重组转铁蛋白突变体.pdf

重组转铁蛋白突变体
    【发明领域】

    本申请涉及重组转铁蛋白突变体和包含这些突变体，特别是避免N-连接的糖基化并保持野生型蛋白质生物活性的突变体序列的蛋白质。本申请还涉及编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的多核苷酸，和制备与使用所述重组蛋白的方法。

    【发明背景】

    本说明书中列出或讨论的在先公开文件不应视为是对所述文献属于现有技术的一部分或者是公知常识的承认。

    据估计，有超过370种新的生物技术药物在研制中。生产生物技术药物是复杂而耗时的过程。细胞必须在经过严格维持和调控的条件下在大型不锈钢发酵罐中生长。在有些情况下，细胞分泌蛋白质；在其它情况下，细胞必须裂解，使得可以提取和纯化蛋白质。一旦方法经过测试、设计和放大，就可以大批量生产生物技术药物。这可以通过在严格控制的条件下，在大不锈钢釜中培养经转化而包含目的基因或抗体的宿主细胞来实现。细胞保持存活，并通过精确的培养条件加以刺激，使其产生目标蛋白质，所述条件包括温度(其可通常变化不超过一摄氏度)、氧、酸度(即使pH水平变化很小，细胞也很容易死亡)、培养基组分和其它变量的平衡。在合适的培养基或血清中小心培养后(持续时间依赖于产生的蛋白质和生物体性质而变化)，从培养物分离蛋白质，在纯化的每个步骤严格测试，并配制成具有药物活性的产品。所有这些步骤严格遵照食品和药品监督管理局(FDA)的规定进行(http://www.bio.org/pmp/factsheetl.asp，″A Brief Primer on Manufacturing Therapeutic Proteins″)。

    有很多不同类型的细胞培养基可用于支持细胞生存，例如DMEM培养基(H.J.Morton，1970，In Vitro，6，89)、F12培养基(R.G.Ham，1965，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，53，288)和RPMI 1 640培养基(J.W.Goding，1980，J.Immunol.Methods，39，285；JAMA，1957，199，519)。然而，这些培养基(常称作“基础培养基”)经常严重缺乏大多数动物细胞所需的营养成分。通常，必须向基础培养基中添加血清来克服这些缺陷。通常以显著的浓度使用胎牛血清(FBS，由牛胎收获)、人血清、猪血清和马血清。

    尽管使用血清对于正确的细胞生长而言是理想的，也常是必需的，但是它有一些缺点。很难获得具有一致的生长特性的血清。此外，血清的生化复杂性能使目的蛋白质的下游加工复杂化，从而增加生产成本。在试图解决这个问题的尝试中，去除了血清而加入特定成分代替。

    这些组分之一是转铁蛋白。人血清转铁蛋白(HST)是正常人血浆中的主要铁结合蛋白质，并且以约2-4g/l存在(van Campenhout等，2003，Free Radic.Res.，37，1069-1077)。在生理上，它的功能是将铁从吸收和储存部位安全转运至利用部位，如发育中的红血细胞。它与铁的高度亲和性可降低胞外环境中铁催化的自由基反应的损害作用(von Bonsdorff等，2001，Biologicals，29，27-37)，并且随后的低游离铁浓度对于很多生物体都是抑菌的(von Bonsdorff等，2003，FEMS Immunol.Med.Microbiol.，37，45-51)；它还可具有更直接的抗菌作用(Ardehali等，2003，J.Biomed.Mater.Res.A，66，21-28)。

    HST是分子量约为80kDa的单体糖蛋白，能非常紧密地但可逆地结合两个铁离子。它包含两个球状叶(称作N-叶和C-叶)，每个由被深的裂缝分隔开两个亚域组成，其包含铁离子的结合位点和协同作用的碳酸根阴离子。在大多数细胞类型中，通过将载有铁的全转铁蛋白与特定的转铁蛋白受体(TfR)结合，然后通过Fe³⁺/HST/TfR复合物的胞吞作用而获得铁。铁在核内体的酸性条件中释放，之后HST/TfR复合物返回至细胞表面，由这里将不含铁的脱辅基转铁蛋白释放回循环中(MacGillivray等，1998，Biochemistry，37，7919-7928；Hirose，2000，Biosci.Biotechnol.Biochem.，64，1328-1336；Hemadi等，2004，Biochemistry，43，1736-1745)。

    HST在肝脏中作为698-残基蛋白质而产生。在分泌过程中去除19残基的前导序列以产生约80KDa的成熟糖蛋白，所述糖蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。成熟转铁蛋白的约75KDa多肽链包含19个二硫键，并具有预计的pI为6.64。N-叶和C-叶分别由残基1-331和338-679形成(Steinlein等，1995，Protein.Expr.Purif.，6，619-624)。C-叶在Asn413和Asn611包含两个N-连接的糖基化位点(如上所示，在SEQ ID NO：1中加下划线)。在由仓鼠幼鼠肾脏细胞(Gomme等l，2005，Drug Discov.Today，10，267-273)和酵母巴斯德毕赤酵母(Bewley等，1999，Biochemistry，38，2535-2541)重组表达而产生的N-叶转铁蛋白中也已经鉴定了丝氨酸32处的O-连接的糖基化位点。

    任何动物或哺乳动物转铁蛋白可以用于细胞培养基中，如HST或牛血清转铁蛋白(BST)。

    然而，人们越来越关注使用源自动物的组分如转铁蛋白时病原体可能污染细胞培养物的风险。在BST的情况中，存在认为导致疯牛病(BSE)的朊病毒是与通过血液分级产生BST特别相关的问题。对于HST，当通过血液分级产生HST时，存在可能受到肝炎和免疫缺陷病毒如HIV污染的风险。

    对于培养细胞而言，重组转铁蛋白培养基是标准的含血清培养基的优异替代品。它具有几个优点，包括更好的组成限定，并且非常重要的是，没有以源自动物的病原体污染的风险。

    由于日益关注来自人类和动物的血液传递的疾病，所以越来越关注如何找到不含源自动物的转铁蛋白和其它传统的源自动物的组分的培养基，所述培养基的培养能力可与传统的含血清培养基相比。在本领域持续需要这样的细胞培养基，其不包括与疾病转移相关的使用风险，但是可以以合适的浓度提供所有必需的营养物和生长因子，从而优化细胞的生长。

    近年来大多数努力致力于通过向基础培养基中补加合适的营养物而开发无血清培养基，从而避免加入血清，无需牺牲细胞存活度和/或细胞生长和/或蛋白质产生。这种组分的实例包括牛转铁蛋白和人转铁蛋白；牛白蛋白和人白蛋白；源自天然(动物)或重组来源的某些生长因子，包括表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)；脂类如脂肪酸、甾醇和磷脂；脂类衍生物和复合物如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；蛋白质和类固醇激素如胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、氢化可的松和孕酮；核苷酸前体；和某些痕量元素(由Waymouth，C.，于：Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology，Vol.1：Methods for Preparation of Media，Supplements，and Substrata for Serum-FreeAnimal Cell Culture，Barnes，D.W.等编，New York：Alan R.Liss，Inc.，pp.23-68(1984)，和Gospodarowicz，D.，Id.，在pp 69-86(1984)综述)。

    然而，本文中列出的大多数现有技术仍然描述的是包含源自动物的组分的培养基。

    Bowman和Yang(US 5,026,651，1991年授权)公开了编码HST的cDNA序列的分离。其中公开的序列通过提述并入本文。因此，将来在技术上可能构建HST编码载体并表达它们以产生重组HST。然而，如上述对于SEQ ID NO：1的讨论，HST的序列包括两个用于N-连接的糖基化的共有位点。Lau等(1983，J.Biol.Chem.，258，15225-15260)报导，寡糖转移酶催化糖链转移至蛋白质的序列-Asn-X-Thr/Ser-中包含的天冬酰胺残基，其中X是任何氨基酸。HST的序列包含两个这样的共有序列，分别以氨基酸N413和N611开始，两个序列都由可在N413和N611导致N-连接的糖基化的寡糖转移酶而识别。所选重组宿主细胞的性质对于HST产物的糖基化水平和类型有显著影响，并且能产生在人体中具有可能不理想的抗原作用的异源HST产物。换句话说，在非人细胞中重组产生的HST与源自血清的HST相比，可进行了显著不同的糖基化。

    发明概述

    在本发明的第一方面，提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中Ser415突变成不允许在Asn413发生糖基化的氨基酸。Ser415可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如，Ser415可以突变成保守氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸。优选丙氨酸。

    根据本发明的第一方面，包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含对Asn611的突变，使得其也突变成不允许在该位置糖基化的氨基酸。Asn611可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如，Asn611可以突变成保守氨基酸，或者可以突变成天冬氨酸或谷氨酰胺。

    根据本发明的第一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含对Val612的突变，使得其突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸。Val612可以突变成基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能的氨基酸。例如，Val612可以突变成脯氨酸、半胱氨酸或色氨酸。

    在本发明的第二方面，提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中Thr613突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸。Thr613可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。Thr613可以突变成保守氨基酸，如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。优选丙氨酸。

    根据本发明第二方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含对Asn413的突变，使得其也突变成不允许在该位置糖基化的氨基酸。Asn413可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。例如，Asn413可以突变成保守氨基酸，或者可以突变成天冬氨酸或谷氨酰胺。

    根据本发明第二方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含Lys414的突变，使得其也突变成不允许在Asn413糖基化的氨基酸。Lys414可以突变成基本上不降低突变体的生物功能的氨基酸。例如，Lys414可以突变成脯氨酸、半胱氨酸或色氨酸。

    在本发明的第三方面，提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中Ser415按照本发明的第一方面突变，并且其中Thr613按照本发明的第二方面突变。根据本发明第三方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白还可以包含在Asn413、Lys414、Asn611和/或Val612中任一个或者全部以上述针对本发明的第一和第二方面限定的形式的突变。

    本发明的第三方面的优选实施方案可以是下述蛋白质，其包含或组成为人转铁蛋白蛋白质的序列，所述蛋白质具有突变S415A、T613A。此蛋白质的示例性序列如SEQ ID NO：2中所示。

    两个-N-X-S/T-识别序列中S415A和T613A突变用于N-连接的糖基化。

    在本发明的第四方面，提供包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，其中除了在Ser415突变成不允许Asn413糖基化的氨基酸的突变和/或在Thr613突变成不允许Asn611糖基化的氨基酸的突变之外，引入至少一个另外的可减少蛋白质的O-连接的糖基化的突变。至少一个可减少O-连接的糖基化的突变的优选实例是在Ser32的突变，如S32A或S32C。

    在本发明的第五方面，提供多核苷酸，其包含编码转铁蛋白突变体序列的蛋白质的序列，所述转铁蛋白突变体如上述本发明的第一、第二、第三或第四方面中任一方面所限定。例如，根据本发明第五方面的多核苷酸可以编码蛋白质，所述蛋白质包含或组成为SEQ ID NO：2的序列。这种多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：3的序列。

    在SEQ ID NO：3中，人转铁蛋白cDNA(来自国家生物技术信息中心核苷酸序列NM 001063)的S415和T613密码子变成丙氨酸密码子GCT，其在酿酒酵母中是优选的(37％，http://www.yeastgenome.org/codon usage.shtml)。为此，将1243至1245位置的丝氨酸415的AGC密码子变成GCT，并且通过在位置1837将腺嘌呤突变成鸟嘌呤而将苏氨酸613的ACT密码子变成GCT。

    根据本发明第五方面的多核苷酸可以包含分泌前导序列。因此，编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的序列可以与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作连接。例如，编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的序列可以在其5’末端与编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’末端可操作地连接。

    在本发明的第六方面，提供包含根据本发明第五方面的多核苷酸的质粒。在一个实施方案中，质粒可以进一步包含编码蛋白质二硫化物异构酶的多核苷酸序列。质粒可以是2μm质粒。

    在本发明的第七方面，提供根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒用于转化宿主细胞并从而产生根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的用途。

    在本发明的第八方面，提供产生能表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述蛋白质包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的转铁蛋白突变体序列，方法包括提供根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒；提供宿主细胞；用多核苷酸或质粒转化宿主细胞；和选择已转化的宿主细胞。

    在本发明的第九方面，提供产生根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的方法，所述方法包括提供包含根据本发明第五或第六方面的多核苷酸或质粒的宿主细胞；和在允许表达包含转铁蛋白突变体的重组蛋白的条件下培养宿主细胞。方法可以进一步包括分离已表达重组蛋白的步骤。方法还可以进一步包括用载体或稀释剂配制分离的重组蛋白和任选的以单位剂量形式(unit dosage form)提供配制的蛋白质的步骤，或者将分离的重组蛋白冻干的步骤。

    由本发明的第七、第八或第九方面限定的宿主细胞可以是任何类型的宿主细胞。它可以是，例如，细菌或酵母(或其它真菌)宿主细胞。细菌宿主细胞可为对于克隆目的特别有用的。酵母宿主细胞可为对于表达质粒中存在的基因特别有用的。在一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，如酵母属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的成员，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、巴斯德毕赤酵母和膜蹼毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，或鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、发酵接合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)，或果蝇克鲁维酵母(Kluyveromyces drosphilarum)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，如黑曲霉、米曲霉、木霉属、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。

    在本发明的第十方面中，提供哺乳动物细胞培养基，其包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和选自下组的一个或多个组分：谷氨酰胺、胰岛素、胰岛素样生长因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸钠、蛋白胨和抗氧化剂。

    在本发明的第十一方面中，提供培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培育细胞，所述细胞培养基包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和选自下组的一个或多个组分：谷氨酰胺、胰岛素、胰岛素样生长因子、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸钠、蛋白胨和抗氧化剂。

    在本发明的第十二方面中，提供药物组合物，其包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和医药上可接受的载体。

    发明详述

    本发明涉及包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。通过“重组”，我们表示通过在宿主细胞中表达遗传修饰的(即非天然的)基因序列而产生的蛋白质。通常，本发明的重组蛋白通过下述产生：用编码转铁蛋白突变体的核酸构建体转化合适的宿主细胞，在适于表达的条件下培养转化的宿主细胞，和回收由所述细胞表达的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。

    转铁蛋白的变体形式由定点突变等标准技术产生，如下面的实例中报导的。

    本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白根据由SEQ ID NO：1限定的HTS序列中特定氨基酸(特别是，SEQ ID NO：1的Ser415，SEQ ID NO：1的Asn611，SEQ ID NO：1的Val612；SEQ ID NO：1的Thr613；SEQ ID NO：1的Asn413；SEQ ID NO：1的Lys414)的突变和/或防止糖基化而限定。然而，本发明基于对转铁蛋白的两个糖基化位点共有序列中丝氨酸和苏氨酸氨基酸的功能和作用的改进的理解，其应用不限于将特定的突变引入由SEQ ID NO：1限定的转铁蛋白的全部和确切的序列中。

    HTS有很多变体，如通过等电聚焦(IEF)所显示的(Constans等，1980，Hum.Genet.，55，111-114；Namekata等，1997，Hum.Genet.，100，457-458)。在神经氨酸苷酶处理和用铁饱和后，通过电泳已经检测到至少22种功能性变体。这些变体的初级氨基酸序列不同(第一决定因素)，其可以通过遗传表征而限定特定的氨基酸取代或缺失。其它变化在铁含量上有差异(第二决定因素)和N-连接的多糖链上有差异(第三决定因素(de Jong等，1990，Clin.Chim.Acta，190，1-46))。

    在欧洲人口中，超过95％的人口认定为具有TfC表型(de Jong等，1990，如前所述)。在1987年，宣布C-变体的总数为16。暂时将两个主要的变体总地命名为TfC₁和TfC₂，其中计算得出TfC₁最常见，以约0.74至0.82的频率发生(Kuhnl和Spielmann，1978，Hum.Genet.，43，91-95；Kuhnl和Spielmann，1979，Hum.Genet.，50，193-198；Weidinger等，1980，Z.Rechtsmed.，85，255-261)。在密码子570处的C/T碱基取代用TfC₂中的丝氨酸取代Tf℃₁中的脯氨酸。从爱斯基摩人到土著居民，已将C₁亚种鉴定为特别突出的转铁蛋白，其显示强的选择优势(de Jong等，1990，如前所述)。TfC₁表型是异源的，并且能根据限制片段长度多态性(RFLP)分析而分成两个亚类(Beckman等，1998，Hum.Genet.，102，141-144)。

    SEQ ID NO：1基于成熟的TfC₁蛋白质序列，并且(在SEQ ID NO：2中)我们已经提供了经修饰的序列，其中寡糖基转移酶识别序列中的丝氨酸415和苏氨酸613变成丙氨酸残基，以防止分别在Asn413和Asn611位点处的N-连接的糖基化。

    由于转铁蛋白的多变性，甚至在人类群体中也是如此，此外因为本发明基于对转铁蛋白的两个糖基化位点共有序列中丝氨酸和苏氨酸氨基酸的功能和作用的改进的理解，所述转铁蛋白的应用不限于SEQ ID NO：1所限定的转铁蛋白蛋白质的完整和确切序列，然后技术人员可以理解术语“转铁蛋白”用于本文可用于表示除SEQ ID NO：1限定的蛋白质之外的其它转铁蛋白蛋白质。例如，其它天然或非天然转铁蛋白序列也可以由术语“转铁蛋白”涵盖，其中它们包含与SEQ ID NO：1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸。

    与SEQ ID NO：1的Ser415和/或Thr613等同的氨基酸是存在于转铁蛋白蛋白质的N-连接的糖基化共有位点中(即在由寡糖转移酶识别的序列中)存在的丝氨酸或苏氨酸残基，通常具有N-X-S或N-X-T序列(以N-到C-方向)，其中X是任何氨基酸，如赖氨酸或缬氨酸，并且通常不是半胱氨酸、色氨酸或脯氨酸。然而，与Ser415和/或Thr613等同的氨基酸不需要处于与Ser415(即，从转铁蛋白蛋白质的N-末端开始415个氨基酸)或Thr613(即，从转铁蛋白蛋白质的N-末端开始613个氨基酸)相同的位置而成为等同的。例如，通过将SEQID NO：1序列和截短形式进行简单比对，技术人员将能容易地确定Ser415和Thr613的等同物在SEQ ID NO：1的N-末端截短形式中的位置。在本上下文中，等同物是功能性等同物，使得转铁蛋白分子中的氨基酸如果是转铁蛋白蛋白质的N-连接的糖基化位点中的第三个氨基酸(第一个是Asn)并且位于转铁蛋白蛋白质N-末端最接近的糖基化位点时，能称为与SEQ ID NO：1的Ser415等同。同样地，转铁蛋白分子中的氨基酸如果是转铁蛋白蛋白质的N-连接的糖基化位点中的第三个氨基酸(第一个是Asn)并且位于转铁蛋白蛋白质N-末端第二接近的糖基化位点时，能称为与SEQ ID NO：1的Thr613等同。

    SEQ ID No：1的Asn413、SEQ ID No：1的Lys414、SEQ ID No：1的Asn611，和SEQ ID No：1的Val612的等同物也可以使用相同的方法容易地确定。Asn413和Asn611的等同物将一直是Asn，并发现其分别距离Ser415和Thr613的等同物两个氨基酸(在N-末端方向)。Lys414的等同物可以是任何氨基酸，其任一侧翼为Asn413和Ser415的等同物。Val612的等同物可以是任何氨基酸，其任一侧翼为Asn611和Thr615的等同物。

    因此，根据本发明的转铁蛋白蛋白质可以在除本发明第一、第二和第三方面已经限定的那些修饰之外的位置，通过序列插入、缺失和取代而不同于SEQ ID No：1的序列。因此，转铁蛋白蛋白质可以是转铁蛋白家族的任何成员(Testa，Proteins of iron metabolism，CRC Press，2002；Harris和Aisen，Ironcarriers and iron proteins，Vol.5，Physical Bioinorganic Chemistry，VCH，1991)及其衍生物，如转铁蛋白、突变转铁蛋白(Mason等，1993，Biochemistry，32，5472；Mason et al，1998，Biochem.J.，330(1)，35)、截短的转铁蛋白、转铁蛋白叶(Mason等，1996，Protein Expr.Purif.，8，119；Mason等，1991，Protein Expr.Purif.，2，214)、乳铁蛋白、突变乳铁蛋白、截短的乳铁蛋白、乳铁蛋白叶或上述任一种与其它肽、多肽或蛋白质的融合体(Shin等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2820；Ali等，1999，J.BiolChem.，274，24066；Mason等，2002，Biochemistry，41，9448)，只要转铁蛋白蛋白质包含SEQ ID No：1的氨基酸Asn413、Lys414、Ser415、Asn611、Val612和Thr613的等同物。

    本发明的转铁蛋白突变体可以任选地与其它蛋白质融合，特别是生物活性蛋白质，如下所述。融合可以在N-或C-末端或包含插入。技术人员还应理解，开放阅读框可以编码包含任何序列的蛋白质，所述蛋白质可以为天然蛋白质(包括酶原)，或天然蛋白质的变体或片段(其可以是，例如域)；或全部合成的蛋白质；或不同蛋白质(天然或合成)的单或多融合体。转铁蛋白融合体的实例在美国专利申请如US2003-026778、US2003-0221201和US 2003-0226155，和Shin等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA.92m 2820，Ali等(1999)J Biol Chem274，24066，Mason等2002，Biochemistry 41，9448中公开，所述文献的内容通过提述并入本文。

    本发明的转铁蛋白突变体可以任选地使用本领域已知的方法，并入纳米体中，如WO 2008/007146中所述。

    转铁蛋白可以是或者可以不是人转铁蛋白。术语“人转铁蛋白”在本文中用来表示与源自人的转铁蛋白没有区别或为其变体或片段的材料。“变体”包括插入、缺失和取代，或者保守或者非保守。

    本发明包括转铁蛋白的突变体。这些突变体可具有或者可不具有改变的免疫原性。转铁蛋白突变体可以或者可以不改变其与金属离子和/或其它蛋白质(如转铁蛋白受体)的天然结合。

    我们还包括人转铁蛋白或人转铁蛋白类似物的天然存在的多态变体。

    在一个实施方案中，转铁蛋白蛋白质，如本发明的第一、第二或第三方面所限定的，将具有与SEQ ID No：1的序列有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。序列同一性可以使用本领域公知的方法计算，如根据WO 2006/136831中所述的方法进行。

    通常地，人转铁蛋白的变体或片段将具有包含SEQ ID No：1序列的蛋白质的配体结合能力的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％(优选至少80％、90％或95％)，所述比例为重量比例(weight for weight)。转铁蛋白或测试样品的铁结合能力可以如下所述确定。

    包含本发明的转铁蛋白突变体序列的蛋白质包含对至少Ser415(或其等同物)的突变，使其被不允许在Asn413糖基化的氨基酸(或其等同物)取代，和/或对Thr613(或其等同物)的突变，使其被不允许在Asn611糖基化的氨基酸(或其等同物)取代。用“不允许糖基化”，我们包括如下意义：当编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因依照本申请实施例中给出的规程在酿酒酵母宿主菌株中表达时，在与突变的氨基酸相同的糖基化位点中的Asn氨基酸(即，在Ser415突变情况中的Asn413，和在Thr613突变情况中的Asn611)未进行可检出的N-连接的糖基化，并且其中选择的酿酒酵母宿主菌株能在由SEQ ID No：1的序列组成的蛋白质的Asn413和Asn611进行N-连接的糖基化。

    蛋白质可包含本发明的转铁蛋白突变体序列，其中除了Ser415突变成不允许在Asn413糖基化的氨基酸和/或Thr613突变成不允许在Asn611糖基化的氨基酸之外，引入至少一个降低蛋白质的O-连接的糖基化的其它突变。用“降低O-连接的糖基化”，我们包括下述意义：在天然转铁蛋白分子中与O-糖基化相关联的氨基酸突变成不能糖基化的氨基酸，或者突变成导致O-连接的糖基化程度低于在天然转铁蛋白分子中所观察到的程度的氨基酸。这种突变的优选位置是SEQ ID NO：1中的位置32，更优选S32A或S32C。

    在一个实施方案中，为了防止突变体的糖基化，对本发明的转铁蛋白突变体序列进行的突变基本上不降低转铁蛋白突变体的生物功能。这是在与“对照”蛋白质比较中评估的，所述对照蛋白质具有与所述包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白相同的序列，除了对下述任一个的突变：SEQ ID NO：1的Ser32；SEQ ID No：1的Ser415；SEQ ID No：1的Asn611；SEQ ID No：1的Val612；SEQ ID No：1的Thr613；SEQ ID No：1的Asn413；SEQ ID No：1的Lys414(或它们的等同物)以防止糖基化，任选地，其中所述重组蛋白和其对照在相同的表达系统中表达，并使用相同的方法分离。

    突变体的生物功能，与对照相比，指下述功能中的至少一种或多种：铁结合能力，受体结合能力，铁摄入能力，和细胞培养性能。

    铁结合能力指包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白可逆结合铁的能力。因此，在一个实施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的铁结合能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地，不超过对照转铁蛋白的铁结合能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可以用分光光度计，通过蛋白质在其无铁和全铁负荷状态的470nm∶280nm吸光度比例来确定铁结合能力。除非特别说明，试剂应不含铁。能通过针对0.1M柠檬酸(盐)，0.1M乙酸(盐)，10mM EDTApH 4.5透析而从转铁蛋白或测试样品去除铁。蛋白质在100mM HEPES、10mM NaHCO₃pH8.0中应该为约20mg/mL。测定在水中稀释的脱辅基转铁蛋白(即不含铁的对照转铁蛋白)(Calbiochem，CN Biosciences，Nottingham，UK)的470nm∶280nm吸光度比例，使280nm处吸光度能用分光光度计准确地确定(0％铁结合)。通过将191mg氨基三乙酸(nitrotriacetic acid)溶解于2mL 1M NaOH中，然后加入2mL 0.5M氯化铁而制备20mM氨基三乙酸铁(FeNTA)溶液。用去离子水稀释至50mL。通过加入足够过量的新鲜制备的20mM FeNTA而完全用铁加载脱辅基(对照)转铁蛋白(100％铁结合的)，然后针对100mM HEPES、10mM NaHCO₃pH8.0完全透析全转铁蛋白制备物以去除剩余的FeNTA，然后测量470nm∶280nm的吸光度比例。使用测试样品(即所述包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白)重复所述步骤，所述样品开始应不含铁，并将最终比例与对照相比。

    在另一个实施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的受体结合能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地，不超过对照转铁蛋白的受体结合能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体的糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可通过用于研究生物分子实时相互作用的基于无标记表面等离子体共振(SPR)的技术，或者通过放射标记的铁摄入试验确定受体结合能力(见下文)。

    铁摄入能力指包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的下述能力：结合铁，并结合转铁蛋白受体，然后通过受体介导的胞吞作用由细胞内化，从而将铁传递入细胞内。因此，在另一个实施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的铁摄入能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地，不超过对照转铁蛋白的铁摄入能力的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列进行以防止突变体糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可以使用人红白血病(erythroleukemic)K562细胞，通过在⁵⁵Fe摄入试验中放射标记的转铁蛋白的受体介导的传递而确定铁摄入能力。这种红白血病细胞系是通过这种途径进行的转铁蛋白的受体介导的胞吞和铁供给的模型开发中的标准(Klausner等，1983，J.Biol.Chem.，258，4715-4724；Bates&Schlabach，1973，J.Biol.Chem.，248，3228-3232)。或者，转铁蛋白样品可以在竞争试验中互相比较，例如，通过血浆转铁蛋白对照，比较两个未标记的重组转铁蛋白的抑制放射性标记铁摄入的能力。

    对于从标记的二铁转铁蛋白的铁-55摄入，用包含HEPES缓冲液和1mg/ml牛血清白蛋白的无血清培养基洗涤在标准条件下(碳酸氢盐缓冲液，5％CO₂，抗生素，10％胎牛血清)于RPMI细胞培养基中培养的K562红白血病细胞，并且在次培养基中以1000万细胞/ml的浓度使用。测试的样品应该以与脱辅基转铁蛋白相等的摩尔浓度制备。可以使用氨基三乙酸铁作为铁源，根据标准过程用铁加载转铁蛋白。更高浓度的对照蛋白质或各个用⁵⁵Fe标记的测试蛋白质样品(0、25、100、200、400、800、1600nM)，应该与25μl培养基混合，并通过加入300μl细胞悬浮液而开始反应。应该在过量百倍的未标记铁转铁蛋白存在的情况下进行第二个系列的平行实验用于考察(accountfor)非特异性结合。在37℃25分钟后，通过浸入冰浴而停止反应，将60μl细胞悬浮液的三个等分试样转移至新试管中并在低温离心细胞，并在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层之后再次在低温离心细胞。应去除上清，将细胞沉淀转移至计数瓶中并用0.5M KOH+1％Triton X-100裂解。裂解液应在过夜裂解后用1M HCl中和，并与Readysolv闪烁混合物(cocktail)混合，并在Packard Liquid Scintillation Counter中计数。结果可以用fmol⁵⁵Fe/百万细胞表示，并且可用于计算转铁蛋白受体的解离常数(K_d)。

    对于竞争实验，可将更高浓度的对照二铁蛋白质和测试二铁蛋白质样品(0、25、100、200、400、800、1600nM)与25μl培养基中的用⁵⁵Fe标记的100nM天然二铁血浆转铁蛋白混合。并通过加入300μl细胞悬浮液而开始反应。在37℃25分钟后，通过浸入冰浴而停止反应，将60μl细胞悬浮液的三个等分试样转移至新试管中并在低温离心细胞，并在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层之后再次在低温离心细胞。去除上清，将细胞沉淀转移至计数瓶中并用0.5M KOH+1％Triton X-100裂解。裂解液在过夜裂解后用1M HCl中和，与Readysolv闪烁混合物混合，并在Packard LiquidScintillation Counter中计数。

    在另一个实施方案中，如果突变体具有对照转铁蛋白的细胞培养性能的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％(和，任选地，不超过对照转铁蛋白的细胞培养性能的150％、140％、130％、120％、110％、105％、104％、103％、102％、101％或基本上100％)，认为对本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白中的转铁蛋白序列所进行以防止突变体的糖基化的突变基本上不降低突变体的生物功能。可以通过Keenan等，2006，Cytotechnology，51，29-37所述的方法确定细胞培养性能，所述方法通过提述并入本文。

    如本文所使用的，术语“保守的”氨基酸取代指在相同组中进行的取代，其通常基本不影响蛋白质功能。在一个实施方案中，可以使用下图确定保守的氨基酸取代-

    

    在另一个实施方案中，“保守的”氨基酸取代指在相同组中进行的取代，如在碱性氨基酸组(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)中进行的取代。

    因此，例如，Ser415的保守取代包括甘氨酸或丙氨酸。Thr613的保守取代包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸。Asn413和/或Asn611的保守取代包括谷氨酰胺和天冬氨酸。

    非保守取代包括一组中的氨基酸由另一组中的氨基酸取代。例如，非保守取代包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。

    可以产生多核苷酸(如DNA或RNA分子)，其包含编码蛋白质的序列，所述蛋白质包含如上由本发明第一、第二或第三方面中任一方面所限定的转铁蛋白突变体的序列。其可以是编码蛋白质的基因，所述蛋白质包含重组转铁蛋白突变体的序列。

    编码包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的基因，其包含编码包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的多核苷酸序列(通常根据任何给出的生物体的标准密码子选择)，指定开放阅读框(“ORF”)。基因可以额外地包含一些不编码开放阅读框的多核苷酸序列(称为“非编码区”)。

    基因中的非编码区可以包含一个或多个调节序列，其与ORF可操作地连接，允许开放阅读框的转录和/或得到的转录本的翻译。

    术语“调节序列”指调节(即，促进或减少)与其可操作连接的ORF的表达(即，转录和/或翻译)的序列。调节区通常包括启动子、终止子、核糖体结合位点等。技术人员应理解的是，调节区的选择依赖于意欲表达的系统。例如，启动子可为组成型或诱导型的，并且可为细胞或组织类型特异性或非特异性的。

    合适的调节区，可以长为5bp、10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、220bp、240bp、260bp、280bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp或更长。

    本领域的技术人员承认，编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因还可以包含非编码区和/或调节区。这些非编码区和调节区不限于通常与分子伴侣ORF相关的天然非编码区和/或调节区。

    当表达系统(即宿主细胞)是酵母如酿酒酵母时，对于酿酒酵母合适的启动子包括与PGK1基因，GAL1或GAL10基因，TEF1，TEF2，PYK1，PMA1，CYC1，PHO5，TRP1，ADH1，ADH2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶的基因，α-交配因子信息素，a-交配因子信息素相关的那些启动子，PRB1启动子，PRA1启动子，GPD1启动子，和涉及5’调节区部分与其它启动子的5’调节区部分或与上游活化位点形成的杂合体的杂合启动子(例如EP-A-258067的启动子)。

    合适的转录终止信号在本领域中公知。当宿主细胞是真核生物时，转录终止信号优选源自真核基因的3’侧翼序列，其包含转录终止和聚腺苷化的正确信号。合适的3’侧翼序列可以，例如，是与使用的表达调控序列天然连接的基因的那些，即可以对应于启动子。或者，它们可以不同。在这种情况下，并且当宿主是酵母，优选酿酒酵母时，则优选酿酒酵母ADH1、ADH2、CYC1或PGK1基因的终止信号。

    对于启动子和编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的基因的开放阅读框来说，有益的是侧翼为转录终止序列，使得转录终止序列位于启动子和开放阅读框的上游和下游，以防止转录通读入任何相邻基因如2μm基因中，反之亦然。

    在一个实施方案中，酵母如酿酒酵母中有利的调节序列包括：酵母启动子(例如酿酒酵母PRB1启动子)，如EP 431880中所教导的；和转录终止子，优选来自酵母属ADH1的终止子，如EP 60057中所教导的。

    对于非编码区有益的是，并入多于一个编码转录终止密码子如UAA、UAG或UGA的DNA序列以将翻译通读降至最少，从而避免产生延长的非天然融合蛋白质。优选翻译终止密码子UAA。

    术语“可操作地连接”包括这样的意义：调节序列定位于基因中任何非编码区中，使得其与ORF形成关系以允许调节区以期望的方式作用于ORF上。因此调节区“可操作地连接”于以这种方式定位的ORF，使得调节区能在与调节序列相容的条件下，以期望的方式影响ORF的转录和/或翻译。

    在一个优选的实施方案中，包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白是分泌的。在这种情况下，编码分泌前导序列的序列可以包括在开放阅读框中。因此，根据本发明第四方面的多核苷酸可包含编码重组蛋白的序列，所述重组蛋白包含与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作连接的转铁蛋白突变体序列。前导序列通常，尽管并不必需，位于ORF的初级翻译产物的N末端，并且通常，尽管并不必需，在分泌过程中从蛋白质切掉，以产生“成熟”蛋白质。因此，在一个实施方案中，在前导序列的上下文中的术语“可操作地连接”包括这样的意义：编码包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的序列在其5’端并以符合读框的方式(in frame)连接至编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’端。或者，编码分泌前导序列的多核苷酸序列可以符合读框的方式位于包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的编码序列中，或者位于包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的编码序列的3’端。

    很多天然或人工多肽前导序列(也称作分泌前区域和前区域/区域原)已用于开发用于分泌来自宿主细胞的蛋白质。前导序列指导初生蛋白质朝向将蛋白质从细胞输出至周围培养基或在有些情况下输出至周质空间中的细胞机器。

    为了在真核菌种如酵母酿酒酵母、接合酵母菌种、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中产生蛋白质，已知的前导序列包括来自酿酒酵母酸性磷酸酶蛋白质(Pho5p)(参见EP 3664o0)、转化酶蛋白质(Suc2p)(参见Smith等(1985)Science，229，1219-1224)和热冲击蛋白-150(Hsp150p)(参见WO 95/33833)的那些。此外，已经使用了来自酿酒酵母交配因子α-1蛋白质(MFα-1)和来自人溶菌酶和人血清白蛋白(HAS)蛋白质的前导序列，后者已经特别地用于(尽管不是专用于)分泌人白蛋白。WO 90/01063公开了MFα-1和HAS前导序列的融合体。此外，天然转铁蛋白前导序列可以或者可以不用于指导包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的分泌。

    根据本发明的第六方面，可将根据本发明第五方面的多核苷酸整合入质粒。技术人员应理解的是，可以使用任何合适的质粒，如着丝粒质粒。其它合适的质粒包括酵母相容的基于2μm的质粒。WO 2005/061718提供了对于合适质粒的完整描述，其内容通过提述并入本文。此外，也如WO 2005/061718中所公开的，质粒可以包含编码分子伴侣的基因，如蛋白质二硫化物异构酶(PDI)，用于与包含转铁蛋白突变体序列的蛋白质的质粒编码基因共表达。

    根据本发明第五和第六方面的多核苷酸或质粒可用于转化宿主细胞。宿主细胞可以是任何类型的细胞。宿主细胞可以是或者可以不是动物(如哺乳动物、鸟类、昆虫等)、植物、真菌或细菌细胞。细菌和真菌如酵母宿主细胞可以是或者可以不是优选的。

    在一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，如酵母属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的成员，如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母和膜蹼毕赤酵母，或鲁氏接合酵母，拜耳接合酵母，发酵接合酵母，多形汉逊酵母(也称作安格斯毕赤酵母)或果蝇克鲁维酵母是优选的。

    在另一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，如黑曲霉、米曲霉、木霉属、镶片镰孢、安格斯毕赤酵母或多形汉逊酵母。

    可为特别有利的是使用在一种或多种涉及蛋白质O-糖基化的蛋白质甘露糖基转移酶中有缺陷(例如通过破坏基因编码序列得到)的宿主细胞如酵母宿主细胞。WO 94/04687公开了在一种或多种PMT基因中有缺陷的酵母菌株，并且在WO 2005/061718中进一步进行了讨论，文献内容通过提述并入本文。或者，能在存在抑制PMT基因之一的活性的化合物存在的情况下培养酵母(Duffy等，“Inhibition of protein mannosyltransferase 1(PMT1)activity in the pathogenic yeastCandida albicans”，Intemational Conference on Molecular Mechanisms of Fungal CellWall Biogenesis，26-31August 2001，Monte Verita，Switzerland，海报摘要(PosterAbstract)P38；海报摘要可以在http://www.micro.biol.ethz.ch/cellwall/浏览)。

    在一个实施方案中，宿主细胞可以过表达分子伴侣，如PDI或另一种分子伴侣，如WO 2005/061718、WO 2006/067511或WO 2006/136831中讨论的，每篇文献的内容通过提述并入本文。例如，除了分子伴侣的内源拷贝之外，宿主细胞可以包含分子伴侣(例如PDI)基因的一个或多个额外的染色体拷贝，或者可(例如)经过遗传修饰，以引起内源分子伴侣(例如PDI)基因过表达。

    转化动物细胞的合适方法在本领域中公知，并且包括，例如使用逆转录病毒载体(如慢病毒载体)。Wolkowicz等，2004，Methods Mol.Biol.，246，391-411描述了慢病毒载体将重组核酸序列传递至哺乳动物细胞用于细胞培养技术中的用途。Fassler，2004，EMBORep.，5(1)，28-9综述了慢病毒转基因载体及其在转基因系统产生中的用途。关于脊椎动物细胞，用于转染这些细胞的试剂，例如磷酸钙和DEAE-右旋糖酐或脂质体配制物，可由StratageneCloning Systems或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877，USA得到。

    对于原核宿主细胞的转化，参见，例如，Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110和Sambrook等(2001)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY。

    在Sherman等(1986)Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY中描述了酵母细胞的转化。也可以用Beggs(1978)Nature275，104-109的方法。用于转化酿酒酵母的方法通常在EP 251744、EP 258067和WO 90/01063中教导，全部文献通过提述并入本文。

    电穿孔也可以用于转化细胞，并且在本领域中公知可用于转化真菌(包括酵母)细胞、植物细胞、细菌细胞和动物(包括脊椎动物)细胞。用于通过电穿孔转化酵母的方法公开于Becker&Guarente(1990)Methods Enzymol.194，182中。

    如上所述的多核苷酸或质粒，可以通过上述标准技术导入宿主。通常，多核苷酸或质粒不会转化所有宿主，并且因此需要选择已转化的宿主细胞。因此，多核苷酸或质粒可以包含选择性标记，包括但不限于细菌选择性标记和/或酵母选择性标记。通常的细菌选择性标记是β-内酰胺酶基因，尽管本领域中已知很多其它标记。通常的酵母选择性标记包括LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1和PGK1。

    一种选择技术涉及将DNA序列标记(及任何必要的调控元件)并入多核苷酸或质粒中，所述标记在转化细胞中编码可选择的性状。这些标记包括针对真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶、G418、新霉素或博莱霉素(zeocin)抗性，和针对培养大肠杆菌和其它细菌的四环素、卡那霉素、氨苄青霉素(即β-内酰胺酶)或博莱霉素抗性基因。博莱霉素抗性载体可由Invitrogen得到。或者，这些可选择性状的基因可以在另一个载体上，该载体用于共转化期望的宿主细胞。

    另一种鉴定成功转化细胞的方法涉及培养由于导入多核苷酸或质粒而得到的细胞，任选地允许表达重组多肽(即由质粒上的多核苷酸序列编码的多肽，并且对于宿主细胞是异源的，意味着该多肽不是由宿主天然产生的)。重组多肽可以是或者可以不是本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。可以收获并裂解细胞，并使用如Southern(1975)J. Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3，208所述的方法或本领域常用的其它DNA和RNA分析方法，检查其中DNA或RNA内容物中是否存在重组序列。或者，可以使用抗体检测转化细胞培养物的上清液中多肽的存在。

    除了直接测定是否存在重组DNA之外，当重组DNA能指导蛋白质的表达时，可以通过公知的免疫方法确认转化是否成功。例如，用表达载体成功转化的细胞产生表现出合适抗原性的蛋白质。收获怀疑被转化的细胞样品，并使用合适的抗体测定蛋白质。

    在选择转化的宿主细胞后，可以在允许表达所述包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的条件下培养所述细胞。考虑到本文中公开的教导，适当的条件是本领域技术人员已知的。培养基可以是非选择性的或将选择压力施加于维持本发明的第四或第五方面的多肽或质粒的宿主细胞。

    因此产生的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白可以存在于细胞内，或者，如果分泌，则存在于培养基和/或宿主细胞的周质空间。因此可以适当地进行另外的从已培养宿主细胞、重组生物体或培养基分离表达的重组蛋白的步骤。

    “从已培养宿主细胞、重组生物体或培养基分离表达的重组蛋白”的步骤任选地包含细胞固定化、细胞分离和/或细胞裂解，但是总是包含至少一个不同于细胞固定化、分离和/或裂解步骤的其它纯化步骤。

    细胞固定化技术，如使用海藻酸钙珠装入(encase)细胞，在本领域中公知。相似地，细胞分离技术，如离心、过滤(例如错流过滤、膨胀床色谱等)在本领域中公知。相似地，细胞裂解的方法，包括珠磨、超声处理、酶处理等，在本领域中公知。

    可使用本领域已知的技术回收表达的重组蛋白。在一个实施方案中，包含转铁蛋白突变体序列的已表达重组蛋白由宿主分泌，通过离心和收集上清而从细胞培养基回收，以得到部分纯化的重组蛋白。

    可以通过一个或多个本领域已知的蛋白质纯化步骤，从上清进一步纯化部分纯化的重组蛋白。用于纯化转铁蛋白的方法在例如US 5,986,067、US6,251,860、US 5,744,586和US 5,041,537中公开。尽管这些文献中一些涉及从血浆而不是从重组宿主细胞纯化转铁蛋白，但是可以应用其中使用的一些步骤。此外，可以使用已发现可用于纯化蛋白质的任何已知的技术。合适的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸或溶剂提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析，凝集素层析，浓缩，稀释，pH调整，渗滤(diafiltration)，超滤，高效液相色谱(“HPLC”)，反相HPLC，电导率调整等。例如，在一个实施方案中，可以使用一个或多个离子交换步骤。例如，可以使用阳离子交换步骤，所述步骤相对于包含转铁蛋白突变体的重组蛋白以主动或被动模式进行，任选地之后进行(有或没有中间的纯化步骤)阴离子交换步骤，所述步骤相对于包含转铁蛋白突变体的重组蛋白以主动或被动模式进行，或者反之亦然。

    因此可以以无铁(即“脱辅基”)形式，提供包含转铁蛋白突变体序列的由此分离的重组蛋白，作为包含脱辅基转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，或者可以使用本领域已知的技术进行全铁化(即用Fe³⁺离子饱和)，以产生包含全-转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。最后产生的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白的制备物可以部分或全部全铁化。例如，它可具有少于99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或基本上0％的铁结合能力。可以通过，例如EP 1094835B1的方法确定铁结合能力(参见49-51段，所述内容通过提述并入本文)。

    可以进一步操作包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白，以改变其浓度或环境，例如使用本领域已知的技术如超滤和渗滤。在一个实施方案中，可以以约10^-4g.L^-1、10^-3g.L^-1、0.01g.L^-1、0.02g.L^-1、0.03g.L^-1、0.04g.L^-1、0.05g.L^-1、0.06g.L^-1、0.07g.L^-1、0.08g.L^-1、0.09g.L^-1、0.1g.L^-1、0.2g.L^-1、0.3g.L^-1、0.4g.L^-1、0.5g.L^-1、0.6g.L^-1、0.7g.L^-1、0.8g.L^-1、0.9g.L^-1、1g.L^-1、2g.L^-1、3g.L^-1、4g.L^-1、5g.L^-1、6g.L^-1、7g.L^-1、8g.L^-1、9g.L^-1、10g.L^-1、15g.L^-1、20g.L^-1、25g.L^-1、30g.L^-1、40g.L^-1、50g.L^-1、60g.L^-1、70g.L^-1、70g.L^-1、90g.L^-1、100g.L^-1、150g.L^-1、200g.L^-1、250g.L^-1、300g.L^-1、350g.L^-1、400g.L^-1、500g.L^-1、600g.L^-1、700g.L^-1、800g.L^-1、900g.L^-1、1000g.L^-1或更高的浓度提供包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白。1-100g.L^-1，如10-50g.L^-1、15-25g.L^-1或18-22g.L^-1，例如约20g.L^-1的浓度可为优选的。

    包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白还可以使用本领域已知的技术灭菌，如0.22μm过滤。

    通过相对粗糙的纯化方法可以获得商业或工业可接受的纯度水平，通过所述方法，将包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白制成适用于其期望目的的形式。已纯化至商业或工业可接受的纯度水平的蛋白质制备物，除了包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白之外，还可包含例如细胞培养组分如宿主细胞或由其得到的碎片。或者，高分子量组分(如宿主细胞或由其得到的碎片)可以或者可以不去除(如通过过滤或离心进行)而获得包含重组蛋白的组合物，所述蛋白质包含转铁蛋白突变体序列和，任选的功能上可接受水平的源自细胞培养过程的低分子量污染物。

    包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白可以纯化或者可以不纯化而实现医药上可接受的纯度水平。如果蛋白质基本上不含致热源(pyrogen)并且能以医药有效量施用而不会引起与蛋白质活性无关的医学效果，则所述蛋白质具有在医药上可接受的纯度水平。

    得到的包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白可以用于其已知的任何用途，包括对患者静脉注射以治疗各种病症，和补充培养基，和作为其它蛋白质的配制物中的赋形剂。

    本发明的分离的重组蛋白可以使用本领域公知的方法配制成医药组合物，并施用用于治疗已知可由转铁蛋白(如血浆转铁蛋白)治疗的适应症。可以在美国专利申请10/405,612中找到作为转铁蛋白已知的临床用途的实例。

    本发明的分离的重组蛋白还可用于具有转铁蛋白的已知用途的应用，如普通医疗用途、涂层和生物材料。其中可使用本发明蛋白质的生物材料的实例在Ghosh等(2008)Angew.Chem.Int.Ed 47，2217-2221中提及。

    本发明的方法可以或者可以不进一步包括用载体或稀释剂配制包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白和任选的以单位剂量形式提供由此配制的蛋白质的步骤。

    尽管由本发明过程获得的、包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白可能单独施用，但是优选将其连同一种或多种可接受的载体或稀释剂作为医药配制物提供。载体或稀释剂必须是“可接受的”，表示与期望的蛋白质相容，并且对于其接受者无害。通常，载体或稀释剂是水或盐水，其是无菌的并且不含致热源。

    任选地，由此配制的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白以单位制剂形式，如以片剂、胶囊、注射溶液等形式提供。

    或者，本发明的方法可以或者可以不进一步包括将由此获得的包含转铁蛋白突变体序列的分离的重组蛋白冻干的步骤。

    如上所讨论的，本发明的第十方面提供哺乳动物细胞培养基，所述培养基包含根据本发明第一、第二、第三或第四方面的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白和一个或多个选自下组的组分：谷氨酰胺、胰岛素、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、氨基酸、亚硒酸钠、蛋白胨、胰岛素样生长因子和抗氧化剂。

    在本发明第十方面的一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和一个或多个选自下组的组分：胰岛素、亚硒酸钠、谷氨酰胺、白蛋白、蛋白胨、乙醇胺、胎球蛋白、维生素、脂蛋白、脂肪酸、胰岛素样生长因子和氨基酸。

    组合物可以包含，例如，0.0001-10％，0.0005-7.5％，0.001-5.0％，最特别为0.05-3.0％(w/v)的根据本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。

    组合物可以包含0.001-1000mg/L，更特别为0.01-500mg/L，甚至更特别为0.01-100mg/L并且最特别为0.04-10mg/L的白蛋白。白蛋白可以是重组白蛋白，在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质，例如如WO 2000/044772中所公开的，所述文献内容通过提述并入本文。

    组合物可以包含0.01-1000mg/L，更特别为0.01-500mg/L，甚至更特别为0.1-100mg/L，如1-50mg/L，并且最特别为4-20mg/L的胰岛素。胰岛素可以是重组胰岛素，在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质。

    组合物可以包含0.0001-10mg/L，更特别为0.005-7.5mg/L，甚至更特别为0.1-5.0mg/L并且最特别为0.75-3.5mg/L的脂蛋白。脂蛋白可以是重组脂蛋白，在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质。

    组合物可以包含0.00001-50mg/L的IGF，更特别为0.001-5.0mg/L，甚至更特别为0.01-1.0mg/L，并且最特别为0.04-0.2mg/L的IGF。IGF可以是重组IGF，在此情况中其优选获得自无血清来源并在将其加入组合物之前基本上不含任何其它源自动物的蛋白质。

    在本发明第十方面的另一个实施方案中，组合物包含：(i)基础培养基；(ii)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；(iii)胰岛素；(iv)亚硒酸钠；和/或(v)白蛋白。

    组合物可以包含至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9mg/ml白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；至少3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、10、15或20μg/ml本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；约5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、15或20μg/ml胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；至少1、2、3、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.7、7.0、7.5、8.0、9.0、10、15或20μg/ml亚硒酸钠。

    在一个特定的实施方案中，细胞培养基在基础培养基中可以包含约4mg/ml白蛋白；约5.5μg/ml本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；约10μg/ml胰岛素；约6.7μg/ml亚硒酸钠。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)乙醇胺。组合物在基础培养基中可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7或8％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19、20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和约1、2、3、4、5、6、7、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM乙醇胺。

    在一个特定的实施方案中，细胞培养基在基础培养基中可以包含约4mM谷氨酰胺；约0.5％白蛋白；约10mg/L胰岛素；约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约10μM乙醇胺。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物可包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；和一种或多种选自下组的下述组分：(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。在一个实施方案中，组合物包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；和或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。在一个特定的实施方案中，组合物在基础培养基中包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)白蛋白，约10mg/L胰岛素，和/或约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)谷氨酰胺；(iii)重组白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；和/或(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vii)蛋白胨。在一个实施方案中，组合物包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或3％(w/v)蛋白胨。在一个特定的实施方案中，组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)重组白蛋白，约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和/或约0.1％(w/v)蛋白胨。

    在本发明的实施方案中，蛋白胨或蛋白胨混合物是蛋白质水解物，其获得自水解的动物或植物蛋白质。蛋白胨可以源自屠宰场的动物副产品、纯化的明胶或植物材料。来自动物或植物来源的蛋白质可以使用酸、热或多种酶制备物水解。能使用的蛋白胨混合物包括SPY蛋白胨、“Primatone RL”和/或“Primatone HS”，后两者均为商业上可得到的(Sheffield，England或QuestInternational(IPL：5X59051)，RL)。或者，蛋白胨可以产生自非动物来源的产品，如源自植物的蛋白胨。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)谷氨酰胺；(iii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)胎球蛋白(如Pedersen)。在一个实施方案中，组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、18、19、20μg/ml胎球蛋白。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)白蛋白，约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和/或约12.5μg/ml胎球蛋白(如Pedersens)。

    在本发明第九方面的另一个实施方案中，组合物包含(i)基础培养基；(ii)白蛋白(任选的，如上所讨论的重组白蛋白)；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)维生素E。在一个实施方案中，组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM谷氨酰胺；约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、3.5至5、5至10、10至20％(w/v)白蛋白；约1、2、3、4、5、6、7、8、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/L胰岛素；约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6或7mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10微摩尔维生素E。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物在基础培养基中可包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)重组白蛋白，约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，和/或约5μM维生素E。组合物可以包含约4mM谷氨酰胺，约1％(w/v)重组白蛋白，约10mg/L胰岛素，约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白，约0.1％(w/v)蛋白胨，约12.5μg/mL胎球蛋白(如Pederson)，和/或约5μM维生素E。

    在另外的实施方案中，组合物可以包含WO 2005/070120的表1中列出的任何培养基，所述文献通过提述并入本文。在另一个实施方案中，无血清培养基是杂交瘤培养基，无动物组分或Ex-Cell(JRH Biosciences，Inc.)。

    在本发明的另一个方面，提供组合物用作细胞培养基，用来增加由培养基中培养的细胞产生的生物产物如蛋白质的产量。在一个实施方案中，组合物可以将生物产物的产量增加至少25％、30％、50％、100％、200％或300％。在另一个实施方案中，产生的生物产物可以是肽，如治疗或诊断肽、多肽、蛋白质、单克隆抗体、免疫球蛋白、细胞因子(如干扰素)、整合素、抗原、生长因子、细胞循环蛋白、激素、神经递质、受体、融合肽、血蛋白和/或嵌合蛋白。

    产生的生物产物可以或者可以不包含选自包含以下的列表的生物产物：4-1BB配基、5-螺旋蛋白、人C-C趋化因子、人L105趋化因子、命名为huL1053的人L105趋化因子、由γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白、血小板基础蛋白(PBP)、α₁-抗胰蛋白酶、ACRP-30同源物；互补组分C1q C、腺样表达的趋化因子(ADEC)、aFGF；FGF-1、AGF、AGF蛋白、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、对脑衰蛋白具有特异性的抗体、antistasin、抗-TGF β家族抗体、抗凝血酶III、APM-1；ACRP-30；Famoxin、载脂蛋白种类(apo-lipoprotein species)、芳基硫酸酯酶B、b57蛋白、BCMA、β-凝血球蛋白(β-TG)、bFGF；FGF2、血凝因子、BMP加工酶弗林蛋白酶、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发生蛋白-2、降钙素、钙蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受体蛋白、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52Mab、cerebus蛋白、趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK变体、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M1、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M10、趋化因子-样蛋白质IL-8M3、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M8、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M9、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-414、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-426、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-M2、霍乱疫苗、软骨调节因子-样蛋白、c-kit配体；SCF；肥大细胞生长因子；MGF；纤维肉瘤来源的干细胞因子、CNTF及其片段(如CNTF_Ax15`(Axokine^TM))、前和活性形式的凝结因子、胶原、互补C5Mab、结缔组织活化蛋白-III、CTAA16.88Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXC趋化因子受体3、cyanovirin-N、Darbepoetin(促红血球生成素)、指定的exodus、指定的huL1057、DIL-40、脱氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮抑素、嗜酸细胞活化趋化因子、上皮嗜中性粒细胞活化蛋白-78、EPO受体；EPOR、红细胞生成素(EPO)和EPO模拟物、Eutropin、Exodus蛋白、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白(DcR3)、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；成纤维细胞生长因子同源因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9；神经胶质活化因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、滤泡刺激激素α亚基、滤泡刺激激素β亚基、促滤泡素、趋化因子CX3(fractalkine)、肌原纤维蛋白肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF、GDF-1、基因疗法、胶质瘤来源的生长因子、胰增血糖素、胰增血糖素-样肽、葡糖脑苷脂酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、妊娠相关蛋白-A(Glycodelin-A)；与孕酮有关的子宫内膜蛋白、GM-CSF、促性腺激素、粒性白细胞趋化性蛋白-2(GCP-2)、粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关的致癌基因-α(GRO-α)、生长相关的致癌基因-β(GRO-β)、生长相关的致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4；TROY、hCG、乙肝表面抗原、乙肝疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV抑制肽、HIV蛋白酶抑制肽、HIV-1蛋白酶抑制物、HPV疫苗、人6CKine蛋白、人Act-2蛋白、人脂肪形成抑制因子、人B细胞刺激因子-2受体、人β-趋化因子H1305(MCP-2)、人C-C趋化因子DGWCC、人CC趋化因子ELC蛋白、人CC型趋化因子白介素C、人CCC3蛋白、人CCF18趋化因子、命名为SLC(第二淋巴样趋化因子)的人CC-型趋化因子蛋白、人趋化因子β-8短形、人趋化因子C10、人趋化因子CC-2、人趋化因子CC-3、人趋化因子CCR-2、人趋化因子Ckβ-7、人趋化因子ENA-78、人趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人趋化因子GRO α、人趋化因子GROα、人趋化因子GROβ、人趋化因子HCC-1、人趋化因子HCC-1、人趋化因子I-309、人趋化因子IP-10、人趋化因子L1053、人趋化因子L1057、人趋化因子MIG、人趋化因子MIG-β蛋白、人趋化因子MIP-1α、人趋化因子MIP1β、人趋化因子MIP-3α、人趋化因子MIP-3β、人趋化因子PF4、人趋化因子蛋白331D5、人趋化因子蛋白61164、人趋化因子受体CXCR3、人趋化因子SDF1α、人趋化因子SDF1β、人趋化因子ZSIG-35、人Chr19Kine蛋白、人CKbeta-9、人CKbeta-9、人CX3C111氨基酸趋化因子、人DNAX白介素-40、人DVic-1C-C趋化因子、人EDIRF I蛋白序列、人EDIRF II蛋白序列、人嗜曙红细胞CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人嗜曙红细胞表达的趋化因子(EEC)、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白I、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白T、胎儿脾脏表达的趋化因子、FSEC、人GM-CSF受体、人gro-α趋化因子、人gro-β趋化因子、人gro-γ趋化因子、人IL-16蛋白、人IL-1RD10蛋白序列、人IL-1RD9、人IL-5受体α链、人IL-6受体、人IL-8受体蛋白hIL8RA、人IL-8受体蛋白hIL8RB、人IL-9受体蛋白、人IL-9受体蛋白变体#3、人IL-9受体蛋白变体片段、人IL-9受体蛋白变体片段#3、人白介素1δ、人白介素10、人白介素10、人白介素18，、人白介素18衍生物、人白介素-1β前体、人白介素-1β前体、人白介素-1受体辅助蛋白、人白介素-1受体拮抗剂β、人白介素-13-型受体、人白介素-10(前体)、人白介素-10(前体)、人白介素-11受体、人白介素-1240kD亚基、人白介素-12β-1受体、人白介素-12β-2受体、人白介素-12p35蛋白、人白介素-12p40蛋白、人白介素-12受体、人白介素-13α受体、人白介素-13β受体、人白介素-15、来自P1克隆的人白介素-15受体、人白介素-17受体、人白介素-18蛋白(IL-18)、人白介素-3、人白介素-3受体、人白介素-3变体、人白介素-4受体、人白介素-5、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-7、人白介素-8(IL-8)、人胞内IL-1受体拮抗剂、人IP-10和HIV-1gp120高可变区融合蛋白、人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人肝脏和活化调节趋化因子(LARC)、人Lkn-1全长和成熟蛋白、全长和成熟的人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白、人成熟趋化因子Ckβ-7、人成熟gro-α、用于治疗败血症(sepsis)的人成熟gro-γ多肽、人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人MI10蛋白、人MI1A蛋白、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3、人单核细胞趋化原蛋白(MCPP)序列、人neurotactin趋化因子样域、人非-ELR CXC趋化因子H174、人非-ELRCXC趋化因子IP10、人非-ELR CXC趋化因子Mig、人PAI-1突变体、具有IL-16活性的人蛋白、具有IL-16活性的人蛋白、人第二淋巴样趋化因子(SLC)、人SISD蛋白、人STCP-1、人基质细胞来源的趋化因子、SDF-1、人T细胞混合的淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)、人胸腺和活化调节细胞因子(TARC)、人胸腺表达的、人TNF-α、人TNF-α、人TNF-β(LT-α)、人CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白序列、人II型白介素-1受体、人野生型白介素-4(hIL-4)蛋白、人ZCHEMO-8蛋白、人源化的抗-VEGF抗体，及其片段，人源化的抗-VEGF抗体，及其片段，透明质酸酶、ICE 10kD亚基、ICE 20kD亚基、ICE 22kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL-12p40亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、Il-17受体、Il-17受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、含IL-3融合蛋白、IL-3突变蛋白、IL-3变体、IL-3变体、IL-4、IL-4突变蛋白、IL-4突变蛋白Y124G、IL-4突变蛋白Y124X、IL-4突变蛋白、Il-5受体、IL-6、Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白变体(Met117型)、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或它们的片段(例如小模块ImmunoPharmaceutical^TM(“SMIP”)或dAb、Fab’片段、F(ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，包括但不限于血纤维蛋白溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素-样生长因子、整合素Mab、间α胰蛋白酶抑制剂、间α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ诱导蛋白(IP-10)、干扰素(如干扰素α种类和子种类，干扰素β种类和子种类，干扰素γ种类和子种类)、干扰素(如干扰素α种类和子种类，干扰素β种类和子种类，干扰素γ种类和子种类)、白介素6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋白p43、白介素-3、白介素-4突变蛋白、白介素-8(IL-8)蛋白、白介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thr117型)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、Kalikrein抑制剂、角化细胞生长因子、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋白融合体)、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋白融合体)、LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白II、瘦素、肝脏表达趋化因子-1(LVEC-1)、肝脏表达趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体素化激素、莱姆疫苗、淋巴细胞趋化因子、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC(n+1)、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-eyfy、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-yl、巨噬细胞来源的趋化因子、MDC、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)；蛋白酶抑制剂5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑素瘤抑制蛋白、膜结合蛋白、Met117人白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-γ、MIRAP、修饰的Rantes、本文未描述的单克隆抗体、MP52、突变白介素6S176R、肌原纤维蛋白收缩蛋白肌钙蛋白I、钠尿肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Neurotactin、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-4a、神经营养蛋白-4b、神经营养蛋白-4c、神经营养蛋白-4d、嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、命名为PTEC的新β-趋化因子、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白-1；OP-1；BMP-7、成骨蛋白-2、OX40；ACT-4、OX40L、催产素(神经垂体激素运载蛋白I)、甲状旁腺激素、Patched、Patched-2、PDGF-D、百日咳类毒素、脑垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘生长因子、胎盘生长因子-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-1；PAI-1、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血小板来源生长因子、血小板来源生长因子Bv-sis、血小板来源生长因子前体A、血小板来源生长因子前体B、血小板Mab、血小板来源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板来源生长因子A链、血小板来源生长因子B链、用于治疗败血症的多肽、前原载脂蛋白(Preproapolipoprotein)“米兰”变体、前原载脂蛋白“巴黎”变体、前-凝血酶、灵长类动物CC趋化因子″ILINCK″、灵长类动物CXC趋化因子″IBICK″、胰岛素原、催乳素、催乳素2、prosaptide、蛋白酶抑制肽、蛋白C、蛋白S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组白介素-16、抵抗素、逆转录病毒蛋白酶抑制剂、轮状病毒疫苗、RSV Mab、分泌的和跨膜多肽、分泌的和跨膜多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白(如凝血因子)、可溶BMP受体激酶蛋白-3、可溶VEGF受体、干细胞抑制因子、葡萄球菌属(Straphylococcus)疫苗、基质来源的因子-1α、基质来源的因子-1β、物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4内切核酸酶、TACI、Tarc、TGF-β1、TGF-β2、Thr117人白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表达的趋化因子(TECK)、甲状腺刺激激素、壁虱抗凝肽、Tim-1蛋白、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII；TNF p75受体；死亡受体、tPA、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型RANTES蛋白(3-68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(神经垂体激素运载蛋白II)、VEGF R-3；flt-4、VEGF受体；KDR；flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E；VEGF-X、von Willebrand因子、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、ZTGF-β9和它们的变体、片段和类似物。

    如上所讨论的，本发明的第十一方面提供培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在根据本发明第九方面的细胞培养基中培养细胞。本发明的细胞培养基可以或者可以不用于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养，或者作为用于杂交瘤细胞、单克隆抗体产生细胞、病毒产生细胞、转染的细胞、癌细胞和/或重组肽产生细胞的培养基。组合物可以用于培养真核细胞，如植物和/或动物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或鸟细胞。其它类型的细胞可以选自下组：MK2.7细胞(ATCC目录号CRL1909，抗-鼠-VCAM IgGI表达型杂交瘤细胞)、HEK 293细胞、PER-C6细胞、CHO细胞、COS细胞、5L8杂交瘤细胞、Daudi细胞、EL4细胞、HeLa细胞、HL-60细胞、K562细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、Sp2/0细胞；和/或WO 2005/070120表II(其通过提述并入本文)中列出的杂交瘤细胞，或本文公开的或本领域技术人员已知的任何其它细胞类型。

    基础培养基可以包含，但不限于Dulbecco修正Eagle培养基(DMEM)、最小基本培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α最小基本培养基(αMEM)、Glasgow最小基本培养基(G-MEM)，和/或lscove修正Dulbecco培养基。

    本发明还提供培养真核细胞的方法，包括将细胞与组合物接触，所述组合物可用作本发明的细胞培养基和/或在适于支持在培养物中培养细胞的条件下维持细胞。在一个特定的实施方案中，细胞是癌细胞或杂交瘤细胞。在其它实施方案中，提供培养组织外植体(explant)的方法，包括将组织与本文所述细胞培养基组合物接触。

    在一个实施方案中，方法包括将杂交瘤细胞与组合物接触，所述组合物包括：(i)基础培养基；(ii)重组白蛋白；(iii)谷氨酰胺；(iv)胰岛素(任选的，如上所讨论的重组胰岛素)；(v)本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；和/或(vi)乙醇胺，和/或在适于支持在培养物中培养杂交瘤细胞的条件下维持杂交瘤细胞。在一个特定的实施方案中，方法包括将杂交瘤细胞与组合物接触，所述组合物包括：(i)基础培养基；(ii)约0.5％(w/v)白蛋白；(iii)约4mM谷氨酰胺；(iv)约10mg/L胰岛素；(v)约1mg/L本发明的包含转铁蛋白突变体序列的重组蛋白；(vi)约10μM乙醇胺。

    现在将参照下述非限定性实施例和图来例示本发明。

    附图简述

    图1至10显示实施例中提及的质粒的多个质粒图谱。

    图11显示从包含pDB2973和pDB2974的多种酿酒酵母菌株中分泌的转铁蛋白(S415A，T613A)的RIE分析。用300μl冷冻保存的酵母储存物一式三份地接种10mL BMMD摇瓶，并在30℃培养4天。在火箭免疫电泳凝胶的每个孔加载5μl培养物上清液。血浆Tf标准物浓度用μg/mL表示。50μL羊抗Tf/50mL琼脂糖。将Precipin用考马斯蓝染色。

    图12显示从包含pDB2973和pDB2974的专有菌株中分泌的重组转铁蛋白(S415A，T613A)的SDS-PAGE分析。用300μl冷冻保存的酵母储存物一式三份地接种10mL BMMD摇瓶，并在30℃培养4天。在非还原性SDS-PAGE(4-12％MOPS缓冲液，InVitrogen)上用Blue试剂(Pierce)分析20μl上清液。

    在图12的凝胶1中，泳道对应于下述样品：1＝20μl SeeBlue Plus标记物；2＝20μl菌株1pSAC35s/n(阴性对照)；3＝20μl菌株1pDB2973s/n；4＝20μl菌株1pDB2973s/n；5＝20μl菌株2；6＝pDB2973s/n；6＝20μl菌株3pDB2973s/n；7＝20μl菌株4pDB2973s/n；8＝20μl菌株1pDB2974s/n；8＝20μl菌株1pDB2929s/n(阳性对照)；10＝20μl SeeBlue Plus标记物。

    在图12的凝胶2中，泳道对应于下述样品：1＝20μl SeeBlue Plus标记物；2＝20μl菌株1pSAC35s/n(阴性对照)；3＝20μl菌株1pDB2974s/n；4＝20μl菌株1pDB2974s/n；5＝20μl菌株2pDB2974s/n；6＝20μl菌株3pDB2974s/n；7＝20μl菌株4pDB2974s/n；8＝20μl菌株1pDB2973s/n；9＝20μl菌株1pDB2929s/n(阳性对照)；10＝20μl SeeBlue Plus标记物。

    图13显示重组转铁蛋白(N413Q，N611Q)和转铁蛋白(S415A，T613A)的分析型TBE-脲凝胶分析。根据下述实例中所述规程制备样品。在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离20μg样品，并用考马斯G250(Pierce)染色。泳道1-3显示菌株1[pDB2929]样品；泳道4-6显示菌株1[pDB2973]样品；泳道1和4显示纯化的重组转铁蛋白突变体；泳道2和5显示重组脱辅基转铁蛋白突变体；泳道3和6显示重组全铁转铁蛋白突变体。

    图14显示质粒pDB3191的结构。

    图15显示质粒pDB3753的结构。

    图16显示质粒pDB3768的结构。

    图17显示分别从包含pDB2973、pDB3773、pDB3765、pDB3768或pDB3778的酿酒酵母菌株1分泌的重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S415C，T613A)、重组转铁蛋白(S415A，T613C)、重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)，和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的RIE分析。用200μL冻存的酵母储存物一式两份地接种10mL BMMD摇瓶，并在30℃培育5天。火箭免疫电泳凝胶的每个孔加载4μL培养上清液的两个样品。血浆Tf标准物浓度用μg/mL表示。30μL羊抗Tf/50mL琼脂糖。用考马斯蓝将Precipin染色。

    图17的凝胶1显示分别从包含pDB3237、pDB3773或pDB3765的酿酒酵母菌株1分泌的重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S415C，T613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613C)的RIE分析。图17的凝胶2显示分别从包含pDB3237、pDB3768或pDB3778的酿酒酵母菌株1分泌的重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的RIE分析。

    图18显示分别从包含pDB2973、pDB3773、pDB3765、pDB3768和pDB3778的酿酒酵母菌株1分泌的重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S415C，T613A)、重组转铁蛋白(S415A，T613C)、重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)，重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的SDS-PAGE分析。用200μL冻存的酵母储存物一式两份地接种10mL BMMD摇瓶，并在30℃培育5天。在非还原性SDS-PAGE(4-12％Bis/TrisMOPS缓冲液，Invitrogen)上用Blue试剂(Pierce)分析20μL上清液。

    在图18的凝胶1中，泳道对应下述样品：1＝20μLSeeBlue Plus标记物；2＝20μL菌株1[pDB3237]s/n；3＝20μL菌株1[pDB3237]s/n；4＝20μL菌株1[pDB3773]s/n；5＝20μL菌株1[pDB3773]s/n；6＝菌株1[pDB3765]s/n；7＝20μL菌株1[pDB3765]s/n。在图18的凝胶2中，泳道对应下述样品：1＝20μLSeeBlue Plus标记物；2＝无样品；3＝20μL菌株1[pDB3237]s/n；4＝20μL菌株1[pDB3237]s/n；5＝20μL菌株1[pDB3768]s/n；6＝20μL菌株1[pDB3768]s/n；7＝菌株1[pDB3778]s/n；8＝20μL菌株1[pDB3778]上清液。

    图19显示重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415C，T613A)的分析型TBE-脲凝胶分析。

    根据下述实例所述规程制备样品。在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离5μg样品，并用考马斯G250(Pierce)染色。

    泳道1-2显示菌株1[pDB3237]样品；泳道3显示菌株1[pDB3773]样品；泳道1显示无铁重组转铁蛋白(S415A，T613A)制备物；泳道2和3显示加载铁的重组转铁蛋白突变体。

    图20显示由菌株1[pDB3237]、菌株1[pDB3773]和菌株1[pDB3765]的表达的重组转铁蛋白上清液的分析型TBE-脲凝胶分析。图20的凝胶1中，泳道1-2显示纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3237]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。图20的凝胶2中，泳道1-2显示纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3773]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。图20的凝胶3中，泳道1-2显示纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3765]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。

    图21显示由菌株1[pDB3237]、菌株1[pDB3778]和菌株1[pDB3768]的表达的重组转铁蛋白上清液的分析型TBE-脲凝胶分析。图21的凝胶1中，泳道1-2显示纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3768]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。图21的凝胶2中，泳道1-2显示菌株1[pDB3237]样品；泳道3-4显示菌株1[pDB3778]样品；泳道1和3显示无铁制备物；泳道2和4显示加载铁的制备物。

    图22显示重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415C，T613A)的纯化的加载铁的制备物的表面等离子体共振(SPR)分析。

    图23显示由使用ESI-TOF质谱法分析重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)得到的去卷积质谱。谱A显示由菌株1[pDB3237]的高细胞密度发酵纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)的质谱。峰标识A)未修饰的分子(理论质量75098Da)，B)未修饰的分子+1己糖(理论质量75259Da)。谱B显示由菌株1[pDB3778]的高细胞密度发酵纯化的重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)变体的质谱。峰标识C)未修饰的分子(理论质量75114Da)。谱C显示由菌株1[pDB3768]的高细胞密度发酵纯化的重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)变体的质谱。峰标识D)未修饰的分子(理论质量75130Da)。

    图24质粒pDB3237的质粒图谱。

    实施例

    实施例1，表达载体的构建

    构建表达质粒，用于产生在-N-X-S/T-基序中具有对丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变的未糖基化重组转铁蛋白。在先前公开的未糖基化重组转铁蛋白突变体N413Q、N611Q(由第一个酿酒酵母菌株(菌株1)[pDB2929]产生时)和新的未糖基化重组转铁蛋白突变体S415A、T613A(由菌株1[pDB2973]产生时)的数量或质量未观察到显著差别，如由RIE、SDS-PAGE、脲凝胶分析、质谱、N-末端测序和向体外生长的人红白血病细胞的铁传递所确定的。

    寡糖基转移酶催化寡糖链从焦磷酰多萜醇转移至序列-Asn-X-Thr/Ser-中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸或天冬氨酸之外的任何氨基酸(de Jong等，1990，Clin Chim Acta，190，1；Lau等，1983，J Biol Chem，258，15255)。分泌的蛋白质的N-连接的糖基化在内质网中的这个序列基序处发生。

    然而，由于空间约束，蛋白质所有可能的位点中只有约三分之一被糖基化。在人转铁蛋白中两个可能的位点是可用的，在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611处(均位于C-叶中)，并且两个位点都被利用。先前尝试从酿酒酵母分泌人转铁蛋白产生弥散的异源产物，据信这是由于在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611的高甘露糖基化(hypermannosylation)(未给出数据)，这与先前在非人宿主细胞中重组产生人转铁蛋白的相关观察是一致的。

    本文描述了通过将丝氨酸-415和苏氨酸-613改变成丙氨酸残基而产生非糖基化重组转铁蛋白突变体，以防止在天冬酰胺-413和天冬酰胺-611处的N-连接的糖基化。

    质粒pDB2504(图1a)是包含用于人转铁蛋白的NofI表达盒的pBST(+)(Sleep等，2001，Yeast，18，403-441)，除了成熟转铁蛋白蛋白质的残基413和611的密码子未突变以防止N-连接的糖基化，并且分别是编码天冬酰胺残基的AAT和AAC之外，所述表达盒与pDB2536(WO 2005/061719的图36和实施例2，和WO 2005/061718的实施例1)中的表达盒相同，

    pDB2504的糖基化人转铁蛋白DNA序列中丝氨酸-415和苏氨酸-613的密码子突变成酿酒酵母对于丙氨酸的优选密码子，其为GCT(37％，http://www.yeastgenome.org/codon_usage.shtml)。这可以根据Stratagene的QuickChange^TM定点突变试剂盒的说明手册实现。使用突变寡核苷酸CF156(SEQ ID NO：4)和CF157(SEQ ID NO：5)导入S415A突变，并且使用寡核苷酸CF158(SEQ ID NO：6)和CF159(SEQ ID NO：7)导入T613A突变(表1)。

    表1：

       名称  注释序列  CF156  和  CF157  CF156 5’-GGCAGAAAACTACAATAAGGCTGATAATTGTGAGGATACACC-3’  CF 1573’-CCGTCTTTTGATGTTATTCCGACTATTAACACTCCTATGTGG-5’  A  E  N  Y  N  K  A  D  N  C  E  D  T  ＞＞＞  S415A  CF158  和  CF159  CF158 5’-GCACCTATTTGGAAGCAACGTAGCTGACTGCTCGGGCAACTTTTG-3’  CF159 3’-CGTGGATAAACCTTCGTTGCATCGACTGACGAGCCCGTTGAAAAC-5’  H  L  F  G  S  N  V  A  D  C  S  G  N  F  ＞＞＞  T613A

    突变在1154-bp HpaI-SphI pDB2504片段上进行，其已经亚克隆入用HpaI、SphI和小牛肠碱性磷酸酶消化的阿泊拉霉素选择性大肠杆菌克隆载体pDB2685(图1b，还参见WO 2005/061719)中。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α并选择阿泊拉霉素抗性菌落(35μg.mL^-1阿泊拉霉素)。通过用HpaI、SphI、EcoRI和NdeI限制性消化而鉴定质粒pDB2958(图2)。

    用寡核苷酸CF156和CF157(表1)突变质粒pDB2958，导入S415A修饰并产生质粒pDB2970(图3)。用反应产物转化大肠杆菌DH5α使其具有阿泊拉霉素抗性，并从四个阿泊拉霉素抗性菌落中分离质粒DNA。随后用寡核苷酸CF158和CF159突变这些质粒，导入T613A修饰，并产生质粒pDB2971(图4)。分离阿泊拉霉素菌落，并由用于导入S415A修饰的四个反应中每个反应所产生的两个克隆制备质粒DNA。选出八个质粒制备物中的三个首先用于DNA测序，以鉴定S415A和T613A修饰，其每个都源自单独的T613A突变反应。

    DNA测序使用寡核苷酸DS 181(SEQ ID NO：8)、DS182(SEQ ID NO：9)、DS183(SEQ ID NO：10)、DS184(SEQ ID NO：11)、DS185(SEQ ID NO：12)、DS186(SEQ ID NO：13)、DS187(SEQ ID NO：14)、M13正向(SEQ ID NO：15)和M13反向引物(SEQ ID NO：16)(表2)。

    表2：

       引物  描述  序列  DS181  转铁蛋白，24聚物  5’-CTCAACCAGGCCCAGGAACATTTT-3’  DS182  转铁蛋白，19聚物  5’-AGAGACCACCGAAGACTGC-3’  DS183  转铁蛋白，19聚物  5’-AACCACTGCAGATTTGATG-3’  DS184  转铁蛋白，18聚物  5’-GCCAGAGCCCCGAATCAC-3’  DS185  转铁蛋白，22聚物  5’-ATTTTTCATATGTGTTTCTGTC-3’  DS186  转铁蛋白，20聚物  5’-TTCACAAAGGCCACATCTCC-3’  DS187  转铁蛋白，18聚物  5’-CAAAATACCCTGCCTCTG-3’  M13-F  17聚物  5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’  M13-R  16聚物  5’-AACAGCTATGACCATG-3’

    所有三个质粒都包含期望的S415A和T613A修饰，但是一个在1154-bpHpaI-SphI区中的其它地方还包含额外的腺嘌呤插入。因此，用相同的引物将正确的pDB2971质粒克隆之一的祖质粒测序，并显示其在完整的1154-bpHpaI-SphI区中包含期望的pDB2970序列。

    通过凝胶纯化分离包含S415A和T613A修饰的1154-bp HpaI-SphIpDB2971片段，并与来自pDB2928(图5，也参见WO 2005/061718)的5312-bpHpaI-SphI片段连接，后者在用HpaI、SphI、AccI和小牛肠碱性磷酸酶消化后纯化。AccI的加入导致未修饰的1154-bp HpaI-SphI片段三重消化。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，使其具有氨苄青霉素抗性，并由选择的克隆制备质粒DNA。通过用HpaI、SphI、NotI和NdeI限制性消化鉴定基于pBST(+)的质粒，pDB2972(图6)，其包含用于使用mHSA-前先导序列进行非糖基化重组人转铁蛋白分泌的NotI表达盒。

    用引物DS181、DS182、DS184、DS185、DS186和DS187(表2)的DNA测序确认了1，154-bp HpaI-SphI区的正确序列和临近序列。随后在用NotI和ScaI消化后从pDB2972分离了3,256-bp表达盒。将其与pDB2690(图7，也参见WO 2005/061718)连接，所述pDB2690已用NotI和小牛肠碱性磷酸酶消化。用连接产物转化大肠杆菌DH5α，使其具有氨苄青霉素抗性，并由选择的克隆制备质粒DNA。使用HindIII、NotI、BamHI、NdeI和EcoRI的限制性消化鉴定pDB2973(图8)和pDB2974(图9)。两个质粒均确认了1,154-bpHpaI-SphI区的正确DNA序列和临近序列。在pDB2973中，转铁蛋白基因以与LEU2相同的方向转录，而在pDB2974中，它以相反的方向转录。

    实施例2：HST突变体的产生和分析

    用pDB2973和pDB2974转化酿酒酵母菌株(菌株1)，使其成为亮氨酸原养型。使用修正的乙酸锂方法转化酵母(Sigm酵母转化试剂盒，YEAST-1，规程2；Ito等，1983，J.Bacteriol.，153，16；Elble，1992，Biotechniques，13，18)。在BMMD-琼脂平板上选择转化体，随后挑取接于BMMD-琼脂平板上。BMMD的组成如Sleep等，2002，Yeast，18，403所述。由10mL BMMD摇瓶培养物(24小时，30℃，200rpm)，在20％(w/v)海藻糖中制备冷冻储存物。

    用包含pDB2973和pDB2974的每个菌株接种一式三份的10mL BMMD摇瓶培养物，并在30℃生长4天。菌株1[pDB2929](图10，也参见WO2005/061718)相似地生长用于对照目的。pDB2929包含以与LEU2相同的方向转录的N413Q、N611Q突变体转铁蛋白基因和酿酒酵母SKQ2n PDI1基因。通过RIE和非还原性SDS-PAGE分析上清液。RIE分析表明所有包含pDB2973和pDB2974的菌株都分泌重组转铁蛋白(图11)。来自包含pDB2973的所有菌株的表达效价(titre)看起来略高于包含pDB2974的菌株。来自pDB2973和pDB2974的效价看起来是相当的。

    因此，通过RIE，在所研究菌株的摇瓶培养过程中分泌的可选的非N-连接的-糖基化突变体水平之间未表现出显著差别。

    重组转铁蛋白(S415A，T613A)分泌的非还原性SDS-PAGE分析如图12所示。包含pDB2973和pDB2974的多个酿酒酵母菌株(菌株1至4)都分泌与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413Q，N611Q)共迁移的蛋白条带，其在阴性对照菌株中不存在。通过SDS-PAGE观察到的转铁蛋白(S415A，T613A)条带的产量(yield)与通过RIE观察到的效价一致。此外，通过SDS-PAGE分析，来自菌株1[pDB2973]的转铁蛋白(S415A，T613A)条带与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413Q，N611Q)条带之间未表现出显著差别。转铁蛋白(S415A，T613A)条带明显没有弥散，表明丝氨酸-415和苏氨酸613变为丙氨酸残基的突变成功防止了天冬酰胺-413和天冬酰胺611处的高糖基化。

    菌株1[pDB2973]的高细胞密度发酵产生约1.74g.L^-1(n＝4)的产量，这与菌株1[pDB2929]的生产能力相似。从菌株1[pDB2973]表征转铁蛋白(S415A，T613A)表明其在功能上与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413Q，N611Q)相当。在纯化(SP-FF和DE-FF)和脲凝胶分析(图13)的过程中，可选的非糖基化突变体看起来是相当的。

    使用Makey和Seal过程的修正方法(Monthony等，1978，Clin.Chem.，24，1825-1827；Harris和Aisen，1989，Physical biochemistry of the transferrins，VCH；Makey和Seal，1976，Biochim.Biophys.Acta.，453，250-256；Evans和Williams，1980，Biochem.J.，189，541-546)，用商业迷你凝胶(6％同源TBE脲，Invitrogen)，进行脲凝胶电泳。将包含约10μg蛋白质的样品1∶1稀释于TBE-脲样品缓冲液(Invitrogen)中，在180V分离550至600Vh并用Blue试剂(Pierce)染色。通过针对0.1M柠檬酸(盐)、0.1M乙酸(盐)、10mM EDTA pH 4.5透析而制备脱辅基转铁蛋白。过滤溶液(0.22μm)，并使用Vivaspin聚醚砜10,000NMWCO离心浓缩机浓缩至10mg/ml，并针对10倍体积的水，然后是10倍体积的0.1M HEPES、0.1M NaHCO₃pH 8.0渗滤。从浓缩机通过冲洗而回收样品，并使其终浓度达到5mg/ml。通过加入10μl 1mM FeNTA(新鲜制备，作为氯化铁于氨基三乙酸二钠中的等摩尔溶液)至50μl等分试样而由这个溶液制备重构的全铁转铁蛋白，并静置10分钟以在电泳分析前使CO₂溶解，完成铁结合。这一技术可分离不同铁负荷的四种分子形式(目的是增加迁移率(mobility))，即脱辅基转铁蛋白、C-叶和N-叶结合单铁的转铁蛋白和全铁转铁蛋白。认为四种形式转铁蛋白的分离是由于在6M脲中的部分变性，其中任何叶上的铁结合会引起构型变化，导致对变性的耐受性增加。因此叶中存在铁可产生更紧密的结构，具有更高的电泳迁移率。因为N-叶的二硫键比C-叶少(分别是8和11)，其在缺乏铁的情况下进一步解折叠，使具有结合至C-叶的铁的单铁形式迁移性最差(the least mobile)。

    质谱鉴定了不同非糖基化转铁蛋白突变体之间期望的质量差别，并为转铁蛋白(S415A，T613A)中正确的一级蛋白质序列提供了很好的证据(未显示数据)。关于翻译后修饰，转铁蛋白(S415A，T613A)也可与转铁蛋白(N413Q，N611Q)相比。

    此外，来自菌株1[pDB2973]的重组转铁蛋白(S415A，T613A)的体外将铁传递至K562细胞的能力与来自菌株1[pDB2929]的转铁蛋白(N413Q，N611Q)相当(表3)。

     表3-来自人血浆对照和重组转铁蛋白的，由体外生长的人红白血病K562细胞的总铁摄入、非特异性摄入、表观亲和性和关联系数(r²)

    摄入数据以fmol Fe/百万细胞25分钟表示，表观亲和性用nM转铁蛋白(估计的浓度，未针对系统误差进行调整)表示。

       样品  最大摄入  非特异性摄入  表观亲和性  r²  人血浆转铁蛋白  2093±83  313±71  186  0.9976  菌株1[pDB2929]  1856±106  355±79  123  0.9946  菌株1[pDB2973]  1681±117  362±87  123  0.9923

    应注意的是，尽管对照的最大摄入看起来更高，但是此数字并不重要(relevant)。经常是天然转铁蛋白对照的摄入最大，因此与重组样品的差异是统计偏差。唯一重要的数字是表观亲和常数，其都略低于天然转铁蛋白，和代表实验数据质量的相关系数。简言之，可以说所有这些重组转铁蛋白将铁传递至红系细胞的能力至少和天然蛋白一样好。

    表3中的数据获得自竞争试验，其中血浆转铁蛋白用铁-55放射性标记，并且通过放射性标记铁-55比较两个未标记的重组转铁蛋白突变体的抑制铁-55传递的能力。

    用包含HEPES-缓冲液和1mg/ml牛血清白蛋白的无血清培养基洗涤标准条件下(碳酸氢盐缓冲的，5％CO₂，抗生素，10％胎牛血清)在RPMI细胞培养基中培养的K562红白血病细胞，并在此培养基中以一千万细胞/ml的浓度使用。

    将浓度渐增的天然或各个二铁重组转铁蛋白样品(0、25、100、200、400、800、1600nM)与用⁵⁵Fe标记的于25μl培养基中的100nM天然二铁血浆转铁蛋白混合。

    通过加入300l细胞悬浮液而开始反应。在37℃25分钟后，通过浸入冰浴中而终止反应，将60μl的细胞悬浮液的三个等分试样转移至新管，并在低温离心细胞，在加入邻苯二甲酸二乙酯/邻苯二甲酸二丁酯的油层后再次在低温离心细胞。去除上清液，将细胞沉淀转移至计数瓶中，并用0.5MKOH+1％Triton X-100裂解。在o/n裂解后用1M HCl中和裂解物，与Readysolv闪烁混合物(cocktail)混合，并在Packard液体闪烁计数器中计数。

    因此，丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变看来是对-N-X-S/T-基序中天冬酰胺残基的突变的可行的替代方案，用于防止由酿酒酵母分泌的重组转铁蛋白的N-连接的糖基化。

    先前的研究已经得出结论，即N413Q，N611Q转铁蛋白突变体与未突变转铁蛋白在生物学上相当(未给出数据)，并且这些研究表明，丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变得到的转铁蛋白突变体与N413Q，N611Q转铁蛋白突变体在生物学上相当。因此，可以得出结论，即丝氨酸-415和苏氨酸-613的突变得到的转铁蛋白突变体与未突变转铁蛋白在生物学上相当。

    实施例3.转铁蛋白突变蛋白质表达质粒的构建

     A：转铁蛋白突变蛋白质表达质粒的构建

    本发明用于转铁蛋白变体的表达质粒可以用与下述对于Tf变体S415A，T613A相似的方式构建。

    通过定点突变修饰名为pDB3237的质粒而产生转铁蛋白突变蛋白质。使用商业提供的试剂盒(如Stratagene的Quikchange^TM试剂盒)所示的步骤，用重叠突变寡核苷酸序列将选择的残基密码子修饰成可以编码半胱氨酸残基的任何DNA序列(TGT或TGC)。

     B：转铁蛋白(S415A，T613A)表达质粒pDB3237的构建

    使用重叠寡核苷酸引物产生合成DNA，其编码转化酶前导序列人转铁蛋白(S415A，T613A)，所述DNA为在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化。

    SEQ ID NO：18包含成熟人转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列，其在丝氨酸415和苏氨酸613处修饰成丙氨酸残基，以防止在Asn413和Asn611位点发生N-连接的糖基化(核苷酸124-2160)；两个翻译终止密码子(核苷酸2161-2166)；转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)；3’UTR和部分ADH1基因终止子一直到SphI克隆位点(核苷酸2167-2359)；5’UTR和部分PRB1基因启动子一直到AfIII克隆位点(核苷酸1-66)。

    转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)编码信号肽MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID NO：19)。

    用SphI和AflII完全消化转化酶前导序列人转铁蛋白(S415A，T613A)DNA序列，产生2.357kb片段。使用限制性内切酶SphI和AflII完全消化WO 00/44772中所述质粒pDB2241(4.383kb)，产生4.113kb片段，其随后使用小牛碱性肠磷酸酶去磷酸化。将2.537kb转化酶前导序列人转铁蛋白(S415A，T613A)DNA片段连接入来自pDB2241的4.113kb SphI/AflII片段，产生质粒pDB3191(图14)。用NotI限制性内切酶完全消化质粒pDB3191，释放3.259kb转化酶前导序列人转铁蛋白(S415A，T613A)表达盒。

    质粒pDB2690的构建如WO/2005061719A1中所述。用限制性内切酶NotI完全消化质粒pDB2690(13.018kb)，并使用小牛碱性肠磷酸酶去磷酸化，并与3.259kb NotI转铁蛋白(S415A，T613A)表达盒连接，产生16.306kbpDB3237，其具有与LEU2基因反向的转铁蛋白(S415A，T613A)表达盒(图24)。

    或者，可以在将NotI转铁蛋白变体表达盒亚克隆入pD B2690之前通过将合成的DNA片段亚克隆入质粒pDB3191(图14)而产生本发明的转铁蛋白变体的表达质粒。

    pDB3191(图14)的转铁蛋白DNA序列包含唯一的AflII、XcmI、NcoI和AccI限制性内切酶位点。预定突变的位置定位于pDB3191(图14)的转铁蛋白表达盒序列上。序列侧翼为AflII和XcmI限制性内切酶位点，以促进克隆。通过修饰AflII和XcmI限制性位点之间的DNA序列而产生另外的硫代转铁蛋白变体，其包含在丝氨酸415处修饰成丙氨酸以防止在Asn413位点处的N-连接的糖基化的成熟人转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列直到XcmI克隆位点的部分(核苷酸124-1487)、转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)和PRB1基因启动子直到AflII克隆位点的部分(核苷酸1-66)。在给出的实例中，将密码子TGT用于半胱氨酸残基，然而，本发明中也使用密码子TGC。

    SEQ ID NO：18，包含在丝氨酸-32处修饰成丙氨酸以防止O-连接的糖基化(核苷酸216-218)并在丝氨酸-415处修饰成丙氨酸以防止在Asn413位点处的N-连接的糖基化的成熟人转铁蛋白C₁变体蛋白质编码序列直到XcmI克隆位点的部分(核苷酸124-1487)、转化酶前导(信号)蛋白质编码序列(核苷酸67-123)和PRB1基因启动子直到AflII克隆位点的部分(核苷酸1-66)。在这个实施例中，使用密码子优化的DNA，然而，本发明中也可使用未进行密码子优化的DNA。

    用AflII和XcmI完全消化SEQ ID NO：18变体DNA序列，产生1.479kb片段。使用限制性内切酶AflII和XcmI完全消化质粒pDB3191(6.47kb)，产生4.991kb片段，其随后使用虾碱性磷酸酶去磷酸化。将1.479kb转铁蛋白(S32A，S415A)变体DNA片段亚克隆入来自pDB3191的4.991kbAflII/XcmI片段，产生质粒pDB3753(图15)。

    用NotI限制性内切酶完全消化转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)变体亚克隆质粒pDB3753，释放合适的3.259kb转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)表达盒。

    WO/2005061719A1中已经描述了质粒pDB2690的构建。用限制性内切酶NotI完全消化质粒pDB2690(13.018kb)，并使用虾碱性磷酸酶去磷酸化，并与3.259kb NotI转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)变体表达盒连接，产生16.306kb质粒pDB3768，其具有与LEU2基因同向的转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)变体表达盒(图15)。

    用质粒pDB3237或pDB3768将酿酒酵母菌株(菌株1)转化成亮氨酸原养型。使用修改的乙酸锂方法(Sigma酵母转化试剂盒，YEAST-1，规程2；Ito等，1983，J.Bacteriol.，153，16；Elble，1992，Biotechniques，13，18)转化酵母。在BMMD-琼脂平板上选择转化体，随后挑取到BMMD-琼脂平板上。BMMD的组成由Sleep等，2002，Yeast，18，403描述。从10mL BMMD摇瓶培养物(24小时，30℃，200rpm)在20％(w/v)海藻糖中制备冷冻的保存物。

     C：转铁蛋白(S415C，T613A)表达质粒pDB3773的构建

    使用与构建pDB3237的方法相应的方法构建这个质粒。

     D：转铁蛋白(S415A，T613C)表达质粒pDB3765的构建

    使用与构建pDB3237的方法相应的方法构建这个质粒。

     E：转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)表达质粒pDB3778的构建

    使用与构建pDB3237的方法相应的方法构建这个质粒。

    实施例4：表达重组转铁蛋白突变体的酵母菌株的生产能力

    用包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3778和pDB3768的菌株1酵母菌株接种一式两份的10mL BMMD摇瓶培养物，并在30℃生长5天。通过火箭免疫-电泳(RIE)和非还原性SDS-PAGE分析上清液。RIE分析表明包含pDB3237、pDB3773、pDB3765、pDB3768和pDB3778的所有菌株都分泌重组转铁蛋白(图17和图18)。当与分别包含pDB3778和pDB3768表达重组转铁蛋白突变体S32C，S415A，T613A和重组转铁蛋白突变体S32A，S415A，T613A的菌株1比较时，来自包含pDB3237表达重组转铁蛋白突变体S415A、T613A的菌株1的表达效价看来相似(图17中的凝胶2)，表明这些构建体中丝氨酸-32的突变不会降低产物产量。相反，来自分别包含pDB3773或pDB3765表达重组转铁蛋白突变体S415C，T613A或重组转铁蛋白突变体S415A，T613C的菌株1的表达效价看来较低(图17中的凝胶1)，表明优选丝氨酸和苏氨酸变为丙氨酸残基以防止N-连接的糖基化的突变。

    因此，通过RIE，当与仅包含S415A和T613A突变的重组转铁蛋白突变体相比，包含S415A和T613A突变和在丝氨酸-32处额外的突变的重组转铁蛋白突变体水平之间看来没有显著差异。相似地，通过SDS-PAGE分析(图18中的凝胶2)，与来自菌株1[pDB3778]的重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)条带，或来自菌株1[pDB3768]的重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)条带相比，来自菌株1[pDB3237]的重组转铁蛋白(S415A，T613A)条带看来没有显著差异。

    然而，通过RIE分析，当表达包含“非保守”突变如将丝氨酸-415取代为半胱氨酸或将苏氨酸-613取代为半胱氨酸的重组转铁蛋白突变体时，分泌的重组蛋白的量减少。通过SDS-PAGE分析确认了这个结果(图18中的凝胶1)。

    表达转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)变体的菌株1[pDB3768]的高细胞密度补料批式发酵得到的产量为2.26mg.mL^-1，并且表达转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的菌株1[pDB3768]得到的产量为1.95mg.mL^-1，其与表达转铁蛋白(S415A，T613A)变体的菌株1[pDB3237]中所见相似。然而，表达转铁蛋白(S415C，T613A)变体的菌株1[pDB3773]的高细胞密度补料批式发酵得到的产量约为1.06mg.mL^-1(n＝2)，表明丝氨酸-415变为半胱氨酸残基的“非保守”取代导致生产能力显著下降。

    实施例5：与重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的铁结合能力

    将由菌株1[pDB3237]、菌株1[pDB3773]和菌株1[pDB3765]的摇瓶上清液纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415C，T613A)、重组转铁蛋白(S415A，T613C)的铁结合能力与纯化的重组人转铁蛋白(S415A，T613A)标准物相比较。

    对于加载铁的纯化重组转铁蛋白(S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415C，T613A)，使用下述方法。向纯化的转铁蛋白加入碳酸氢钠，得到20mM的终浓度。计算铁量(以10mg.mL^-1(16.5-18.5％Fe)柠檬酸铁铵的形式)以靶向2摩尔Fe³⁺每摩尔转铁蛋白，加至重组转铁蛋白/20mM重碳酸钠制备物，并在环境温度混合最少60分钟，然后超滤至145mM NaCl中。

    为了制备无铁的纯化重组转铁蛋白(S415A，T613A)，在0.1M柠檬酸钠、0.1M乙酸钠、10mM EDTApH 4.5中在环境温度温育样品最少180分钟，然后超滤至100mM HEPES、10mM碳酸钠缓冲液pH 8.0中。

    在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离5μg样品，并用考马斯G250(Pierce)染色(图19)。纯化的重组转铁蛋白(S415C，T613A)的铁结合能力在这些实验条件下看来与重组转铁蛋白(S415A，T613A)不同。已经进行相同的全铁化处理的重组转铁蛋白(S415C，T613A)样品(图19中的泳道3)看来未用铁完全饱和，并且显示通过分析型TBE脲凝胶迁移的条带比重组转铁蛋白(S415A，T613A)更慢(图19中的泳道2)，表明重组“全铁转铁蛋白”(S415C，T613A)样品与重组“全铁转铁蛋白”(S415A，T613A)所含铁量不相同。

    通过离心从酵母生物质分离在200mL BMMD摇瓶中生长5天后作为摇瓶上清液表达的重组转铁蛋白变体。将上清液样品浓缩至1mL并渗滤至10mM HEPES缓冲液pH 8中。通过RP-HPLC测试材料，以获得蛋白质浓度，随后分成两个样品。将一个样品通过两倍稀释和在0.1M柠檬酸钠、0.1M乙酸钠、10mM EDTA pH 4.5中温育三小时而转化成脱辅基转铁蛋白形式，将另一个样品通过在全铁化缓冲液(0.5M碳酸盐，2.5mg.ml^-1柠檬酸铁)中两倍稀释而能将脱辅基转铁蛋白转化成二铁全铁转铁蛋白形式(铁结合)的步骤处理三小时。

    在6％TBE脲PAGE(Invitrogen)上分离0.5μg样品，并用考马斯G250(Pierce)染色。分离自摇瓶上清液的重组转铁蛋白(S415A，T613A)(图19的凝胶1中的泳道3和4)看来与铁加载的重组转铁蛋白(S415A，T613A)(图20的凝胶1中的泳道1和2)具有相同的铁结合能力。

    在这些实验条件下，分别分离自菌株1[pDB3773]和菌株1[pDB3765]的摇瓶上清液的重组转铁蛋白(S415C，T613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613C)的铁结合能力看来不同于分离自菌株1[pDB3237]的摇瓶上清液的重组转铁蛋白(S415A，T613A)。，进行全铁化处理以用铁加载转铁蛋白的重组转铁蛋白(S415C，T613A)样品(图20的凝胶2中的泳道4)与和纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)(图20的凝胶2中的泳道2)相比迁移率降低的一些种类一起迁移通过分析型TBE脲凝胶，表明重组“全铁-转铁蛋白”(S415C，T613A)以铁部分饱和，并且与结合的铁为2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415C，T613A)以及结合的铁小于2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415C，T613A)不同源。

    进行全铁化处理以用铁加载转铁蛋白的重组转铁蛋白(S415A T613C)样品(图20的凝胶3中的泳道4)也与和纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)(图20的凝胶3中的泳道2)相比迁移率降低的一些种类一起迁移通过分析型TBE脲凝胶，表明在本分析中，重组“全铁-转铁蛋白”(S415A，T613C)与结合的铁为2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415A，T613C)以及结合的铁小于2摩尔的一些重组转铁蛋白(S415A，T613C)不同源。

    通过分析型TBE脲凝胶电泳，与重组转铁蛋白(S415C，T613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613C)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的铁结合能力看来有功能性差异。这表明优选重组转铁蛋白(S415A，T613A)突变体用于控制N-连接的糖基化。

    实施例6：与重组转铁蛋白(S415C，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的受体结合能力

    通过表面等离子体共振(SPR)分析来评价重组转铁蛋白变体的受体结合能力。可以使用表面等离子体共振(SPR)测定转铁蛋白样品和转铁蛋白受体的结合活性，所述SPR是一种非侵入性光学技术，其中的SPR响应是由于分子结合或解离而在检测器表面的质量浓度变化的量度。将样品通过恒定流速的微流系统送至传感器芯片的表面上。在这个分析中，如果转铁蛋白样品能与TfR结合，表面传感器芯片上的质量会由于TfR和Tf分子之间的结合而增加，产生表面等离子体波，并且可检测与结合量成比例的SPR信号的变化作为共振单位(RU)的变化。1RU的响应相当于约1pg.mm^-2的表面浓度的变化。

    通过首先将转铁蛋白受体抗体固定化，然后加入转铁蛋白而制备Biacore传感器芯片，用于进行转铁蛋白和转铁蛋白受体之间的相互作用分析。具体地，在25℃使用氨耦合化学，将抗转铁蛋白受体(抗-TfR)抗体固定化在CM5传感器芯片表面(GE Healthcare目录号BR-1000-14)。通过加入N-羟基琥珀酰亚胺：N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(NHS：EDC)，将CM5传感器芯片流动池上的羧甲基化的右旋糖酐表面转化成活性的琥珀酰胺酯(succinamideester)。

    在由溶剂或类似物使样品标本在芯片上流动以去除所谓的本体效应时，同时制备具有固定化蛋白质而不是转铁蛋白受体的传感器芯片，并扣除共振单位的变化，从而可确认(转铁蛋白)受体的特异性结合。将抗-TfR抗体(AbDSerotec目录号MCA1148)在10mM乙酸pH 5.0(GE Healthcare cataloguenumber BR-1003-50)中稀释至10μg.mL^-1，并仅注入流动池2。同时将50μl转铁蛋白受体(TfR)(AbD Serotec目录号9110-300)(用HBS-EP(10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P-20，pH 7.4)稀释至10-20μg.mL^-1)注入两个流动池中。使用乙醇胺氢氯化物(1M pH 8.5)使传感器芯片表面上过量的酯基团失活。

    使用HBS-EP作为电泳缓冲液和稀释缓冲液，用于相互作用分析。将纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415A，T613A)或纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415C，T613A)稀释至10μg.mL^-1，并向两个流动池注入50μL。进行重复实验以确保可重复性。通过在样品注入之间8-12s注入10mM乙酸钠pH 4.5(GEHealthcare目录号BR-1003-50)，而在加入纯化的重组转铁蛋白变体之间再生制备的Biacore传感器芯片表面。进行了多至三次注射后，根据需要直到恢复基线。

    根据SPR分析，纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415C，T613A)的受体结合能力看来不同于纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415A，T613A)。纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415A，T613A)给出最大响应59.3(n＝3)，而纯化的加载铁的重组转铁蛋白(S415C，T613A)给出最大响应44.6(n＝3)，表明与重组转铁蛋白(S415C，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的转铁蛋白受体结合能力有功能性差异。这表明重组转铁蛋白(S415A，T613A)突变体优选用于控制N-连接的糖基化。

    实施例7：与重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的质谱分析

    ESI-TOF质谱分析是研究翻译后变化和蛋白质中其它修饰的强大方法。它能提供±0.01％的质量精确度(对于转铁蛋白可低至几个道尔顿)，并且能区别相差少至20道尔顿的种类。

    通过ESITOF质谱仪分析重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)的样品，并与纯化的重组转铁蛋白(S415A，T613A)的样品比较。

    分别从菌株1[pDB3778]和菌株1[pDB3237]的高细胞密度补料批式发酵纯化重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S415A，T613A)的样品，同时通过由10000Da分子量截留旋转柱(SartoriusVivaspin20-10000MWCO)浓缩15mL上清液而从菌株1[pDB3768]摇瓶上清液纯化重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)。根据制造商的说明离心重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)样品，然后使用15mL 0.1％三氟乙酸(TFA)重新平衡。将重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)样品重悬于1.2mL 0.1％TFA中，并转移至微型离心管，然后进行HPLC脱盐。使用反相HPLC(RP.HPLC)将0.5mL转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)样品脱盐/浓缩。

    以测试蛋白质的水溶液形式制备所有样品进行质谱分析，所述溶液使用RP HPLC脱盐/浓缩，使回收蛋白质的浓度通常为20-100nmol.mL^-1。在Brownlee Aquapore BU-300(C4)7mm，100x2.1mm柱上进行RP HPLC脱盐，方法使用0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)作为溶剂A，并且70％(v/v)乙腈、0.1％(v/v)TFA作为溶剂B的二元梯度，并收集通过在280nm处的UV吸光度检出的洗脱的组分。飞行时间质谱：将样品导入混合的四极飞行时间质谱仪(QqOaTOF，Applied Biosystems，QSTAR-)，其配备有阳离子模式的IonSprayTM源，使用流动注射分析(FIA)。活性调节的唯一的设备参数是去耦电势(DP)，通常设为250V。通常，将多个2分钟样品扫描平均。对于蛋白质分析，针对质子化的分子离子马肌红蛋白(Sigma)校准TOF分析仪，并且分辨率通常为12000。使用AnalystTM QS v 1.1软件(Applied Biosystems)进行设备控制和数据获取与处理。

    转铁蛋白(S415A，T613A)的质谱分析显示两个峰(图23)。在这种情况下，一个峰(图23中标为“A”)对应于未修饰的转铁蛋白(S415A，T613A)分子，表观质量为75097(理论质量为75098Da)(图23中的谱1)。还有一个大峰(图23中标为“B”)，预期其由于加入了单己糖而增加了162道尔顿。这可能代表了O-连接的糖基化。在丝氨酸-32处具有突变的重组转铁蛋白的质谱分析仅显示一个峰。转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的质谱分析仅显示一个主峰。图23中标为“C”的峰对应于未修饰的转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)分子，表观质量为75112(理论质量为75114Da)(图23中的谱2)。此外，转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)的质谱分析仅显示一个主峰。图23中标为“D”的峰对应于未修饰的转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)分子，表观质量为75082(理论质量为75080Da)(图23中的谱3)。这个结果表明丝氨酸-32的突变防止在这个位置发生O-连接的糖基化。

    实施例8：与重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的伴刀豆球蛋白A分析

    由于与包含α-甘露糖残基的寡糖链高度的亲和性，伴刀豆球蛋白A(ConA)已广泛用于糖蛋白的研究。将重组转铁蛋白(S415A，T613A)、重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)的纯化样品进行ConA琼脂糖亲和层析，通过RP.HPLC确定加载的样品和洗脱液的浓度，允许计算％ConA结合材料(表4)。

    表4：与重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)相比，重组转铁蛋白(S415A，T613A)的伴刀豆球蛋白A分析。

       样品  上样  体积  (mL)  上样  浓度  mg.  mL^-1  总上  样量  (mg)  洗脱  液体  积  (mL)  洗脱  液浓  度  mg.  mL^-1  总洗  脱物  (mg)  分析1  洗脱  液回  收率％  (w/w)  分析2  洗脱  液回  收率％  (w/w)  转铁蛋白(S32C，  S415A，T613A)  10  10.45  104.50  6  0.044  0.26  0.25  0.26  转铁蛋白(S32A，  S415A，T613A)  10  9.88  98.80  6  0.024  0.14  0.15  -  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品1  1  10.27  10.27  6  0.148  0.89  8.65  8.19  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品2  1  12.88  12.88  6  0.138  0.83  6.43  -

       样品  上样  体积  (mL)  上样  浓度  mg.  mL^-1  总上  样量  (mg)  洗脱  液体  积  (mL)  洗脱  液浓  度  mg.  mL^-1  总洗  脱物  (mg)  分析1  洗脱  液回  收率％  (w/w)  分析2  洗脱  液回  收率％  (w/w)  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品3  1  15.15  15.15  6  0.135  0.81  5.35  -  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品4  1  11.26  11.26  6  0.123  0.74  6.55  7.36  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品5  1  13.87  13.87  6  0.097  0.58  4.20  5.78  转铁蛋白(S415A，  T613A)样品6  1  11.57  11.57  6  0.120  0.72  6.22  7.00

    通过将4mL 50％(v/v)浆料ConA琼脂糖珠：ComA平衡缓冲液(100mMNaOAc，100mM NaCl，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM CaCl₂pH 5.5)分散到2mL一次性柱上而制备ConA柱。以约10mg.mL^-1，通过在ConA稀释缓冲液(200mM NaOAc，85mM NaCl，2mM MgCl₂，2mM MnCl₂，2mM CaCl₂，pH5.5)中以1∶1稀释而制备转铁蛋白样品(约20mg.mL^-1)。通过RP.HPLC确认稀释的“加载”样品的浓度。排空ConA柱并用5mL ConA平衡缓冲液(100mMNaOAc，100mM NaCl，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM CaCl₂pH 5.5)平衡。

    将1ml重组转铁蛋白(S415A，T613A)加载至2mL ConA柱上，而将10mL重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)和重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)加载至2mL ConA柱上。用ConA平衡缓冲液将柱洗涤三次，并用6mL ConA洗脱缓冲液(100mM NaOAc，100mM NaCl，0.5M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷，pH 5.5)洗脱。通过RP.HPLC确定洗脱样品的浓度(表4)。

    约6.6％重组转铁蛋白(S415A，T613A)(n＝10)结合至ConA，而只有0.25％(n＝2)的重组转铁蛋白(S32C，S415A，T613A)和0.15％(n＝1)的重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)能结合ConA，证明转铁蛋白中丝氨酸-32的突变引起O-连接的糖基化的降低，并且重组转铁蛋白(S32A，S415A，T613A)是控制重组产物糖基化的优选突变体。

    【序列表】

    <110>诺维信生物制药丹麦公司(Novozymes Biopharma DK A/S)

     

    <120>重组转铁蛋白突变体

     

    <130>11258.204-WO

     

    <160>19

     

    <170>PatentIn version 3.5

     

    <210>1

    <211>679

    <212>PRT

    <213>人(Homo Sapiens)

     

    <400>1

     

    Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala

    1               5                  10                  15

    Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser

                20                  25                  30

    Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys

            35                  40                  45

    Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala

        50                  55                  60

    Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val

    65                  70                  75                  80

    Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr

                   85                  90                  95

    Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu

                100                 105                 110

    Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp

            115                 120                 125

    Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys

        130                 135                 140

    Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro

    145                 150                 155                 160

    Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly

                   165                 170                 175

    Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe

                180                 185                 190

    Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser

            195                 200                 205

    Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu

        210                 215                 220

    Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp

    225                 230                 235                 240

    Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met

                    245                 250                 255

    Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu

                260                 265                 270

    His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro

            275                 280                 285

    His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys

        290                 295                 300

    Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val

    305                 310                 315                 320

    Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr

                    325                 330                 335

    Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg

                340                 345                 350

    Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys

            355                 360                 365

    Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly

        370                 375                 380

    Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly

    385                 390                 395                 400

    Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp

                    405                 410                 415

    Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val

                420                 425                 430

    Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys

            435                 440                 445

    Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met

        450                 455                 460

    Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe

    465                 470                 475                 480

    Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys

                    485                 490                 495

    Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu

                500                 505                 510

    Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly

            515                 520                 525

    Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly

        530                 535                 540

    Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu

    545                 550                 555                 560

    Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn

                    565                 570                 575

    Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp

               580                 585                 590

    Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe

            595                 600                 605

    Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser

        610                 615                 620

    Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys

    625                 630                 635                 640

    Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val

                    645                 650                 655

    Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu

                660                 665                 670

    Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

        675

    <210>2

    <211>679

    <212>PRT

    <213>人(Homo Sapiens)

     

    <400>2

     

    Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala

    1               5                   10                  15

    Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser

                20                  25                  30

    Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys

            35                  40                  45

    Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala

        50                  55                  60

    Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val

    65                  70                  75                  80

    Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr

                    85                  90                  95

    Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu

                100                 105                 110

    Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp

            115                 120                 125

    Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys

        130                 135                 140

    Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro

    145                 150                 155                 160

    Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly

                    165                 170                 175

    Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe

                180                 185                 190

    Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser

            195                 200                 205

    Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu

        210                 215                 220

    Leu Leu Cye Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp

    225                 230                 235                 240

    Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met

                    245                 250                 255

    Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu

                260                 265                 270

    His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro

            275                 280                 285

    His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys

        290                 295                 300

    Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val

    305                 310                 315                 320

    Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr

                    325                 330                 335

    Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg

                340                 345                 350

    Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys

            355                 360                 365

    Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly

        370                 375                 380

    Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly

    385                 390                 395                 400

    Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ala Asp

                    405                 410                 415

    Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val

                420                 425                 430

    Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys

            435                 440                 445

    Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met

        450                 455                 460

    Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe

    465                 470                 475                 480

    Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys

                    485                 490                 495

    Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu

                500                 505                 510

    Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly

            515                 520                 525

    Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly

        530                 535                 540

    Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu

    545                 550                 555                 560

    Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn

                    565                 570                 575

    Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp

                580                 585                 590

    Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe

            595                 600                 605

    Gly Ser Asn Val Ala Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser

        610                 615                 620

    Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys

    625                 630                 635                 640

    Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val

                    645                 650                 655

    Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu

                660                 665                 670

    Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

            675

     

    <210>3

    <211>2040

    <212>DNA

    <213>人(Homo Sapiens)

     

    <400>3

    gtccctgata aaactgtgag atggtgtgca gtgtcggagc atgaggccac taagtgccag    60

    agtttccgcg accatatgaa aagcgtcatt ccatccgatg gtcccagtgt tgcttgtgtg    120

    aagaaagcct cctaccttga ttgcatcagg gccattgcgg caaacgaagc ggatgctgtg    180

    acactggatg caggtttggt gtatgatgct tacctggctc ccaataacct gaagcctgtg    240

    gtggcagagt tctatgggtc aaaagaggat ccacagactt tctattatgc tgttgctgtg    300

    gtgaagaagg atagtggctt ccagatgaac cagcttcgag gcaagaagtc ctgccacacg    360

    ggtctaggca ggtccgctgg gtggaacatc cccataggct tactttactg tgacttacct    420

    gagccacgta aacctcttga gaaagcagtg gccaatttct tctcgggcag ctgtgcccct    480

    tgtgcggatg ggacggactt cccccagctg tgtcaactgt gtccagggtg tggctgctcc    540

    acccttaacc aatacttcgg ctactcggga gccttcaagt gtctgaagga tggtgctggg    600

    gatgtggcct ttgtcaagca ctcgactata tttgagaact tggcaaacaa ggctgacagg    660

    gaccagtatg agctgctttg cctggacaac acccggaagc cggtagatga atacaaggac    720

    tgccacttgg cccaggtccc ttctcatacc gtcgtggccc gaagtatggg cggcaaggag    780

    gacttgatct gggagcttct caaccaggcc caggaacatt ttggcaaaga caaatcaaaa    840

    gaattccaac tattcagctc tcctcatggg aaggacctgc tgtttaagga ctctgcccac    900

    gggtttttaa aagtcccccc caggatggat gccaagatgt acctgggcta tgagtatgtc    960

    actgccatcc ggaatctacg ggaaggcaca tgcccagaag ccccaacaga tgaatgcaag    1020

    cctgtgaagt ggtgtgcgct gagccaccac gagaggctca agtgtgatga gtggagtgtt    1080

    aacagtgtag ggaaaataga gtgtgtatca gcagagacca ccgaagactg catcgccaag    1140

    atcatgaatg gagaagctga tgccatgagc ttggatggag ggtttgtcta catagcgggc    1200

    aagtgtggtc tggtgcctgt cttggcagaa aactacaata aggctgataa ttgtgaggat    1260

    acaccagagg cagggtattt tgctgtagca gtggtgaaga aatcagcttc tgacctcacc    1320

    tgggacaatc tgaaaggcaa gaagtcctgc catacggcag ttggcagaac cgctggctgg    1380

    aacatcccca tgggcctgct ctacaataag atcaaccact gcagatttga tgaatttttc    1440

    agtgaaggtt gtgcccctgg gtctaagaaa gactccagtc tctgtaagct gtgtatgggc    1500

    tcaggcctaa acctgtgtga acccaacaac aaagagggat actacggcta cacaggcgct    1560

    ttcaggtgtc tggttgagaa gggagatgtg gcctttgtga aacaccagac tgtcccacag    1620

    aacactgggg gaaaaaaccc tgatccatgg gctaagaatc tgaatgaaaa agactatgag    1680

    ttgctgtgcc ttgatggtac caggaaacct gtggaggagt atgcgaactg ccacctggcc    1740

    agagccccga atcacgctgt ggtcacacgg aaagataagg aagcttgcgt ccacaagata    1800

    ttacgtcaac agcagcacct atttggaagc aacgtagctg actgctcggg caacttttgt    1860

    ttgttccggt cggaaaccaa ggaccttctg ttcagagatg acacagtatg tttggccaaa    1920

    cttcatgaca gaaacacata tgaaaaatac ttaggagaag aatatgtcaa ggctgttggt    1980

    aacctgagaa aatgctccac ctcatcactc ctggaagcct gcactttccg tagaccttaa    2040

     

    <210>4

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工的

    <220>

    <223>寡核苷酸

     

    <400>4

    ggcagaaaac tacaataagg ctgataattg tgaggataca cc    42

     

    <210>5

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸CF 157

     

    <400>5

    ggtgtatcct cacaattatc agccttattg tagttttctg cc    42

     

    <210>6

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸CF 158

     

    <400>6

    gcacctattt ggaagcaacg tagctgactg ctcgggcaac ttttg 45

     

    <210>7

    <211>45

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸CF 159

     

    <400>7

    caaaagttgc ccgagcagtc agctacgttg cttccaaata ggtgc 45

     

    <210>8

    <211>24

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 181

     

    <400>8

    ctcaaccagg cccaggaaca tttt                         24

     

    <210>9

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS182

     

    <400>9

    agagaccacc gaagactgc                               19

     

    <210>10

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工的DS 183

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 183

     

    <400>10

    aaccactgca gatttgatg        19

     

    <210>11

    <211>18

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 184

     

    <400>11

    gccagagccc cgaatcac         18

     

    <210>12

    <211>22

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 185

     

    <400>12

    atttttcata tgtgtttctg tc    22

     

    <210>13

    <211>20

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 186

     

    <400>13

    ttcacaaagg ccacatctcc       20

     

    <210>14

    <211>18

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸DS 187

     

    <400>14

    caaaataccc tgcctctg         18

     

    <210>15

    <211>17

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸M13-F

     

    <400>15

    gtaaaacgac ggccagt          17

     

    <210>16

    <211>16

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>寡核苷酸M13.R

     

    <400>16

    aacagctatg accatg    16

     

    <210>17

    <211>679

    <212>PRT

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>转铁蛋白突变体

     

    <400>17

     

    Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala

    1               5                   10                  15

    Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ala

                20                  25                  30

    Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys

            35                  40                  45

    Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala

        50                  55                  60

    Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val

    65                  70                  75                  80

    Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr

                    85                  90                  95

    Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu

                100                 105                 110

    Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp

            115                 120                 125

    Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys

        130                 135                 140

    Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro

    145                 150                 155                 160

    Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly

                    165                 170                 175

    Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe

                180                 185                 190

    Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Ala Phe Val Lvs His Ser

            195                 200                 205

    Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu

        210                 215                 220

    Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp

    225                 230                 235                 240

    Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met

                    245                 250                 255

    Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu

                260                 265                 270

    His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro

            275                 280                 285

    His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys

        290                 295                 300

    Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val

    305                 310                 315                 320

    Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr

                    325                 330                 335

    Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg

                340                 345                 350

    Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys

            355                 360                 365

    Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly

        370                 375                 380

    Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly

    385                 390                 395                 400

    Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ala Asp

                    405                 410                 415

    Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val

                420                 425                 430

    Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys

            435                 440                 445

    Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met

        450                 455                 460

    Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe

    465                 470                 475                 480

    Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys

                    485                 490                 495

    Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu

                500                 505                 510

    Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly

            515                 520                 525

    Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly

        530                 535                 540

    Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu

    545                 550                 555                 560

    Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn

                    565                 570                 575

    Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp

                580                 585                 590

    Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe

            595                 600                 605

    Gly Ser Asn Val Ala Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser

        610                 615                 620

    Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys

    625                 630                 635                 640

    Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val

                    645                 650                 655

    Lys Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu

                660                 665                 670

    Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro

            675

    <210>18

    <211>2359

    <212>DNA

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>DNA构建体

     

    <400>18

    cttaagagtc caattagctt catcgccaat aaaaaaacaa gcttaaccta attctaacaa    60

    gcaaagatgt tgttgcaagc ttttttgttt ttgttggctg gttttgctgc taaaatttct    120

    gctgttccag ataaaacagt tagatggtgt gctgtttctg aacatgaagc tactaaatgt    180

    caatctttta gagatcatat gaaatctgtt attccatctg atggtccatc tgttgcttgt    240

    gttaaaaaag cttcttattt ggattgtatt agagctattg ctgctaatga agctgatgct    300

    gttactttgg atgctggttt agtttatgat gcttatttgg ctccaaacaa tttgaaacca    360

    gttgttgctg aattttatgg ttctaaggaa gatccacaaa ctttttatta tgctgtagcc    420

    gttgtaaaaa aggattcagg ttttcaaatg aatcaattga gaggtaaaaa atcttgtcat    480

    actggtttag gtagatctgc tggatggaat attccaattg gtttgttgta ttgtgatttg    540

    ccagaaccaa gaaaaccatt ggaaaaagct gttgctaatt ttttttctgg ttcttgtgct    600

    ccatgtgctg atggtacaga ttttccacaa ttgtgtcaat tatgtccagg ttgtggttgt    660

    tctactttga atcaatattt tggttattct ggtgctttta aatgtttgaa agatggtgct    720

    ggtgatgttg cttttgttaa acattctact atttttgaaa atttggcaaa caaagctgat    780

    agagatcaat atgaattgtt gtgtttggat aatactagaa aaccagttga tgaatataaa    840

    gattgtcatt tggctcaagt tccatctcat actgttgttg ctagatctat gggtggtaaa    900

    gaagatttga tttgggaatt gttgaatcaa gctcaagaac attttggtaa agataaatct    960

    aaagaatttc aattgttttc ttctccacat ggtaaagatt tgttgtttaa agattctgct    1020

    catggttttt tgaaagttcc accaagaatg gatgctaaaa tgtatttggg ttatgaatac    1080

    gttactgcta ttagaaattt gagagaaggt acttgtccag aagctccaac tgatgaatgt    1140

    aaaccagtta aatggtgtgc tttgtctcat catgaaagat taaaatgtga tgaatggtct    1200

    gttaattctg ttggtaaaat tgaatgtgtt tctgctgaaa ctacagaaga ttgtattgct    1260

    aaaattatga atggtgaagc tgatgctatg tctttagatg gtggttttgt atatattgct    1320

    ggtaaatgtg gtttagttcc agttttggct gaaaattata acaaagctga taattgtgaa    1380

    gatactccag aagctggtta ttttgctgtt gctgttgtta aaaaatctgc ttctgatttg    1440

    acttgggata atctaaaagg aaaaaagagt tgccatacag ctgttggaag aacagccgga    1500

    tggaacattc caatgggatt gctatacaac aaaattaatc attgtagatt tgatgaattt    1560

    ttttctgaag gttgtgctcc aggttctaaa aaagattctt ctttgtgtaa attgtgtatg    1620

    ggttctggat tgaatttgtg tgaaccaaac aacaaggaag gttattatgg ttatactggt    1680

    gcttttagat gtttagttga aaaaggtgat gttgcttttg ttaaacatca aacagttcca    1740

    caaaatactg gtggtaaaaa tccagatcca tgggctaaaa atttgaatga aaaagattac    1800

    gaattactat gtttagatgg tacaagaaag ccagttgagg aatacgctaa ttgtcattta    1860

    gctagagcac caaatcatgc tgttgttact agaaaagata aagaagcttg tgttcataaa    1920

    attttgagac aacaacaaca tttgtttggt tctaatgttg ctgattgttc tggtaatttt    1980

    tgtttgttta gatctgaaac taaagattta ttgtttagag atgatactgt ttgtttggct    2040

    aaattgcatg atagaaatac ttatgaaaaa tatttgggtg aagaatacgt taaagctgtt    2100

    ggtaatttga gaaaatgttc tacttcttct ttgttggaag cttgtacttt tagaaggcca    2160

    taataagctt aattcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata    2220

    agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt    2280

    aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac    2340

    cacacctcta ccggcatgc                                                 2359

     

    <210>19

    <211>19

    <212>PRT

    <213>人工的

     

    <220>

    <223>转化酶前导序列

     

    <400>19

     

    Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

    1               5               10                      15

    Ile Ser Ala