来自尿的祖细胞及其使用方法 相关申请
本 申 请 按 照 35U.S.C.§119(e) 要 求 2007 年 5 月 21 日 提 交 的 美 国 临 时 申 请 60/939,247 和 2007 年 6 月 11 日提交的美国临时申请 60/943,215 的优先权， 其中每个均在 此全文引入作为参考。
技术领域
本发明大体上涉及从尿中分离细胞， 以及所分离的细胞及其使用方法。背景技术 再生性药物是组织工程的应用领域， 其着眼于机体的损伤组织的再生。再生性药 物的应用包括器官例如膀胱的重建或替换。
很多疾病和损伤可引起膀胱的伤害或丧失， 需要修复或替换该器官。具有先天性 异常例如膀胱外翻、 后尿道瓣膜或脊髓脊膜突出 ( 通常称为脊柱裂 ) 的儿童可以发展高压 和高渗的低顺应性膀胱。 在美国， 在成年群体中， 膀胱癌是男性中第四常见的诊断的恶性肿 瘤， 女性中是第九常见的诊断的恶性肿瘤。
膀胱的基础功能是提供可以在低压下存储尿并且在意志力控制下清空的宽敞的 容器。遭受包括膀胱功能丧失的痛苦的病人经历其生活质量的显著的消极改变， 并且有肾 盂积水和肾衰竭的风险。
当药物治疗不足时， 通常需要进行膀胱重建， 或膀胱成形术。目前， 膀胱扩大术通 常是通过将去管状的肠段置于膀胱中而实现的。虽然是功能性的， 但是可以因使用用于泌 尿重建的肠段或胃瓣 (gstric flap) 产生几种并发症。有害的副作用包括感染、 肠堵塞、 产 生粘液、 电解液异常、 穿孔和致癌性。因此， 需要临床上更适用的通过组织工程化再生的膀 胱重建过程。
组织工程的进展已经证明可能通过使用接种原代培养细胞的生物可降解膜进 行 膀 胱 重 建 (Kropp 等 人 (1996)J.Urol.156 ： 599 ； Atala 等 人 (1992)J.Urol.148 ： 658 ； Oberpenning 等 人 (1999)Nat.Biotechnol.17 ： 149)。 已 经 在 人 中 证 明 了 这 个 概 念 的 可 行 性， 并 且 实 现 了 膀 胱 重 建 和 膀 胱 体 积 的 扩 大 (Atala 等 人 .(2006)The Lancet 367 ： 1241-46)。
用于实现成功的膀胱重建的生物材料支架包括非细胞的胶原基质和合成的聚合 物。 胶原基质包括猪的膀胱粘膜下层膜 (BSM) 和小肠粘膜下层 (SIS)， 二者均含有正常细胞 生长、 分化和功能所需的众多的天然组分， 包括胶原、 糖蛋白、 蛋白聚糖和功能性生长因子 (Hodde 等 人 (2001)Endothelium 8 ： 11 ； Voytik-Harbin 等 人 (1997)J.Cell.Biochem.67 ： 478)。合成的聚合物支架包括聚羟基乙酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA) 和乳酸 - 羟基乙酸的 共 聚 物 (PLGA)(Oberpenning 等 人 (1999)Nat.Biotechnol.17 ： 149 ； Atala 等 人 (1993) J.Urol.150 ： 608)。
自体膀胱细胞是用于无癌症病人中组织工程构建体的最常见的细胞来源。接种
到生物材料支架的病人自己的培养细胞可以用作再生组织的框架。但是， 为了获得膀胱细 胞， 需要进行侵入性组织活检程序以便收获细胞， 这增加了医疗保健的代价并且伴有潜在 的并发症例如流血、 感染和尿道或膀胱损伤。 此外， 由于在活检前或活检时对粘膜组织的破 坏， 从膀胱活检获得的细胞有时候不能够生长 (Zhang&Frey(2003)Adv.Exp.Med.Biol.539 ： 907)。
正在研究用于尿道重建的替代性细胞来源， 包括胚胎、 胎儿和成体干细胞。干细 胞是自我更新的且非终末分化的， 因此可产生各种类型的细胞。人类胚胎干细胞对于组织 工程目的是有前途的 (Frimberger 等人 (2005)Urology65 ： 827 ； Lakshmanan 等人 (2005) Urology 65 ： 821)， 但是存在免疫相容性、 肿瘤形成和伦理学问题。发现胎儿或成体干细胞 在宿主组织中只有非常稀少的数目， 可能不能在培养中很好地扩增， 且具有更加受限制的 分化潜能 (Vogel(2001)Science 292 ： 1820)。所以， 目前干细胞在组织工程上的临床应用 可能是有限的。
需要比通过活检收获自体细胞更优选的替代方案以用于尿道组织工程和细胞治 疗， 特别是当活检不能获得自体来源细胞时。 发明内容 本发明提供了产生尿祖细胞 (UPC) 培养物的方法， 包括提供尿样品 ； 然后从所述 尿样品中分离尿祖细胞。在一些实施方式中， 所述分离步骤通过以下进行 ： (a) 从尿样品中 收集细胞以提供粗制细胞样品 ； 和 (b) 从所述粗制细胞样品中选择尿祖细胞。在一些实施 方式中， 所述收集步骤通过所述尿样品的离心进行。
在一些实施方式中， 所述选择通过将所述细胞平板接种于 (plating) 包含选择性 细胞培养基的组合物中而进行。 在一些实施方式中， 所述选择基于形态学而进行。 在一些实 施方式中， 所述选择通过选择对尿祖细胞特异的标记而进行， 例如 C-kit(CD117)、 SSEA-4、 CD105、 CD73、 CD90、 CD133 和 / 或 CD44。在一些实施方式中， 尿祖细胞来自哺乳动物对象 ( 例如， 人对象 )。通过本文公开的任何方法制备的尿祖细胞是本发明的另一个方面。
还提供了分离的尿祖细胞， 其中所述细胞是 c-kit 阳性的， 且其中所述细胞可分 化成选自下列的两个或多个谱系 ： 尿道上皮、 平滑肌、 内皮和间质细胞。
提供了将细胞接种到组织支架上的方法， 包括提供 UPC， 分化 UPC 和将分化的细胞 接种到生物可降解的组织支架上。组织支架可包含胶原基质和 / 或合成的聚合物， 例如聚 羟基乙酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA) 或乳酸 - 羟基乙酸的共聚物 (PLGA)。
提供了治疗有需要的对象的方法， 包括提供膀胱组织基底 (substrate)， 其中所述 基底包含分化的 UPC ； 和将所述基底移植到病人中。基底可以包括胶原基质和 / 或合成的 聚合物， 例如聚羟基乙酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA) 或乳酸 - 羟基乙酸的共聚物 (PLGA)。
提供了试剂盒， 所述试剂盒可包含适于尿样品运输的容器 ； 培养基 ； 一种或多种 抗生素 ； 容纳所述容器、 培养基和抗生素的包装体 ； 以及任选地， 使用说明书。
本发明的另一个方面是如上所述的细胞在制备用于进行如上所述的治疗方法的 药物中的用途。
本发明的前述和其它目标和方面通过本文的附图和以下说明书更详细地解释。
附图说明 图 1. 提议的尿祖细胞 (UPC) 分化路径的示意图。
图 2. 经过体外培养的来自尿的祖细胞的显微图像。细胞可以在不存在饲养层细 胞的条件下增殖。
图 3. 尿细胞培养物的细胞生长曲线。在 10 至 12 天内在 6-cm 培养皿中细胞从单 一细胞生长至汇合。
图 4. 荧光激活的细胞分选 (FACS) 图像证明从尿中分离的细胞中存在祖细胞标记 物， 例如 CD44、 105、 73、 90 和 133。
图 5. 在 从 膀 胱 活 检 获 得 的 人 尿 道 上 皮 中 (A-D) 和 UPC(E-H) 中 用 uroplakin(UPIa)、 细胞角蛋白 7、 13、 19、 17 和核酸进行免疫荧光染色的显微图像。
图 6. 用核酸和对平滑肌特异性的标记物双染色的 UPC 的显微图像。图像显示源 自尿的平滑肌祖细胞表达平滑肌蛋白标记物， 例如 α- 平滑肌肌动蛋白 (ASMA)(A)、 调宁蛋 白 (Calponin)(B)、 结蛋白和肌球蛋白 (D)。
图 7. 体内移植后一个月的 UPC- 膀胱粘膜下层膜 (BSM) 和 UPC- 小肠粘膜下层 (SIS) 构建体的组织学特征。A.Masson 三重 (Trichrome) 染色和 UPC 在 SIS 支架上生长的 检测。B. 在 SIS 基质上鉴定的 Lac-Z 标记的 UPC。C. 接种尿细胞的 BSM 移植物的苏木精 & 伊红 (H&E) 染色的部分。D. 在 BSM 基质内记录到 UPC 的人 X/Y 染色体。
图 8. 在培养的尿细胞中观测到的四种细胞类型 ： 内皮样细胞、 平滑肌样细胞、 上 皮样细胞和间质样细胞。
图 9. 通过 FACS 分析细胞的细胞特异性标记物 AE1/AE3、 结蛋白、 波形蛋白和红细 胞生成素。
图 10. 克隆的 UPC 的吉姆萨 (Giemsa) 带核型图在第 6 代显示出正常的染色体式 样。
优选实施方式详述
本发明涉及祖细胞和从尿中选择和培养祖细胞的方法。有利地， 尿中所发现的细 胞可以不需要组织活检而获得， 免除了病人的不舒适度和可能的并发症。
所有引用的美国专利参考文献的公开均在这里引入作为参考， 达到其与本文的公 开一致的程度。如本发明的说明书和随附的权利要求书所用的单数形式 “一个” 、 “一种” 和 “所述” 也包括复数形式， 除非上下文清晰地另有说明。此外， 当提及可测定值， 例如化合物 的量、 剂量、 时间、 温度等时， 本文使用的术语 “约” 和 “大约” 是指包括指定量 20％、 10％、 5％、 1％、 0.5％或甚至是 0.1％的变化。同样， 如本文所用的 “和 / 或” 和 “/” 是指并且包括 所列项目相关的一个或多个任何和所有可能的组合， 以及当在或者 (“或” ) 中分析时组合 的缺失。
“尿祖细胞” 或 “UPC” 是从尿中收集和 / 或分离的细胞， 其具有多能性和增殖潜能。 UPC 是 “多能性的” ， 是指其能够产生一个或多个谱系内的各种细胞类型。例如， 根据一些实 施方式的 UPC 具有分化成下列的一种或多种的潜能 ： 膀胱尿道上皮、 平滑肌、 内皮、 间质细 胞， 甚至是骨、 肌肉、 上皮细胞和其它类型的细胞和组织。以前的研究已经表明尿道上皮细 胞可分化为成熟的软骨细胞 (Fernandez-Conde， Bone(1996)18(3) ： 289-91)。
从尿道腔中脱落的细胞通常被认为是难以在体外培养和保持的老的或损坏的表
面细胞。从尿中获得的几种细胞可以在饲养层细胞上迅速生长。但是， 当用小鼠饲养细胞 培养人细胞时， 饲养层细胞通常来源于可能将病毒从动物转移到人类的胚胎小鼠组织。为 了避免这个并发症， 我们最近在没有饲养层细胞的条件下从尿中培养了细胞。获得了具有 祖细胞特征且保持了增殖能力和多能性潜能的细胞。
我们的研究表明在尿中有混合的细胞群体 ： 有祖细胞， 也有成熟细胞。 如本文所讨 论， 尿含有尿道上皮祖细胞和平滑肌祖细胞， 以及内皮和间质祖细胞。 尿中发现的祖细胞可 来源于膀胱组织、 肾组织等。在一些实施方式中， 对 UPC 进行排除肾脏来源的选择。这可通 过例如将收集的细胞传代而进行， 因为人们认为肾脏细胞在传代时通常不能存活。在一些 实施方式中， 在生长 24-48 小时内 ( 例如每 31.3 小时 )， UPC 良好地倍增， 这允许它们大量 生长。在另外的实施方式中， UPC 不诱导肿瘤形成， 在一些实施方式中， UPC 的生长或分化不 需要饲养细胞。
“分离的” 是指将细胞置于非其天然环境的条件中。但是， 术语 “分离的” 不排除后 来将这些细胞与其它细胞组合或混合使用。
“对象” 通常为人对象， 包括但不限于 “病人” 。对象可以是男性或女性， 可以是任 何种族或种族划分， 包括但不限于高加索人、 非洲裔美国人、 非洲人、 亚洲人、 西班牙人、 印 度人等。对象可以是任何年龄的， 包括新生儿、 婴儿、 婴幼儿、 儿童、 青年人、 成年人和老人。 对象也可以包括用于 ( 例如 ) 兽药和 / 或药物开发目的的动物对象， 特别是哺乳 动物对象， 例如犬、 猫、 牛、 山羊、 马、 绵羊、 猪、 啮齿动物 ( 例如大鼠和小鼠 )、 兔类动物、 灵长 类 ( 包括非人灵长类 ) 等。
细胞的收集
可以从任何产生尿的动物 ( 包括人类 ) 收集 UPC。 在本发明的一些实施方式中， 尿 祖细胞从哺乳动物的尿中收集。例如， UPC 可以从狗、 猫、 猪、 母牛 (cow)、 马、 猴子或人的尿 中收集。在具体实施方式中， 尿祖细胞从人尿中获得。
在一些实施方式中， UPC 从新鲜的自发尿样品中获得， 或从通过尿道导尿管或膀胱 洗涤排出的尿获得。 尿样品可在 4℃于 1500RPM 离心 5 分钟， 吸取上清液并用合适的溶液例 如磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤细胞。PBS 可任选地含有 5％胎牛血清 (FBS) 和 1％青霉素 - 链 霉素以分别保护细胞免受损伤和潜在感染。
可以在例如美国专利 No.5,912,116 ； 美国专利申请 No.20040087017 ； 美国专利申 请 No.20020012953 ； 和 WO 2005/047529 中发现从生物液体中分离细胞的方法和设备的其 它例子。
细胞的选择和繁殖
在一些实施方式中， 扩增收集的 UPC。 “扩增” 是指有活力的细胞数目的增加。可 通过例如使细胞生长一个或多个细胞周期而实现扩增， 其中至少一部分细胞分裂以产生另 外的细胞。
“原代培养物” 是将收集的细胞接种到培养容器后建立的首次培养物。 “传代” 是 指将培养物转移或次培养至第二个培养容器， 通常包括机械或酶学解聚， 再接种， 且通常分 裂为两个或两个以上子代培养物， 这取决于增殖的速率。如果为了特定的基因型或表型而 选择群体， 则培养物经次培养成为 “细胞株” ， 即培养物为匀质的且具有所需要的特征。 “细 胞系” 的建立， 与细胞株相反， 是基本上未分化的， 虽然它们可能成为特定的谱系。
“选择” 可基于将一种细胞类型与另一种区别开的任何独特性质， 例如、 密度、 大 小、 独特标记物、 独特代谢途径、 营养需求、 蛋白表达、 蛋白分泌等。 例如， 可以使用梯度离心 基于密度和大小而选择细胞。 可使用荧光激活的细胞分选 (FACS)、 免疫磁珠分选、 磁激活的 细胞分选 (MACS)、 淘选 (Panning) 等选择独特标记物。可通过改变细胞生长的培养基特别 是无血清环境的营养成分的组成和 / 或数量来利用独特的代谢途径和营养需求。可使用各 种检验 ( 例如 ELISA) 检测蛋白表达和 / 或分泌。
在一些实施方式中， 通过将由尿分离的细胞提供在促进祖细胞生长的特定生长环 境 ( 例如祖细胞培养基 ) 中而选择 UPC。在一些实施方式中， 祖细胞培养基含有 3/4DMEM、 -10 1/4Ham′ s F12、 10％ FBS、 0.4mg/ml 氢化可的松、 10 M， Chron 毒素、 5mg/ml 胰岛素、 1.2mg/ ml 腺嘌呤、 2.5mg/ml 铁传递蛋白加 0.136mg/ml 3， 39， 5- 三碘 -L- 甲腺原氨酸、 10mg/ml EGF、 和 1 ％ 青 霉 素 - 链 霉 素 (Zhang 等 人， In vitro Cell Dev.Biol.-Animal 37 ： 419， 2001)。在其它实施方式中， 将分离的 UPC 提供在促进祖细胞选择性分化的特定生长环境 中。例如， 在一些实施方式中， 在角化细胞无血清培养基中生长的 UPC 发育为尿道上皮。在 其它实施方式中， 在含有 10％胎牛血清的 DMEM 中生长的 UPC 发育成平滑肌样细胞。在一 些实施方式中， 内皮样细胞可在含有 20％ FBS、 2mmol/1L- 谷氨酰胺、 EGF(5nl/ml)1％丙酮 酸钠和 1％青霉素 - 链霉素的 M199 中培养。在一些实施方式中， 间质样细胞可在含有 10％ FBS、 2mmol/1L- 谷氨酰胺和 1％青霉素 - 链霉素的 DMEM 中培养。 在其它实施方式中， 通过形态学选择 UPC。例如， 可将从尿中分离的细胞稀释至允 许分离单个细胞的浓度 ( 例如， 细胞可在多孔板中被稀释至约 0.5 细胞 / 孔 )， 并在显微镜 下观察。可以保留含有单个细胞的孔用于扩增， 通过观察形态而选择， 例如尿道上皮、 平滑 肌、 内皮和 / 或间质细胞 ( 见图 6A)。
根据本发明的一些实施方式的尿祖细胞可基于一种或多种 “标记物” 而鉴定、 选择 和 / 或分离。 这样的标记物包括特异性基因表达、 在这类细胞表面发现的抗原性分子等。 在 特定的实施方式中， 尿祖细胞基于至少一种特异性标记物选择和分离。 在一些实施方式中， UPC 具有以下的一种或多种标记物， 例如 CD117(C-kit)、 SSEA-4、 CD105、 CD73、 CD90、 CD133 和 CD44， 并且不具有可评估量的一种或多种以下标记物 ： CD31、 CD34 和 CD45。因此， 某些实 施方式包括选择和分离表达 CD117、 SSEA-4、 CD105、 CD73、 CD90、 CD133 和 CD44 中的一种或 多种和 / 或不表达 CD31、 CD34 和 CD45 中的一种或多种的尿祖细胞。例如， 在一些实施方式 中， 本发明的尿祖细胞是基于 CD117 的表达而鉴定、 选择和 / 或分离的。
在一些实施方式中， 可按照本文的公开内容通过下述而获得 UPC ： 从尿样品中收 集细胞 ( 例如通过离心 )， 和 / 或直接将细胞置于合适的培养基之中或之上， 和 / 或基于祖 细胞特异性细胞标记物的表达而选择并分离尿祖细胞 ( 例如通过免疫组化或 western 印迹 分析 )。 或者， 可通过收集并选择细胞而获得尿祖细胞， 所述选择通过荧光激活的细胞分选， 例如使用与荧光团 ( 例如 APC、 藻红蛋白、 别藻蓝蛋白、 荧光素、 德克萨斯红 (TEXAS RED) 等 ) 偶联的标记物特异性抗体 ( 例如抗 CD117 抗体 )， 或使用与磁性颗粒偶联的标记物特异性抗 体进行磁性选择。说明性地， 可使用与 CD117 报告蛋白的细胞外结构域 ( 氨基酸 23-322) 特异性结合的兔多克隆抗体孵育细胞 (De Coppi 等人 (2007)Nat.Biotechnol.25 ： 100)。 可 通过使用磁性山羊抗兔 IgG 微珠孵育并在 Mini-MACS 设备上选择而纯化 CD117- 阳性细胞。 还可使用直接与微珠偶联的抗 -CD117 单克隆抗体来选择尿祖细胞。任何适合于选择的方
法， 包括与固相结合和分离， 均涵盖在本发明的范围内。
根据本发明的一些实施方式的尿祖细胞可常规传代或次培养， 例如以 1 ∶ 4 稀释 并允许扩增至约 50 ～ 70％汇合度。尿祖细胞的分离的群体可常规生长并在常规培养条件 下保持， 例如 37℃在 5％ CO2 的湿润空气中。 虽然本发明的细胞可在含有 KFSM- 祖细胞培养 基的复合培养基 (1 ∶ 1) 中生长 (Zhang 等人， In vitro Cell Dev.Biol.-Animal 37 ： 419， 2001)， 但是通常优选的是细胞在简单的无血清培养基中保持， 例如用于尿道上皮祖细胞的 KSFM ； 或含有 10％ FBS 的用于平滑肌或间质祖细胞的培养基， 例如 Dulbecco 最低必需培养 基 (DMEM)、 Hank 碱性盐溶液 (HBSS)、 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)、 RPMI、 或 Iscove 改进 的 Dulbecco 培养基 (IMDM)， 从而实现对祖细胞分化为所需要细胞的更精确控制。 可通过常 规的限制性稀释方法在 96 孔板或 24 孔板中产生克隆尿祖细胞系。一旦形成细胞克隆， 将 细胞分离并转移至多孔培养皿。
在一些实施方式中， 培养基中包含生长因子或其它促有丝分裂剂以促进不同细胞 群体的增殖和分化。从这个意义上， 本发明的具体实施方式包括用支持尿祖细胞生长并分 化为尿道上皮、 平滑肌、 间质细胞等的选择性培养基来培养尿祖细胞。在本文上下文中， 分 化是指细胞状态， 其中细胞发展特定的形态学或功能性特征。 说明性地， 当尿祖细胞在补充 了 0.09mM 钙的角质细胞无血清培养基 (KSFM) 中生长时， 细胞分化成尿道上皮。同样地， 在 补充了血清例如 10％胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 中培养的尿祖细胞促进向平滑肌细胞的分化。 因此， 本发明还包括分化并表达至少一种尿道上皮特异性标记物或至少一种平滑肌特异性 标记物或至少一种其它组织特异性标记物 ( 例如间质特异性 ) 的尿祖细胞群体。
可通过检测对特定细胞类型特异性的标记物来确定 UPC 是否分化成这些特定类 型的细胞。例如， 可通过一种或多种尿道上皮特异性标记物 ( 包括 ： 例如 uroplakin、 细胞 角蛋白 7、 细胞角蛋白 13、 细胞角蛋白 17、 细胞角蛋白 19 和细胞角蛋白 20) 的存在来鉴定尿 道上皮细胞 ； 可通过一种或多种平滑肌特异性标记物 ( 包括， 例如 α- 平滑肌肌动蛋白、 结 蛋白、 调宁蛋白和肌球蛋白 ) 的存在来鉴定平滑肌细胞。可通过使用任何合适的常规方法 例如免疫组化和 / 或 western 印迹分析来确定细胞类型特异性标记物的表达。
此外， 如果需要， 可在使用前将细胞冷冻或冷藏， 然后解冻成有活力的形式。冷冻 或冷藏细胞的方法 ( 用于以后回复至有活力的形式 ) 在本领域是熟知的。例如细胞的冷藏 可包括将细胞在生长培养基与另一种防止水形成冰晶体的液体的混合物中冷冻， 然后将细 胞储存于液氮温度 ( 例如， 约 -80℃至约 -196℃ )。参见例如美国专利 No.6,783,964。
治疗方法
可使用本文公开的方法治疗的疾病， 包括但不限于尿道组织的扩大或替换。本文 所用的 “治疗” 是指任何种类的对病人有益的治疗， 所述病人为例如患有疾病的病人或具有 患疾病风险的病人。 治疗包括为了改善病人病状 ( 例如一种或多种症状的减轻 )、 延缓疾病 的发生或发展等而进行和禁止进行的行动。
已经证明根据本发明的一些实施方式的尿祖细胞可分化成各种功能细胞类型， 本 发明的尿祖细胞可应用于治疗尿道的疾病和病状， 包括 ： 例如膀胱外翻 ； 膀胱体积不足 ； 部 分或全部切除后的膀胱重建 ； 膀胱修复 ； 外伤引起的肾或输尿管损伤等。按照一些实施方 式的治疗包括尿道疾病和病状， 例如先天性异常、 癌症、 外伤、 辐射、 感染、 医原性损伤、 神经 损伤或其它诱因。通常， 治疗包括改变尿道功能 ； 改善尿道功能 ； 或重建、 修复、 扩大或替换损伤的尿道细胞或全组织或器官， 以预防或治疗尿道疾病或病状。 从这个意义上， 尿祖细胞 可用于如下尿道结构的组织工程 ： 例如输尿管、 膀胱、 尿道、 肾盂 (renal pelvic)、 肾脏、 骨、 软骨、 肌肉、 皮肤等。
此外， 尿祖细胞可应用于下尿道药理学和尿道疾病的诊断。根据本发明的一些实 施方式的细胞可用于诊断疾病， 例如， 血尿症或尿道系统的肿瘤， 如膀胱、 肾盂、 肾脏、 输尿 管、 前列腺和尿道的肿瘤 ； 肾脏疾病， 例如肾糖尿病、 肾小管坏死、 急性或慢性肾衰竭和肾移 植后的肾脏排斥 ； 和其它疾病， 包括间质性膀胱炎、 神经源性膀胱、 辐照膀胱和膀胱输尿管 反流或反流肾病。参见例如美国专利 No.5,733,739、 5,325,169 和 5,741,648。
按照本发明， 在一些实施方式中， 治疗包括给予需要治疗的对象有效量的尿祖细 胞， 例如未分化的、 分化的或其混合物， 从而改善或减轻对象疾病或病状的至少一种体征或 症状。
在组织移植的应用中， 在一些实施方式中， 细胞是与移植入组织的对象相同物种 的细胞。 在一些实施方式中， 细胞为自体的 ( 即来自待治疗的对象 )、 同基因的 ( 即， 遗传学 上相同的不同对象， 例如来自相同的双胞胎 )、 同种异体的 ( 即来自相同物种的非遗传相同 成员 ) 或异种的 ( 即来自不同物种的成员 )。 在一些实施方式中， 当本发明的细胞用于治疗对象时， 细胞被配制成药物组 合物， 所述组合物包含与药学上可接受的溶媒或载体混合的细胞。这样的制剂可通 过 本 领 域 熟 知 的 技 术 制 备。 参 见 例 如 美 国 专 利 申 请 2003/0180289 ； Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， Alfonso R.Gennaro， 编 辑， 第 20 版 Lippincott Williams&Wilkins ： Philadelphia， PA， 2000。 在制备根据本发明的药物制剂时， 细胞通常与 特别是可接受的载体混合。 当然载体必须是在可以与制剂中的其它任何成分兼容的意义上 可接受的， 且必须对病人无害。 载体可以是固体或液体或二者皆有 ( 例如， 水凝胶 )， 可与细 胞配制成单位剂量的制剂。在一个实施方式中， 以载体中的悬浮液的形式提供细胞以减少 细胞凝块。
在另一些实施方式中， 细胞配制成胶囊化形式 ( 例如封装在可通透营养物和氧气 的胶囊中以维持细胞在体内的活力 )。用于将细胞封装在通透性胶囊中的材料和方法是熟 知的， 在例如美国专利 No.6,783,964 中有描述。 例如， 细胞可封装在直径为 50 或 100μm 至 1 或 2mm 的微胶囊中， 微胶囊包含含有细胞的内部多糖树胶核心， 所述核心被半透膜包围 ； 微胶囊包含藻酸盐与聚赖氨酸、 聚鸟氨酸及其组合的组合。其它合适的封装材料包括但不 限于在美国专利 No.5,702,444 中描述的那些。
在具体实施方式中， 本发明的细胞与生物可降解支架或基质一起给予。 已经证明 ： 在富含胶原的支架上体外共培养之后， 膀胱细胞可形成特殊层状 (distinctive layers) 的 正常膀胱结构， 尿道上皮生长在平滑肌细胞上面 (Zhang 等人 (2000)J.Urol.164 ： 928)。另 外， 已经表明 ： 在部分膀胱造口术模型中， 接种了膀胱细胞的支架构建体参与了组织重塑的 再生过程 (Zhang 等人 (2005)BJU Int.96 ： 1120)。因此， 祖细胞的实施方式可应用于体外 工程化细胞支架构建体， 以用于后续的体内移植以完全再生膀胱。
生物可降解支架或基质是无毒或对生物学功能无损害且能够被宿主分解为其基 础成分的任何物质。理想地， 支架或基质是多孔结构以允许细胞沉积在基质上和基质的孔 内， 在某些实施方式中， 支架或基质是定形的。这样的制剂可以这样制备 ： 向生物可降解支
架提供至少一个细胞群体以将细胞群体接种在支架上和 / 或支架内。在一些实施方式中， 然后将接种的支架移植入受体对象的体内， 其中分离的、 层化组织的细胞群体促进新生器 官或组织结构的形成。
可以使用的生物可降解支架包括例如天然或合成的聚合物， 例如胶原 ( 例如 SIS 和 BSM) ； 聚 (α 酯 )， 例如聚乳酸 ； 聚羟基乙酸 ； 聚原酸酯和聚酸酐及它们的共聚物， 它们可 以受控速率通过水解被降解且再吸收。在美国专利 No.7,186,554 中提供了其它合适材料 的实例。
可使用如下方法将生物可降解支架 “定形” ， 例如， 溶剂浇铸、 压模、 拉丝、 网格化 (meshing)、 浸出 (leaching)、 织造 (weaving) 和包被。 在溶剂浇铸中， 将溶于合适溶剂 ( 例 如二氯甲烷 ) 中的一种或多种聚合物的溶液浇铸为分枝 (branching) 图案浮雕结构。溶剂 蒸发后， 获得薄膜。在压模时， 以最多 30,000 磅每平方英寸的压力将聚合物压入合适的模 样中。拉丝包括从熔化的聚合物中拉丝， 网格化包括通过将纤维压成毡状材料而形成网。 在浸出时， 将含有两种材料的溶液铺展 (spread) 成类似最后形式的形状。然后， 使用溶剂 熔解掉一种组分， 从而形成孔 ( 参见美国专利 No.5,514,378)。在成核时， 将重建性尿道上 皮移植物形状的薄膜暴露于能够产生放射损坏材料轨迹的放射性裂变产物。然后， 用酸或 碱蚀刻聚碳酸酯层， 将放射损坏材料轨迹变成孔。 最后， 可使用激光进行定形并且烧出通过 很多材料的单个孔以形成具有统一孔尺寸的重建性尿道上皮移植物。 这些定形技术可组合 使用。例如， 可以将生物可降解基质织造、 压模并且还粘合。此外， 可以将通过不同方法定 形的不同聚合物材料结合在一起以形成复合形状。复合形状可以是层状结构。例如， 可以 将聚合物基质与一种或多种聚合物基质结合以形成多层聚合物基质结构。 所述结合可通过 使用液态聚合物粘合或通过缝合而进行。另外， 聚合物基质可形成为固体块并通过激光或 其它标准机械加工技术定形成为其想要的最终形式。 激光定形是指使用激光除去材料的方 法。
可以在移植前 ( 在接种细胞前或后 ) 用添加剂或药物处理生物可降解支架以便 例如促进移植后新组织的形成。因此， 例如， 可将生长因子、 细胞因子、 细胞外基质组分和 / 或其它生物活性材料加入生物可降解支架中以促进移植物愈合和新组织的形成。通常， 这样的添加剂根据重建或扩大的组织或器官而选择， 以确保在移植的器官或组织中形成合 适的新组织。用于促进骨愈合的这样的添加剂的例子参见例如 Kirker-Head(1995)Vet. Surg.24(5) ： 408-19。
可根据标准方法将细胞接种到生物可降解支架上。例如， 已经报道了将细胞接 种到聚合物基底以用于组织修复 ( 参见， 例如授予 Atala 的美国专利 No.6,171,344， 引入 本文作为参考 ； Atala 等 人 (1992)J.Urol.148 ： 658-62 ； Atala 等 人 (1993)J.Urol.150 ： 608-12)。作为例子， 可将生长于培养物中的细胞胰蛋白酶化以分离细胞， 分离的细胞可接 种在生物可降解支架上。 或者， 从细胞培养获得的细胞可作为细胞层从培养板中提起， 可直 接将细胞层接种于生物可降解支架上而不预先分离细胞。
生物可降解支架上接种的细胞的密度可以变化。 例如， 在一些实施方式中， 较高的 细胞密度促进所接种的细胞形成更多的组织， 而较小的密度可允许由从宿主渗入移植物的 细胞形成相对较多的组织。还可依据生物可降解支架和细胞使用其它的接种技术。例如， 可通过真空过滤将细胞施于生物可降解支架。根据本文的教导， 选择细胞类型并将细胞接种在生物可降解支架上对于本领域普通技术人员来说将是常规的。
在其它实施方式中， 本发明的制剂包括用于肠胃外给药的那些 ( 例如皮下、 肌内、 真皮内、 静脉内、 动脉内、 腹膜内注射 ) 或移植。在一些实施方式中， 通过血管内给药， 可以 通过简单注射， 也可以通过置于合适的血管 ( 例如肾动脉 ) 中的导管注射。在另一个实施 方式中， 以如上讨论的待扩大器官或组织上的移植物的方式施用。
适用于肠胃外给药的本发明的制剂包括无菌液体， 优选细胞的水性注射组合物， 该制剂可以与意向接受者的血液是等渗。 这些制剂还可以包含抗氧化剂、 缓冲剂、 抑菌剂和 溶质， 这些物质使制剂与意向接受者的血液等渗。除了所给予的细胞外， 制剂是无菌的， 其 意义是它们不含微生物污染物， 例如细菌和病毒。 制剂可以是可灌注 (synringeable)、 可注 射形式 ； 可以是适合于手术移植入 ( 例如 ) 对象的膀胱、 尿道、 输尿管或肾脏的形式 ； 或其 它任何适于给予到对象中的形式。
根据一些实施方式， 给予对象的细胞可以是与待治疗对象同基因的 (syngeneic) ( 即同系的， 包括同基因的 (isogeneic) 和自体的 )， 同种异体的 ( 即同源的 ) 或异种的 ( 即 异源的 )， 这取决于其它的步骤例如是否存在封装或是否给予细胞免疫抑制治疗。
细胞的治疗有效剂量在对象之间有所不同， 这取决于例如年龄、 体重和对象的状 况以及递送途径等的因素。可根据本领域技术人员已知的程序来确定此剂量。通常， 在一 5 6 6 7 8 些实施方式中， 可以给予每个对象 1×10 、 1×10 或 5×10 直至 1×10 、 1×10 或 1×109 个 细胞的剂量， 单独一次一起给予或分开几次给予。 在其它实施方式中， 可以给予每千克对象 8 体重为 1-100×10 个细胞的剂量， 单独一次一起给予或分开几次给予。当然， 如果必要可 以提供后续的给药。
如果需要或必要， 还可根据已知的技术给予对象抑制所给予细胞的移植排斥的药 剂， 例如雷帕霉素、 咪唑硫嘌呤、 皮质类固醇、 环孢霉素和 / 或 FK506。参见例如美国专利 No.5,461,058 ； 5,403,833 ； 和 5,100,899 ； 另外参见美国专利 No.6,455,518 ； 6,346,243 ； 和 5,321,043。
此外， 本发明的细胞可在接种前用遗传材料进行转染 ( 例如， 用特定基因 )。可用 的遗传材料可以是例如能够减少或消除宿主内免疫反应的遗传序列。 例如， 可以抑制诸如 I 类和 II 类组织相容性抗原等细胞表面抗原的表达。这将使所移植的细胞被宿主排斥的几 率降低。
用于收集尿祖细胞的试剂盒
本文还提供了用于收集尿样品的试剂盒。优选地， 根据本发明的试剂盒用于在向 遥远地区 ( 例如合适的实验室设施 ) 运输时保存尿祖细胞的活力。在一些实施方式中， 试 剂盒包括含有合适培养基 ( 例如 1-15mL， 在一些实施方式中为 5mL 的血清例如胎牛血清 ) 的管。培养基可以是冷冻形式提供， 在使用前解冻。在其他实施方式中， 试剂盒包括含有抗 生素 ( 例如， 1-15mL， 在一些实施方式中为 5mL 的含有 1％青霉素和链霉素的溶液 ) 的管。 抗生素可以是粉末形式或水性溶液 ( 任选地以冻干形式提供， 在使用前解冻 )。
试剂盒还可包含合适的容器 ( 例如瓶子 )， 以用于收集尿样品 ( 例如， 三个无菌塑 料瓶， 其具有合适体积， 例如 100-1,000mL， 在一些实施方式中为 500mL)。试剂盒还可包含 醇药签。在一些实施方式中包括冷却装置例如冰袋、 冷却袋 (cold pack) 等， 以保持尿冷却 于约 4℃ ( 例如， 2 个尺寸为 3 英寸 ×2 英寸 ×0.5 英寸的冰袋 )。另外的实施方式包括能容纳以上所列组分的容器 ( 例如， 尺寸为 6 英寸高 ×6 英寸宽 ×7 英寸长的塑料盒 )， 任选 地， 还包括使用说明书。
本发明以以下非限定性实施例进行更详细的解释。
实施例 1 从尿中分离并鉴定祖细胞
从 22 个男性和 1 个女性供体 (15 个健康个体和 8 个病人， 年龄为 2 至 50 岁 ) 中 收集 58 份人尿样品。在任何培养物中均没有发现细菌污染。尿样品在 4℃于 1500RPM 离心 5 分钟， 用无菌 PBS 洗涤两次。使用梯度稀释方法， 将细胞以平均 0.5 细胞 / 孔置于含有祖 细胞培养基的多孔板中。祖细胞培养基含有 3/4DMEM、 1/4Ham′ s F12、 10％ FBS、 0.4mg/ml -10 氢化可的松、 10 M， Chron 毒素、 5mg/ml 胰岛素、 1.2mg/ml 腺嘌呤、 2.5mg/ml 铁传递蛋白加 0.136mg/ml 3， 39， 5- 三碘 -L- 甲腺原氨酸、 10mg/ml EGF， 、 和 1％青霉素 - 链霉素 (Zhang 等人， In vitro Cell Dev.Biol.-Animal 37 ： 419， 2001)。鉴定单个细胞并允许其生长至 50％以上的汇合度。然后将细胞次培养， 转移至 6cm 的培养皿并扩增。
从约 39％的源自尿样品的培养物获得原代细胞长出物。集落中的平均细胞数目 为： 在健康个体中在第二天为 4.5/100ml 尿 ( 表 1 和图 1)。细胞是小的、 看起来亮的细胞， 基于我们的长期观察经验， 其最像是来自于膀胱粘膜的底层， 是相对未分化的。 从每个克隆 系中得到了一致的高产率的尿细胞。 在含有祖细胞培养基和 KSFM(1 ∶ 1) 的复合培养基中， 尿细胞的细胞倍增时间为 31.3 小时。在 6-cm 培养皿中， 尿细胞从单个细胞到达到汇合需 要 10 至 12 天 ( 图 2)。
表1
为了证明尿细胞的分子和细胞特征， 分析了祖细胞特异性和分化细胞特异性标 记物的表达。第 1、 3 和 4 代的尿细胞对包括下列的祖细胞特异性表面标记物染色均为阳 性： C-kit、 SSEA-4、 CD105+、 CD73+、 CD90+、 CD133+ 和 CD44+ ； 对 于 CD31-、 CD34- 和 CD45- 染色均为阴性 ( 表 2 和图 3)。CD44 被认为是膀胱基底细胞的细胞表面标记物 (Desai 等人 (2000)Mod.Pathol.13 ： 1315)。由于基底细胞具有自我更新的潜能并且可以增殖并分化成中间和表面细胞， 所以基底细胞被称作尿道上皮祖细胞或干细胞 (Staack 等人 (2005) Differentiation 73 ： 121)。通过 CD44 和使用细胞角蛋白 13( 其为基底细胞和中间细胞的 细胞内蛋白标记物 ) 的免疫荧光确定了尿中的基底细胞 (Romih， 等人 (2005)Cell Tissue Res.320 ： 259)。
表2
CD 抗原 C-kit(CD117) SSEA-4 CD105 CD73 CD90 CD133 CD44 CD31 CD34 CD45
第 1 代 (％ ) 7 93 90 95 0 -第 3 代 (％ ) 2 72 86 62 83 2 67 0.5 0 1笫 4 代 (％ ) 0.5 75 71 41 89 10 40 0 0 0.5看起来在尿中具有混合的细胞群体 ： 有祖细胞也有成熟细胞。发现尿含有尿道上 皮祖细胞和平滑肌祖细胞。如上所示， 用 CD 标记物确认了这些细胞。另外， 使用了尿道上 皮祖细胞标记物和平滑肌细胞标记物以进一步鉴定这些细胞。在 70％的细胞汇合度时使 用抗尿道上皮祖细胞特异性标记物 uroplakin Ia 和细胞角蛋白 7、 13、 17 和 19 的单克隆抗 体， 每个抗体按照以下稀释使用 ： 抗 - 细胞角蛋白 7， 1 ∶ 200 ； 抗 - 细胞角蛋白 13， 1 ∶ 100 ； 抗 - 细胞角蛋白 17， 1 ∶ 100 ； 和抗 - 细胞角蛋白 19， 1 ∶ 100。 确定了尿祖细胞中 uroplakin 和所示细胞角蛋白的表达， 并将其与培养的从常规活检组织获得的尿道上皮 (Zhang 等人 (2003)Adv.Exp.Med.Biol.539 ： 907 ； Ludwikowski 等人 (1999)BJU Int.84 ： 507 ； Sugasi 等 人 (2000)J.Urol.164 ： 951 ； Zhang 等人 (2001)In VitroCell Dev.Biol.Anim.37 ： 419) 以 及正常人膀胱粘膜 (Southgate 等人， LabInvestigation(1994)71 ： 583) 中的标记物表达相 比较。免疫荧光程度定义为从阴性 (-) 到强阳性 (++++)。与从培养的组织活检获得的尿道 上皮相似， 尿细胞表达 uroplakin Ia 和细胞角蛋白 (CK)7、 13、 17 和 19( 图 3 和表 3)。
表3
此外， 如免疫荧光所确定 ( 图 4 和表 4)， 与原始膀胱细胞相比， 从尿获得的细胞表 达平滑肌细胞特异性标记物、 α- 平滑肌肌动蛋白 (ASMA)、 结蛋白、 肌球蛋白和调宁蛋白。
表4
实施例 3 ： 尿祖细胞的细胞收缩性和紧密连接
通过用胶原栅格测定细胞收缩性而确定了源自尿的平滑肌细胞的功能特征。 胶原 栅格收缩检验的方法在本领域是已知的 (Kropp 等人 (1999)J.Urol.162 ： 1779)。对激动剂 的收缩反应以相似的方式进行， 只是在栅格即将释放前向无血清培养基中加入激动剂。所 测试的激动剂包括 Ca- 离子载体 A23187(1025M) 和 KCl。
分析了源自尿的尿道上皮祖细胞的紧密连接。尿道上皮的屏障功能由顶膜斑和 细胞间紧密连接来维持。用常规方法例如电子显微镜研究了尿祖细胞内的紧密连接组分 (Zhang 等 人 (2003)Adv.Exp.Med.Biol.539 ： 907 ； Ludwikowski 等 人 (1999)BJU Int.84 ： 507 ； Sugasi 等 人 (2000)J.Urol.164 ： 951 ； Zhang 等 人 (2001)In Vitro Cell Dev.Biol. Anim.37 ： 419 ； Cross 等人 (2005)Am.J.Physiol.Renal Physiol.289 ： F459)。
实施例 4 ： 尿祖细胞分化为平滑肌细胞
为了确定上皮 - 间质 (stromal) 细胞相互作用或细胞 - 细胞相互作用对尿祖细 胞分化为平滑肌细胞的作用 (Staack 等人 (2005)Differentiation73 ： 121 ； DiSandro 等人
(1998)J.Urol.160 ： 1040)， 使用了两种共培养方法。 第一种是使用具有 4.5μm 尺寸排除的 跨孔 (transwell) 装置进行间接共培养。将尿平滑肌祖细胞置于上部小室的孔中， 将来自 组织活检的膀胱平滑肌细胞和 / 或尿道上皮接种在跨孔单元底部的孔中 (Luk 等人 (2005) J.Immunol.Methods 305 ： 39 ； Gerstenfeld 等人 (2003)Connect Tissue Res.44( 增刊 1) ： 85)。 第二种方法是直接的共培养方法， 用 0.4μm 孔尺寸的跨孔插入物进行。 跨孔用作基底 膜， 其中在下侧培养尿祖细胞， 而在相对的上侧培养正常人膀胱尿道上皮和平滑肌细胞 (Le Visage 等人 92004)Tissue Eng.10 ： 1426)。然后通过在接种细胞后 3、 7、 14 和 28 天后的表 型外观、 分子分析和针对平滑肌蛋白表达的免疫组化染色来评价尿细胞。
实施例 5 ： 接种尿祖细胞的支架
评价了膀胱粘膜下层膜 (BSM) 和小肠粘膜下层 (SIS) 上的尿祖细胞的细胞粘附、 增殖和分化， 以确定临床应用的细胞 - 基质相互作用。在体外接种细胞的构建体中， 在混合 培养基 (KSFM ∶ DMEM， 1 ∶ 1) 得存在下， 将源自尿祖细胞的尿道上皮接种在 BSM 粘膜一侧， 将源自尿祖细胞的平滑肌细胞接种在浆膜一侧。
接下来， 将接种的基质皮下移植到无胸腺小鼠内。取回移植的工程化组织并通 过组织化学 (H&E 和 Trichrom)、 免疫组化 ( 细胞角蛋白和平滑肌细胞特异性标记物 )、 western 印迹分析和人 X/Y 染色体检测检验 (FISH) 进行评价。对于组织化学和免疫组化 分析， 使用标准程序将工程化组织固定于 10％中性缓冲的福尔马林中， 脱水， 并包埋于石蜡 中。切取 5 毫米的部分并固定。进行常规的苏木精伊红 (H&E) 染色和 Masson 三重染色。使 用以下单克隆抗体进行免疫组化染色 ： 抗平滑肌细胞蛋白的单克隆抗体 ： α- 平滑肌肌动 蛋白 (1 ∶ 1000 稀释 )、 结蛋白 (1 ∶ 20)、 调宁蛋白 (1 ∶ 50) 和肌球蛋白 (1 ∶ 100) ； 以及抗 尿道上皮细胞特异性蛋白的单克隆抗体 ： 细胞角蛋白 AE 1/AE3(1 ∶ 100 抗体稀释 )(Zhang 等 人 (2005)BJU Int.96 ： 1120 ； Zhang 等 人 (2003)Adv.Exp.Med.Biol.539 ： 907 ； Zhang 等 人 (2000)J.Urol.164 ： 928 ； Zhang 等人 (2006)BJUInt.98 ： 1100 ； Zhang 等人 (2004)Tissue Eng.10 ： 181 ； Zhang 等人 (2001)In VitroCell Dev.Biol.Anim.37 ： 419)。
根 据 已 知 方 法 (Zhang 等 人 (2005)BJU Int.96 ： 1120 ； Lin 等 人 (2004) J.Urol.171 ： 1348) 用裂解缓冲液裂解细胞或接种细胞的支架组织而分离用于 western 印 迹分析的蛋白。小鼠抗 - 人 α- 平滑肌肌动蛋白、 结蛋白、 肌球蛋白和 AE 1/AE3 用作一抗， 过氧化物酶标记的山羊抗 - 小鼠 IgG 用作二抗。通过商售的加强化学发光检验试剂盒检测 蛋白条带的存在。
在移植后一个月用 LacZ 染色在移植物组织中观察尿祖细胞。还通过人 X/Y 染色 体确认了移植的细胞。有利地， 在体内支架中尿祖细胞形成多层尿道上皮细胞和平滑肌样 组织结构 ( 图 5)。此外， 移植后三个月未在移植物组织中发现肿瘤。
因此这些数据提供了体外和体内证据， 其证明从尿中获得的细胞可以作为膀胱组 织工程的来源。尿祖细胞是容易获得的， 并且已经表明它们在体外增殖并分化成尿道上皮 和平滑肌。源自尿祖细胞的膀胱细胞显示出尿道上皮和平滑肌样的表型， 包括分别表达尿 道上皮和平滑肌特异性蛋白。胶原基质支持尿祖细胞的三维生长， 这对于膀胱重建是基本 的需要。体内接种尿祖细胞的支架为膀胱重建提供了具有成本有效性的方法。
以上是本发明的示例， 不应被理解为其限制。 本发明通过以下权利要求限定， 其中 包括权利要求的等同物。