具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物及其应用，对大鼠的脂肪肝具有明显的预防和治疗作用，且具有天然、无毒、效果明显等优点，属于壳聚糖及其衍生物的应用技术。
背景技术
脂肪肝主要是由于肝脏摄入、合成脂肪与其排出、氧化分解之间失衡，引起脂肪(主要为甘油三酯)在肝中积聚所致。据文献报道，体重、体脂、肝脏脂肪、胆固醇、游离脂肪酸等生化指标的升高以及肝脏的超氧化物歧化酶含量的降低等，都是导致脂肪肝病症出现的诱因。目前，脂肪肝是肝脏疾患中发病率仅次于肝炎、肝硬化的一类常见疾病，肝脏脂肪变性可影响肝功能，是其代偿能力不足，对缺氧、中毒等的耐受性降低而容易发生肝功能衰竭，部分患者还可能进一步发展成为肝炎、肝纤维化和肝硬化。目前国内外尚无针对脂肪肝的理想预防和治疗药物。
甲壳素是从动物甲壳中提取而来的一类线型高分子多糖，具有多种药理作用，据报道部分脱乙酰化的甲壳素——壳聚糖能阻止实验性高胆固醇血症的发生，并且具有抗脂肪肝作用。
O-羧甲基壳聚糖具有水溶性，使其更容易和胆汁酸结合并排出体外，为了保持胆汁酸正常含量就必须在肝脏中将胆固醇转化为胆汁酸，其结果是血液中的胆固醇含量必然下降，从而使其具有预防和治疗脂肪肝作用；十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖，是通过对壳聚糖进行改性，增强其在水或油中的溶解能力和对脂肪、胆固醇等的吸附能力，油溶性使壳聚糖对油脂不是简单的吸附，而是使其溶解于水、油两溶性壳聚糖衍生物中，即可极大程度的提高壳聚糖对油脂的吸附效率。
结合以上衍生物的特点，利用壳聚糖天然、无毒功效，本发明专利设计了一种具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物，既可用于脂肪肝的预防又可以用于脂肪肝病症的治疗。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物及其应用，该组成物中所涉及的O-羧甲基壳聚糖和十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖易于制取，用于大鼠脂肪肝预防和治疗具有明显效果。
本发明中所涉及的具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物是通过下述技术方案加以实现的：
本发明的具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物，组份及质量份数为：壳聚糖4～8份，O-羧甲基壳聚糖9～14份，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖9～14份，丹参8～12份，何首乌6～8份，牛膝4～8份。
将壳聚糖组成物混合并粉碎成细末；压制成片剂0.05g/片，片剂用量为0.05～0.25g/天。
本发明的具有抗脂肪肝作用的壳聚糖组成物的应用，将粉碎细末压制成片剂0.05g/片，片剂用量为0.05～0.25g/天。
本发明的预防和治疗技术方案如下：
(1)将大鼠分成四组——正常对照组，肥胖模型组，片剂高剂量对照组，片剂低剂量对照组，除正常对照组喂基础饲料外，其余三组均喂高脂饲料，实验周期为6周。
(2)检测(1)的大鼠的部分生化指标。
应用性能检测如下：体重、体脂、肝脏脂肪和胆固醇、粪脂、肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、肝脏游离脂肪酸(FFA)以及对肝脏的病理学检查。
预防和治疗方案中的步骤(1)中的片剂，均是将片剂掺于大鼠饲料中，片剂的剂量为0.05～0.25g/天；过程中均选用wistar雄性大鼠，清洁级，体重在60～90克，由天津市动物实验中心提供。
用本发明所得片剂测得的大鼠生化指标如下(各生化指标都是相对于肥胖模型组的百分比)：
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【附图说明】
图1：实施例2正常对照组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图2：实施例2肥胖模型组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图3：实施例2PA添加组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图4：实施例2PB添加组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图5：实施例4正常对照组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图6：实施例4肥胖模型组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图7：实施例4高剂量组大鼠肝脏组织切片(HE染色)400倍；
图8：实施例6正常对照组大鼠肝脏组织切片(HE染色)200倍；
图9：实施例6肥胖模型组大鼠肝脏组织切片(HE染色)200倍；
图10：实施例6高剂量组大鼠肝脏组织切片(HE染色)200倍；
图11：实施例6低剂量组大鼠肝脏组织切片(HE染色)200倍。
【具体实施方式】
下面通过实例对本发明作进一步详细说明：
实施例1：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖40g，O-羧甲基壳聚糖90g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖90g，丹参80g，何首乌60g，牛膝40g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.25g/天，低剂量为0.05g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.体重、体脂以及肝脏脂肪和胆固醇含量的检测：
(1)对大鼠体重及体脂的影响：实验初始时各组间大鼠体重差异不具有显著性；至第3周时肥胖模型组大鼠体重明显高于正常对照组，差异具有显著性(P＜0.01)；从第5周开始片剂组体重均明显低于模型组，差异具有显著性(P＜0.01)，至实验结束时这种差异更为显著，且高脂饲料组大鼠体重是基础饲料对照组的1.65倍，其增重量是基础饲料组增重的1.96倍。肥胖模型组大鼠体重增长速度明显快于其他三组，整个实验期间片剂服用低、高剂量组大鼠体重增量分别比肥胖模型组低33％和37％，体脂含量也分别降低了14％和22％(表1)。
表1各组间大鼠体重的变化及体脂含量(x±s)
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a与基础饲料组相比P＜005，b与基础饲料组相比P＜001
c与高脂饲料组相比P＜005，d与高脂饲料组相比P＜001
(2)对肝脏脂肪和胆固醇含量的影响：肥胖模型组大鼠肝脏脂肪和胆固醇含量分别为(11.06±3.03)％、(136.20±33.87)μg，显著高于仅喂饲基础饲料的对照组(3.11±1.44)％、(48.00±27.99)μg。低剂量组大鼠肝脏脂肪及胆固醇含量分别为(7.11±2.90)％、(58.15±27.14)μg，高剂量组大鼠肝脏脂肪及胆固醇含量分别为(5.94±1.26)％、(46.06±18.88)μg。可见服用片剂组的大鼠肝脂肪含量与高脂饲料组大鼠相比明显下降，其中低剂量组肝脂肪含量下降36％，肝胆固醇含量下降57％；高剂量组的大鼠肝脂肪含量下降46％，肝胆固醇含量下降66％(表2)。
表2对大鼠肝脏脂肪和胆固醇含量的影响
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*与高脂组比较P＜005，
**与高脂组比较P＜001；@高脂组比较p＝005
实施例2：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖6g，O-羧甲基壳聚糖10g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖10g，丹参9g，何首乌7g，牛膝6g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.20g/天，低剂量为0.10g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.粪脂水平以及肝脏病理学的检测：
(1)对大鼠粪脂水平的影响：从外观看来，与喂饲基础饲料的对照组比较高脂饲料组和壳聚糖衍生物添加组大鼠粪便颜色发白，质地稀软。测定各组大鼠粪便中总脂肪含量，发现片剂服用组均能促进脂肪由粪便的排出，与高脂饲料组相比分别增加34％和46％，P＜0.01，差异具有显著性(表3)。
表3壳聚糖衍生物对大鼠粪便中脂肪含量的影响
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**与高脂组比较P＜001；△与PA组比较P＜005
(2)对肝脏的病理学检查：比较图1～4可知，肥胖组肉眼观察肝脏明显增大，色黄、触之有油腻感，切面呈花斑状，预防组大鼠肝脏外观与添加基础饲料的对照组大鼠肝脏大体相似。镜下观察发现肥胖模型组大鼠肝细胞呈弥漫性水变性，胞浆内充满细胞脂滴，并融合成多量大小不等的脂肪空泡，大者占据胞浆大部分并挤压细胞核，肝窦明显受挤闭塞。PA和PB添加组病变程度相似，较模型组明显减轻。肝细胞水变性基本消失，肝窦恢复正常，仅见部分细胞胞浆内存在小的脂肪空泡，未见融合性大脂滴和压榨现象。
实施例3：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖7g，O-羧甲基壳聚糖11g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖10g，丹参10g，何首乌7g，牛膝7g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.25g/天，低剂量为0.10g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.体重、体脂以及肝脏脂肪和胆固醇的检测：
(1)对大鼠体重及体脂的影响：肥胖的主要表现就是体重和体脂含量的增加。表4反映了各剂量组体重的动态变化，实验初始时各组间大鼠体重较为接近，自第四周开始各片剂组大鼠体重的下降趋势逐渐突出，至实验结束时片剂组大鼠体重明显降低，片剂高、低剂量组分别较对照组低90.22g和81.51g，差异具有显著性(P＜0.01)。两片剂组对体脂含量的影响类似，两者均能明显降低大鼠的体脂含量，且具有明显的剂量依赖性。
表4壳聚糖及其衍生物对大鼠体重及体脂含量的影响(x±s)
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**与Control组相比P＜001
(2)对肝脏脂肪和胆固醇的影响：两种片剂剂量组的肝/体比明显低于肥胖对照组。高、低片剂剂量组与对照组相比，肝脏胆固醇含量下降幅度分别达到44％和39％，肝脏脂肪含量下降36％和34％(表5)。
表5大鼠肝/体比与肝脏脂肪含量情况(x±s)
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*与Control组相比P＜005，
**与Control组相比P＜001
实施例4：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖8g，O-羧甲基壳聚糖12g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖13g，丹参11g，何首乌8g，牛膝8g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.15g/天，低剂量为0.05g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.粪脂水平以及肝脏病理学的检测：
(1)对大鼠粪脂水平的影响：片剂的高剂量组大鼠粪便中脂肪含量与对照组相比增加38％，与对照组相比低剂量的片剂组粪脂含量也有所增加，P＜0.01，差异具有显著性。
(2)对肝脏的病理学检查：图5～7分别为空白对照组、肥胖对照组大鼠及治疗实验片剂组的肝脏组织切片。肥胖对照组大鼠肝细胞呈严重的脂肪变性，肝细胞浆内见多量大小不等的脂肪空泡，许多小的脂肪空泡融合形成大的脂滴，挤压细胞核。高、低剂量治疗组病变程度大致相同，肝细胞弥漫性水变性，肝窦狭窄，肝细胞脂肪变性的程度较肥胖组轻，部分肝细胞内见脂肪空泡。高剂量治疗组肝细胞未见水变性，肝窦恢复正常，细胞浆内仅见少许脂滴，脂肪变性程度较中、低剂量组明显减轻。
实施例5：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖8g，O-羧甲基壳聚糖14g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖14g，丹参12g，何首乌8g，牛膝8g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.10g/天，低剂量为0.05g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.抗氧化指标(肝脏SOD)检测：各剂量组对大鼠肝脏中的SOD含量有显著性提高作用(与高脂对照组相比较P≤0.05)，且对SOD的影响具有剂量依赖性，高剂量组比低剂量组的效果明显(表6)。
表6壳聚糖及其衍生物预防组对超氧化物歧化酶(SOD)的影响
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注：
*与高脂对照组相比P≤005
实施例6：
1.壳聚糖组成物的成分：壳聚糖6g，O-羧甲基壳聚糖11g，十六烷基-N，N-二甲基季铵盐壳聚糖14g，丹参12g，何首乌6g，牛膝6g，混合并粉碎成细末。
2.将上述粉末压制成片剂，并以该成分的片剂对大鼠进行试验，高剂量为0.15g/天，低剂量为0.05g/天，并对其部分生化指标进行检测。
3.肝脏游离脂肪酸(FFA)以及肝脏病理学的检测：
(1)对大鼠肝脏游离脂肪酸(FFA)的检测：肝脏中FFA含量的变化非常的明显，第六周后空白对照组(C)与高脂对照组(F)的FFA含量变化差异明显分别为821.5±525.6μmol/L和2245.9±1151μmol/L，同期F组比C组高出一倍多，而片剂组均低于高脂对照组，且均出现显著性变化(P≤0.05)，有的甚至低于或接近正常空白组，且FFA的变化量与剂量呈正相关(表7)。
表7壳聚糖及其衍生物预防组对游离脂肪酸(FFA)的影响
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注：
*与高脂对照组相比P＜005
(2)对肝脏的病理学检查：从光镜下观察，正常组肝脏组织结构完整，肝小叶轮廓清晰，肝细胞条数围绕中央静脉呈放射状排列，无异常现象，几乎见不到脂滴空胞且纤维组织增生不明显，如图8所示。图9中的高脂对照组肝小叶紊乱，肝细胞呈严重的脂肪变性，肝窦狭窄，细胞浆内有大量的脂滴空泡，许多小的脂肪空泡融合形成大的脂滴，挤压细胞核，细胞之间界限不清纤维组织增生明显。由此说明高脂造成肥胖模型的同时，也导致了脂肪肝变性严重。而从各片剂组的病理切片中可以看出，对脂肪肝均有明显的改善作用。高剂量组大鼠肝脏切片，细胞排列整齐，脂滴细胞相比高脂组明显减少，少量炎细胞浸润，肝细胞轻微变性(图10)；低剂量组大鼠肝脏切片也有所好转，肝小叶结构存在，纤维组织轻微增生，仅是少量炎细胞浸润，肝细胞轻微变样(图11)。说明壳聚糖及衍生物对大鼠肝损伤有预防和治疗作用。
本发明并不局限于实施例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的，本发明的权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围之内。