LH 液体制剂 【发明领域】
本发明涉及促黄体生成素 (LH) 的液体药物制剂领域， 也涉及这种制剂的生产方法。 发明背景
促黄体生成素 (LH)、 卵泡刺激素 (FSH) 和绒毛膜促性腺激素 (CG) 是可以注射的蛋 白质， 属于促性腺激素类。LH、 FSH 和 CG 单独或联合使用可以治疗不孕症和女性和男性患 者的生殖系统疾病。
在自然界中， FSH 和 LH 由垂体产生。作为药物使用的 FSH 和 LH 及其变体可以重 组制得 (rFSH 和 rLH)， 也可以从绝经后妇女的尿液中制得 (uFSH 和 uLH)。
FSH 在女性患者中用于促排卵 (OI) 和控制卵巢过度刺激 (COH)， 作为一种辅助生 殖技术 (ART)。经典的促排卵治疗方案是， 每天给患者注射 FSH 或 FSH 变体 ( 大约 75 至 300IU FSH/ 天 )， 持续大约 6 至 12 天的时间。经典的控制性卵巢过度刺激的治疗方案是， 每天给患者注射 FSH 或 FSH 变体 ( 大约 150-600IU FSH/ 天 )， 持续大约 6 至 12 天的时间。
FSH 也用于男性少精症患者， 可以诱导精子生成。150IU FSH 每周三次给药合并 2500IU hCG 每周二次使用的给药方案已经成功地使男性低促性腺激素型性腺功能减退症 患者的精子数量得到提高 (Burgues 等， 1997 年 )。
LH 与 FSH 联合用于治疗女性 OI 和 COH 患者， 特别是那些内源性 LH 水平非常低或 对 LH 具有抗性的患者， 比如患有低促性腺激素型性腺功能减退症 (HH， WHO 第 1 组 ) 的病人 或者年纪稍大的患者 ( 即 35 岁或以上者 )， 以及存在胚胎着床或早期流产问题的患者。LH 与 FSH 的联合传统上有一种称为人绝经期促性腺激素 (hMG) 的制剂， 从绝经后妇女的尿液 中分离得到。hMG 与比例为 1 ∶ 1 的 FSH ∶ LH 的活性相当。
CG 作用在与 LH 相同的受体上， 引起同样的效应。CG 的循环半衰期比 LH 长， 因此， 通常作为 LH 活性的长效来源使用。CG 在 OI 和 COH 的治疗方案中用来模拟天然 LH 的峰值 水平， 诱发排卵。在用 FSH 或 FSH 与 LH 的混合物进行刺激的末期， 注射人绒毛膜促性腺激 素 (hCG) 用以诱发排卵。在治疗 OI 和 COH 的刺激周期， CG 也可以与 FSH 一起使用， 目的是 在刺激周期为需要 LH 的患者提供 LH 活性， 如上所述。
FSH、 LH 和 CG 是杂二聚体、 糖蛋白激素家族的成员， 该家族还包括促甲状腺激素 (TSH)。这个家族的成员是包括一个 α 亚基和一个 β 亚基的杂二聚体。亚基之间通过非 共价作用相互连接。人 FSH(hFSH) 杂二聚体的组成如下 ： (1) 成熟肽 92 个氨基酸组成的糖 蛋白 α 亚基， 这个亚基为另一个人家族成员 ( 即绒毛膜促性腺激素 (“CG” )、 促黄体生成 素 (“LH” ) 和促甲状腺激素 (“TSH” )) 所共有 ； (2) 成熟肽 111 个氨基酸组成的 β 亚基， 这是 FSH 所独有的 (Shome 等， 1974 和 1988 年 )。人 LH 杂二聚体组成如下 ： (1) 成熟肽 92 个氨基酸组成的糖蛋白 α 亚基 ； (2) 成熟肽 112 个氨基酸组成的 β 亚基， 这是 LH 所独有 的 (Keutmann 等， 1979 年 ； Talmadge 等， 1984 年 ； Fiddes 和 Talmadge， 1984 年 )。由于与防 腐剂、 表面活性剂和其他辅料的相互作用， 糖蛋白的 α 和 β 亚基在制剂中可能容易发生游 离。这些亚基的游离会导致生物活性的丧失 (Reichert 和 Ramsey， 1975 年 )。
FSH 制成肌肉注射 (IM) 或皮下注射 (SC) 制剂。FSH 以冻干 ( 固体 ) 形式供应， 装 在小瓶或安瓿瓶中， 75IU/ 瓶和 150IU/ 瓶， 贮存在 2-25℃下的保质期约为两年。用注射用 水 (WFI) 将冻干产品重建形成注射溶液。对于诱发排卵和控制卵巢过度刺激， 建议每日注 射， 初始剂量为 75IU 至 600IU， 注射至约 10 天。 根据患者的反应， 可以使用长达三个治疗周 期， FSH 剂量递增。使用冻干制剂， 患者需要每天向一瓶新的冻干材料中加稀释剂使其复原 为溶液， 并在复原后迅速给药。[ 包装说明书 N1700101A， 1996 年 2 月出版， FertinexTM( 注 射用尿促卵泡素， 纯化品 ) 皮下注射剂， SeronoLaboratories， Inc.， Randolph， MA].
FSH 也制成单剂量和多剂量液体形式， 装于小瓶或安瓿瓶中。 单剂量形式在使用前 的贮存过程中必须保持稳定并维持活性。
在安瓿密封完成后， 多剂量形式不仅必须在使用前的贮存过程中保持稳定并维持 活性， 而且必须在给药期的几天内保持稳定、 维持活性并保持相对无菌。为此， 多剂量形式 通常包含抑菌剂。
LH 制成肌肉注射 (IM) 或皮下注射 (SC) 制剂。LH 以冻干 ( 固体 ) 形式供应， 装在 小瓶或安瓿瓶中， 75IU/ 瓶， 贮存在 2-25℃下的保质期约为两年。用注射用水 (WFI) 将冻干 产品重建形成注射溶液。对于诱发排卵和控制卵巢过度刺激， 建议与 FSH 联合应用， 每日注 射 LH， 初始剂量为 75IU 至 600IU， 注射至约 10 天。
EP 0 618 808(Applied Research Systems ARS Holding N.V.) 公开了一种包含 促性腺激素和稳定量蔗糖 ( 单独或与甘氨酸组合 ) 的固体均质混合物的药物组合物。
EP 0 814 841(Applied Research Systems ARS Holding N.V.) 公开了一种稳定 的液体药物组合物， 包含重组人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 和稳定量的甘露醇。
WO 2004/087213(Ares Trading S.A.) 公开了一种液体和冻干药物组合物， 包含 卵泡刺激素 (FSH) 或其变体， 和 / 或促黄体生成素 (LH) 或其变体， 以及选自 F77、 Pluronic F87、 Pluronic F88 和 Pluronic F68 的表面活性剂。
WO 2004/112826(Ares Trading S.A.) 公开了一种冻干制剂， 包含卵泡刺激素 (FSH) 或其变体， 和促黄体生成素 (LH) 或其变体， 以及选自吐温 20、 吐温 40 和吐温 80 等聚 山梨醇酯的表面活性剂。
WO 00/04913(Eli Lilly and Co.) 公开了一种包含 FSH 或 FSH 变体和防腐剂的制 剂， 其中 FSH 包含一个 α 和 β 亚基， 防腐剂选自苯酚、 间甲酚、 对甲酚、 邻甲酚、 氯甲酚、 苯 甲醇、 羟苯甲酸烷基酯 ( 甲酯、 乙酯、 丙酯、 丁酯等 )、 苯扎氯铵、 苄索氯铵、 脱氢醋酸钠和硫 柳汞， 或其混合物的水溶性稀释液。
WO 2004/105788(Ferring B.V.) 公开了一种由负载在至少一种药学上可接受的 载体上的 FSH 和 hCG 组成的药物组合物。
EP 0 448 146(AKZO N.V.) 公开了一种稳定化的、 含促性腺激素的冻干粉针， 包含 促性腺激素和稳定量的二羧酸盐组成。
EP 0 853 945(Akzo Nobel N.V.) 公开了一种含促性腺激素的液体制剂， 其特征 在于， 该制剂包含促性腺激素和稳定量的多聚羧酸或其盐类和硫醚化合物。
对单剂量或多剂量给药用 LH 或 LH 变体的稳定液体制剂仍有需求。
发明概述
本发明的目的是提供 LH 或 LH 变体的液体制剂， 它们的制备方法， 以及它们在治疗生育疾病上作为药物或兽药应用的方法。
第一个方面， 本发明提供一种 LH 或 LH 变体的液体制剂， 包含纯化的 LH 或 LH 变体 制剂， 和稳定量的精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐。
第二个方面， 本发明提供了一种 LH 或 LH 变体液体制剂的制备方法， 包括的步骤是 1) 制成 LH 或 LH 变体的溶液， 和 2) 在上述溶液中加入稳定量的精氨酸或其盐类和 / 或赖氨 酸或其盐类。
第三个方面， 本发明提供一种 LH 或 LH 变体液体制剂的成品形式， 包含在消毒条件 下密封在适合使用前贮存的容器中的本发明所述的液体制剂。 容器可以是安瓿瓶、 小瓶、 注 射器或储药器。
第四个方面， 本发明提供一种人药用制品， 包含包装材料和装有本发明所述 LH 或 LH 变体液体制剂的容器以及抗菌剂， 其中所述的包装材料包含一个标签， 指明这个制剂在 第一次使用后可以保存 28 天或以上的时间。
本发明的另一目的是提供本发明所述的 LH 或 LH 变体液体制剂与 FSH 或 FSH 变体 液体制剂联合使用的用途。
附图简要说明 图 1 显示了 r-hLH 制剂在不同浓度 (6、 12 和 24μg/ml r-hLH)， 不同容器 ( 注 射器和储药器 ) 和不同灌装量 (0.25、 0.5 和 1ml) 情况下的色谱学性质比较 (SE-HPLC)。 除 r-hLH 以外， 这些制剂还包含磷酸盐缓冲液、 蔗糖、 吐温 20、 甲硫氨酸、 苯甲醇、 苯扎氯 铵和注射用水。点线对应于 0.25ml 的灌装量 ； 短划线对应于 0.5ml 的灌装量 ； 黑线对应 于 1ml 的灌装量。(A)6μg/ml r-hLH 制剂装于注射器中 ； (B)6μg/ml r-hLH 制剂装于储 药器中 ； (C)12μg/ml r-hLH 制剂装于注射器中 ； (D)12μg/ml r-hLH 制剂装于储药器中 ； (E)24μg/ml r-hLH 制剂装于注射器中 ； (F)24μg/ml r-hLH 制剂装于储药器中。 保留时间 在 8.5 分钟的峰对应于完整的杂二聚体 ( 通过非共价键连接的 α+β 亚基 )， 而较高保留时 间 ( 大约 9.5 分钟 ) 的峰对应于游离亚基。AU ： 吸光单位。
图 2 比较了合用与不合用抑菌剂的制剂用 SE-HPLC 法测得的杂二聚体百分比， 分 别是 SAC/500/24μgBACL_cart 和 SAC/500/24μg_cart。(A)+40 ℃贮存三天 (3d) 后测定 SE-HPLC ； (B)+33℃贮存八天 (8d)、 四周 (4w)、 六周 (6w)、 八周 (8w) 和十三周 (13w) 后测定 SE-HPLC。
发明详述
本发明的 LH 液体制剂具有改善的或更合适的性质或稳定性， 对女性和 / 或男性不 育症的治疗有用。
在一个优选实施方案中， 本发明的液体制剂是皮下注射和 / 或肌肉注射制剂。
本发明的 LH 或 LH 变体液体制剂的合适性质和稳定性， 通过防止或减少活性或稳 定性的降低， 或通过改善任何方面的给药有效性或满意度来获得， 例如， 通过给药方式、 频 率、 剂量、 舒适性、 易用性等中的至少一种。
促黄体生成素 (LH)， 如本文中所使用的， 是指作为全长成熟蛋白产生的 LH， 其中 包括但不仅限于人 LH 或 “hLH” ， 不管是重组产生的还是从人类来源， 如绝经后妇女的尿液 中分离得到的。
“LH 变体” 这一表述方式是为了涵盖氨基酸序列、 糖基化模式或亚基间的连接与人
LH 不同， 但却表现出 LH 活性的分子。
术语与 LH 相关的 “活性” ， 是指 LH 制剂或混合制剂引发与 LH 相关的生物反应的能 力， 例如精囊增重法 (Van Hell 等， 1964 年 )。LH 的生物活性依据认可的 LH 标准来评价。
活性的测量用每毫升溶液的国际单位数 (IU/ml) 来表示， 或者用每毫升溶液的 百万国际单位数 (MIU/ml) 来表示。 (1MIU/ml ＝ 1,000,000IU/ml)。 一个国际单位按照国立 健康研究院 ( 贝塞斯达， 马里兰州 )(National Instituteof Health， Bethesda， Maryland) 出版的 《研究参考试剂说明第 35 卷》 中的描述进行计算。
LH 或 LH 变体可用合适的方法生产， 例如重组方法， 若可能的话从天然来源中分离 或纯化， 或化学合成， 或它们的任何组合。
术语 “重组” 用来指通过运用重组 DNA 技术制得的 LH 或 LH 变体的制备 ( 例如见 WO 85/01958)。用重组技术表达 LH 的方法的一个实例是通过用编码 LH 的 α 和 β 亚基的 DNA 序列 ( 无论提供在一个载体还是两个载体上， 每个亚基具有一个单独的启动子 ) 转染真 核细胞， 如欧洲专利 EP 0 211 894 和 EP 0 487 512 所述。
另一个运用重组技术产生 LH 的例子是运用同源重组技术插入异源的调节片段， 可操作性地连接编码 LH 亚基的内源性序列， 如欧洲专利 EP 0 505500(Applied Research Systems ARS Holding NV) 所述。 卵泡刺激素 (FSH)， 如本文中所使用的， 是指作为全长成熟蛋白产生的 FSH， 其中 包括但不仅限于人 FSH 或 “hFSH” ， 不管是重组产生的还是从人类来源， 如绝经后妇女的尿 液中分离得到的。
“FSH 变体” 这一表述是为了涵盖氨基酸序列、 糖基化模式或亚基间的连接与人 FSH 不同， 但却表现出 FSH 活性的分子。
术语与 FSH 相关的 “活性” ， 是指 FSH 制剂或混合制剂引发与 FSH 相关生物反应的 能力， 例如 Steelman-Pohley 测定法中的精囊增重法 (Steelman 等， 1953 年 ) 或女性患者的 卵泡发育。女性患者的卵泡发育可以用超声来评估， 例如， 根据在刺激第 8 天平均直径达到 或约为 16mm 的卵泡数量。FSH 的生物活性依据认可的 FSH 标准来评价。
FSH 变体的例子包括 CTP-FSH， 一种长效修饰的重组 FSH， 由野生型 α- 亚基和杂交 β- 亚基组成， 其 hCG 的羧基末端肽已融合在 FSH β- 亚基的 C- 末端， 如 LaPolt 等 (1992 年 ) 或 Klein 等 (2003 年 ) 所述。还包括单链 CTP-FSH， 它是一个由以下序列 ( 从 N- 末端 到 C- 末端 ) 组成的单链分子 ：
βFSH
βhCG-CTP(113-145)αFSH其中 βFSH 表示 FSH 的 β- 亚基， βhCG-CTP(113-145) 表示 hCG 的羧基末端肽， αFSH 表示 FSH 的 α- 亚基， 如 Klein 等 (2002 年 ) 所述。
FSH 变体的其他例子包括具有掺入 α- 和 / 或 β- 亚基的额外糖基化位点的 FSH 分子， 如 WO 01/58493(Maxygen) 中所公开的， 尤其是 WO 01/58493 中的权利要求 10 和 11 所公开的 ； 以及具有亚基间 S-S 键的 FSH 分子， 如 WO98/58957 所公开的。
FSH 或 FSH 变体可用任何合适的方法产生， 例如重组法， 若可能的话从天然来源中 分离或纯化， 或化学合成， 或它们的任一组合。本发明所使用的 FSH 或 FSH 变体不仅可以用包括从哺乳动物细胞重组的方法制 备， 还可以从其他生物来源纯化得到， 例如来自尿液来源。 可接受的方法包括以下文献中所 述， Hakola 等 (1997 年 )， Keene 等 (1989 年 )， Cerpa-Poljak 等 (1993 年 )， Dias 等 (1994 年) ； Flack 等 (1994 年 )， Valove 等 (1994 年 )， 美国专利 3,119,740 和美国专利 5,767,067。
术语 “给与” 或 “给药” 指的是将本发明的制剂引入到需要用其治疗某一疾病或身 体状况的患者的体内。
术语 “患者” 指的是接受对某一疾病或身体状况治疗的一种哺乳动物。患者来自 于， 但不仅限于以下起源 ： 人类、 羊、 猪、 马、 牛、 兔等。
术语 “水稀释液” 是指含水的液体溶剂。水溶剂系统可以仅仅由水组成， 也可以由 水和另一种或多种易混溶的溶剂组成， 还可以包含溶解质如糖、 缓冲剂、 盐或其它赋形剂。 应用更普遍的非水溶剂是指短链有机醇 ( 例如甲醇、 乙醇、 丙醇 )， 短链酮类 ( 例如丙酮 )， 和多元醇 ( 例如甘油 )。
“等渗剂” 是指一种在生理学上能耐受的化合物， 它赋予制剂适当的张力， 以防止 跨细胞膜的水净流， 所述细胞膜与制剂接触。
化合物如甘油， 在已知浓度下被普遍用于上述目的。其他合适的等渗剂包括 ( 但 不限于 ) 氨基酸或蛋白质 ( 如甘氨酸或白蛋白 )， 盐 ( 如氯化钠 )， 和糖 ( 如葡萄糖， 蔗糖和 乳糖 )。 术语 “抑菌” 或 “抑菌剂” 是指添加到制剂中作为一个抗菌剂的化合物或组合物。 含有本发明所述制剂的可保存的 LH 或 LH 变体能很好地符合防腐剂效能的法定或监管指导 方针， 使其成为商业上可行的多用产品， 尤其在人用方面。
抑菌剂的例子包括苯酚、 间甲酚、 对甲酚、 邻甲酚、 氯甲酚、 苯甲醇、 羟苯甲酸烷基 酯 ( 甲酯、 乙酯、 丙酯、 丁酯等 )、 苯扎氯铵、 苄索氯铵、 脱氢醋酸钠和硫柳汞。
术语 “缓冲液” 或 “生理学上可接受的缓冲液” 是指制剂中已知对药用或兽药用安 全的化合物的溶液， 它们具有使制剂的 pH 值维持或控制在该制剂所需的 pH 范围内的作用。 控制 pH 值在适度酸性 pH 至适度碱性 pH 范围的可接受的缓冲液包括 ( 但不限于 ) 诸如磷 酸盐、 醋酸盐、 柠檬酸盐、 精氨酸、 TRIS 和组氨酸之类化合物。 “TRIS” 是指 2- 氨基 -2- 羟甲 基 -1， 3- 丙二醇， 及其任何药理上可接受的盐。较佳的缓冲液为含盐水或一种可接受的盐 的磷酸盐缓冲液。
术语 “磷酸盐缓冲液” 是指调节到所需 pH 值的含磷酸或其盐的溶液。一般来说， 磷酸盐缓冲液由磷酸或磷酸盐 ( 包括但不仅限于钠盐和钾盐 ) 制得。本技术领域的专业人 员所熟知的有几种磷酸盐， 例如酸的一元、 二元和三元钠盐和钾盐。 磷酸盐也被认为可以作 为盐的水合物形式出现。磷酸盐缓冲液可以覆盖一个 pH 值的范围， 例如从 pH 4 左右至 pH 10 左右， 优选的范围是从 pH 5 左右至 pH 9 左右， 更优选的范围是在 7.5 左右至 8.5 左右， 最优选的是在 pH 8.0 左右。
术语 “小瓶” 或 “容器” 泛指适合将 LH 和稀释剂在无菌状态下保存的贮液器。此 处所使用的小瓶的例子包括安瓿瓶、 储药器、 泡罩包装， 或适合将 LH 通过注射器、 泵 ( 包括 渗透泵 )、 导管、 透皮贴剂、 肺或透粘膜喷雾递送给病人的其他贮液器。 适合包装非肠道、 肺、 透粘膜或透皮给药产品的小瓶是本技术领域的专业人员所熟知的。
术语 “稳定性” 是指本发明制剂中 LH 的物理、 化学和构象稳定性 ( 包括维持生物
活性 )。 蛋白制剂的不稳定性可能是由于蛋白质分子的化学降解或聚集， 形成更高层次的聚 集物， 通过将杂二聚体解离为单体、 去糖基化、 糖基化修饰、 氧化 ( 特别是 α- 亚基 ) 或任何 其他结构修饰， 它们使本发明中所包含的 LH 多肽降低至少一种生物活性。
“稳定的” 溶液或制剂， 其蛋白质的降解、 修饰、 聚集、 生物活性降低等的程度被控 制在可接受的范围， 不随时间增加到难以接受的程度。该制剂最好能在 6 个月的时间里， 在 约 1-10℃的温度范围内， 更优选的是在约 2-8℃， 更优选的是在约 4-5℃温度范围内， 保持 至少或大约 80％标签所示的 LH 活性。LH 活性可以用精囊增重测试法进行测定。
术语 “治疗” 是指为了达到卵泡或睾丸刺激或任何其他由 LH 调节的生理反应的目 的， 而对需要给予 LH 的患者进行给药、 随访、 管理和 / 或照顾。因此， 治疗可以包括 ( 但不 限于 ) 给予 LH 用以诱导或提高精子质量， 刺激男性睾酮释放， 或刺激女性卵泡发育或诱导 女性排卵。
“多剂量使用” 这一表述旨在包括用单个安瓿、 小瓶或储药器容纳超过一次注射剂 量的 LH 制剂的情况， 例如 2、 3、 4、 5、 6 次或更多次的注射剂量。注射剂较佳为在至少或大约 12 小时、 24 小时、 48 小时等的时间内配制， 最好为少于等于或约 28 天的时间。
注射剂可以按时间段分隔， 例如， 按 6、 12、 24、 48 或 72 小时的时间。
蛋白质的 “盐” 是指酸加成盐或碱加成盐。 这种盐最好是由蛋白质中的一个或多个 带电荷基团与一个或多个生理上可接受的无毒阳离子或阴离子之间形成的。 有机盐和无机 盐包括， 例如， 由酸制备的盐， 如盐酸、 硫酸、 磺酸、 酒石酸、 富马酸、 氢溴酸、 乙醇酸、 柠檬酸、 马来酸、 磷酸、 琥珀酸、 醋酸、 硝酸、 苯甲酸、 抗坏血酸、 对甲苯磺酸、 苯磺酸、 萘磺酸、 丙酸、 碳 酸等的盐， 或例如， 铵、 钠、 钾、 钙或镁盐。
研究发现， 选自精氨酸、 赖氨酸、 或其混合物或盐的氨基酸是制备 LH 稳定液体制 剂的一个合适稳定剂。因此， 本发明第一个方面涉及含有促黄体生成素 (LH) 或其变体的液 体促性腺激素制剂， 其特征在于， 所述的制剂包括稳定量的精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或 其盐。
该液体制剂中包含的精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐的稳定剂量是在或大约 在 10 至 150mg/ml 总配方的浓度范围， 更优选的是在或大约在 20 至 60mg/ml。
优选的精氨酸或其盐的浓度是在或大约在 10mg/ml 至 50mg/ml， 更优选的是在或 大约在 20mg/ml 至 40mg/ml， 尤其优选的是在或大约在 25mg/ml 至 35mg/ml， 最优选的是在 或大约在 31.5mg/ml。
优选的赖氨酸或其盐的浓度是在或大约在 10mg/ml 至 50mg/ml， 更优选的是在或 大约在 20mg/ml 至 40mg/ml， 尤其优选的是在或大约在 25mg/ml 至 35mg/ml， 最优选的是在 或大约在 28.5mg/ml。
该液体制剂中的促黄体生成素 (LH) 优选的存在浓度是达到或大约在 1 至 50μg/ ml 总配方的范围。
在一个实施方案中， 促黄体生成素 (LH) 的存在浓度达到或大约在 1 至 15μg/ml 总配方的范围， 尤其是当一次性使用时。
在另一个实施方案中， 促黄体生成素 (LH) 的存在浓度达到或大约在 15 至 30μg/ ml 总配方的范围， 尤其是当多次使用时 ( 多剂量 )。
制剂中 LH 的浓度优选是达到或约为 20IU/ml 至 2,000IU/ml， 更优选的是达到或大约为 50 至 1,000IU/ml， 尤其优选的是达到或大约为 100 至 600IU/ml。
LH 优选用重组方法产生， 尤其优选在用包含编码人糖蛋白 α- 亚基和 LHβ- 亚基 的 DNA 表达载体或载体转染的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中产生。编码 α- 和 β- 亚基的 DNA 可存在于相同或不同的载体上。
重组 LH 与从尿中获得的 LH 相比有几大优点。重组细胞培养与分离技术实现了批 次之间的一致性。相比之下， 从尿中获得 LH 批次之间在以下特征方面的差异很大， 如纯度、 糖基化模式、 唾液酸糖苷化及亚基氧化。由于批次之间的高度一致性和重组 LH 的高纯度， 这些激素可以很容易地使用诸如等电聚焦电泳 (IEF) 技术被识别和定量。重组 LH 的轻松 识别和定量使得药瓶的填充可以依据激素的质量 ( 按质量填充 )， 而不需要依赖生物活性 的测定。
本发明的液体制剂中最好含有缓冲液， 优选是磷酸盐缓冲液， 首选的反离子是钠 或钾离子。磷酸盐生理盐水缓冲液是本研究领域的专业人员所熟知的， 例如 Dulbecco’ s磷 酸盐缓冲生理盐水。 全部溶液中缓冲液的浓度可以在或大约在 1mM、 5mM、 9.5mM、 10mM、 50mM、 100mM、 150mM、 200mM、 250mM 和 500mM 之间变化。优选的缓冲液浓度为或大约为 10mM。尤其 优选的是 10mM 磷酸盐离子 pH 值 8.0 左右的缓冲液。 缓冲液最好以这样一种方式调整， 使本发明的液体制剂的 pH 值在约 7.0 至 9.0 左 右， 更优选的是在约 7.5 至 8.5 左右， 其中包括约 pH 7.8、 pH 8.0 和 8.2。
本发明是针对 LH 或 LH 变体的液体制剂， 可以是单剂量或多剂量制剂。
本发明的拟多剂量使用的液体 LH 制剂包含一种抑菌剂， 如苯酚、 间甲酚、 对甲酚、 邻甲酚、 氯甲酚、 苯甲醇、 羟苯甲酸烷基酯 ( 甲酯、 乙酯、 丙酯、 丁酯等 )、 苯扎氯铵、 苄索氯 铵、 脱氢醋酸钠和硫柳汞。优选的是苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵的组合。抑菌剂的使 用量以在多剂量注射期间 ( 可能是在约 12 或 24 小时至约 12 或 14 天， 较佳为在约 6 至约 28 天内 ) 产生有效维持制剂基本无菌 ( 适合注射 ) 的浓度为准。
抑菌剂的存在浓度优选是在或大约在 0.005 至 15mg/ml， 更优选是在或大约在 0.01 至 12mg/ml。
抑菌剂的存在浓度优选是在或大约在 0.1％ ( 抑菌剂质量 / 溶剂质量 ) 至 2.0％， 更优选是在或大约在 0.2％至 1.0％。
在使用苯甲醇的情况下， 特别优选的浓度是 0.9％或 1.2％。在使用苯酚的情况 下， 特别优选的浓度在或约 0.5％。对于苯甲醇和苯扎氯铵组合的情况， 特别优选的浓度分 别是 0.3％和 0.001％。
本发明的制剂最好含有一种抗氧化剂， 如甲硫氨酸、 亚硫酸氢钠、 乙二胺四乙酸 (EDTA) 盐、 二丁基羟基甲苯 (BHT)、 丁基羟基苯甲醚 (BHA)。最优选的是甲硫氨酸。抗氧化 剂可以防止 LH( 特别是 α- 亚基 ) 的氧化。
抗氧化剂， 例如甲硫氨酸的存在浓度最好在或大约在 0.01 至 5.0mg/ml， 更优选的 是在或大约在 0.05 至 0.5mg/ml。
本发明的制剂最好含有一种表面活性剂。该表面活性剂优选自聚山梨醇酯， 特别 是吐温 20( 聚氧乙烯 (20) 山梨醇单月桂酸酯 )、 吐温 40( 聚氧乙烯 (20) 山梨醇单棕榈酸 酯 ) 和吐温 80( 聚氧乙烯 (20) 山梨醇单油酸酯 )。最优选的是吐温 20， 优选浓度是在或大 约在 0.01 至 10mg/ml 的范围内。
在一个优选的实施方案中， 本发明的制剂包括至少 25μg/ml r-hLH、 1.65mg/ ml Na2HPO4 2H2O、 0.104mg/ml NaH2PO4 H2O、 31.5mg/ml 精氨酸盐酸盐、 0.05mg/ml 吐温 20、 0.5mg/ml 甲硫氨酸和 5mg/ml 苯酚。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的制剂包括至少 25μg/ml r-hLH、 1.65mg/ ml Na2HPO4 2H2O、 0.104mg/ml NaH2PO4 H2O、 28.5mg/ml 赖氨酸盐酸盐、 0.05mg/ml 吐温 20、 0.5mg/ml 甲硫氨酸和 12mg/ml 苯甲醇。
在另一个优选的实施例中， 本发明的制剂包括至少 25μg/ml r-hLH、 1.65mg/ ml Na2HPO4 2H2O、 0.104mg/ml NaH2PO4 H2O、 28.5mg/ml 赖氨酸盐酸盐、 0.05mg/ml 吐温 20、 0.5mg/ml 甲硫氨酸、 3mg/ml 苯甲醇和 0.01mg/ml 苯扎氯胺。
在一个优选的实施方案中， 本发明提供了一种供多剂量使用的液体组合物， 其中 包含 LH 或 LH 变体， 选自精氨酸、 赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂， 及选自苯甲醇、 苯酚和苯 甲醇与苯扎氯铵的混合物的抑菌剂。
在另一个优选的实施方案中， 本发明提供了一种制备供多剂量使用的液体药物组 合物的方法， 包括将 LH 或 LH 变体， 选自精氨酸、 赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂， 选自苯甲 醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂， 以及 WFI( 注射用水 )， 制成水溶液。 在另外一个优选的实施方案中， 本发明提供了一个生产包装药物组合物的方法， 包括配制含 LH 或 LH 变体， 选自精氨酸、 赖氨酸或其混合物或盐的稳定剂， 及选自苯甲醇、 苯 酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂的溶液。
在另一个优选实施方案中， 本发明提供了一个人用药物产品， 包含一个药瓶， 其中 含有由 LH 或 LH 变体， 选自精氨酸、 赖氨酸、 或其混合物或盐的稳定剂， 及选自苯甲醇、 苯酚 和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂组成的溶液， 以及一个标明这种溶液在第一次使用后 可以维持大约 24 小时或以上时间的标签。更好的是标签上标明这个溶液在第一次使用后 可以维持至大约 12 或 14 天。
第一次使用之前， 也就是在小瓶、 安瓿或储药器的密封损坏之前， 本发明的制剂可 以保持至少在大约 6 个月， 12 个月或 24 个月。
在优选的储存条件下， 在第一次使用之前， 将这些制剂保存在远离亮光的地方 ( 最好保存在黑暗处 )， 储存温度在约 2-8℃， 最好在约 4-5℃。
如上所述， 本发明提供了供单剂量和多剂量使用的、 含抑菌剂的 LH 或 LH 变体的液 体制剂。本发明的制剂适合于制药学或兽医学用途。
如上所述， 在一个优选实施方案中， 本发明提供了一个产品， 包括包装材料和药 瓶， 瓶内包含由 LH 或 LH 变体， 选自精氨酸、 赖氨酸、 或其混合物或盐的稳定剂， 选自苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂组成的溶液， 可任选地包含水稀释的缓冲液和 / 或其他辅料， 其中所述的包装材料包含一个标签， 标明这种溶液在第一次使用后可以维持 24 小时或以上的时间。
本发明的制剂在超过 24 个月的包装时间里 ( 第一次使用之前 ) 最好保持至少或 大约 80％的 LH 活性。LH 活性可以用大鼠精囊增重测试法 5 测定。
本发明的制剂可由以下方法制备， 该方法包括将 LH 或其变体， 稳定量的精氨酸或 其盐和 / 或赖氨酸或其盐， 以及可任选地选自苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的 抑菌剂以固体形式混合， 或将 LH 或其变体， 稳定量的精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐， 以
及可任选地选自苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂溶解在水稀释剂中。组 分的混合和在水稀释剂中的溶解按照常规的溶解和混合程序进行。 为了制备一个合适的制 剂， 例如， 将标准量的 LH 或 LH 变体的缓冲液溶液， 与精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐和 可任选地选自苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯铵混合物的抑菌剂的缓冲液溶液混合， 用量 足以提供所需浓度的蛋白质、 精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐和可任选的抑菌剂。然后 将所得溶液分配入药瓶、 安瓿或储药器。该制备工艺的改变是本研究领域具备普通技能的 人员可以认识到的。
例如， 组分的添加顺序、 是否使用其他添加剂、 制剂制备时的温度和 pH， 都是可以 根据给药浓度和给药方式来进行优化的因素。
在一个优选的实施方案中， 本发明制剂的制造通过制备所有制剂组分各自的已知 浓度储备液 ( 例如磷酸钠缓冲液、 精氨酸或其盐和 / 或赖氨酸或其盐、 吐温 20、 甲硫氨酸、 LH) 并按体积等分试液形成同一组合物的 “母液” 作为最终制剂。这个 “母液” 最好是通过 一个 (Millipore)0.22 微米 PDF 滤膜过滤， 以去除微生物， 然后将等分试液分配 入各容器， 如药瓶、 安瓿或储药器中。
本发明的制剂可与包含 FSH 或 FSH 变体 ( 如 ) 的制剂联合使用。 本发明的制剂可用经验证的设备给药。包含单瓶系统的例子， 包括笔式注射设 备， 用来递送溶液剂如 Pen、 Pen、 和
本发明要求保护的产品包括包装材料。除了监管机构所要求的资料外， 包装材料 还提供该产品可使用的条件。对于单瓶溶液产品， 标签应标明该溶液在第一次使用后可以 储存 24 小时或以上的时间， 最好是可以储存至 12 或 14 天。本发明要求保护的产品可用于 人类医药产品的使用。
下面的实施例仅对本发明的制剂和组合物的制备提供进一步的说明。 本发明的范 围不应解释为仅限于由以下实施例构成。
实施例
材料 项目 r-hLH L- 精氨酸盐酸盐 苯扎氯铵 苯甲醇 间甲酚 生产商 Laboratoires Serono SA 默克代码 1.01544 Fluka 代码 12063 默克代码 1.00987 默克代码 8.0969112101842083 A CN 101842084说项目 L- 甘氨酸 L- 赖氨酸盐酸盐 甲硫氨酸 苯酚明书生产商 默克代码 5.00190 默克代码 1.05701 默克代码 1.05707 默克代码 1.00200 默克代码 1.00563 默克代码 1.06498 默克代码 1.06580 默克代码 1.06346 默克代码 1.006649 Sigma 代码 S-1876 默克代码 1.07653 默克代码 1.08216 默克代码 8.22184 milliQ10/34 页磷酸 85％ (Ph Eur， BP， NF) 氢氧化钠 磷酸氢二钠二水合物 磷酸二氢钠一水合物 无水硫酸钠 山梨醇 蔗糖 海藻糖 吐温 20 水
下面的研究评估了大量制剂的以下参数 ： ·稳定剂和 / 或抑菌剂的研究 ·与 FSH 制剂的相容性 ·与基本包装的相容性 ·贮存后的稳定性特征 制剂是液体单剂量和多剂量制剂。对下列六种稳定剂进行了评价 ： ·L- 精氨酸盐酸盐 ( 实施例中的 ARG 或精氨酸 ) ·L- 赖氨酸盐酸盐 ( 实施例中的 LYS 或赖氨酸 ) ·海藻糖 (TRE) ·L- 甘氨酸 ( 实施例中的 GLY 或甘氨酸 ) ·蔗糖 (SAC)·山梨醇 (SOR)
对以下四种抑菌剂进行了多剂量制剂的评价 ：
·苯甲醇 (BA)
·间甲酚 (mCr)
·苯酚 (Phe)
·苯甲醇和苯扎氯铵的组合 (BACL)
实施例 1- 单剂量制剂的稳定剂研究
对六种稳定剂 ( 蔗糖、 精氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸、 山梨醇和海藻糖 ) 进行测试， 以提 供稳定的单剂量制剂。接受测试的制剂总结于表 1。
表 1. 含有不同稳定剂的若干 r-hLH 单剂量制剂的组成
组分 SAC/250 量 /ml r-hLH Na2HPO4 2H2O NaH2PO4 H2O 甲硫氨酸 吐温 20 蔗糖 精氨酸 甘氨酸 赖氨酸 山梨醇 海藻糖 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 105mg 足量至 注射用水 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 33mg 足量至 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 23mg 足量至 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 28mg 足量至 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 56,5mg 足量至 6μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 106mg 足量至 ARG/250 GLY/250 LYS/250 SOR/250 TRE/250q.s. ＝足量
每种溶液大约制备 40ml， 通过 0.22μm 滤膜过滤到 22ml 的不锈钢容器中， 并在 2-8℃， +25℃和 +40℃条件下， 储存于 15ml 塑料管中。 连续 1 个月测试该溶液的蛋白质含量 (SE-HPLC 法 )、 氧化形式 (RP-HPLC 法 )、 聚集物 (SE-HPLC 法 ) 和亚基形成 ( 定性， SE-HPLC 法 )。用于本制剂的整套测试的结果在表 2 至 5 中报告。
表 2.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +40℃ )
T ＝时间 ； d ＝天 表 3.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +25℃ )
M ＝月 表 4.RP-HPLC 法测得的氧化形式％制剂 SAC/250 12 天 (+40℃ ) 7,62 1 个月 (+25℃ ) 21,8415101842083 A CN 101842084说制剂 GLY/250 ARG/250 LYS/250 SOR/250 TRE/250明书1 个月 (+25℃ ) n.a. 9,59 4,90 24,58 10,4513/34 页12 天 (+40℃ ) 7,46 6,26 6,68 6,62 19,95
n.a. ＝未测定 表 5.SE-HPLC 法测得的 r-hLH 含量T＝1天 制剂 T＝0 (+40℃ ) SAC/250 GLY/250 ARG/250 LYS/250 SOR/250 TRE/250 5,50 6,10 6,30 6,00 5,30 5,40 4,20 5,10 6,70 4,80 4,80 4,80 (+40℃ ) 4,50 5,10 6,40 5,50 5,10 5,40 5,50 6,10 6,30 6,00 5,30 5,40 T＝4天 T＝0 (+25℃ ) 5,40 5,03 6,33 6,02 4,93 5,23 T ＝ 1 个月基于这些结果， 蔗糖、 赖氨酸和精氨酸被选定为最佳辅料， 以进一步研究其与递增 剂量 (250μg/ml 和 500μg/ml) 的抗氧化剂甲硫氨酸的相容性。 该测试溶液的组成见表 6。 应当注意的是， 这些溶液是从头配制的。
表 6. 包含选定的稳定剂和不同量甲硫氨酸的 r-hLH 单剂量制剂的组成
组分数量 /ml r-hLH Na2HPO4 2H2OSAC/250ARG/250LYS/250SAC/500ARG/500LYS/5006μg 1.65mg6μg 1.65mg6μg 1.65mg6μg 1.65mg6μg 1.65mg6μg 1.65mg16101842083 A CN 101842084说SAC/250 ARG/250明书SAC/500 ARG/50014/34 页组分数量 /ml NaH2PO4 H2O 甲硫氨酸 吐温 20 蔗糖 精氨酸 赖氨酸LYS/250LYS/5000.104mg 250μg 50μg 105mg 足量至0.104mg 250μg 50μg 33mg 足量至 1ml0.104mg 250μg 50μg 28mg 足量至 1ml0.104mg 500μg 50μg 105mg 足量至 1ml0.104mg 500μg 50μg 33mg 足量至 1ml0.104mg 500μg 50μg 28mg 足量至 1ml注射用水 1ml
每种溶液配制大约 100ml， 通过 0.22μm 滤膜过滤到 22ml 的不锈钢容器中， 并充填 入 1ml 玻璃注射器， 以测定药品与最终容器 (1ml 玻璃注射器 + 柱塞 ) 的相容性。注射器在 2-8℃， +25℃， +33℃和 +40℃条件下储存。+33℃储存温度的引入是为了在太快 (+40℃ ) 与 太慢 (+25℃ ) 的降解动力学性质中进行一个折衷。连续 2-3 个月测试该溶液的 r-hLH 含量 (SE-HPLC 法 )， 氧化形式 (RP-HPLC 法 )， 聚集物 (SE-HPLC 法 ) 和亚基形成 ( 定性， SE-HPLC 法 )。
用于表 6 所述制剂的整套测试的结果在表 7 至 11 中报告。
表 7.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +40℃ )
w ＝周 表 8.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +33℃ )
表 9.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +25℃ )
表 10.RP-HPLC 法测得的氧化形式％4天 制剂 (+40℃ ) SAC/250 SAC/500 ARG/250 ARG/500 LYS/250 LYS/500 6,13 17,37 6,29 4,69 5,24 3,25 (+25℃ ) 7,32 35,78 5,96 5,67 5,05 4,02 (+33℃ ) 9,72 39,12 9,72 6,69 8,00 5,71 (+33℃ ) 20,13 45,93 7,02 8,10 8,63 6,84 8周 4周 6周
表 11.SE-HPLC 法测得的 r-hLH 含量T＝4天 制剂 T＝0 (+40℃ ) SAC/250 5,03 3,09 (+25℃ ) 5,09 (+33℃ ) 5,31 (+33℃ ) 4,74 (+33℃ ) 未测定 T＝8周 T＝4周 T＝6周 T＝8周19101842083 A CN 101842084说T＝4天 T＝0 (+40℃ )明书T＝4周 (+33℃ ) 5,96 5,63 5,05 5,83 5,73 T＝6周 (+33℃ ) 5,63 5,34 未测定 5,58 5,49 T＝8周 (+33℃ ) 6,20 5,17 未测定 5,84 5,4817/34 页T＝8周 (+25℃ ) 6,00 5,50 4,25 5,74 5,61制剂SAC/500 ARG/250 ARG/500 LYS/250 LYS/500
6,27 5,90 5,00 6,14 6,084,92 3,74 3,36 4,54 3,91根据这些结果， 蔗糖与 250μg/ml 甲硫氨酸， 赖氨酸与 500μg/ml 甲硫氨酸， 精氨 酸与两种浓度的甲硫氨酸都具有较高的相容性。
实施例 2-r-hLH 单剂量液体制剂与 FSH 多剂量液体制剂的相容性 鉴于实施例 1 所披露的结果， 表 6 所描述的制剂与 FSH 制剂 ( 例如 Gonal- 多剂 量液体制剂 ) 混合， 并在 25℃接触 24 小时后， 根据以下方法进行测定 ：
-RP-HPLC 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 的 α- 亚基氧化形式 ( 表 12 中报道了在％纯度 的非氧化形式 )
-SE-HPLC 法测定聚集物定量
-RP-HPLC 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 滴度
-r-hFSH 和 r-hLH 体内生物测定
-SDS-PAGE 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 的游离亚基和聚集物定量 ( 数据未报道 )
- 视觉外观
这些结果报道于表 12 至 14.
表 12.RP-HPLC 法测得的纯度和 SE-HPLC 法测得的％聚集物
h ＝小时表 13.FSH 和 LH 含量
# *FSH 理论含量 ： 200IU ＝ 15,48μg/ml ； LH 理论含量 ： 100IU ＝ 4μg/ml 表 14. 生物测定
所有测定的单剂量制剂与 多剂量制剂互相兼容， 因为 ：
- 没有 FSH 和 LH 含量损失
- 不被氧化
- 没有聚集和游离亚基解离 (SDS-PAGE 法 )
- 没有 FSH 和 LH 生物活性损失
实施例 3- 单剂量液体制剂的稳定性研究
基于上述实施例的结果， 表 6 所描述的制剂， 除含精氨酸的制剂以外， 是在两种不 同的 r-hLH 浓度 (6μg/ml 和 12μg/ml) 下制备的， 储存于 2-8℃和 +25℃， 根据严格的稳定 性计划测定， 测试依据以下分析方法 ：
-RP-HPLC 法测定 LH 含量
-RP-HPLC 法测定 α- 亚基氧化形式
-SDS-PAGE 法测定游离亚基和聚集物
- 生物测试
- 溶液的 pH 值
- 视觉外观
对所有借助于 Stabileo 1.1 软件被认定为稳定性参数的结果进行统计分析。
在 2-8℃和 25±2℃贮存下的 r-hLH 浓度 (RP-HPLC 法 )
本制剂在 2-8℃贮存 6 个月后， 没有发现蛋白质含量有统计学意义上的显著降低， 不论 r-hLH 的浓度如何 (6μg/ml 和 12μg/ml)。在 25±2℃贮存 6 个月后观察到一般降低 0.4μg/ 月。
在 2-8℃和 25±2℃贮存下的 r-hLH 生物活性 ( 生物测试 )
本制剂在 2-8 ℃和 25±2 ℃贮存 6 个月后， 没有发现生物活性的显著降低， 不论 r-hLH 的浓度如何 (6μg/ml 和 12μg/ml)。
SDS-PAGE 法测得的亚基和聚集物百分率
在 2-8℃和 25℃贮存 6 个月后， SDS-PAGE 法测得两种浓度下聚集物的百分率仍保 持在 2％以下。在 2-8℃贮存 6 个月后， SDS-PAGE 法测得两种浓度下亚基的百分率仍保持 在 2％以下。在 25±2℃贮存 6 个月后一般降低大约 5％ / 月。
RP-HPLC 法测得的氧化形式百分率
在 2-8℃贮存 6 个月后， 测得大约 0.4％ / 月的增加， 在 25℃ ±2℃贮存， 则增加的 范围为 0.6-1.4％ / 月。
pH 值和外观
在生产和贮存期间， 没有任何外观 ( 颜色、 澄清度、 可见颗粒 ) 的改变， 也没有 pH 值的变化。
实施例 4- 多剂量制剂的稳定剂和抑菌剂的相容性
测试六种稳定剂 ( 蔗糖、 精氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸、 山梨醇和海藻糖 ) 与抑菌剂的相 容性， 以提供稳定的多剂量制剂。接受测试的制剂总结于表 15。
表 15. 包含不同组合的稳定剂和抑菌剂的多种 r-hLH 多剂量制剂的组成SAC/250 BA 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 105mg 0.90％ SAC/250 mCr 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 105mg 0.30％ SAC/250 Phe 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 105mg 0.50％ ARG/250 BA 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 33mg 0.90％ ARG/250 mCr 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 33mg 0.30％ ARG/250 Phe 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg 33mg 0.50％组分 数量 /ml r-hLH Na2HPO4 2H2O NaH2PO4 H2O 甲硫氨酸 吐温 20 蔗糖 精氨酸 苯甲醇 间甲酚 苯酚22101842083 A CN 101842084说SAC/250 BA 足量至 1ml SAC/250 mCr 足量至 1ml LYS/250 mCr 25μg 1.65mg 0.104mg明Phe书ARG/250 BA 足量至 1ml SOR/250 BA 25μg 1.65mg 0.104 mg ARG/250 mCr 足量至 1ml SOR/250 mCr 25μg 1.65mg 0.104mg20/34 页组分 数量 /ml 注射用水SAC/250ARG/250 Phe 足量至 1ml SOR/250 Phe 25μg 1.65mg 0.104mg足量至 1ml LYS/250 Phe 25μg 1.65mg 0.104mg组分 数量 /ml r-hLH Na2HPO4 2H2O NaH2PO4 H2OLYS/250 BA 25μg 1.65mg 0.104mg甲硫氨酸 吐温 20 赖氨酸 山梨醇 苯甲醇 间甲酚 苯酚 注射用水250μg 50μg 28mg 0.90％ 足量至 1ml GLY/250/ BA 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg250μg 50μg 28mg 0.30％ 足量至 1ml GLY/250/ mCr 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg250μg 50μg 28mg 0.50％ 足量至 1ml GLY/250/ Phe 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg250μg 50μg 56.5mg 0.90％ 足量至 1ml TRE/250/ BA 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg250μg 50μg 56.5mg 0.30％ 足量至 1ml TRE/250/ mCr 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg250μg 50μg 56.5mg 0.50％ 足量至 1ml TRE/250/ Phe 25μg 1.65mg 0.104mg 250μg 50μg组分 数量 /ml r-hLH Na2HPO4 2H2O NaH2PO4 H2O 甲硫氨酸 吐温 2023101842083 A CN 101842084说SAC/250 BA 23mg 0.90％ 足量至 1ml SAC/250 mCr 23mg 0.30％ 足量至 1ml明Phe 23mg -书ARG/250 BA 106mg 0.90％ 足量至 1ml ARG/250 mCr 106mg 0.30％ 足量至 1ml21/34 页组分 数量 /ml 甘氨酸 海藻糖 苯甲醇 间甲酚 苯酚 注射用水SAC/250ARG/250 Phe 106mg 0.50％ 足量至 1ml0.50％ 足量至 1ml
每种溶液大约制备 40ml， 通过 0.22μm 滤膜过滤， 在 2-8℃， +25℃和 +40℃条件下 贮存于 15ml 塑料管中。 连续 1 个月测试该溶液的蛋白质含量 ( 体积排斥 -HPLC 法， SE-HPLC 法， 数据未显示 )， 氧化形式 ( 反相 -HPLC 法， RP-HPLC 法 )， 聚集物 (SE-HPLC 法 ) 和亚基形 成 ( 定性， SE-HPLC 法 )。用于本制剂的整套测试的结果报道于表 16 至 18。
由于抑菌剂和表面活性剂 ( 吐温 20) 不相容， 所有含间甲酚 (mCr) 的溶液在生产 出来以后就立即变为乳白色。
表 16.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +40℃ )
表 17.SE-HPLC 法测得的纯度 ( 贮存温度 ： +25℃ )
表 18.RP-HPLC 测得的氧化形式％制剂 SAC/250/mCr SAC/250/BA SAC/250/Phe GLY/250/mCr GLY/250/BA 12 天 (+40℃ ) 51,14 14,07 25,55 59,29 10,53 1 个月 (+25℃ ) 16,62 8,83 17,54 5,43 4,4426101842083 A CN 101842084说制剂 GLY/250/Phe ARG/250/mCr ARG/250/BA ARG/250/Phe LYS/250/mCr LYS/250/BA LYS/250/Phe SOR/250/mCr SOR/250/BA SOR/250/Phe TRE/250/mCr TRE/250/BA TRE/250/Phe明书1 个月 (+25℃ ) 16,06 3,13 5,65 11,27 16,36 9,30 17,86 25,68 8,49 17,75 26,36 11,41 27,7624/34 页12 天 (+40℃ ) 34,86 65,27 7,12 15,49 44,05 13,69 56,55 58,29 13,51 30,78 45,84 19,12 23,87基于上述结果， 蔗糖、 赖氨酸和精氨酸被选定为最佳稳定剂， 用以进一步研究其与 增量甲硫氨酸 (500μg/ml) 的相容性。苯甲醇、 苯酚和苯甲醇与苯扎氯胺的组合物被选定 为抑菌剂。接受测试的制剂总结于表 19。
表 19. 包含选定稳定剂和不同抑菌剂的多种 r-hLH 多剂量制剂的组成
每种溶液大约制备 100ml， 通过 0.22μm 滤膜过滤， 充填入 3ml 储药器中。使用下 述基本包装 ：
- 经硅化处理的 3ml 玻璃储药器 (Nuova Ompi)
- 卷曲瓶盖代码 CAP J 3ML L1H075-1-H1B FM 257/2(HelvoetPharma)
- 涂药柱塞 ： Helvoet V9282FM257/2 Omniflex 涂层 .
储药器贮存在 2-8℃， +25℃和 +40℃， 测试其在 2 个月内的蛋白质含量 (SE-HPLC 法 )， 氧化形式 (RP-HPLC 法 )， 聚集物 (SE-HPLC 法 ) 和亚基形成 ( 定性， SE-HPLC 法 )。
用于第二组制剂的整套测试的结果报道在表 20 至 26 中。
表 20.SE-HPLC 测得的纯度 ( 贮存温度 ： +40℃ )
表 21.SE-HPLC 测得的纯度 ( 贮存温度 ： +33℃ )
表 22.SE-HPLC 测得的纯度 ( 贮存温度 ： +25℃ )
表 23.RP-HPLC 测得的氧化形式的百分比％ ( 贮存温度 ： +33℃ ) 制剂 SAC/500/BA T＝0 1,12 T＝3周 5,2130T＝8周 4,21T ＝ 13 周 4,26101842083 A CN 101842084说T＝0 0,90 0,99 0,69 1,13 0,94 1,53 1,60 0,66明书T＝8周 4,90 6,01 4,13 3,57 5,24 16,34 5,83 34,97 T ＝ 13 周 4,46 16,14 2,65 2,97 4,82 8,77 5,70 25,5128/34 页制剂 SAC/500/BACL SAC/500/Phe ARG/500/BA ARG/500/BACL ARG/500/Phe LYS/500/BA LYS/500/BACL LYS/500/Phe
T＝3周 5,59 8,28 4,52 4,57 4,60 5,71 4,49 9,66表 24.RP-HPLC 测得的氧化形式的百分比％ ( 贮存温度 ： +25℃ ) 制剂 SAC/500/BA SAC/500/BACL SAC/500/Phe ARG/500/BA ARG/500/BACL ARG/500/Phe LYS/500/BA LYS/500/BACL LYS/500/Phe T＝0 1,12 0,90 0,99 0,69 1,13 0,94 1,53 1,60 0,66 T＝4周 2,04 2,10 2,68 1,40 1,46 1,31 2,51 1,96 4,05 T＝8周 2,19 2,31 5,72 1,61 2,31 2,77 3,35 3,14 11,38 T ＝ 13 周 2,44 2,23 7,50 1,65 1,89 2,35 4,73 3,47 22,52
表 25.RP-HPLC 测得的氧化形式百分比％31101842083 A CN 101842084说T＝0明书T ＝ 3 天 (+40 T＝0 ℃)29/34 页制剂T ＝ 13 周 (+5℃ )SAC/500/BA SAC/500/BACL SAC/500/Phe ARG/500/BA ARG/500/BACL ARG/500/Phe LYS/500/BA LYS/500/BACL LYS/500/Phe1,12 0,90 0,99 0,69 1,13 0,94 1,53 1,60 0,661,11 1,29 2,51 1,03 1,16 2,02 2,03 1,56 未测定1,12 0,90 0,99 0,69 1,13 0,94 1,53 1,60 0,661,16 1,25 1,47 0,64 1,06 1,47 1,84 1,58 3,10
制剂表 26.SE-HPLC 测得的 r-hLH 含量T＝3天 (+40 ℃) 21,70 22,06 21,49 18,86 21,48 22,38 20,93 21,78 21,05 T＝3周 (+33 ℃) 21,05 21,31 21,02 19,52 21,71 20,60 18,85 20,68 20,20 T＝4周 (+33 ℃) 22,54 22,64 22,53 24,64 23,52 23,09 22,10 23,44 21,89 T＝8周 (+33 ℃) 16,47 18,77 20,71 16,14 16,86 16,99 14,93 15,50 16,50 T＝4周 (+25 ℃) 23,70 23,65 22,66 25,26 24,18 24,41 24,24 24,07 22,99 T＝8周 (+25 ℃) 18,43 18,10 17,23 17,69 19,34 16,32 17,36 18,60 16,56T＝0SAC/500/BA SAC/500/BACL SAC/500/Phe ARG/500/BA ARG/500/BACL ARG/500/Phe LYS/500/BA LYS/500/BACL LYS/500/Phe20,38 21,73 21,24 22,23 22,38 21,34 20,33 23,83 21,34上述结果证实了稳定剂与增量甲硫氨酸之间的相容性 ( 参见实施例 1)。此外， 该 结果还显示抑菌剂与 500μg/ml 甲硫氨酸是可以配伍的。
实施例 5-r-hLH 多剂量液体制剂与 FSH 多剂量液体制剂的相容性
根 据 实 施 例 4 的 结 果， 将 贮 存 于 3ml 储 药 器 中 的 r-hLH 制 剂 与 FSH 制 剂 ( 即 多剂量液体制剂 ) 混合， 在 25℃接触 24 小时后按照下述方法进行测定 ： -SE-HPLC 法测定纯度 -RP-HPLC 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 滴度 -RP-HPLC 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 的 α- 亚基氧化形式 -r-hFSH 和 r-hLH 体内生物活性测试 -SDS-PAGE 法测定 r-hFSH 和 r-hLH 的游离亚基以及聚集物定量 ( 数据未报道 ) - 溶液的 pH 值 - 可视外观 结果列于表 27 至 29。 表 27.SE-HPLC 测得的纯度
表 28.FSH 和 LH 含量
# *FSH 理论含量 ： 200IU ＝ 30,96μg/ml ； LH 理论含量 ： 100IU ＝ 8μg/ml 表 29. 生物测定所有接受测试的多剂量制剂与 多剂量制剂都是可以配伍的， 因为 ：
- 未出现 FSH 和 LH 含量的损失
- 未被氧化
- 没有沉淀 (SE-HPLC 法 )
- 没有聚集物和亚基的生成 (SDS-PAGE 法 )
- 未出现 LH 和 FSH 生物活性的损失
实施例 6- 与基本包装的相容性
为了测试 r-hLH 制剂与最终容器 ( 注射器和储药器 ) 之间的相容性， 设置矩阵试 验来测试以下参数 ：
-r-hLH 浓度的影响 ： 6μg/ml， 12μg/ml， 24μg/ml，
- 充填体积的影响 ： 0.25ml， 0.5ml， 1ml，
- 容器类型 ： 1ml 玻璃注射器和 3ml 玻璃储药器，
- 抑菌剂的影响 ： 包含和不含抑菌剂的制剂， 贮存在 3ml 储药器中。
一种制剂 (SAC/500/BACL) 被制备成不同的 r-hLH 浓度， 充填在不同灌装量的容器 中。 采用 SE-HPLC 法定性地比较 33℃放置一周批次之间的变化。 研究结果发布在图 1(A-F) 中。 图 2(A-B) 比较了制剂中含有与不含抑菌剂组合时， SE-HPLC 法测得的杂二聚体百分比。
根据图 1 和 2 给出的结果， 可以得出以下结论 ：
- 在 12μg/ml 与 24μg/ml 的浓度下容器对制剂没有影响
- 在 12μg/ml 与 24μg/ml 的浓度下灌装量对制剂没有影响
- 浓度增加对亚基解离有正向作用
- 有或没有抑菌剂， 批次之间无差异
- 较高的稳定性与较高的 r-hLH 浓度相关。
实施例 7- 多剂量液体制剂的稳定性研究
基于上述实施例的结果， 表 19 中描述的四种制剂 (SAC/500/BACL， LYS/500/BA， LYS/500/BACL 和 ARG/500/Phe) 在 2-8℃和 +25℃的条件下贮存， 按照严格的稳定性计划根 据以下分析方法进行测试 ：
-RP-HPLC 法测定 LH 的含量
-RP-HPLC 法测定 α- 亚基氧化形式
-RP-HPLC 法测定苯酚的含量
-RP-HPLC 法测定苯扎氯胺的含量
-RP-HPLC 法测定苯甲醇的含量
-SDS-PAGE 法测定游离亚基和聚集物
- 生物活性测试
- 溶液的 pH 值
- 可视外观
对上述制剂中赖氨酸和精氨酸的量进行调整 ( 即 L- 赖氨酸盐酸盐为 28.5mg 和 L- 精氨酸盐酸盐为 31.5mg)， 以优化制剂的等渗性。
对所有借助于 Stabileo 1.1 软件被认定为稳定性参数的结果进行统计分析。
在 2-8℃和 25±2℃下贮存的 r-hLH 浓度 (RP-HPLC 法测定 )
本制剂在 2-8℃贮存 12 个月后， 没有发现蛋白质含量有统计意义上的显著降低。 在 25±2℃贮存 6 个月后一般降低 0.4μg/ 月。
在 2-8℃和 25±2℃下贮存的 r-hLH 生物活性 ( 生物活性测试 )
本制剂在 2-8℃和 25±2℃贮存 12 个月后， 没有发现生物活性的显著降低。
SDS-PAGE 法测得的亚基和聚集物百分率％
所有制剂在 2-8℃和 25℃贮存 12 个月后， SDS-PAGE 法测得的聚集物百分率仍保 持在 2％以下。
所有制剂在 25℃贮存 6 个月后， SDS-PAGE 法测得的亚基百分率增加到 32％以上。
RP-HPLC 法测得的氧化形式百分率％
SAC/500/BACL 和 ARG/500/Phe 呈现出氧化形式的较低增长。
pH 值和外观
在生产和贮存期间， 未观察到任何外观 ( 颜色、 澄清度、 可见颗粒 ) 的改变， 也未观 察到 pH 值的变化。
抑菌剂的含量
苯酚和苯甲醇的含量检测达到目标， 在 6 个月至 12 个月的稳定性检验点没有检测 到含量降低。制剂 SAC/500/BACL 在 6 个月的稳定性检验点被检出苯扎氯胺的含量低于标准 ( 测得的是 6μg/ml， 而不是 10μg/ml)。
抑菌剂的效果
制剂在 T ＝ 0 的时间点和 9 个月后的重复试验中， 抑菌效果测试的结果发布于表 30 至 33。
表 30. 多剂量制剂 SAC/500/BACL 的抑菌效果测试结果
表 31. 多剂量制剂 LYS/500/BACL 的抑菌效果测试结果
表 32. 多剂量制剂 LYS/500/BA 的抑菌效果测试结果
表 33. 多剂量制剂 ARG/500/Phe 的抑菌效果测试结果包含 0.3％苯甲醇 +0.001％苯扎氯胺和蔗糖或赖氨酸 (SAC/500/BACL 和 LYS/500/ BACL) 的组合的制剂符合 《欧洲药典》 的标准 A， 即使苯扎氯胺的量低于目标 (6μg/ml， 而不 是 10μg/ml)。
包含 0.5％苯酚的制剂 (ARG/500/Phe) 和包含 1.2％苯甲醇的制剂 (LYS/500/BA) 符合 《欧洲药典》 的标准 B。
结论
所有多剂量制剂在 2-8℃贮存 12 个月后， 都显示出很好的稳定性。