难度大，无菌体系建立后，分生苗的诱导时间长、增殖率低；分化的幼苗细弱、生根难度较大、移栽过渡成活率低等技术问题，提供一种既能解决上述技术难点，又能降低生产成本，实现规模化优质组培苗生产的适宜“喜临门杜鹃”品种的组织培养快繁方法及其专用培养基。
为解决上述技术问题，本发明有以下技术方案：
一、喜临门杜鹃品种的专用培养基，由不定芽的诱导培养基，不定芽的增殖培养基，丛生苗的继代及壮苗培养基和生根培养基组成：
其中，所述的不定芽的诱导培养基的配方为：1/4MS，ZT3mg/L，NAA0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的不定芽的增殖培养基的配方为：1/4MS，ZT1mg/L，NAA 0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的丛生苗的继代及壮苗培养基的配方为：1/4MS，ZT0.5mg/L，NAA0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的生根培养基的配方为：1/4MS，IBA2mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6。
一、喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法，按以下步骤进行：
(1)外植体的选择：用透明塑料袋对刚开过花的喜临门杜鹃品种的枝条进行套袋，采取3-5cm新抽嫩枝作为外植体；
(2)外植体的灭菌：将上述外植体先用75％的酒精处理10-30min，再0.1％HgCl2浸泡茎尖5min，浸泡茎段8-10min，再用无菌水冲洗外植体4-5次；
(3)不定芽的诱导：在无菌工作条件下，将消毒灭菌后的茎尖段和茎段，接种于上述专用培养基中的不定芽的诱导培养基中，培养条件为光照时间12h/d，光照强度1500-2000lx，培养温度24±2℃；
(4)不定芽的增殖：将诱导出的不定芽接种于上述专用培养基中的不定芽的增殖培养基中，培养条件同上；
(5)丛生苗的继代及壮苗，将增殖获得的丛生苗接种于上述专用培养基中的丛生苗的继代及壮苗培养基中进行继代繁殖，培养条件同上；
(6)壮苗生根及继续扩繁：将上述继代增殖中高为2.5cm以上的健壮苗切成单株接种于上述专用培养基中的生根培养基中，将其余组织切割成2-4团接种于上述专用培养基中的不定芽的增殖培养基中，培养条件同上；
(7)移栽过渡：将步骤(6)中根长1-2cm的组培瓶苗移到温室中，常温、自然光下逐渐开瓶炼苗2-3天后出瓶移栽；取出植株健壮、根系发达的小苗，洗去沾在根部的培养基，栽植到下述过渡育苗基质中，过渡育苗基质为：泥炭土∶珍珠岩＝2∶1，用0.1％的多菌灵溶液作为定根水浇透，覆盖塑料薄膜，并盖上遮阴网。一周内保持湿度在90％以上和20-25℃的温度；1周后逐渐打开薄膜，增加光照和通风透气；2周后，进行常规管理。
上述喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法步骤(1)外植体的选择中所述的用透明塑料袋对刚开过花地喜临门杜鹃品种的枝条进行套袋是在1月进行套袋，在同一年的3月剪取3-5cm新抽嫩枝作为外植体。
上述喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法所述的步骤(2)外植体的灭菌是将上述外植体先用75％的酒精处理30s，再用0.1％HgCl2浸泡茎尖5min，浸泡茎段8min，再用无菌水冲洗外植体4-5次。
在上述喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法中将步骤(4)不定芽的增殖中获得的丛生幼苗切割为3-5苗的小丛苗团，再接种于上述不定芽的增殖培养基中继代繁殖，每瓶放置9-11团；完成培养周期后，每团苗可增长3-5倍，且丛苗的高度也会增长；如此通过反复继代繁殖，可获得大量的丛生苗。
在研究喜临门杜鹃品种的组织培养专用培养基的配方以及组培与快繁方法的过程中，主要解决了下列技术难题：
(1)通过优选开花多、花朵大、花色艳的喜临门杜鹃品种枝条，预先用透明塑料袋对其套袋，保持进瓶外植体的洁净，解决了由于该品种枝条带有糙伏毛，建立无菌体系难度大的问题，且优中选优，起到复壮保持本品种优良性状的效果。本发明不用锡箔纸或普通纸套袋，是因为用锡箔纸或普通纸套袋易造成枝条黄化，而用透明塑料袋套袋的光透性好，既有利于枝条健壮又保持了进瓶外植体的洁净。
(2)通过实验发现恰当的ZT浓度(3mg/L)，可提高外植体分化丛生苗的诱导率；而低浓度的ZT(0.5-1mg/L)，有利于丛生苗的增殖和壮苗，且无变异苗产生。
(3)ZT的售价十分昂贵，寻找出最适宜的ZT浓度后，不仅显著提高了分化苗的增长率，并降低了生产成本。
(4)筛选出最适宜分生壮苗生根的激素及其浓度是2mg/L IBA。
(5)本发明将基本培养基MS改良为1/4MS，调整PH为5.4-5.6，特别适宜“喜临门杜鹃”品种的良好的生长效果从而获得优质组培苗，并且进一步降低了生产成本。
本发明的有益效果是：
(1)提供的适宜“喜临门杜鹃”品种的离体组培快繁成套方法及其专用培养基，解决了“喜临门杜鹃”品种进瓶建立无菌体系难度大，无菌体系建立后，分生苗的诱导时间长、增殖率低；分化的幼苗细弱、生根难度较大、移栽过渡成活率低等技术问题，最终使该品种的组培快繁的种苗移栽成活率达90％以上。
(2)针对“喜临门杜鹃”品种的嫩枝分化特点，通过用透明塑料袋套袋获得相对洁净的外植体，结合恰当的灭菌技术，使进瓶成功率达到65％以上，有效进种率可达到85％-90％，在短期内获得了大量的无菌材料。
(3)通过恰当的ZT浓度(3mg/L)加速了诱导外植体分化，其芽诱导率达到100％的好效果，较文献资料中普遍报道的效果50-80％有明显的提高。通过恰当的ZT浓度(0.5-1mg/L)还提高了丛生苗的增殖率及壮苗率，以及筛选最佳生根剂等综合技术的应用，使“喜临门杜鹃”品种组培苗的繁殖量每年达到了10万株以上。实现了该品种种苗的规模化生产，为扦插苗的生产提供了大量种源。
(4)采用1/4MS培养基及低浓度的ZT含量，有效地降低了组培苗的生产成本。
【具体实施方式】
下面给出采用本发明专用培养基及其组织培养快繁方法的实施例对本发明作进一步的阐述。下述实施例中的方法如无特别说明，常规方法。下述实施例中所用的各种试剂均为常规试剂且均可在商店购买到，有些也可按常规方法自行配置。
实施例1、喜临门杜鹃品种的组织培养快繁方法及其专用培养基试验
试验材料取自云南绿大地生物科技股份有限公司温室内的“喜临门”杜鹃优选单株，所用试剂：MS培养基由本公司自行配制；ZT(即玉米素)和NAA(萘乙酸)从北京康贝斯科技有限公司购买。
喜临门杜鹃品种的专用培养基由不定芽的诱导培养基，不定芽的增殖培养基，丛生苗的继代及壮苗培养基和生根培养基组成：
其中，所述的不定芽的诱导培养基的配方为：1/4MS，ZT3mg/L，NAA0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的不定芽的增殖培养基的配方为：1/4MS，ZT1mg/L，NAA 0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的丛生苗的继代及壮苗培养基的配方为：1/4MS，ZT0.5mg/L，NAA0.5mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6；
所述的生根培养基的配方为：1/4MS，IBA2mg/L，糖30g/L和琼脂5g/L，PH为5.4-5.6。
采用上述“喜临门杜鹃”品种的专用培养基，对“喜临门杜鹃”品种进行组织培养快繁，按以下步骤进行：
(1)外植体的选择：在1月份将刚开过花的喜临门杜鹃枝条用透明塑料袋套袋，在同一年的3月份当枝条上发出的嫩枝长度达3-5cm时，剪取这些新抽嫩枝放入玻璃瓶内带回作为外植体。
(2)外植体的灭菌：将上述外植体先用75％的酒精处理30秒，使酒精的杀菌作用迅速渗透；再用0.1％升汞浸泡茎尖5min，用0.1％升汞浸泡茎段8min，需不停地摇动瓶子，使外植体充分与杀菌液接触；再用无菌水冲洗4-5次，这样的处理方法，得到了较多数量的无菌外植体和成活个体。
(3)不定芽的诱导培养：将经过消毒灭菌的外植体，在无菌工作环境中，接种于上述专用培养基中的不定芽的诱导培养基中，培养条件为每天光照时间12小时，光照强度1500-2000lx，培养温度24+2℃。外植体接种到诱导培养基两周后，茎尖顶芽开始生长，侧芽膨大萌动，继续培养至45天，茎尖诱导出2-3芽(顶部侧芽)，茎段的节上长出1-2个侧芽。
(4)不定芽的增殖培养：切下上述不定芽，接种于上述专用培养基中的不定芽的增殖培养基中，培养条件同上。培养45-60天后，不定芽的基部长出愈伤组织，从愈伤组织分化出许多丛生幼苗；进一步将上述获得的丛生幼苗切割为3-5苗的小丛苗团，在上述上述专用培养基中的不定芽的增殖培养基中继代繁殖，每瓶放置10团左右。完成培养周期后，每团苗可增长3-5倍，且丛苗的高度也会增长。如此反复继代繁殖，可获得大量的丛生苗。
(5)丛生苗的继代及壮苗：再将丛生苗切割为3-5苗的丛苗团，接种于上述专用培养基中的丛生苗的继代及壮苗培养基中，每瓶放置10团左右，培养条件同上。培养45-60天后，丛苗团苗的分化量减少为2-3倍，但丛苗的茎增粗、高度增长，多数达到2cm以上。
(6)壮苗生根及继续扩繁：将上述高为2.5cm以上的健壮苗切成单株，接种于上述专用培养基中的生根培养基中，培养条件同上；生根苗培养30天左右，长出长短不等的白色根系，培养45天后，根有5-7条，根长达到1.5-3cm，是出瓶过渡移栽的最佳时间；将其余愈伤组织团上的小苗及具有活力的植株下段材料分切为2-4团，接种于上述专用培养基中的不定芽的增殖培养基中，培养条件同上；
(7)移栽过渡培养：将步骤(6)中根长1-2cm的组培生根瓶苗移到温室内，常温、自然光下炼苗2-3天后开瓶出苗移栽。取出植株健壮、根系发达的组培苗、洗除沾在根部的培养基，然后移栽到育苗基质中，育苗基质为泥炭土∶珍珠岩＝2∶1，用0.1％的多菌灵溶液浇透，用塑料薄膜覆盖，并盖上遮阴网；一周内保持较高湿度在90％以上，保持适宜温度在20℃-25℃，1周后逐渐打开薄膜，增加光照及通风透气；2周后，便可进行常规管理，其组培快繁的种苗移栽成活率达90％以上。本试验在只有3台无菌操作台的情况下，达到了每年生产10万株以上组培苗。实现了该品种种苗的规模化生产，为扦插苗的生产提供了大量种源。
实施例2外植体灭菌方法的实验
由于“喜临门杜鹃”品种的生物特性决定进瓶建立无菌体系难度大，因此本研究进行了对“喜临门杜鹃”品种外植体灭菌方法的实验。
本实验使用两种消毒药液及不同的杀菌时间，对“喜临门杜鹃”品种的套袋萌发枝条的茎尖和茎段进行消毒处理，寻找最佳的消毒处理方式；采用套袋和未套袋新萌发的幼嫩枝条、进行两种消毒剂的处理时间比较实验。从表1看出：
(1)外植体材料用75％的酒精处理10-30min，再用0.1％HgCl2浸泡尖5min、浸泡茎段8-10min，其有效进种率达到75％-90％；
(2)外植体材料的最佳消毒处理方式为75％的酒精处理30秒，再用0.1％HgCl2浸泡尖5min、浸泡茎段8min，其有效进种率达到85％-90％；
(3)采用透明塑料袋套袋与未套袋比较，采用透明塑料袋不仅让新抽嫩枝在洁净的环境中生长，而且透光性好新抽嫩枝也生长健壮，以此作为外植体进瓶材料，可有效提高进瓶成功率达到65％以上，是未套袋材料的2.6倍以上。而用锡箔纸或普通纸套袋实验，结果显示新抽嫩枝黄化而不能使用，因而放弃。
表1不同外植体及消毒时间的比较实验
实施例3分化诱导培养基的筛选实验
该实验通过不同基本培养基和不同浓度的激素配比，寻找提高“喜临门杜鹃”外植体成活率、分化率、丛生苗诱导率及壮苗的培养基配方；选择NAA、IBA两种生长素，进行混配及单独使用，筛选最佳生根培养基配方。
该实验选用培养基基本元素简单、浓度相对较低的Read培养基作为对照，降低MS培养基无机元素为1/4浓度，作为筛选“喜临门杜鹃”品种组织培养的基本培养基。采用ZT 3mg/l、NAA0.5mg/l的激素搭配及浓度限定，获得了使“喜临门”杜鹃品种的组培芽诱导率为100％的好效果，较文献资料中普遍报道的效果50-80％有明显的提高。
从表2还可看出，相同激素配比情况下，基本培养基以1/4MS培养基诱导率高于Read培养基。因此，确定“喜临门杜鹃”的诱导分化培养基为1/4MS+ZT 3mg/l+NAA0.5mg/l，起到了加速“喜临门杜鹃”品种组培进度的作用。
表2喜临门杜鹃组培的基本培养基及激素筛选
培养基编号 基本培养基 ZT NAA 芽诱导率％ A1 1/4MS 3 0.5 100 A2 1/4MS 1 0.5 75 A3 Read 3 0.5 83 A4 Read 1 0.5 55
实施例4继代增殖培养基的筛选实验
ZT(玉米素)价格昂贵，减少ZT用量，可有效降低生产成本。从表3看出，B1和B2培养基的增殖效果差异不明显，均为5倍左右。因此选用B2培养基作为分生苗的增殖和继代培养基。
表3不同浓度的ZT对喜临门杜鹃芽增殖的影响
培养基 编号 ZT NAA 增殖系数 增殖情况 B1 2 0.5 5 基部丛生苗多，苗细弱，苗高1-2cm。 B2 1 0.5 4.8 基部丛生苗多，苗细弱，苗高1-2cm。。 B3 0.5 0.5 2.3 茎基部丛生量减少，茎稍粗，节间伸 长，苗高2-3cm。
当ZT浓度降低至0.5mg/l时(B3)，可有效控制丛生苗的分化芽数，已分化丛苗的茎增粗，苗的节间伸长，苗的高度增加，因此选用B3培养基作为分生苗的壮苗培养基。同时根据增殖数量的需要，可将B2和B3培养基进行交替轮换使用。
实施例5生根培养基的筛选实验
生根苗的适宜根数量及根的长度及质量，是提高过渡移栽成活率的关键。从表4看出“喜临门杜鹃”组培苗在不同的生根培养基上，生根情况各不相同，其中C4培养基的生根效率最好，生根率达到93.3％，多数具有4条根以上，平均根长为1.8cm，因此选用C4(1/4MS+IBA2mg/l)培养基作为喜临门杜鹃组培苗的最适宜生根培养基。
表4NAA和IBA对喜临门杜鹃组培苗的生根效果比较
培养基 编号 NAA IBA 生根率(％) 平均根长 (cm) 平均根数 (条/株) C1 0.1 1 63.3 1.5 2.5 C2 0.2 2 70 2.0 5 C3 2 0 40 1.5 3.7 C4 0 2 93.3 1.8 4.5
从上述各实施例可得出，本发明的专用培养基及其组织培养快繁方法，对“喜临门杜鹃”品种的组培快繁具有成套性、专用性、特效性和综合效果，该发明使进瓶成功率达到65％以上，有效进种率可高达到85％-90％，在短期内获得了大量的无菌材料；芽诱导率达到100％的好效果，还提高了丛生苗的增殖率及壮苗率，生根剂效果好，组培快繁的种苗移栽成活率达90％以上，使“喜临门杜鹃”品种组培苗的繁殖量每年达到了10万株以上。实现了该品种种苗的规模化生产，为扦插苗的生产提供了大量种源。