截短的GLP-1衍生物和它们的治疗用途 【发明领域】
本发明涉及治疗肽的领域，即，涉及新的截短的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和其衍生物。
【发明背景】
许多不同的方法已经用于修饰胰高血糖素样肽1(GLP-1)化合物，以提供体内的更长的作用持续时间。
WO 2006/097538、WO 2006/097536、WO 2006/037810、WO2006005667、WO 2005/027978.WO 98/08871和US 2001/0011071描述了各种GLP-1类似物和其衍生物。
在本发明的优先权日之后公开的Runge et al(Journal of BiologicalChemistry，vol.283，no.17，pp.11340-11347)公开了配体结合GLP-1受体的细胞外结构域的晶体结构。
许多糖尿病患者，特别是2型糖尿病部分的患者经历了所谓的“针头恐惧”，即，自己注射的相当的担忧。在2型糖尿病部分中，大多数患者用口服的降血糖试剂治疗，由于GLP-1化合物预计是这些患者将要施用的可注射的药物产品，注射的担忧可能成为临床上非常有前景的化合物的广泛应用的严重障碍。因而，需要开发新的化合物，其可以低于每天一次地，例如，每两天或三天一次、优选的每周一次地施用，而保持了可接受的临床概况，或任选地通过非侵入性的施用例如肺部的、鼻部的、舌下的、口腔的或口服施用来施用。
本发明的一个目的是提供化学上、物理上和酶学上稳定的GLP-1类似物或其衍生物。
本发明的进一步的目的是提供长效的、即具有如上所述的施用方式的GLP-1类似物或其衍生物。
本发明的另一个目的是提供具有高效力(受体亲和力)的GLP-1类似物或其衍生物，以降低用于例如每周一次s.c.给药、或作为选择用于非侵入性递送的治疗剂量。
本发明的另一个目的是提供具有对GLP-1受体(GLP-1R)的高结合亲和力的GLP-1化合物。
本发明的更进一步的目的是提供具有对GLP-1受体(nGLP-1R)的细胞外结构域的高结合亲和力的GLP-1化合物。
本发明的另一个目的是提供具有高白蛋白结合亲和力的GLP-1类似物或其衍生物，其保护所述肽免于蛋白水解降解并降低所述肽的肾脏清除。
效价、对GLP-1受体的结合亲和力、以及可能还对GLP-1受体的细胞外结构域的结合亲和力，是实现长效、稳定和当然地治疗活性的、具有每周施用一次的潜力的GLP-1衍生物总体目标的潜在相关的性质。
发明概述
本发明涉及GLP-1(7-37)的截短的类似物和其衍生物。
本发明涉及GLP-1类似物，其是修饰的GLP-1(7-35)(SEQ IDNO：1)，具有：i)与GLP-1(7-35)相比总共2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代，包括a)在相当于GLP-1(7-35)的位置22的位置处的Glu残基，和b)在相当于GLP-1(7-35)的位置26的位置处的Arg残基；或其衍生物。
本发明还涉及这些衍生物和类似物的组合物和用途。
任选地，在相当于GLP-1(7-35)的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸可以是没有的，条件是如果在位置30、31、32、33或34处的氨基酸是没有的，则下游的每个氨基酸残基也是没有的。
还任选地，本发明的GLP-1类似物包含C-末端酰胺基团，或C-末端羧酸基团。
在进一步的方面，提供了根据本发明的类似物和衍生物的药物组合物和方法和用途。
发明的描述
定义和特定的实施方式
在本说明书中，以下的术语具有所指明的含义：在此使用的术语“多肽”和“肽”是指由通过肽键连接的至少五个构成性氨基酸组成的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸的组，它们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不由遗传密码编码的天然氨基酸有，例如，γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的氨基酸包含通过化学合成制造的氨基酸，即，由遗传密码编码的氨基酸的D-同分异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔-丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
22种成蛋白(proteogenic)氨基酸是：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
因而非成蛋白质(也称为非天然的)氨基酸是可以经由肽键被掺入到肽中、但是不是成蛋白质氨基酸的部分。实例有γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸，例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非成蛋白氨基酸包括通过化学合成制造的氨基酸，即，由遗传密码编码的氨基酸的D-同分异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔-丁基甘氨酸)、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、des-氨基-组氨酸、氨基酸的β类似物，例如β-丙氨酸等等，D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸。
在此关于多肽使用的术语“类似物”是指修饰的肽，其中肽的一个或更多个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，和/或其中一个或更多个氨基酸残基在肽的C-末端中从肽上删除。
在此使用的术语“修饰的肽”是指上文定义的修饰的肽。对此，这个术语与术语“修饰的肽序列”可互换地使用。与此一致地，术语“修饰”当在此与肽序列一起使用时，是指氨基酸取代、添加和/或删除。
为本目的，任何氨基酸取代、删除和/或添加是指人类GLP-1(7-35)的序列，其在此作为SEQ ID NO：1被包括。然而，在序列表中氨基酸残基的编号总是从no.1开始，而对我们所需要的，根据本领域中的惯例，从氨基酸残基no.7开始，对它指定编号7。因而，一般地，在此对GLP-1(7-35)序列的位置编号的引述是从位置7的His开始、以位置35的Gly结束的序列。
一种简单的系统常常用于描述类似物：例如，[Arg34]GLP-1(7-37)Lys是指GLP-1(7-37)类似物，其中位置34处的天然存在的赖氨酸被精氨酸替代，以及其中赖氨酸添加到末端氨基酸残基，即添加到Gly
37。
但在此使用来表征修饰的GLP-1(7-35)序列时表述“相当于......的位置”是指在天然的GLP-1(7-35)序列(具有SEQ ID NO：1的序列)中的相应的位置。例如，通过简单的手写和目测，容易地推断相应的位置。在备选方案中，可以使用标准的蛋白质或肽比对程序，例如“align”，其是Needleman-Wunsch比对。该算法在Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48：443-453以及Myers and W.Miller in″Optimal Alignments in LinearSpace″CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988)4：11-17的比对程序中描述了。对于所述比对，可以使用默认的计分矩阵BLOSUM50和默认的同一性矩阵，缺口中第一个残基的罚分可以设置在-12，缺口中其他残基的罚分设置在-2。
旋光异构体没有声明的所有氨基酸被理解为是指L-同分异构体。
在此使用的术语“下游的每个氨基酸残基”是指相对于特定的氨基酸位于C-末端的每个氨基酸。例如，Lys34和Gly35是GLP-1(7-35)中Val33的下游的每个氨基酸残基。
在本发明的实施方式中，最多8个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多7个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多6个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多5个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多4个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多3个氨基酸被修饰。在本发明的实施方式中，最多2个氨基酸被修饰。
在本发明的实施方式中，一个或更多个氨基酸在C-末端中被删除。
在本发明的一个方面，根据本发明的类似物或衍生物的C-末端可以以酸或者酰胺结束。在优选的方面，本发明的类似物或衍生物的C-末端是酰胺。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是28个氨基酸。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置34、35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是27个氨基酸。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置33、34、35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是26个氨基酸。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置32、33、34、35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是25个氨基酸。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置31、32、33、34、35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是24个氨基酸。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置30、31、32、33、34、35、36和37处的氨基酸是没有的，和其中GLP-1类似物的总长度是23个氨基酸。
在一个方面，本发明涉及具有C-末端酰胺基团的GLP-1类似物或其衍生物。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比的3个氨基酸取代，包括在位置22和26处的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、3l、33和34的组的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的取代。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比的4个氨基酸取代，包括在位置22和26处的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的两个取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的两个取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的氨基酸取代。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比的5个氨基酸取代，包括在位置22和26处的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的三个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34的组的三个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的两个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的两个氨基酸取代。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比的6、7或8个氨基酸取代，包括在位置22和26处的取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的四、五或六个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的四、五或六个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的三、四或五个氨基酸取代。在进一步的方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的三、四或五个氨基酸取代。
在一个方面，本发明涉及具有式(I)的序列的GLP-1类似物或其衍生物Xaa
7-Xaa
8-Xaa
9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18-Tyr-Xaa
20-Glu-Glu-Xaa
23-Xaa
24-Xaa
25-Arg-Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30-Xaa
31-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(I)(SEQ ID No：2)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
9是Glu或Glu衍生物，例如，α，α二甲基-Glu；
Xaa
16是Val或Leu；
Xaa
18是Ser、Lys、Cys或Arg；
Xaa
20是Leu、Lys或Cys；
Xaa
23是Gln、Glu、Lys、Cys或Arg；
Xaa
24是Ala或Asn；
Xaa
25是Ala或Val；
Xaa
27是Glu、Ala或Leu；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或没有；
Xaa
31是Trp、Lys、Cys或没有；
Xaa
33是Val、Lys、Cys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Asn、Arg、Cys或没有；
Xaa
35是Gly、Aib或没有；
R是酰胺或是没有的；
条件是，如果Xaa
30、Xaa
31、Xaa
32、Xaa
33或Xaa
34是没有的，则下游的的每个氨基酸残基也是没有的。
在一个方面，本发明涉及具有式(II)的序列的GLP-1类似物或其衍生物Xaa
7-Xaa
8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa
18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa
30-Trp-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(II)(SEQ ID No：3)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
18是Ser、Lys或Arg；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或是没有的；
Xaa
33是Val、Lys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
35是Gly、Aib或是没有的；
R是酰胺或是没有的。
在本发明的一个方面，R是没有的。在本发明的进一步的方面，Xaa
35和R是没有的。在本发明的进一步的方面，Xaa
34、Xaa
35和R是没有的。在本发明的进一步的方面，Xaa
33、Xaa
34、Xaa
35和R是没有的。在本发明的进一步的方面，Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34、Xaa
35和R是没有的。
在此相关于肽使用的术语“衍生物”是指化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基在未修饰肽或其类似物中是不存在的，即，被共价地修饰的肽。
典型修饰是酰胺、碳水化物、烷基基团、酰基基团、酯等等。根据本发明的衍生物的实例是Nε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys33)GLP-1(7-33)酰胺(结构1)其中在位置20处天然存在的Tyr被赖氨酸取代，所述赖氨酸在N-ε20用ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}衍生化
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结构1
和其中位置8的天然存在的丙氨酸被Aib取代，位置22的甘氨酸用谷氨酸取代、位置25的丙氨酸用缬氨酸取代、位置26的赖氨酸用精氨酸取代、位置27的谷氨酸用亮氨酸取代、位置30的丙氨酸用谷氨酸取代、位置33的缬氨酸用赖氨酰胺取代。
在本发明的一个方面，提供了用白蛋白结合残基衍生化的、或聚乙二醇化的GLP-1类似物或其衍生物。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或衍生物，其中被聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的氨基酸是Lys-残基或Cys-残基。在一个方面，被聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的氨基酸是Lys-残基。在一个方面，被聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的氨基酸是Cys-残基。在一个方面，C-末端氨基酸被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。在一个方面，本发明涉及在位置18、20、23、31、33、34或在C-末端氨基酸聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置18聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置20聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置23聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置31聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置33聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。在进一步的方面，本发明涉及在位置34聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的GLP-1类似物或其衍生物。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其用白蛋白结合残基衍生化。
在此使用的术语“衍生化的”是指通过共价键化学地连接的。例如，赖氨酸残基或半胱氨酸残基经由化学键连接到白蛋白结合残基。例如，这样的化学键可以通过通过用白蛋白结合残基的活性酯，例如长脂肪酸的酰化的赖氨酸的ε氨基基团的衍生化来获得。
在本发明中使用的连接两个化学部分的其他实例包括但不限于烷基化、酯形成、酰胺形成或马来酰亚胺偶联。
在此使用的术语“接头”是指分隔肽和白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物的间隔区(在本说明书中，两个术语间隔区和接头可互换地使用)。
在本发明的一个方面，接头包含一个或更多个亚烷基二醇单元，例如，1到5个亚烷基二醇单元。亚烷基二醇单元在进一步方面中是乙二醇、丙二醇或丁二醇，但也可以是更高级的亚烷基二醇。
在本发明的另一个方面，所述接头是选自以下的亲水性接头
-(CH
2)
lD[(CH
2)
nE]
m(CH
2)
p-Q
q-，其中
l、m和n独立地是1-20，p是0-10，
Q是-z-(CH
2)
lD[(CH
2)
nG]
m(CH
2)
p-，
q是0到5的范围内的整数，
每个D、E和G独立地选自-O-、-NR
3-、-N(COR
4)-、-PR
5(O)-和-P(OR
6)(O)-，其中R
3、R
4、R
5和R
6独立地代表氢或C
1-6-烷基，
Z选自-C(O)NH-，-C(O)NHCH
2-，-OC(O)NH-，-C(O)NHCH
2CH
2-，-C(O)CH
2-，-C(O)CH＝CH-，-(CH
2)
s-，-C(O)-，-C(O)O-or-NHC(O)-，其中s是0或1。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中l是1或2，n和m独立地是1-10，p是0-10。
在本发明的另一个方面，接头是上文定义的亲水性接头，其中D是-O-。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中E是-O-。
在本发明的又一个方面，所述亲水性接头是
-CH
2O[(CH
2)
2O]
m(CH
2)
pQ
q-，其中m是1-10，p是1-3，Q是-z-CH
2O[(CH
2)
2O]
m(CH
2)
p-其中Z是上文定义的。
在本发明的另一个方面，接头是上文定义的亲水性接头，其中q是1。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中G是-O-。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中Z选自由-C(O)NH-、-C(O)NHCH
2和-OC(O)NH-构成的组。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中q是0。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中l是2。
在本发明的另一个方面，所述接头是上文定义的亲水性接头，其中n是2。
在本发明的一个方面，使用“亲水性接头”，其分隔肽和白蛋白结合残基与化学部分。
在本发明的一个方面，所述亲水性接头是-C(O)-(CH
2)
l-O-[(CH
2CH
2-O]
m-(CH
2)
p-[NHC(O)-(CH
2)
l-O-[(CH
2)
n-O]
m-(CH
2)
p]
q-NH-，其中l、m、n和p独立地是1-5，q是0-5。
在本发明的又一个方面，所述亲水性接头是-C(O)-CH
2-O-CH
2CH
2-O-CH
2CH
2[NHC(O)-CH
2-O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2]
q-NH-，其中q是0-5。
在本发明的又一个方面，所述亲水性接头是-C(O)-CH
2-O-CH
2CH
2-O-CH
2CH
2-NHC(O)-CH
2-O-CH
2CH
2O-CH
2CH
2-NH-。
在本发明的又一个方面，所述亲水性接头是-[CH
2CH
2O]
m+1(CH
2)
pQ
q-
其中m和p独立地是0-10，和
Q是如上文定义的-Z-(CH
2)
lD[(CH
2)
nG]
m(CH
2)
p-。
在本发明的又一个方面，所述亲水性接头是
-(CH
2)
l-O-[(CH
2)
n-O]
m-(CH
2)
p-[C(O)NH-(CH
2)
l-O-[(CH
2)
n-O]
m-(CH
2)
p]
q-，其中l、m、n和p独立地是1-5，q是0-5。
在本发明的进一步的方面，所述接头包含除了Cys以外的氨基酸残基，或二肽，例如Gly-Lys。在本文中，表示“二肽，例如Gly-Lys”被用于指一种二肽，其中C-末端氨基酸残基是Lys、His或Trp，优选的Lys，和其中N-末端氨基酸残基选自包含Ala、Arg、Asp、Asn、Gly、Glu、Gln、Ile、Leu、Val、Phe和Pro的组。适合的PEG聚合物一般是商业上可获得的，或可以通过本领域技术人员公知的技术制得。
在本发明的一个方面，PEG聚合物具有大于700D的分子量，在进一步的方面，大于5kD的分子量，在又进一步的方面，大于10kD，在再进一步的方面，大于20kD。PEG聚合物可以是线性的或分支的。在PEG聚合物大于20kDa的情况下，PEG聚合物优选的具有分支结构，例如，43kD分支的PEG-肽(Shearwater 2001catalog#2D3XOT01，mPEG2-MAL)。
PEG对完整的肽的附着可以伴随着将PEG附着到与受体相互作用的肽表面的对侧。
存在着几种策略用于偶联PEG到肽上(参见，例如Veronese，Biomaterials 22：405-417，2001)，所有这些通过完全引用合并在此。因而本领域技术人员将能够利用公知的技术，连接PEG聚合物到此处描述的人类胰淀素(amylin)或胰淀素类似物。
简要地，半胱氨酸PEG化是位点特异性PEG化的一种方法，可以通过在人类胰淀素或胰淀素类似物上的特定位置之一处引入独特的半胱氨酸突变，然后将产生的肽与半胱氨酸-特异性PEG化试剂，例如PEG-马来酰亚胺反应来完成。可能必需突变肽以允许位点特异性PEG化。例如，如果肽含有半胱氨酸残基，这些将需要用保守的氨基酸取代，以确保位点特异性PEG化。此外，刚性的接头，包括但不限于“GGS”、“GGSGGS”和“PPPS”可以添加到C-末端，但是在PEG附着的位点(即，独特的半胱氨酸残基)之前。
在本发明的一个方面，所述白蛋白结合残基是亲脂性的残基。在进一步的方面，亲脂性残基任选地经由接头、通过缀合化学作用，例如，通过烃基化、酰化、酯形成或酰胺形式附着到赖氨酸残基，或通过马来酰亚胺偶联附着到半胱氨酸残基。
在本发明的进一步的方面，所述白蛋白结合残基是在生理学pH值下带负电的。在本发明的另一个方面，所述白蛋白结合残基包含可以带负电的基团。可以带负电的一种优选的基团是羧酸基团。
在本发明的又一个方面，所述白蛋白结合残基选自由直链烷基基团、支链烷基基团、具有ω-羧酸基团的羧酸基团基团和部分地或完全地氢化的环戊烷菲(cyclopentanophenanthrene)主干构成的组。
在本发明的进一步的方面，所述白蛋白结合残基是cibacronyl残基。
在本发明的进一步的方面，所述白蛋白结合残基具有6到40个碳原子，8到26个碳原子或8到20个碳原子。
在本发明的进一步的方面，所述白蛋白结合残基是选自包含CH
3(CH
2)
rCO-的组的酰基基团，其中r是4到38的整数，优选的4到24的整数，更优选的选自包含CH
3(CH
2)
6CO-，CH
3(CH
2)
8CO-，CH
3(CH
2)
10CO-，CH
3(CH
2)
12CO-，CH
3(CH
2)
14CO-，CH
3(CH
2)
16CO-，CH
3(CH
2)
18CO-，CH
3(CH
2)
20CO-和CH
3(CH
2)
22CO-的组。
在本发明的另一个方面，所述白蛋白结合残基是直链或支链烷α，ω-二羧酸的酰基基团。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化
其中A-选自以下构成的组
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其中n选自由14、15、16、17、18和19构成的组，p选自由10、11、12、13和14构成的组，以及d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，
-B-选自以下构成的组
![]()
其中x选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12构成的组，
-C-选自以下构成的组
![]()
其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由0、1和2构成的组，条件是当c是0时b是1或2，或当c是1或2时b是0，和当f是0时e是1或2，或当f是1或2时e是0，知
-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。
在本发明的一个方面，根据本发明的类似物的一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化。
在一个方面，所述衍生化的氨基酸残基包含氨基基团。在进一步的方面，所述衍生化的氨基酸残基包含侧链中的伯氨基基团。在又进一步的方面，所述衍生化的氨基酸残基是赖氨酸。
在一个方面，A-是
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在一个方面，n选自由15和17构成的组，更优选的是17。
在一个方面，A-是
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在一个方面，p选自由12、13和14构成的组，更优选的是13。在一个方面，d选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的0、1和2构成的组，最优选的1。在一个方面，d选自由0、1和2构成的组，p选自由12、13或14构成的组，更优选的，d选自由1和2构成的组，p选自由13和14构成的组，最优选的d是1和p是13。
在一个方面，-B-是
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在一个方面，-B-是
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在一个方面，-B-是
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在一个方面，-B-是
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在一个方面，x选自由0、1和2构成的组，更优选的，x选自由0和1构成的组，最优选的x是1。
在一个方面，-B-是
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在一个方面，y选自由2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的组，更优选的y选自由2、3、4、5、6、7和8构成的组。
在一个方面，-C-是
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在一个方面，c选自由0和1构成的组，b选自由1和2构成的组，更优选的b是1和c是0。
在一个方面，-C-是
![]()
在一个方面，f选自由0和1构成的组，e选自由1和2构成的组，更优选的e是1和f是0。
在一个方面，-C-是
![]()
在一个方面，D选自以下构成的组
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和其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组，m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组。
在一个方面，-D-是
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在一个方面，k选自由1、2、3、11和27构成的组，更优选的k是1。在一个方面，m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
在一个方面，-D-是
在一个方面，-D-是
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在一个方面，-D-是
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在一个方面，-D-是
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在一个方面，-D-是
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在一个方面，m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
在一个方面，A-B-C-D-选择和组合自
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在一个方面，A-B-C-D-选择和组合自
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在一个方面，A-B-C-D-选自以下构成的组
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在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化，其中所述衍生物结合白蛋白。
在一个方面，A-B-C-D由白蛋白结合片段A-B-C-和亲水性接头D组成。
在此使用的术语“GLP-1肽”是指GLP-1(7-35)(SEQ ID NO：1)或其GLP-1(7-35)类似物。
在一个实施方式中，根据本发明的GLP-1类似物或其衍生物是促胰岛素试剂。
在本发明的方面中，其中类似物是衍生化的，GLP-1类似物中的任何氨基酸位置可以被衍生化。在本发明的一个方面，被衍生化的氨基酸残基包含氨基基团。包含氨基基团的氨基酸残基的实例有赖氨酸、鸟氨酸、ε-N-烷基化的赖氨酸，例如ε-N甲基赖氨酸、O-氨基乙基丝氨酸、O-氨基丙基丝氨酸或在侧链中含有伯或仲氨基基团的更长的O-烷基化的丝氨酸。
在本发明的进一步的方面，衍生化的氨基酸残基包含侧链中的伯氨基基团。包含伯氨基团的氨基酸残基的实例是赖氨酸、鸟氨酸、O-氨基乙基丝氨酸、O-氨基丙基丝氨酸、或在侧链中含有伯氨基团的更长的O-烷基化的丝氨酸。
在本发明的又进一步的方面，所述衍生化的氨基酸残基是赖氨酸。在本发明的又进一步的方面，根据本发明的衍生物是仅在一个位置衍生化的，例如，仅一个氨基酸残基被衍生化。
在本发明的另一个方面，所述被衍生化的氨基酸残基是半胱氨酸。
功能性质
如实验部分所描述的，已经合成和测试了许多本发明的GLP-1化合物。
本发明的GLP-1化合物具有几种有利的和有益的性质，如在下文、参考实施例所解释的。
在此使用的术语“促胰岛素试剂”是指一种GLP-1类似物或其衍生物，其是人类GLP-1受体的激动剂，即，刺激含有人类GLP-1受体的适合的介质中cAMP的形成的GLP-1类似物或其衍生物(一种这样的介质在下文公开)。
在第一个方面，本发明的GLP-1类似物或衍生物具有可接受的、优选的高效价(对受体)。
促胰岛素试剂例如本发明的GLP-1化合物的效价可以通过从剂量反应曲线计算EC
50值，例如实施例21中描述的来确定。
在特定的实施方式中，(i)使用表达克隆的人类GLP-1受体的婴儿仓鼠肾脏(BHK)细胞，优选的BHK-467-12A，更优选的BHK-467-12A(tk-ts13)；(ii)细胞在添加了100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5％胎牛血清和0.5mg/ml遗传霉素G-418(LifeTechnologies)的DMEM培养基中，优选的在5％CO2下生长；(iii)细胞，优选的在大约80％汇合时，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次；(iv)用乙二胺四乙酸的四钠盐的水溶液，例如Versene收获细胞；(v)通过匀质化，优选的在缓冲液1中，从细胞制备质膜；匀浆物在4℃例如在48,000x g离心15分钟；和/或(vii)团粒通过在缓冲液2中匀质化来悬浮。步骤(vi)和(vii)优选的再重复例如一次或两次。
功能性受体分析可以通过测量作为对促胰岛素试剂刺激的反应的环化AMP(cAMP)如实施例21中描述的来进行。形成的cAMP优选的通过AlphaScreen
TM cAMP Kit(Perkin Elmer Life Sciences)来定量。孵育可以在总体积50μl的缓冲液3(50mM Tris-HCI、5mMHEPES、10mM MgCl2、pH 7.4)和具有以下添加物的半区域96孔微量滴定板中进行：1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％Tween-20、0.1％BSA、6μg膜制品、15μg/mL接受体珠子、与6nM生物素基-cAMP预孵育的20μg/mL供体珠子。测试激动剂活性的类似物或衍生物优选的在缓冲液3中溶解和稀释。GTP对每个实验新鲜地制备。平板在室温下在暗处缓慢搅动孵育三小时，随后在Fusion
TM仪器(Perkin Elmer Life Sciences)中计数。对单独的类似物或衍生物标绘浓度-反应曲线，利用Prism，版本4.0或5.0(GraphPad，Carlsbad，CA)的四参数逻辑模型估计EC
50值。
在第一个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-1衍生物具有的效价(按nM的EC
50)低于10.00、优选的低于9.00、更优选的低于8.00、再更优选的低于7.00和最优选的低于6.00(nM)。
在第二个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-1衍生物具有的效价(按nM的EC
50)低于5.00、优选的低于4.00、更优选的低于3.00、再更优选的低于2.00和最优选的低于1.00(nM)。
在第三个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-1衍生物具有的效价(按nM的EC
50)低于0.80、优选的低于0.60、更优选的低于0.40、再更优选的低于0.20和最优选的低于0.10(nM)。
在第四个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-1衍生物具有的效价(按nM的EC
50)低于0.090、优选的低于0.080、更优选的低于0.070、再更优选的低于0.060和最优选的低于0.050(nM)。
在第五个特定的实施方式中，如利用cAMP分析测定的，本发明的GLP-1衍生物具有的效价(按nM的EC
50)低于0.040、优选的低于0.030、更优选的低于0.020、最优选的低于0.010(nM)。
因而，本发明的GLP-1衍生物的效价(按照nM的EC
50，使用cAMP分析测定的)的示范性的范围是0.010-10.0，0.010-8.0，0.010-6.0，0.010-4.0，0.010-2.0，0.010-1.00，0.010-0.80，0.010-0.60，0.010-0.40，0.010-0.30，0.010-0.20，0.010-0.10，和0.010-0.90(nM)，优选的0.010-0.40，0.010-0.30，0.010-0.20，0.010-0.10，和0.010-0.90(nM)。
在第二个方面，GLP-1类似物或其衍生物(“GLP-1化合物”)具有对GLP-1受体的高亲和力。对GLP-1受体的亲和力可以如实施例23中描述的测定，即，通过从受体置换
125I-GLP-1的方式。BHK细胞可以用于膜制备，优选的菌株tk-ts13。膜可以优选的如实施例23中描述的纯化。优选的结合分析方法是实施例23的SPA分析。IC
50值可以从结果(结合)曲线中作为从受体替换50％的
125I-GLP-1的浓度来读取。
在第一个特定的实施方式中，所述IC
50值低于500nM、优选的低于400nM、更优选的低于300nM、再更优选的低于200nM、最优选的低于100nM。
在第二个特定的实施方式中，所述IC
50值低于80nM、优选的低于60nM、更优选的低于50nM、再更优选的低于40nM、最优选的低于30nM。
在第三个特定的实施方式中，所述IC
50值低于20nM、优选的低于15nM、更优选的低于10nM、再更优选的低于5.0nM、最优选的低于4.0nM。
在第四个特定的实施方式中，所述IC
50值低于3.0nM、优选的低于2.0nM、更优选的低于1.0nM、再更优选的低于0.80nM、最优选的低于0.60nM。
在第五个特定的实施方式中，所述IC
50值低于0.50nM、优选的低于0.40nM、更优选的低于0.30nM、再更优选的低于0.20nM、最优选的低于0.10nM。
因而，IC
50的示范性的范围是：0.1-400、0.2-300、0.3-200、0.4-100、0.5-50和1-10nM。
在第三个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其以高亲和力结合分离的GLP-1受体的N-末端细胞外结构域(nGLP-1R)。亲和力可以作为从替换
125I-Exendin-4(9-39)结合nGLP-1R的能力来测量，例如实施例22中描述的。
在该分析中，Exendin-4以5nM的IC
50值结合nGLP-1R，GLP-1(7-37)以1120nM的IC
50值结合nGLP-1R，利拉鲁肽以1500nM的IC
50值结合nGLP-1R。在本发明的一个方面，本发明的GLP-1类似物或其衍生物以比利拉鲁肽更低的IC
50值结合nGLP-1R。更优选的，本发明的GLP-1类似物或其衍生物以低于100nM的IC
50值结合nGLP-1R，再更优选的低于10nM、或甚至低于5nM。
蛋白质nGLP-1R可以如Runge et al2007(In Biochemistry，vol.46，pp.5830-5840)所描述的制备。然后蛋白质被生物素化的和固定，优选的固定在链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子上。适合的缓冲液例如0.1M NaHCO
3中的nGLP 1R可以利用75μg BNHS(Sigma H 1759)生物素化为1mg蛋白质。生物素化的nGLP1R随后优选的相对于PBS来透析。所有试剂和类似物或衍生物优选的在具有0.05％v/v Tween20的PBS中稀释。例如，结合分析可以在200μl的最终体积中在96孔OptiPlates(PerkinElmer 6005290)中进行。每个反应孔可以含有2mg的链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子(PerkinElmerRPNQ007)、0.1pmol生物素化的nGLP1R、50pCi
125I-Exendin(9-39)和终浓度例如从1000nM到0.064nM的测试肽。平板优选的在RT在摇动器上孵育3小时。SPA颗粒可以通过在例如1500rpm离心10分钟来旋转沉降，平板在例如TopCount-NXT(PerkinElmer)中计数。
亲和力可以通过IC
50值来表示，其是作为替换50％的
125I-Exendin-4(9-39)结合nGLP-1R的GLP-1衍生物的浓度从曲线上读取。
在第一个特定的实施方式中，如在实施例22的分析中作为IC
50/nM测量的，本发明的GLP-1衍生物对GLP-1受体的细胞外结构域(nGLP-1R)的亲和力低于1500、优选的低于1000、再更优选的低于900、最优选的低于800(nM)。
在第二个特定的实施方式中，如在实施例22的分析中作为IC
50/nM测量的，本发明的GLP-1衍生物对GLP-1受体的细胞外结构域(nGLP-1R)的亲和力低于700、优选的低于600、再更优选的低于500、最优选的低于400(nM)。
在第三个特定的实施方式中，如在实施例22的分析中作为IC
50/nM测量的，本发明的GLP-1衍生物对GLP-1受体的细胞外结构域(nGLP-1R)的亲和力低于300、优选的低于200、再更优选的低于100、最优选的低于80(nM)。
在第四个特定的实施方式中，如在实施例22的分析中作为IC
50/nM测量的，本发明的GLP-1衍生物对GLP-1受体的细胞外结构域(nGLP-1R)的亲和力低于60、优选的低于50、再更优选的低于40、最优选的低于30(nM)。
在第五个特定的实施方式中，如在实施例22的分析中作为IC
50/nM测量的，本发明的GLP-1衍生物对GLP-1受体的细胞外结构域(nGLP-1R)的亲和力低于20、优选的低于15、再更优选的低于10.0、最优选的低于5.0(nM)。
因此，本发明的GLP-1衍生物对nGLP-1R的亲和力的示范性的范围(按nM的IC
50)是：5-1500，5-1000，10-500，20-300，50-500，10-500，和5-50(nM)。
在此对于多肽使用的术语“DDP-IV保护的”是指一种多肽，其已经被化学地修饰以使得所述衍生物对血浆肽酶二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)有抗性。血浆中的DPP-IV酶已知涉及几种肽激素，例如GLP-1、GLP-2、Exendin-4等等的降解。因而，进行了相当大的努力来开发对DPP-IV介导的水解敏感的多肽的类似物和衍生物，以降低通过DPP-IV的降解速度。
在一个实施方式中，根据本发明的GLP-1类似物或其衍生物是DPP-IV保护的GLP-1类似物或其衍生物。
在一个实施方式中，根据本发明的GLP-1类似物或其衍生物是DPP-IV保护的GLP-1类似物或其衍生物，与利拉鲁肽相比其对于DPP-IV是更有抗性的。
肽对二肽基氨肽酶IV的降解的抗性通过以下降解分析来测定：
肽的等分量(5nmol)在37℃在100μL 0.1M三乙胺-HCl缓冲液pH 7.4中与相当于5mU酶活性的1μL纯化的二肽基氨肽酶IV孵育10-180分钟。通过添加5μL的10％三氟乙酸终止酶反应，分离肽降解产物并利用HPLC分析来定量。进行这种分析的一种方法是：混合物施加到Vydac C 18widepore(30nm孔，5μm颗粒)250×4.6mm柱上，以1ml/分钟的流速用0.1％三氟乙酸中线性阶式梯度的乙腈洗脱(0％乙腈3分钟，0-24％乙腈17分钟，24-48％乙腈1分钟)，根据Siegel etal.，Regul.Pept.1999；79：93-102和Mentlein et al.Eur.J.Biochem.1993；214：829-35。肽和它们的降解产物可以通过它们在220nm处(肽键)或280nm处(芳香族氨基酸)的吸光度来监测，和通过相对于标准物来积分它们的峰面积来定量。肽被二肽基氨肽酶IV的水解的速率以引起低于10％的肽被水解的孵育时间来估计。
做为选择，肽对二肽基氨肽酶IV的降解的抗性可以通过以下降解分析来测定：
肽的等分量(4nmol)在存在或缺乏1.6％人血清白蛋白的情况下，在37℃在40μL的0.085M Tris-HCl缓冲液pH 8.0中与10.9mU的纯化的二肽基氨肽酶IV孵育22小时。在0、4和22小时之后，采集10μl的样品，通过与100μl的1％三氟乙酸混合来终止酶反应。分离肽降解产物，使用HPLC分析来定量。进行这种分析的一种方法是：混合物施加到Agilent Zorbax 300SB-C18(5μm颗粒)150×2.1mm柱上，以0.5ml/分钟的流速用具有0.07％TFA的从0.1％三氟乙酸到100％乙腈的线性梯度在30分钟内洗脱。肽和它们的降解产物通过它们在214nm处的吸光度来监测，通过积分它们的峰面积来定量。肽对二肽基氨肽酶IV的稳定性作为相对于完整肽与裂解后缺少两个氨基末端氨基酸的降解产物的峰面积的总和的完整肽的峰面积来测定。
在此使用的术语“药学上可接受的”是指适合于正常的药物应用，即，在患者中不产生严重的有害事件，等等。
在此使用的术语“赋形剂”是指通常被添加到药物组合物中的化合物，例如，缓冲剂、张度试剂、防腐剂，等等。
在此使用的术语“有效数量”是指与没有治疗相比对于患者的治疗足以有效的剂量。
在此使用的术语“药物组合物”是指一种产物，其包含根据本发明的活性GLP-1类似物或其衍生物以及药物赋形剂，例如缓冲剂、防腐剂和任选地张度修饰剂和/或稳定剂。因而，药物组合物在本领域中也称为药物制剂。
在此使用的术语“疾病的治疗”是指发生了疾病、状况或病症的患者的管理和照料。治疗的目的是对抗疾病、状况或病症。治疗包括施用根据本发明的活性类似物或衍生物来消除或控制疾病、状况或病症，以及减轻与疾病、状况或病症相关的症状或并发症。
在另一个方面，本发明涉及可以同时结合白蛋白和GLP-1受体的GLP-1类似物或其衍生物。
在另一个方面，本发明涉及在存在2％白蛋白的情况下以低于100nM、优选的低于30nM的亲和力结合GLP-1受体的GLP-1类似物或其衍生物。
在另一个方面，所述GLP-1类似物或其衍生物(“GLP-1化合物”)具有对GLP-1受体的亲和力，当比较存在极低浓度(例如0.005％到0.2％)的人白蛋白的情况下的亲和力和存在2％人白蛋白的情况下的亲和力时，其仅部分地降低。在这些条件下结合亲和力的改变低于50倍、优选的低于30倍，更优选的低于10倍。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其对于exendin-4通常所见的化学降解、特别是氧化和脱酰胺作用是稳定的。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其具有对受体的高效价。对于具有低于100nM的白蛋白结合亲和力的非常强的白蛋白结合类似物，在cAMP分析中，GLP-1效价是好于3微摩尔、优选的效价是好于1微摩尔。
对于具有低于500nM的白蛋白结合亲和力的强白蛋白结合类似物或衍生物，在cAMP分析中，GLP-1效价是好于1微摩尔，优选的效价是好于0.2微摩尔。
在另一个方面，本发明涉及具有高白蛋白结合亲和力的GLP-1类似物或其衍生物。本发明的类似物或衍生物具有低于1微摩尔的白蛋白结合亲和力。更优选的，本发明的类似物或衍生物具有低于500nM、再更优选的低于200nM或甚至低于100nM的白蛋白结合亲和力。
白蛋白结合亲和力可以利用以下的分析来测量：
白蛋白结合分析：
GLP-1类似物或其衍生物对人血清白蛋白(HSA)的亲和力通过竞争性闪烁亲近分析(SPA)来测量。链霉抗生物素蛋白-SPA珠子(GEHealthcare RPNQ0009)与生物素化的HSA孵育5小时。珠子用缓冲液洗涤来除去未结合的HSA。珠子与
125I标记的酰化的GLP-1类似物例如N-ε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][Aib8，
125I-Tyr19，Arg34]GLP-1(7-37)或N-ε37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-四唑-5-基)十六烷酰基氨磺酰基)丁酰基氨基]十二烷酰氨基)-4-羧基丁酰氨基)-4-羧基丁酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Aib8，
125I-Tyr19，Glu22，Arg26，34，Lys37]GLP-1(7-37)-NH
2在含有100mM Hepes、100mM NaCl、10mM MgSO
4、0.025％Tween-20、pH7.4的缓冲液中混合。混合物吸移到Perkin Elmer Optiplate-96 6005290(100μl每孔)的反应孔中，100μl的要测量的GLP-1类似物或衍生物的稀释系列添加到相同的缓冲液中。在室温下温和摇动20小时后，平板被离心，在TopCounter上计数。作为GLP-1类似物或衍生物浓度的函数标绘结合的cpm，竞争曲线的EC
50值用作类似物或衍生物对HSA的亲和力的度量。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，相对于利拉鲁肽，其在啮齿动物中和在非啮齿动物模型中具有实质上改善的终末半衰期。
在本发明的一个方面，相对于利拉鲁肽，在啮齿动物或在非啮齿动物模型中的终末半衰期被改善至至少3倍。
在本发明的另一个方面，相对于利拉鲁肽，在非啮齿动物模型中的终末半衰期被改善至至少6倍。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其在i.v.施用给大鼠后具有至少10小时的体内半衰期。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其在s.c.施用给迷你猪后具有至少50小时的体内半衰期，优选的，在s.c.施用给迷你猪后具有至少80小时的体内半衰期。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其可以配制为适合于肺部施用的颗粒。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其在中性pH值下，最优选的在6-8的范围内是化学上和物理上稳定的。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其有很少的或没有聚集的倾向。在一个方面，当在硫黄素分析中测试时，相对于利拉鲁肽，聚集倾向被显著地改善了。
在另一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其适合于肺部递送。这可以是关于对肺部制剂有用的物理或化学方面。做为选择，类似物或衍生物对于气道和肺中酶的降解是稳定的。
在本发明的实施方式中，实现了上述特征的组合。
在此使用的术语“白蛋白结合部分”是指与人血清白蛋白非共价地结合的残基。附着于治疗性多肽的白蛋白结合残基一般具有低于1微摩尔的白蛋白结合亲和力，优选的低于500nM、再更优选的低于200nM或甚至低于100nM。
在含有4-40个碳原子、具有末端酸性基团的线性和分支亲脂(lipohophillic)部分中，许多白蛋白结合残基是已知的。
在此使用的术语“亲水的接头”是指将肽和白蛋白结合残基与化学物质部分分隔的间隔区，所述化学物质部分包含至少5个非氢原子，其中它们的30-50％是N或O。
在一个方面，本发明涉及GLP-1类似物或其衍生物，其包含在修饰的GLP-1序列和一个或更多个白蛋白结合残基之间的亲水性接头。
在一个方面，所述亲水性接头是不分支的寡聚乙二醇部分，在两个末端都具有合适的官能团，其形成修饰的GLP-1序列的氨基基团与白蛋白结合残基的官能团之间的桥。
在此处的式子中，来自附着的基团的末端键被认为是附着键，并且除非声明了，不以亚甲基基团结束。
在本发明的一个方面，所述GLP-1类似物或衍生物选自以下构成的组
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys33)GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺，
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺，
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)肽，
Nε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺，和
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-32)酰胺。
制剂
本发明的另一个目的是提供包含以0.1mg/ml到25mg/ml的浓度存在的根据本发明的类似物或衍生物的药物制剂，和其中所述制剂具有3.0到9.0的pH值。制剂可以进一步包含缓冲系统、防腐剂、张度试剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。
在本发明的一个实施方式中，所述药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂。这样的制剂一般是溶液或悬浮液。
在本发明的进一步的实施方式中，所述药物制剂是水溶液。
术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。同样地，术语“水性溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方式中，所述药物制剂是冻干的制剂，在使用前医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方式中，所述药物制剂是不需要任何在先的溶解随时可使用的干燥的制剂(例如，冻干的或喷雾干燥的)。
在进一步的方面，本发明涉及药物制剂，其包含根据本发明的类似物或衍生物的水溶液和缓冲剂，其中所述类似物或衍生物以0.1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述制剂具有约3.0到约9.0的pH值。
在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7.0到约9.5。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约3.0到约7.0。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约5.0到约7.5。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7.5到约9.0。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约7.5到约8.5。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约6.0到约7.5。在本发明的另一个实施方式中，制剂的pH值是从约6.0到约7.0。在另一个实施方式中，药物制剂是8.0到8.5。
在本发明的实施方式中，每个施用的剂量含有0.01mg-10mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有超过0.05mg的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有超过0.1mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到10mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到9mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到8mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到7mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到6mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有达到5mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。在一个实施方式中，施用的剂量含有从0.2mg到5mg的根据本发明的活性类似物或衍生物。
在本发明的进一步的实施方式中，所述缓冲剂选自由乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二[羟乙基]甘氨酸、N-三(羟乙基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、顺丁烯二酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物构成的组。这些特定缓冲剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。在本发明的进一步的实施方式中，防腐剂选自由苯酚、o-甲酚、m-甲酚、p-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯丁醇和thiomerosal、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲(imidurea)、chlorohexidine、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、chlorphenesine(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物构成的组。在一个实施方式中，所述防腐剂是苯酚或m-甲酚。在本发明的进一步的实施方式中，所述防腐剂以0.1mg/ml到20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述防腐剂以0.1mg/ml到5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述防腐剂以5mg/ml到10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述防腐剂以10mg/ml到20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式。防腐剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便起见，参考Remington：The Science and Practice ofPharmacy，19
th edition，1995。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含等渗试剂。在本发明的进一步的实施方式中，等渗试剂选自由盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物构成的组。在一个实施方式中，所述等渗试剂是丙二醇。可以使用任何糖类，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、茁霉多糖、糊精、环糊精、alfa和beta HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方式中，糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃类，包括，例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯醇。在一个实施方式中，糖醇添加剂是甘露醇。上述的糖类或糖醇可以单独地或组合地使用。对于使用的数量没有固定的限制，只要糖类或糖醇可溶于液体制品中，并且不会不利地影响利用本发明的方法实现的稳定效果。在一个实施方式中，糖类或糖醇浓度在约1mg/ml和约150mg/ml之间。在本发明的进一步的实施方式中，所述等渗试剂以1mg/ml到50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述等渗试剂以1mg/ml到7mg/ml的浓度存在。在本发明的实施方式中，所述等渗试剂以5mg/ml到7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述等渗试剂以8mg/ml到24mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，所述等渗试剂以25mg/ml到50mg/ml的浓度存在。这些特定等渗试剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式。在药物组合物中等渗试剂的使用是技术人员公知的。为了方便起见，参考Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，19
th edition，1995。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明的进一步的实施方式中，所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐和其混合物。在本发明的进一步的实施方式中，螯合剂以0.1mg/ml到5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，螯合剂以0.1mg/ml到2mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方式中，螯合剂以2mg/ml到5mg/ml的浓度存在。这些特定螯合剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式。螯合剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19
th edition，1995。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19
th edition，1995。
更特别地，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，它的治疗活性成分包括多肽，所述多肽在液体药物制剂的保存期间可能展现聚集物形成。
“聚集物形成”是指引起寡聚体形成的多肽分子之间的物理相互作用，其可以是仍然可溶的，或是从溶液沉淀的大的可见的聚集物。“在保存期间”意指液体药物组合物或制剂一旦被制备，不立即施用给受试者。然而，在制备之后，它被包装用于保存，处于液态、冷冻状态、或干燥的形式，用于以后重构成液态或适合于施用给受试者的其他形式。“干燥的形式”意指液体药物组合物或制剂被干燥，通过冷冻干燥(即，冻干；参见，例如，Williams and Polli(1984)J.ParenteralSci.Technol.38：48-59)、喷雾干燥(参见Masters(1991)in Spray-DryingHandbook(5th ed；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，pp.491-676；Broadhead et al.(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；和Mumenthaler et al.(1994)Pharm.Res.11：12-20)或风干(Carpenter and Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；and Roser(1991)Biopharm.4：47-53)。在液体药物组合物的保存期间多肽的聚集物形成可能不利地影响多肽的生物学活性，引起药物组合物的治疗效力的损失。此外，聚集物形成可以引起其他问题，例如，当含有多肽的药物组合物利用输注系统来施用时，管道、膜或泵的阻塞。
本发明的药物组合物可以进一步包含足以降低组合物的保存期间多肽的聚集物形成的、一定数量的氨基酸碱。“氨基酸碱”是指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以它的游离碱形式或以它的盐形式存在。当使用氨基酸的组合时，所有的氨基酸可以以它们的游离碱形式存在，所有的可以以它们的盐形式存在，或某一些以它们的游离碱形式存在而其他的以它们的盐形式存在。在一个实施方式中，在制备本发明的组合物中使用的氨基酸是带有带电侧链的那些，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如，甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和其混合物)的任何立体异构体(即，L、D或其混合物)或这些立体异构体的组合，可以在本发明的药物组合物中存在，只要特定的氨基酸以它的游离碱形式或它的盐形式存在。在一个实施方式中，使用L-立体异构体。本发明的组合物还可以用这些氨基酸的类似物来配制。“氨基酸类似物”是指天然存在的氨基酸的衍生物，其带来在本发明的液体药物组合物的保存期间降低多肽的聚集物形成的期望的效果。适合的精氨酸类似物包括，例如，氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，适合的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和buthionine，适合的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。对于其他氨基酸，氨基酸类似物以它们的游离碱形式或它们的盐形式掺入到组合物中。在本发明的进一步的实施方式中，氨基酸或氨基酸类似物以一定浓度使用，所述浓度足以防止或延缓蛋白质的聚集。
在本发明的进一步的实施方式中，甲硫氨酸(或其他含硫的氨基酸或氨基酸类似物)可以添加来抑制甲硫氨酸残基向甲硫氨酸亚砜的氧化，当作为治疗试剂的多肽是包含对这样的氧化敏感的至少一个甲硫氨酸残基的多肽时。“抑制”是指随着时间的过去甲硫氨酸氧化的物质的最小的积累。抑制甲硫氨酸氧化引起多肽在它的适当的分子形式的更多的存留。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L或D)或其组合。添加的数量应当是足够抑制甲硫氨酸残基的氧化的数量，从而甲硫氨酸亚砜的数量对于管理机构是可接受的。一般地，这意味着组合物包含不超过约10％到约30％的甲硫氨酸亚砜。一般地，这可以通过添加甲硫氨酸、从而添加的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比例从约1∶1到约1000∶1，例如10∶1到约100∶1，来实现。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的组的稳定剂。
在本发明的进一步的实施方式中，稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/氧化纤维素或其衍生物(例如，HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、包含硫的物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫乙醇和不同的盐(例如，氯化钠)。这些特定稳定剂的每一个构成了本发明的可选择的实施方式。
所述药物组合物还可以包含另外的稳定剂，其进一步增强其中的治疗活性多肽的稳定性。
本发明特别感兴趣的稳定剂包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽对抗甲硫氨酸氧化，以及非离子表面活性剂，其保护多肽对抗与冻融或机械剪切相关的聚集。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方式中，所述药物组合物包含两种不同的表面活性剂。在此使用的术语“表面活性剂”是指包含水溶性的(亲水性的)部分、头部和脂溶性的(亲油性的)区段的任何分子或离子。表面活性剂优选地在界面积累，其中亲水性部分朝向水(亲水性的相)亲油性部分朝向油或疏水的相(即，玻璃、空气、油，等等)。表面活性剂开始形成胶束的浓度被称为临界胶束浓度或CMC。此外，表面活性剂降低了液体的表面张力。表面活性剂也称为两亲化合物。术语“洗涤剂”是一般用于表面活性剂的异名。
阴离子表面活性剂可以选自下组：鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸钠盐、胆酸、去氢胆酸、去氧胆酸、去氧胆酸甲酯、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠、甘氨鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸水合物、甘氨脱氧胆酸一水合物、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸钠盐、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、
N-十二烷酰基肌氨酸钠盐、N-十二烷酰基肌氨酸钠盐、N-十二烷酰基肌氨酸、N-十二烷酰基肌氨酸、十二烷基硫酸锂、Lugol、1-辛烷磺酸钠盐、1-辛烷磺酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、1-癸烷磺酸钠、1-十二烷基磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-壬烷磺酸钠、1-丙烷磺酸钠一水合物、2-溴乙烷磺酸钠、胆酸钠水合物、牛或绵羊胆汁、胆酸钠水合物、络胆酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、己烷磺酸钠、辛基硫酸钠、戊烷磺酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅脱氧明酸钠盐、牛磺去氧胆酸钠盐一水合物、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛熊去氧胆酸钠盐、
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十二烷基硫酸盐、DSS(多库酯钠、CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂烷基硫酸钠)、十二烷基磷酸胆碱(FOS-胆碱-12)、癸基磷酸胆碱(FOS-胆碱-10)、壬基磷酸胆碱(FOS-胆碱-9)、二棕榈酰磷脂酸、辛酸钠和/或熊去氧胆酸。
阳离子表面活性剂可以选自下组：烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧乙烯(10)-N-动物脂-1，3-二氨基丙烷、通佐溴胺(Thonzoniumbromide)和/或三甲基(十四烷基)溴化铵。
非离子表面活性剂可选自下组：BigCHAP、二(聚乙二醇二[咪唑基羰基])、嵌段共聚物，如聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物，例如泊洛沙姆、泊洛沙姆188和泊洛沙姆407、
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35、
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56、
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72、
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76、
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92V、
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97、
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58P、
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EL、十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、n-十二烷酰-N-甲基葡糖酰胺、烷基多聚葡糖苷、乙氧基化蓖麻油、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-beta-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二环氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸盐、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸盐、聚氧乙烯50硬脂酸盐、聚氧乙烯8硬脂酸盐、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸盐、来自皂树属树皮的皂角苷、
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20，
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40，
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60，
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65，
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80，
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85，Tergitol，Type 15-S-12，Tergitol，15-S-30型，Tergitol，15-S-5型，Tergitol，15-S-7型，Tergitol，15-S-9型，Tergitol，NP-10型，Tergitol，NP-4型，Tergitol，NP-40型，Tergitol，NP-7型，Tergitol，NP-9型、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、Triton CF-21，Triton CF-32，Triton DF-12，Triton DF-16，Triton GR-5M，Triton QS-15，Triton QS-44，Triton X-100，Triton X-102，Triton X-15，Triton X-151，Triton X-200，Triton X-207，
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X-100，
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X-114，
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X-165溶液
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X-305溶液，
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X-405，
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X-45，
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X-705-70，
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20，
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40，
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60，
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6，
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65，
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80，
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81，
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85、Tyloxapol、鞘磷脂(鞘磷脂)和鞘糖脂(神经酰胺、神经节苷脂)、磷脂和/或n-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷。
两性离子表面活性剂可选自下组：CHAPS、CHAPSO、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐、N-烷基-N，N-二甲基铵-1-丙烷磺酸盐、3-cholamido-1-丙基二甲基铵-1-丙烷磺酸盐、十二烷基磷酸胆碱、十四烷酰基溶血磷脂酰胆碱、两性试剂3-12(N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐)、两性试剂3-10(3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐)、两性试剂3-08(3-(辛基二甲基铵)丙烷磺酸盐)、甘油磷脂(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸)、甘油糖脂(吡喃型半乳糖苷)、溶血磷脂酰基和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如，溶血磷脂酰胆碱的十二烷酰基和十四烷酰基衍生物、二棕榈酰磷脂酰胆碱和极性首基的修饰物，也就是胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸、酰肉碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N
beta酰化的衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化的衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸与中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的N
beta酰化的衍生物，包含中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的三肽的N
beta酰化的衍生物，或所述表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物、长链脂肪酸和其盐C
6-C
12(例如油酸和辛酸)、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐、阴离子的(烷基-芳基-磺酸盐)单价的表面活性剂、棕榈酰溶血磷脂酰基-L-丝氨酸、溶血磷脂(例如，乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯)或其混合物的组。
在此使用的术语“烷基-多聚葡糖苷”涉及直链或分支的C
5-20-烷基、-链烯基或-炔基链，其被一个或更多个糖苷部分，例如麦芽糖苷、糖等等取代。这些烷基-多聚葡糖苷的实施方式包括C
6-18烷基-多聚葡糖苷。这些烷基-多聚葡糖苷的特定的实施方式包括偶数的碳链，例如C
6、C
8、C
10、C
12、C
14、C
16、C
18和C
20烷基链。糖苷部分的特定实施方式包括吡喃糖苷、吡喃葡萄糖苷、麦芽糖苷、麦芽三糖苷和蔗糖。在本发明的实施方式中，低于6个糖苷部分附着到所述烷基基团。在本发明的实施方式中，低于5个糖苷部分附着到所述烷基基团。在本发明的实施方式中，低于4个糖苷部分附着到所述烷基基团。在本发明的实施方式中，低于3个糖苷部分附着到所述烷基基团。在本发明的实施方式中，低于2个糖苷部分附着到所述烷基基团。烷基-多聚葡糖苷的具体实施方式有烷基糖苷，例如n-癸基β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷、十四烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、十六烷基β-D-麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽三糖苷、十二烷基β-D-麦芽三糖苷、十四烷基β-D-麦芽三糖苷、十六烷基β-D-麦芽三糖苷、n-十二烷基-蔗糖、n-癸基-蔗糖、蔗糖单癸酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单豆蔻酸酯和蔗糖单棕榈酸酯。
表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为了方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19
thedition，1995。
在本发明的进一步的实施方式中，所述制剂进一步包含蛋白酶抑制物，例如EDTA(乙二胺四乙酸)和盐酸苯甲脒，但是其他商业上可获得的蛋白酶抑制物也可以使用。蛋白酶抑制物的使用在包含蛋白酶的酶原的药物组合物中是特别有用的，以抑制自催化。
可能的是，其他成分可以存在于本发明的肽药物制剂中。这些其他成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度修饰剂、螯合剂、金属离子、油质载体、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些其他成分不应不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。
含有根据本发明的类似物或衍生物的药物组合物可以在几个位点施用给需要这样的治疗的患者，例如，在局部位点，例如，皮肤和粘膜位点，在绕过吸收的位点，例如，在动脉、静脉、心脏中施用，以及在涉及吸收的位点，例如，在皮肤、皮肤下、肌肉中或腹部内施用。
根据本发明的药物组合物的施用可以通过几种施用途径，例如，舌的、舌下的、口腔的、口中的、口服、胃肠内的、鼻部的、肺部的，例如，通过细支气管和肺泡或其组合、表皮的、真皮的、经皮的、阴道的、直肠的、眼的，例如通过结膜、输尿管的和胃肠外的途径施用给需要这样的治疗的患者。
本发明的组合物可以在几种剂型中施用，例如，作为溶液、悬浮液、乳剂、微乳剂、多重乳剂、泡沫、油膏剂、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、糖衣片剂、口香糖、冲洗剂、胶囊剂、例如，硬明胶胶囊和软明胶胶囊、栓剂、直肠胶囊剂、滴剂、凝胶、喷雾剂、粉剂、气雾剂、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用冲洗剂、阴道的阴道栓剂、阴道的环、阴道的软膏剂、注射溶液、原位转化溶液，例如，原位凝胶、原位凝固、原位沉淀、原位结晶，输注溶液和植入剂。
本发明的组合物可以例如，通过共价的、疏水的和静电相互作用，进一步化合于或附着于药物载体、药物递送系统和先进的药物递送系统，以进一步增强本发明的类似物或衍生物的稳定性、提高生物利用率、提高溶解度、降低不利作用、实现本领域技术人员公知的时间治疗，和提高患者的顺应性，或任何其组合。载体、药物递送系统和先进的药物递送系统的实例包括但不限于，聚合物，例如纤维素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和异丁烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白，例如白蛋白，凝胶，例如，热凝胶化系统，例如，本领域技术人员公知的嵌段共聚物，胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶和其分散体、L2相和其分散体、脂质-水系统中相特性领域技术人员公知的，聚合的胶束、多重乳液、自乳化的、自微乳化的、环糊精和其衍生物以及树枝状高分子(dendrimers)。
本发明的组合物在固体、半固体、粉剂和溶液的制剂中是有用的，用于根据本发明的类似物或衍生物的肺部施用的，利用，例如，计量的剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，这都是本领域技术人员公知的设备。
本发明的组合物在控制的、持续的、延长的、延迟的和缓慢释放的药物递送系统的制剂中是特别有用的。更具体地，而不是受限的，组合物在本领域技术人员公知的胃肠外的控制释放和持续释放系统(两种系统都引起施用数量的多倍降低)的制剂中是有用的。再更优选的是皮下施用的控制释放和持续释放系统。不限制本发明的范围，有用的控制释放系统和组合物的实例有水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合的胶束、微球体、纳米颗粒。
产生对本发明的组合物有用的控制释放系统的方法包括但不限于，结晶、凝缩、共同结晶、沉淀、共同沉淀、乳化、分散、高压匀质化、包囊、喷雾干燥、微胶囊包裹、凝聚、相分离、溶剂蒸发来产生微球体、挤压和超临界流体过程。一般参考药物控制释放手册(Handbook of Pharmaceutical Controlled Release)(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the PharmaceuticalSciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。
胃肠外施用可以通过凭借注射器任选地笔样注射器的皮下的、肌肉内的、腹膜内的或静脉内注射来进行。做为选择，胃肠外施用可以通过输注泵进行。进一步的选择是一种组合物，其可以是溶液或悬浮液或粉剂，用于以鼻部或肺部液体或粉末喷雾剂的形式施用本发明的类似物或衍生物。作为更进一步的选择，含有根据本发明的类似物或衍生物的药物组合物也可以适应于经皮的施用，例如，通过无针头的注射或来自贴片，任选地离子透入贴片，或穿粘膜的，例如口腔的施用。
根据本发明的类似物或衍生物可以使用适合于肺部药物递送的任何已知类型的设备、经由肺部的途径在运载体如溶液、悬浮液或干粉中施用。这些的实例包括但不限于，用于肺部药物递送的三种一般类型的气雾剂发生器，可以包括喷射或超声喷雾器、计量给药吸入器，或干粉吸入器(参照Yu J，Chien YW.Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects.Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
根据标准的测试方法，颗粒的空气动力学直径(d
a)被定义为单位密度(1g/cm
3)的参考标准球状颗粒的几何当量直径。在最简单的情况下，对于球状颗粒，d
a作为密度比的平方根的函数与分度圆直径(reference diameter)(d)相关，如以下描述的：
对非球形颗粒进行这种关系的修改(参照Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances in pulmonary drug deliveryusing large，porous inhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。术语“MMAD”和“MMEAD”是本领域中很好地描述的和公知的(参照Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R and represents ameasure of the median value of an aerodynamic particle size distribution.Recent advances in pulmonary drug delivery using large，porous inhaledparticles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。质量中值空气动力学直径(MMAD)和质量中值有效空气动力学直径(MMEAD)相互可换地使用，是统计学参数，独立于实际的形状、大小或密度，经验性地描述了与气溶胶粒子在肺部沉积的潜力相关的气溶胶粒子的大小(参照Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.Recent advances inpulmonary drug delivery using large，porous inhaled particles.J ApplPhysiol 84(2)(1998)379-385)。MMAD通常从用冲击器进行的测量来计算，冲击器是测量颗粒在空气中的惯性行为的仪器。
在进一步的实施方式中，所述制剂可以通过任何已知的气溶胶化技术例如，雾化来气溶胶化，来实现低于10μm、更优选的1-5μm之间、最优选的1-3μm之间的气溶胶粒子的MMAD。优选的颗粒大小是基于用于药物向深部肺递送的最有效大小，在深部肺中蛋白质被最佳地吸收(参照Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer A，Recentadvances in pulmonary drug delivery using large，porous inhaled particles.J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385)。
包含根据本发明的类似物或衍生物的肺制剂的深部肺沉积任选地可以通过利用吸入技术的修改方法来进一步优化，例如，但不限于：缓慢吸入流动(例如，30L/分钟)、屏气和动作的定时(timing ofactuation)。
术语“稳定化的制剂”是指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的制剂。
在此使用的术语蛋白质制剂“物理稳定性”是指，作为蛋白质暴露于热-机械应力和/或与导致不稳定的界面和表面，例如疏水表面和界面相互作用的结果，蛋白质形成生物学无活性的和/或不溶的蛋白质聚集物的倾向。水性蛋白质制剂的物理稳定性通过在将填充在适合的容器(例如，药筒或管形瓶)中的制剂在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如，搅动)各种时间之后目视检查和/或浊度测定的方式来评估。制剂的目视检查在黑暗背景的精确聚焦光线中进行。制剂的混浊度通过按照例如0到3的浑浊程度的目测评分排列来表征(没有显示混浊的制剂相应于目测评分0，在日光下显示了可见的浑浊的制剂相应于目测评分3)。当制剂在日光下显示了可见混浊时，制剂被分类为对蛋白质聚集是物理不稳定的。做为选择，制剂的混浊度可以通过技术人员公知的简单的浊度测定来评估。水性蛋白质制剂的物理稳定性也可以通过使用光谱学试剂或蛋白质构象状态的探针来评估。探针优选地是小分子，其优先地结合蛋白质的非天然构象异构体。蛋白质结构的小分子光谱学探针的一个实例是硫黄素T。硫黄素T是广泛用于淀粉样纤丝的检测的荧光染料。在存在纤丝的情况下，可能其他蛋白质结构也一样，当与纤丝蛋白质形式结合时，硫黄素T产生在约450nm处新的激发最大值和在约482nm处增强的发射。未结合的硫黄素T在该波长下是基本上没有荧光的。
其他小分子可以用作蛋白质结构从天然到非天然状态改变的探针。例如，优先地结合蛋白质的暴露的疏水块的“疏水块”探针。疏水块一般包埋在天然状态的蛋白质的三级结构内，但是当蛋白质开始解折叠或变性时被暴露。这些小分子光谱学探针的实例有芳香族的疏水性染料，例如，蒽(antrhacene)、吖啶、菲咯啉，等等。其他的光谱学探针有金属氨基酸络合物，例如，疏水性氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等等的钴金属络合物。
在此使用的术语蛋白质制剂的“化学稳定性”是指在蛋白质结构方面的化学的共价改变，其导致与天然蛋白质结构相比具有潜在更低的生物学效价和/或潜在提高的免疫原性性质的化学降解产物的形成。各种化学降解产物可以取决于天然蛋白质的类型和性质、蛋白质暴露的环境而形成。化学降解的消除极其可能不能完全避免，化学降解产物的提高的数量常常在蛋白质制剂的保存和使用期间见到，这是本领域技术人员公知的。大多数蛋白质易于脱酰胺作用，其中谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰残基中的侧链酰胺基被水解形成游离的羧酸。其他降解途径涉及高分子量转化产物的形成，其中两种或更多种蛋白质分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用共价地相互结合，导致共价结合的二聚体、寡聚体和聚合物降解产物的形成。(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern.T.J.&Manning M.C.，Plenum Press，New York1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)可以作为化学降解的另一个变体被提及。蛋白质制剂的化学稳定性可以通过在暴露于不同的环境条件之后的各个时点测量化学降解产物的数量来评估(降解产物的形成常常可以通过例如提高温度来加速)。每种单独的降解产物的数量常常通过取决于分子大小和/或电荷使用各种层析技术(例如，SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物来测定。
因此，如上文阐述的，“稳定的制剂”是指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的制剂。一般地，制剂必须在使用和保存(遵照建议的使用和保存条件)期间是稳定的直到达到期满日期。
在本发明的一个实施方式中，包含根据本发明的类似物或衍生物的药物制剂对于超过6周的使用和超过3年的保存是稳定的。
在本发明的另一个实施方式中，包含根据本发明的类似物或衍生物的药物制剂对于超过4周的使用和超过3年的保存是稳定的。
在本发明的进一步的实施方式中，包含根据本发明的类似物或衍生物的药物制剂对于超过4周的使用和超过两年的保存是稳定的。
在本发明的再进一步的实施方式中，包含根据本发明的类似物或衍生物的药物制剂对于超过2周的使用和超过两年的保存是稳定的。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的类似物或衍生物用于药物的制备的用途。
在一个实施方式中，根据本发明的类似物或衍生物被用于制备用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、冠心病和其他心血管病症、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防的药物。
在另一个实施方式中，根据本发明的类似物或衍生物被用于制备用于延缓或防止2型糖尿病中的疾病发展的药物。
在另一个实施方式中，根据本发明的类似物或衍生物被用于制备用于降低食物摄取、降低β-细胞细胞凋亡、提高β-细胞功能和β-细胞群集和/或用于恢复对β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。
使用根据本发明的类似物或衍生物的治疗还可以与第二种或更多种药理学活性物质组合，所述药理学活性物质例如，选自抗糖尿病试剂、抗肥胖试剂、食欲调节试剂、抗高血压试剂、用于来自或与糖尿病相关的并发症的治疗和/或预防的试剂，和用于来自或与肥胖相关的并发症和病症的治疗和/或预防的试剂。这些药理学活性物质的实例有：胰岛素、磺脲类、双胍、氯茴苯酸(meglitinides)、葡糖苷酶抑制物、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制物、涉及葡糖异生作用和/或糖原分解的刺激的肝脏酶的抑制物、葡萄糖摄取调节物、修饰脂质代谢的化合物，如抗高血脂试剂如HMG CoA抑制物(statins)、抑胃多肽(GIP类似物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β-细胞的ATP依赖性钾通道的试剂；消胆胺、考来替泊、氯贝丁酯、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、那格列奈(Neteglinide)、瑞格列奈(repaglinide)；β-阻断剂，例如阿普洛尔、阿替洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、萘心安和美托洛尔、ACE(血管紧张肽转化酶)抑制物，例如贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利，钙离子通道阻断剂，例如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地尔硫卓和维拉帕米和α-阻断剂，例如，多沙唑嗪、乌拉地尔、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明调节的转录产物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、PYY激动剂、Y2受体激动剂、Y4受体激动剂、混合的Y2/Y4受体激动剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、orexin拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促肾上腺皮质素释放因子)激动剂、CRF BP(促肾上腺皮质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、urocortin激动剂、β3激动剂、胃泌酸调节素和类似物、MSH(促黑素细胞激素)激动剂、MCH(黑色素细胞-浓缩激素)拮抗剂、CKK(胆囊收缩素)激动剂、血清素重新摄取抑制物、血清素和去甲肾上腺素重新摄取抑制物、混合的血清素和产去甲肾上腺素的化合物、5HT(血清素)激动剂、铃蟾肽素激动剂、神经节肽(galanin)拮抗剂、生长激素、生长激素释放化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白质2或3)调节物、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭(bromocriptin)、doprexin)、脂酶/淀粉酶抑制剂、RXR(类视黄醇X受体)调节物、TR β激动剂；组胺H3拮抗剂、抑胃多肽激动剂或拮抗剂(GIP类似物)、促胃液素和促胃液素类似物。
根据本发明的类似物或衍生物的治疗还可以与手术组合，所述手术影响葡萄糖水平和/或脂质内环境稳态，例如胃囊带术或胃旁流。
要理解的是，根据本发明的类似物或衍生物与一种或更多种上述化合物以及任选地一种或更多种进一步药理学活性物质的任何适合的组合被认为处于本发明的范围之内。
制造类似物的方法
取决于序列，本发明的类似物可以通过一种方法产生，所述方法包括培养含有编码多肽的DNA序列、并且能在允许所述多肽表达的条件下在适合的营养培养基中表达所述多肽的宿主细胞，之后从培养物回收产生的肽。
用于培养细胞的培养基可以是适合于生长宿主细胞的任何常规的培养基，例如，含有合适的添加物的最小或复合培养基。适合的培养基可以从商业的供应商获得，或可以根据公开的配方来制备(例如，在美国典型培养物保藏所的目录中)。细胞产生的肽然后可以通过常规过程从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞，通过盐，例如硫酸铵来沉淀上清液或滤液的蛋白质成分，取决于所讨论的肽，通过各种层析过程，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等等纯化。
编码治疗多肽的DNA序列可以适当地是基因组或cDNA来源的，例如，根据标准技术通过制备基因组或cDNA库，以及通过使用合成的寡核苷酸探针杂交来筛选编码多肽的全部或部分的DNA序列(参见，例如，Sambrook，J，Fritsch，EF and Maniatis，T，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)。编码多肽的DNA序列还可以通过已建立的标准方法来合成地制备，例如，Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869所描述的亚磷酰胺方法，或Matthes et al.，EMBO Journal 3(1984)，801-805所描述的方法。DNA序列还可以通过利用特异性引物的聚合酶链式反应来制备，例如在US 4,683,202或Saiki et al.，Science 239(1988)，487-491中描述的。
DNA序列还可以插入任何载体中，所述载体可以方便地经历重组DNA操作，载体的选择常常将取决于要导入它的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制载体，即，其作为染色体外的实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如，质粒。做为选择，载体可以是一种载体，当被导入宿主细胞中时，其整合到宿主细胞基因组中并且与它所整合入的染色体一起被复制。
载体优选地是表达载体，其中编码肽的DNA序列可操作连接到DNA的转录所需的其他片段，例如启动子。启动子可以是任何DNA序列，其显示了在所选的宿主细胞中的转录活性，可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码本发明的肽的DNA在多种的宿主细胞中转录的适合的启动子的实例是本领域公知的，例如，参考Sambrook et al.，上文。
如有必要，编码肽的DNA序列还可以可操作地连接到适合的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体可以进一步包含允许载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
载体还可以包含可选择标记物，例如，其产物补足了宿主细胞中的缺陷，或赋予对药物例如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、匀霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。
为了指导本发明的亲本肽进入宿主细胞的分泌途径，分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)可以在重组载体中提供。分泌信号序列与编码肽的DNA序列按照正确的阅读框连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5′。分泌信号序列可以是通常与肽相连的那些，或可以是来自编码其他分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码当前的肽的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列、以及将它们插入到含有复制必需的信息的适合的载体中的步骤，是本领域的技术人员公知的(参见，例如，Sambrooket al.，上文)。
向其中导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生当前的肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。本领域中公知的和使用的适合的宿主细胞的实例有，无限制地，大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
根据本发明的实施方式
1.一种GLP-1类似物或其衍生物，其包含修饰的GLP-1序列7-35(SEQ ID NO：1)，所述修饰的GLP-1序列7-35具有：
i)与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，包括
a)在相当于SEQ ID NO：1的位置22的位置处的Glu残基，和
b)在相当于SEQ ID NO：1的位置26的位置处的Arg残基，
ii)任选地，在相当于SEQ ID NO：1的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸可以是没有的，条件是如果在位置30、31、32、33或34处的氨基酸是没有的，则下游的每个氨基酸残基也是没有的，和
iii)任选地C-末端酰胺基团。
2.根据实施方式1的GLP-1类似物或其衍生物，其是用白蛋白结合残基衍生化的或是聚乙二醇化的。
3.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是28个氨基酸。
4.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是27个氨基酸。
5.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是26个氨基酸。
6.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是25个氨基酸。
7.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是24个氨基酸。
8.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置30、31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是23个氨基酸。
9.根据实施方式1-8的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有C-末端酰胺基团。
10.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(I)的序列Xaa
7-Xaa
8-Xaa
9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18-Tyr-Xaa
20-Glu-Glu-Xaa
23-Xaa
24-Xaa
25-Arg-Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30-Xaa
31-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(I)(SEQ ID No：2)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
9是Glu或Glu衍生物，例如，α，α二甲基-Glu；
Xaa
16是Val或Leu；
Xaa
18是Ser、Lys、Cys或Arg；
Xaa
20是Leu、Lys或Cys；
Xaa
23是Gln、Glu、Lys、Cys或Arg；
Xaa
24是Ala或Asn；
Xaa
25是Ala或Val；
Xaa
27是Glu、Ala或Leu；
Xaa
30是Ala、Glu、Arg或没有；
Xaa
31是Trp、Lys、Cys或没有；
Xaa
33是Val、Lys、Cys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Asn、Arg、Cys或没有；
Xaa
35是Gly、Aib或没有；
R是酰胺或是没有的；
条件是，如果Xaa
30、Xaa
31、Xaa
32、Xaa
33或Xaa
34是没有的，则下游的的每个氨基酸残基也是没有的。
11.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(II)的序列
Xaa
7-Xaa
8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa
18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa
30-Trp-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(II)(SEQ ID No：3)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
18是Ser、Lys或Arg；
Xaa
30是Ala、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
33是Val、Lys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
35是Gly、Aib或是没有的；
R是酰胺或是没有的。
12.根据实施方式1-11的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化
其中A-选自以下构成的组
![]()
其中n选自由14、15、16、17、18和19构成的组，p选自由10、11、12、13和14构成的组，以及d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，
-B-选自以下构成的组
![]()
![]()
其中x选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12构成的组，
-C-选自以下构成的组
![]()
其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由0、1和2构成的组，条件是当c是0时b是1或2，或当c是1或2时b是0，和当f是0时e是1或2，或当f是1或2时e是0，和
-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。
13.根据实施方式12的GLP-1类似物或其衍生物，其中D选自以下构成的组
![]()
![]()
和其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组，m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组。
14.一种包含根据实施方式1-13的任一项的GLP-1类似物或其衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
15.根据实施方式1-14的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。
人类GLP-1(7-35)的氨基酸序列作为SEQ ID NO：1被包括在序列表中，SEQ ID NO：2和3是根据本发明的其衍生物。
在序列表中，编号从氨基酸残基no.1开始。因而，例如，SEQ IDNO：1的位置1相当于GLP-1(7-35)的位置7(His)，SEQ ID NO：1的位置16相当于GLP-1(7-35)的位置22(Gly)，SEQ ID NO：1的位置20相当于GLP-1(7-35)的位置26(Lys)，对于其他位置和其他序列也是这样。
因而，在上述实施方式1中，本发明还提供了GLP-1类似物或衍生物，其包含修饰的GLP-1(7-35)序列，所述序列具有：
i)与SEQ ID NO：1的序列相比总共2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，包括
a)在相当于GLP-1(7-35)的位置22的位置处的Glu残基(SEQ ID NO：1的位置16)，和
b)在相当于GLP-1(7-35)的位置26的位置处的Arg残基(SEQ ID NO：1的位置20)，
ii)任选地，相当于GLP-1(7-35)的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸(分别地，SEQ ID NO：1的位置24、25、26、27、28或29)可以是没有的，条件是如果GLP1(7-35)的位置30、31、32、33或34处的氨基酸(SEQ ID NO：1的位置24、25、26、27或28)是没有的，则每个下游的氨基酸也是没有的，和
iv)任选地C-末端酰胺基团。
本发明另外提供了相应于根据本发明的任何上述实施方式和特定实施方式的GLP-1类似物或衍生物、方法和其用途以及具有其内容物的药物组合物，其中相应的位置编号修改是如上所解释的进行的，在上文对上述实施方式1的GLP-1类似物或衍生物显示了。
1.一种GLP-1类似物或其衍生物，其包含修饰的GLP-1序列7-35(SEQ ID NO：1)，所述修饰的GLP-1序列7-35具有：
i)与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，包括
a)在相当于SEQ ID NO：1的位置22的位置处的Glu残基，和
b)在相当于SEQ ID NO：1的位置26的位置处的Arg残基，
ii)任选地，在相当于SEQ ID NO：1的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸可以是没有的，条件是如果在位置30、31、32、33或34处的氨基酸是没有的，则下游的每个氨基酸残基也是没有的，和
iii)任选地C-末端酰胺基团。
2.根据实施方式1的GLP-1类似物或其衍生物，其是用白蛋白结合残基衍生化的或是聚乙二醇化的。
3.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是28个氨基酸。
4.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是27个氨基酸。
5.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是26个氨基酸。
6.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是25个氨基酸。
7.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是24个氨基酸。
8.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置30、31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是23个氨基酸。
9.根据实施方式1-8的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有C-末端酰胺基团。
10.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(I)的序列Xaa
7-Xaa
8-Xaa
9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18-Tyr-Xaa
20-Glu-Glu-Xaa
23-Xaa
24-Xaa
25-Arg-Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30-Xaa
31-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(I)(SEQ ID No：2)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
9是Glu或Glu衍生物，例如，α，α二甲基-Glu；
Xaa
16是Val或Leu；
Xaa
18是Ser、Lys、Cys或Arg；
Xaa
20是Leu、Lys或Cys；
Xaa
23是Gln、Glu、Lys、Cys或Arg；
Xaa
24是Ala或Asn；
Xaa
25是Ala或Val；
Xaa
27是Glu、Ala或Leu；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或没有；
Xaa
31是Trp、Lys、Cys或没有；
Xaa
33是Val、Lys、Cys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Asn、Arg、Cys或没有；
Xaa
35是Gly、Aib或没有；
R是酰胺或是没有的；
条件是，如果Xaa
30、Xaa
31、Xaa
32、Xaa
33或Xaa
34是没有的，则下游的的每个氨基酸残基也是没有的。
11.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(II)的序列Xaa
7-Xaa
8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa
18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa
30-Trp-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(II)(SEQ ID No：3)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
18是Ser、Lys或Arg；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或是没有的；
Xaa
33是Val、Lys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
35是Gly、Aib或是没有的；
R是酰胺或是没有的。
12.根据实施方式1-11的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化
其中A-选自以下构成的组
![]()
其中n选自由14、15、16、17、18和19构成的组，p选自由10、11、12、13和14构成的组，以及d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，
-B-选自以下构成的组
![]()
其中x选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12构成的组，
-C-选自以下构成的组
![]()
其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由0、1和2构成的组，条件是当c是0时b是1或2，或当c是1或2时b是0，和当f是0时e是1或2，或当f是1或2时e是0，和
-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。
13.根据实施方式12的GLP-1类似物或其衍生物，其中D选自以下构成的组
![]()
和其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组，m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组。
14.一种包含根据实施方式1-13的任一项的GLP-1类似物或其衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
15.根据实施方式1-14的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。
oOo
1.一种GLP-1类似物，其是修饰的GLP-1(7-35)(SEQ ID NO：1)，所述修饰的GLP-1(7-35)具有：
i)与GLP-1(7-35)相比总共2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代，包括
a)在相当于GLP-1(7-35)的位置22的位置处的Glu残基，和
b)在相当于GLP-1(7-35)的位置26的位置处的Arg残基；
或其衍生物。
2.根据实施方式1的GLP-1类似物或其衍生物，其中在相当于GLP-1(7-35)的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸是没有的，条件是如果在位置30、31、32、33或34的氨基酸是没有的，则每个下游的氨基酸也是没有的。
3.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中所述GLP-1类似物包含i)C-末端羧酸基团；或(iii)C-末端酰胺基团。
4.根据实施方式1-3的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其是用白蛋白结合残基衍生化的或是聚乙二醇化的。
5.根据实施方式1-4的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是28个氨基酸。
6.根据实施方式1-5的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是27个氨基酸。
7.根据实施方式1-6的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是26个氨基酸。
8.根据实施方式1-7的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是25个氨基酸。
9.根据实施方式1-8的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是24个氨基酸。
10.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置30、31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是23个氨基酸。
11.一种GLP-1类似物或其衍生物，具有式(I)的序列Xaa
7-Xaa
8-Xaa
9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18-Tyr-Xaa
20-Glu-Glu-Xaa
23-Xaa
24-Xaa
25-Arg-Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30-Xaa
31-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(I)(SEQ ID No：2)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
9是Glu或Glu衍生物，例如，α，α二甲基-Glu；
Xaa
16是Val或Leu；
Xaa
18是Ser、Lys、Cys或Arg；
Xaa
20是Leu、Lys或Cys；
Xaa
23是Gln、Glu、Lys、Cys或Arg；
Xaa
24是Ala或Asn；
Xaa
25是Ala或Val；
Xaa
27是Glu、Ala或Leu；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或没有；
Xaa
31是Trp、Lys、Cys或没有；
Xaa
33是Val、Lys、Cys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Asn、Arg、Cys或没有；
Xaa
35是Gly、Aib或没有；
R是酰胺或是没有的；
条件是，如果Xaa
30、Xaa
31、Xaa
32、Xaa
33或Xaa
34是没有的，则下游的的每个氨基酸残基也是没有的。
12.一种GLP-1类似物或其衍生物，具有式(II)的序列Xaa
7-Xaa
8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa
18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa
30-Trp-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(II)(SEQ ID No：3)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
18是Ser、Lys或Arg；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或是没有的；
Xaa
33是Val、Lys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
35是Gly、Aib或是没有的；
R是酰胺或是没有的。
13.根据实施方式1-12的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化
其中A-选自以下构成的组
![]()
其中n选自由14、15、16、17、18和19构成的组，p选自由10、11、12、13和14构成的组，以及d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，
-B-选自以下构成的组
![]()
其中x选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12构成的组，
-C-选自以下构成的组
![]()
其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由0、1和2构成的组，条件是当c是0时b是1或2，或当c是1或2时b是0，和当f是0时e是1或2，或当f是1或2时e是0，知
-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。
14.根据实施方式13的GLP-1类似物或其衍生物，其中D选自以下构成的组
![]()
和其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组，m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组。
15.一种GLP-1类似物或衍生物，其选自以下的：
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys33)GLP-1(7-33)酰胺；
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺；
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺；
[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺；
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺；
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)肽；
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-32)酰胺；
N-ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26)GLP-1(7-33)酰胺；
N-ε31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31)GLP-1(7-33)酰胺；
N-ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(去氨基His7，Lys20，Glu22，Arg26)GLP-1(7-33)酰胺；
N-ε31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(去氨基His7，Glu22，Arg26，Lys31)GLP-1(7-33)酰胺；
N-ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys31)GLP-1(7-32)酰胺；
N-ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Nle30，Lys31)GLP-1(7-32)酰胺；
N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九烷酰基氨基)甲基]环己基羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31]GLP-1-(7-33)酰胺；
[去氨基His7，Glu22，Arg26]-GLP-1(7-34)；
[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Lys31]GLP-1(7-32)酰胺；
N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Asp11，Glu18，Glu22，Val25，Arg26，Asp27，Glu30，Lys31]GLP-1(7-33)酰胺；
[Aib8，Glu22，Val25，Lys31]GLP-1(7-33)-酰胺；和
N-ε31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-N-beta34-(2-(二羧基甲基氨基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31，Dap34]GLP-1(7-34)酰胺。
16.一种药物组合物，包含根据实施方式1-15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物或其药学上可接受的盐、酰胺、烷基或酯，以及药学上可接受的赋形剂。
17.根据实施方式1-15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物或根据实施方式16的药物组合物，其用作药物。
18.根据实施方式1-15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，或根据实施方式16的药物组合物，其用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。
19.根据实施方式1-15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，或根据实施方式16的药物组合物在制造用于治疗或预防高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的药物中的用途。
20.一种通过施用药学上活性数量的根据实施方式1-15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物或根据实施方式16的药物组合物来治疗或预防高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的方法。
实施方式
1.一种GLP-1类似物或其衍生物，其包含修饰的GLP-1序列7-35(SEQ ID NO：1)，所述修饰的GLP-1序列7-35具有：
与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，包括
在相当于SEQ ID NO：1的位置22的位置处的Glu残基，和
在相当于SEQ ID NO：1的位置26的位置处的Arg残基，
任选地，在相当于SEQ ID NO：1的位置30、31、32、33、34或35的位置处的氨基酸可以是没有的，条件是如果在位置30、31、32、33或34处的氨基酸是没有的，则下游的每个氨基酸残基也是没有的，知
任选地C-末端酰胺基团。
2.根据实施方式1的GLP-1类似物或其衍生物，其是用白蛋白结合残基衍生化的或是聚乙二醇化的。
3.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是28个氨基酸。
4.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是27个氨基酸。
5.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是26个氨基酸。
6.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是25个氨基酸。
7.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是24个氨基酸。
8.根据实施方式1-2的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中在位置30、31、32、33、34和35处的氨基酸是没有的，以及其中所述GLP-1类似物的总长度是23个氨基酸。
9.根据实施方式1-8的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有C-末端酰胺基团。
10.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比3个氨基酸取代，包括在位置22和26的取代。
11.根据实施方式1-10的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的位置处的取代。
12.根据实施方式11的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的取代。
13.根据实施方式11-12的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的取代。
14.根据实施方式11-13的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的取代。
15.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比4个氨基酸取代，包括在位置22和26的取代。
16.根据实施方式1-9和15的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的位置处的两个取代。
17.根据实施方式15-16的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的两个取代。
18.根据实施方式15-17的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的氨基酸取代。
19.根据实施方式15-18的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的氨基酸取代。
20.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比5个氨基酸取代，包括在位置22和26的取代。
21.根据实施方式1-9和20的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的位置处的三个氨基酸取代。
22.根据实施方式20-21的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34的组的三个氨基酸取代。
23.根据实施方式20-22的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的两个氨基酸取代。
24.根据实施方式20-23的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组两个氨基酸取代。
25.根据实施方式1-9的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比6个氨基酸取代，包括在位置22和26的取代。
26.根据实施方式1-9和25的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有在选自位置7、8、18、20、23、24、25、27、30、31、33和34的组的位置处的四个氨基酸取代。
27.根据实施方式25-26的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其具有选自由去氨基His7、Aib8、Lys18、Cys18、Lys20、Cys20、Lys23、Cys23、Asn24、Val25、Ala27、Leu27、Glu30、Lys31、Cys31、Lys33、Cys33、Lys34、Cys34和Asn34构成的组的四个氨基酸取代。
28.根据实施方式25-27的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组的三个氨基酸取代。
29.根据实施方式25-28的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有选自由去氨基His7和Aib8构成的组的氨基酸取代，和选自由Lys18、Lys20、Lys23、Glu30、Lys31、Lys33和Lys34构成的组三个氨基酸取代。
30.根据实施方式1-29的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(I)的序列Xaa
7-Xaa
8-Xaa
9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18-Tyr-Xaa
20-Glu-Glu-Xaa
23-Xaa
24-Xaa
25-Arg-Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30-Xaa
31-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(I)(SEQ ID No：2)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
9是Glu或Glu衍生物，例如，α，α二甲基-Glu；
Xaa
16是Val或Leu；
Xaa
18是Ser、Lys、Cys或Arg；
Xaa
20是Leu、Lys或Cys；
Xaa
23是Gln、Glu、Lys、Cys或Arg；
Xaa
24是Ala或Asn；
Xaa
25是Ala或Val；
Xaa
27是Glu、Ala或Leu；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或没有；
Xaa
31是Trp、Lys、Cys或没有；
Xaa
33是Val、Lys、Cys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Asn、Arg、Cys或没有；
Xaa
35是Gly、Aib或没有；
R是酰胺或是没有的；
条件是，如果Xaa
30、Xaa
31、Xaa
32、Xaa
33或Xaa
34是没有的，则下游的的每个氨基酸残基也是没有的。
31.根据实施方式1-29的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有式(II)的序列Xaa
7-Xaa
8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa
18-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Phe-Ile-Xaa
30-Trp-Leu-Xaa
33-Xaa
34-Xaa
35-R
式(II)(SEQ ID No：3)
其中
Xaa
7是L-组氨酸、D-组氨酸、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、N
α-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa
8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸，或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa
18是Ser、Lys或Arg；
Xaa
30是Ala、Glu、Lys、Arg或是没有的；
Xaa
33是Val、Lys或没有；
Xaa
34是Lys、Glu、Arg或是没有的；
Xaa
35是Gly、Aib或是没有的；
R是酰胺或是没有的。
32.根据实施方式30-31的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中R是没有的。
33.根据实施方式30-32的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中Xaa
35和R是没有的。
34.根据实施方式30-33的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中Xaa
34、Xaa
35和R是没有的。
35.根据实施方式30-34的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中Xaa
33、Xaa
34、Xaa
35和R是没有的。
36.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共2个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基和相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基。
37.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共3个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的一个氨基酸取代。
38.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共4个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的2个氨基酸取代。
39.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共5个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的3个氨基酸取代。
40.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共6个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的4个氨基酸取代。
41.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共7个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的5个氨基酸取代。
42.根据实施方式30和32-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共8个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：2的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ ID NO：2的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：2中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
9、Xaa
16、Xaa
18、Xaa
20、Xaa
23、Xaa
24、Xaa
25、Xaa
27、Xaa
30、Xaa
31、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的3个氨基酸取代。
43.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共2个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基和相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基。
44.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共3个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的一个氨基酸取代。
45.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共4个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的2个氨基酸取代。
46.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共5个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的3个氨基酸取代。
47.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共6个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的4个氨基酸取代。
48.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共7个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的5个氨基酸取代。
49.根据实施方式31-35的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，具有与SEQ ID NO：1的序列7-35相比总共8个氨基酸取代，其是在相当于SEQ ID NO：3的位置22的位置处的Glu残基、相当于SEQ IDNO：3的位置26的位置处的Arg残基，和与SEQ ID NO：1的序列7-35相比选自SEQ ID NO：3中Xaa
7、Xaa
8、Xaa
18、Xaa
30、Xaa
33、Xaa
34和Xaa
35构成的组的3个氨基酸取代。
50.根据实施方式30-49的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中Xaa
7是去氨基-组氨酸。
51.根据实施方式30-49的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中Xaa
8是Aib。
52.根据实施方式1-51的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中被聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的氨基酸是Lys-残基或Cys-残基。
53.根据实施方式1-51的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中被聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的氨基酸是Lys-残基。
54.根据实施方式1-51的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中C-末端氨基酸是聚乙二醇化的或用白蛋白结合残基衍生化的。
55.根据实施方式1-54的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置18、20、23、31、33、34或在C-末端氨基酸被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
56.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置18被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
57.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置20被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
58.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置23被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
59.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置31被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
60.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置33被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
61.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其在位置34被聚乙二醇化或用白蛋白结合残基衍生化。
62.根据实施方式1-55的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其用白蛋白结合残基衍生化。
63.根据实施方式1-62的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化
其中A-选自以下构成的组
![]()
其中n选自由14、15、16、17、18和19构成的组，p选自由10、11、12、13和14构成的组，以及d选自由0、1、2、3、4和5构成的组，
-B-选自以下构成的组
![]()
其中x选自由0、1、2、3和4构成的组，y选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12构成的组，
-C-选自以下构成的组
![]()
其中b和e各自独立地选自由0、1和2构成的组，c和f各自独立地选自由0、1和2构成的组，条件是当c是0时b是1或2，或当c是1或2时b是0，和当f是0时e是1或2，或当f是1或2时e是0，知
-D-附着到所述氨基酸残基以及是接头。
64.根据实施方式61的GLP-1类似物或其衍生物，其中至少一个氨基酸残基用A-B-C-D-衍生化。
65.根据实施方式63-64的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基包含氨基基团。
66.根据实施方式63-65的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基包含侧链中的伯氨基基团。
67.根据实施方式63-66的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中所述衍生化的氨基酸残基是赖氨酸。
68.根据实施方式63-67的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中仅一个氨基酸残基是衍生化的的。
69.根据实施方式63-68的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中A-是
![]()
70.根据实施方式63-69的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中n选自由15和17构成的组，更优选的是17。
71.根据实施方式63-68的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中A-是
![]()
72.根据实施方式63-68和69的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中p选自由12、13和14构成的组，更优选的是13。
73.根据实施方式61-68和69-70的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中d选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的选自由0、1和2构成的组，最优选的是1。
74.根据实施方式63-68和69-71的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中d选自由0、1和2构成的组，p选自由12、13或14构成的组，更优选的d选自由1和2构成的组和p选自由13和14构成的组，最优选的d是1和p是13。
75.根据实施方式63-74的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-B-是
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76.根据实施方式63-74的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-B-是
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77.根据实施方式63-74的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-B-是
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78.根据实施方式63-74的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-B-是
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79.根据实施方式78的GLP-1类似物或其衍生物，其中x选自由0、1和2构成的组，更优选的x选自由0和1构成的组，最优选的x是1。
80.根据实施方式63-74的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-B-是
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81.根据实施方式80的GLP-1类似物或其衍生物，其中y选自由2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的组，更优选的y选自由2、3、4、5、6、7和8构成的组。
82.根据实施方式63-81的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-C-是
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83.根据实施方式82的GLP-1类似物或其衍生物，其中c选自由0和1构成的组，b选自由1和2构成的组，更优选的b是1和c是0。
84.根据实施方式63-81的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-C-是
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85.根据实施方式84的GLP-1类似物或其衍生物，其中f选自由0和1构成的组，e选自由1和2构成的组，更优选的e是1和f是0。
86.根据实施方式63-81的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-C-是
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87.根据实施方式63-86的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中D选自以下构成的组
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和其中k选自由0、1、2、3、4、5、11和27构成的组，m选自由0、1、2、3、4、5和6构成的组。
88.根据实施方式63-87的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-D-是
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89.根据实施方式88的GLP-1类似物或其衍生物，其中k选自由1、2、3、11和27构成的组，更优选的k是1。
90.根据实施方式88-89的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
91.根据实施方式91的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
92.根据实施方式63-87的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-D-是
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93.根据实施方式93的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
94.根据实施方式1-87的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-D-是
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95.根据实施方式95的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
96.根据实施方式1-87的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-D-是
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97.根据实施方式97的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
98.根据实施方式1-87的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中-D-是
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99.根据实施方式99的GLP-1类似物或其衍生物，其中m选自由0、1、2、3和4构成的组，更优选的m选自由0、1和2构成的组。
100.根据实施方式1-100的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中A-B-C-D-选择和组合自
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101.根据实施方式1-100的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中A-B-C-D-选择和组合自
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102.根据实施方式1-100的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其中A-B-C-D-选自以下构成的组
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103.根据实施方式1-103的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其包含修饰的GLP-1序列和一个或更多个白蛋白结合残基之间的亲水性接头。
104.根据实施方式104的GLP-1类似物或其衍生物，其中所述亲水性接头是不分支的寡聚乙二醇部分，在两个末端具有合适的官能团，其形成修饰的GLP-1序列的氨基基团与白蛋白结合残基的官能团之间的桥。
105.根据上述实施方式的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其选自以下构成的组
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys33)GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺，
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺，
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺，
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)肽，
Nε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺，和
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-32)酰胺。
106.一种提高GLP-1类似物或其衍生物在患者中的作用时间的方法，特征在于修饰的GLP-1序列7-35(SEQ ID NO：1)如在前述实施方式的任一项中公开的衍生化或聚乙二醇化。
107.一种提高GLP-1类似物或其衍生物在患者中的作用时间到超过约40小时的方法，特征在于修饰的GLP-1序列7-37(SEQ ID NO：1)如在前述实施方式的任一项中公开的衍生化或聚乙二醇化。
108.一种包含根据实施方式1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
109.根据实施方式109的药物组合物，其适合于胃肠外施用。
110.根据实施方式1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物用于药物的制备的用途。
111.根据实施方式1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物用于制备用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防的药物的用途。
112.根据实施方式1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物用于制备用于延缓或防止2型糖尿病中的疾病发展的药物的用途。
113.根据实施方式1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物的用途，用于制备降低食物摄取、降低β-细胞细胞凋亡、提高β-细胞功能和β-细胞群集，和/或恢复对β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。
114.根据权利要求1-107的任一项的GLP-1类似物或其衍生物，其用于高血糖、2型糖尿病、损害的葡萄糖耐受、1型糖尿病、肥胖、高血压、综合征X、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管病症、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的治疗或预防。
在此引用的所有的参考文献，包括公开物、专利申请和专利通过引用合并在此，到达如同每个参考文献被单独地和特别地指明通过引用合并、以及在此完全地阐述的程度。
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此处描述的所有方法按照任何适合的顺序进行，除非在此另有陈述或与上下文明显抵触。
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本发明以适用的法律所允许的最大的程度包括在此呈现的方面或权利要求中引述的主题的所有修改体和等价物。
在以下代表性的方法和实施例中进一步说明本发明，然而，无论如何其不意味着限制本发明的范围。
在上述描述和以下实施例中公开的特征可以单独地或以其任何组合地是用于以其各种形式实现本发明的材料。
实施例
使用的缩写：
r.t： 室温
DIPEA： 二异丙基乙胺
H
2O： 水
CH
3CN： 乙腈
DMF： NN二甲基甲酰胺
HBTU： 2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鎓六氟磷酸盐
Fmoc： 9H-芴-9-基甲氧羰基
Boc： 叔丁氧基羰基
OtBu： 叔丁酯
tBu： 叔丁基
Trt： 三苯甲基
Pmc： 2，2，5，7，8-五甲基-色满-6-磺酰基
Dde： 1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)乙基
ivDde： 1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基
Mtt： 4-甲基三苯甲基
Mmt： 4-甲氧基三苯甲基
DCM： 二氯甲烷
TIS： 三异丙基硅烷)
TFA： 三氟乙酸
Et
2O： 二乙醚
NMP： 1-甲基-吡咯烷-2-酮
DIPEA： 二异丙基乙胺
HOAt： 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt： 1-羟基苯并三唑
DIC： 二异丙基碳二亚胺
DBU： 1，8-二氮杂环-[5，4，0]十一烯-7
MW： 分子量
A：树脂结合的肽的合成
SPPS方法A
保护的肽基树脂根据Fmoc策略利用厂家提供的FastMoc UV方案以0.25mmol或1.0mmol规模在Applied Biosystems 433肽合成仪上合成，所述方案采用了HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲鎓六氟磷酸盐)或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)介导的NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的偶联，以及Fmoc保护基团的脱保护的UV监测。用于肽酰胺合成的起始树脂是Rink-酰胺树脂，Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的肽。使用的保护的氨基酸衍生物是在适合于ABI433A合成仪的预先称重的柱体上提供的标准的Fmoc-氨基酸(由，例如Anaspec或Novabiochem提供)，除了非天然氨基酸例如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基异丁酸)之外。N末端氨基酸是在α氨基基团Boc保护的(例如，Boc-His(Boc)OH用于在N-末端具有His的肽)。在位置26的赖氨酸的ε氨基基团用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，取决于白蛋白结合部分和间隔区的附着的途径。在某些情况下肽的合成可以通过使用在二肽酰胺键上用可以在酸性条件下被裂解的基团，例如但不限于2-Fmoc-氧-4-甲氧苯甲基或2，4，6-三甲氧基苯甲基保护的二肽来改进。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可以使用伪脯氨酸二肽。(参见，例如Novobiochem 2002/2003或新版本的目录，或W.R.Sampson(1999)，J.Pep.Sci.5，403。
SPPS方法B：
肽合成的一种可选择的方法(方法B)是在基于微波的Liberty肽合成仪(CEM Corp.，North Carolina)上通过Fmoc化学作用。树脂是具有0.24mmol/g的载荷的Tentagel S RAM。偶联化学作用是NMP中的DIC/HOAt，利用NMP中0.3M的氨基酸溶液和8-10倍的摩尔过量。偶联条件是在高达70℃5分钟。脱保护在高达70℃下利用在NMP中的5％哌啶。当赖氨酸侧链的化学修饰是期望的时，赖氨酸作为Lys(Mtt)来掺入。Mtt基团通过将树脂悬浮在纯净的六氟异丙醇20分钟，随后用DCM和NMP洗涤来除去。赖氨酸的化学修饰通过人工合成或通过在Liberty上一种或更多种自动化步骤然后人工偶联来进行。肽合成的另一种方法是通过利用HBTU偶联的在ABI433上的Fmoc化学作用。在合成之后，树脂用DCM洗涤并干燥，通过TFA/TIS/水(92.5/5/2.5)处理2小时，然后用二乙醚沉淀来从树脂上裂解肽。肽在30％乙酸或类似的溶剂中重新溶解，在C18柱上利用乙腈/TFA通过标准的RP-HPLC来纯化。肽的身份通过MALDI-MS确认。
SPPS方法C
保护的肽基树脂利用制造商提供的方案根据Fmoc策略在Advanced ChemTech合成仪(APEX 348)上合成，0.25mmol规模，其采用NMP(N-甲基吡咯烷酮)中DIC(二环己基碳二亚胺)和HOBt(1-羟基苯并三唑)介导的偶联。用于肽酰胺合成的起始树脂是Rink-酰胺树脂，Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的肽。使用的保护的氨基酸衍生物是标准的Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem提供)。N末端氨基酸是在α氨基基团Boc保护的(例如，Boc-His(Boc)OH用于在N-末端具有His的肽)。在位置26的赖氨酸的ε氨基基团用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，取决于白蛋白结合部分和间隔区的附着的途径。肽的合成在某些情况下可以通过使用二肽来改进，例如，来自Novabiochem的伪脯氨酸，Fmoc-Ser(tbu)-ΨSer(Me，Me)-OH，参见，例如，Novobiochem 2002/2003或更新版本的目录，或W.R.Sampson(1999)，J.Pep.Sci.5，403
除去ivDde或Dde保护的过程 树脂(0.25mmol)置于人工摇动器/过滤装置中，用N-甲基吡咯烷酮中的2％肼处理(20ml，2x 12分钟)来除去Dde或ivDde基团，用N-甲基吡咯烷酮洗涤(4x20ml)。
除去Mtt或Mmt-保护的过程 树脂(0.25mmol)置于人工摇动器/过滤装置中，用DCM中的2％TFA和2-3％TIS处理(20ml，5-10分钟重复6-12次)来除去Mtt或Mmt基团，用DCM(2x20ml)、DCM中的10％MeOH和5％DIPEA(2x20ml)和N-甲基吡咯烷酮(4x20ml)洗涤。
除去Mtt保护的可选择的过程： 树脂置于注射器中，用六氟异丙醇处理2×10分钟来除去Mtt基团。树脂然后如上所述用DCM和NMP洗涤。
用于侧链向赖氨酸残基的附着的过程 白蛋白结合残基(式I的B-U-侧链)可以通过利用标准的酰化试剂例如但不限于DIC、HOBt/DIC、HOAt/DIC或HBTU酰化到树脂结合的肽、或在溶液中酰化到未保护的肽来附着到肽上。
附着到树脂结合的肽：
途径I
式(I)的活化的(活性酯或对称的酸酐)白蛋白结合残基(A-B)-侧链，例如十八烷基二酸单-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi etal.EP511600，相对于树脂结合的肽4摩尔当量)溶于NMP(25mL)中，添加到树脂在室温下摇动过夜。过滤反应混合物，树脂用NMP、二氯甲烷、2-丙醇、甲醇和二乙醚广泛地洗涤。
途径II
白蛋白结合残基(式I的A-(B)-侧链)溶于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1，10ml)中。添加活化试剂例如羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂4摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂4倍摩尔当量)，搅动溶液15分钟。溶液添加到树脂中，添加二异丙基乙胺(相对于树脂4摩尔当量)。树脂在室温下摇动2到24小时。树脂用N-甲基吡咯烷酮(2x20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml)洗涤。
途径III
活化的(活性酯或对称的酸酐)白蛋白结合残基(式I的A-B侧链)例如十八烷基二酸单-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi etal.EP511600，相对于肽1-1.5摩尔当量)溶于有机溶剂例如乙腈、THF、DMF、DMSO或水/有机溶剂的混合物中(1-2mL)，与10摩尔当量的DIPEA一起添加到肽在水中(10-20mL)的溶液中。对于白蛋白结合残基上的保护基团，例如叔丁基来说，反应混合物被冻干O/N，并且分离的粗肽此后脱保护-在叔-丁基基团的情况下肽溶于三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(90∶5∶5)的混合物中。在30分钟后，混合物在真空中蒸发，最后的肽通过制备型HPLC纯化。
除去Fmoc保护的过程：树脂(0.25mmol)置于人工摇动器的滤瓶中，用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)处理(2x20ml)和用N-甲基吡咯烷酮(1x20ml)，N-甲基吡咯烷酮中20％哌啶的溶液(3x20ml，各10分钟)处理。树脂用N-甲基吡咯烷酮(2x20ml)、N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷(1∶1)(2x20ml)和二氯甲烷(2x20ml)洗涤。
肽裂解下树脂的操作： 通过与三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(95∶2.5∶2.5到92∶4∶4)的混合物在室温下搅动180分钟，从树脂上裂解肽。过滤裂解混合物，滤液通过氮气流浓缩成油。粗肽用45mL二乙醚从这种油中沉淀，用45mL二乙醚洗涤1到3次。
纯化：粗肽通过半制备型HPLC在装填了5μ或7μC-18硅石的20mm x 250mm柱上纯化。取决于肽，使用一个或两个纯化系统。
TFA：在干燥之后，粗肽溶于5ml 50％乙酸H
2O中，用H
2O稀释到20ml，注射到柱上，其然后用0.1％TFA中40-60％CH
3CN的梯度10ml/分钟在40℃在50分钟期间洗脱。收集含有肽的级分。纯化的肽在用水稀释洗脱物之后冻干。
硫酸铵：柱用0.05M(NH
4)
2SO
4中的40％CH
3CN平衡，其用浓缩的H
2SO
4调节到pH 2.5。在干燥之后，粗肽溶于5ml 50％乙酸H
2O中，用H
2O稀释到20ml，注射到柱上，其然后用0.05M(NH
4)
2SO
4、pH 2.5中40％-60％CH
3CN的梯度10ml/分钟在40℃在50分钟期间洗脱。采集含有肽的级分，用3倍体积的H
2O稀释，通过用0.1％TFA平衡的Sep-
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C18柱(Waters part#51910)。然后用含有70％CH
3CN的0.1％TFA洗脱，纯化的肽通过在用水稀释洗脱物之后的冻干法来分离。
获得的最终产物通过分析性RP-HPLC(滞留时间)和通过LCMS来表征。
RP-HPLC分析可以使用214nm处的UV检测、以及例如，Vydac218TP544.6mm x 250mm 5μC-18硅石柱(The Separations Group，Hesperia，USA)和在42℃在例如1ml/分钟洗脱来进行。最常使用以下特定条件的一种：
方法03_A1_1
HPLC(方法03_A1_1)：利用装备有Waters 996二极管阵列检测器的Waters 2690系统进行RP分析。UV检测在在42℃以1ml/分钟洗脱的218TP544.6mm x 250mm 5μC-18硅石柱(The SeperationsGroup，Hesperia)上，在214、254、276和301nm处采集。柱用10％的0.5M硫酸铵平衡，其用4M硫酸调节到pH 2.5。在注射之后，样品通过在相同的水性缓冲液中0％到60％乙腈的梯度在50分钟期间洗脱。
方法03_B1_2
HPLC(方法03_B1_2)：利用装备有Waters 996二极管阵列检测器的Waters 2690系统进行RP分析。UV检测在在42℃以0.5ml/分钟洗脱的Zorbax 300SB C-18(4，5x150mm，5μ)上，在214、254、276和301nm处采集。柱用TFA在水中的水溶液(0.1％)平衡。在注射之后，样品通过在TFA在水中的水溶液(0.1％)中0％到60％乙腈(+0.1％TFA)的梯度在50分钟内洗脱。
方法02_B1_1
HPLC(方法02_B1_1)：利用装备有Waters 2487双波带检测器的Alliance Waters 2695系统进行RP分析。214nm和254nm处的UV检测利用Vydac 218TP53，C18，
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5um，3.2mm x 250mm柱，42℃来采集。以0.50ml/分钟的流速，用水中0-60％乙腈、95-35％水和5％三氟乙酸(1.0％)的线性梯度在50分钟内洗脱。
方法01_B4_2
HPLC(方法01_B4_2)：利用装备有Waters 996二极管阵列检测器的Waters 600S系统进行RP分析。214nm、254nm处的UV检测使用Symmetry300C18、5um、3.9mm x 150mm，42℃采集。用水中5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)的线性梯度以1.0分钟/分钟的流速在15分钟内洗脱。
方法02_B4_4
HPLC(方法02_B4_4)：利用装备有Waters 2487双波带检测器的Alliance Waters 2695系统进行RP分析。214nm、254nm处的UV检测使用Symmetry300C18、5um、3.9mm x 150mm，42℃采集。用水中5-95％乙腈、90-0％水和5％三氟乙酸(1.0％)的线性梯度以1.0分钟/分钟的流速在15分钟内洗脱。
方法02_B6_1
HPLC(方法02_B6_1)：利用装备有Waters 2487双波带检测器的Alliance Waters 2695系统进行RP分析。214nm和254nm处的UV检测利用Vydac 218TP53，C18，
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5um，3.2mm x 250mm柱，42℃来采集。以0.50ml/分钟的流速，用水中0-90％乙腈、95-5％水和5％三氟乙酸(1.0％)的线性梯度在50分钟内洗脱。
方法03_B6_1
HPLC(方法03_B1_1)：利用装备有Waters 996二极管阵列检测器的Waters 2690系统进行RP分析。UV检测在218TP544.6mm x250mm 5μC-18硅石柱(The Seperations Group，Hesperia)上，在214、254、276和301nm处采集，其在42℃以1ml/分钟洗脱。柱用水中TFA的水溶液(0.1％)中5％乙腈(+0.1％TFA)来平衡。在注射之后，样品通过在TFA在水中的水溶液(0.1％)中0％到90％乙腈(+0.1％TFA)的梯度在50分钟内洗脱。
HPLC(方法I_BDSB2)：
缓冲液A：10mM tris，15mM(NH
4)
2SO
4，pH值用4N H
2SO
4调节到7.3，20％v/v乙腈
缓冲液B：80％v/v乙腈
流速：1.0ml/min
梯度：0-20分钟10-50％B
柱：Phenomenex，Jupiter 4.6mm x 150mm，C4，5μ，
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柱温度：40℃.
做为选择，可以如上述的进行制备梯度洗脱，其中洗脱化合物的乙腈的百分比是标注的。通过MALDI鉴定身份。
使用以下设备：
LCMS在由Sciex API 100Single quadropole质谱仪、Perkin ElmerSeries 200Quard泵、Perkin Elmer Series 200自动进样器、AppliedBiosystems 785A UV检测器、Sedex 75蒸发光散射检测器组成的装备上进行。
仪器控制和数据获取通过在Windows 2000计算机上的SciexSample控制软件进行。
HPLC泵连接到含有以下的两个洗脱液贮备池：
A：水中0.05％三氟乙酸
B：乙腈中0.05％三氟乙酸
分析在室温下通过在柱上注射合适体积的样品(优选的20μl)来进行，所述柱用乙腈梯度来洗脱。
使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。
柱：Waters Xterra MS C-18X 3mm id 5μm
梯度：以1.5ml/分钟在7.5分钟期间5％-90％乙腈线性
检测：210nm(来自DAD的模拟输出)
ELS(来自ELS的模拟输出)，40℃
MS电离作用方式API-ES
做为选择，LCMS在由Hewlett Packard系列1100G 1312A BinPump、Hewlett Packard系列1100Column compartment、Hewlett Packard系列1100G1315A DAD二极管阵列检测器、Hewlett Packard系列1100MSD和Sedere 75蒸发光散射检测器组成的、由HP Chemstation软件控制的装备上进行。HPLC泵连接到含有以下的两个洗脱液贮备池：
A：水中的10mM NH
4OH
B：90％乙腈中的10mM NH
4OH
分析在23℃下通过在柱上注射合适体积的样品(优选的20μl)来进行，所述柱用A和B的梯度来洗脱。
使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置在下表中给出。
柱Waters Xterra MS C-18X 3mm id 5μm
梯度以1.5ml/分钟在6.5分钟期间5％-100％乙腈
检测210nm(来自DAD的模拟输出)
ELS(来自ELS的模拟输出)
MS电离作用方式API-ES。扫描100-1000amu步进0.1amu
MALDI-MS： 肽的分子量利用基质辅助的激光解吸飞行时间质谱法(MALDI-MS)来测定，记录在Microflex(Bruker)上。使用α-氰-4-羟基肉桂酸的基质。
分析HPLC条件(方法I)： 用0.1％TFA/H
2O平衡柱(Xterra TM MS C18，5um，4，6x 150mm柱，P7N 186000490)，在25分钟期间通过0％CH
3CN/0.1％TFA/H
2O到60％CH
3CN/0.1％TFA/H
2O的梯度、随后在5分钟期间从60％到100％的梯度洗脱。
在本发明的实例中，命名和结构图是指：
对天然的氨基酸使用单字母符号，例如，H是L-组氨酸、A是L-丙氨酸，等等。氨基酸的三字母缩写也可以使用，例如His是L-组氨酸、Ala是L-丙氨酸，等等。对于非天然的氨基酸，使用三字母缩写，例如，Aib是氨基异丁酸。氨基酸的位置可以用氨基酸符号之后的上标数字来表示，例如Lys
33或Lys33。N-末端氨基基团可以表示为NH
2或H。C-末端羧基可以表示为-OH或-COOH。C-末端酰胺基标记为-NH
2。
亚结构
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都是指His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe。
赖氨酸的ε氨基基团可以用希腊符号ε或拼写的″epsilon″来描述。
以下实施例中的结构在一些情况下是组合了氨基异丁酸的三字母缩写Aib的天然氨基酸的单字母符号的组合。在某些情况下，一些氨基酸以展开的完整结构显示。因而被衍生化的赖氨酸可以显示为实施例2中的展开的完整结构，其中在位置20的赖氨酸是展开的。位置19的酪氨酸和位置20的展开的赖氨酸之间的氮(具有标明的H)因而是连接实施例2中两个氨基酸的肽键的氮。
根据上文的过程，以下衍生物作为本发明的非限制性实例被制备：
实施例1
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺
H-H A E G T F T S D V S S Y L E E Q A A R E F I A W L V-NH
2 制备方法：B
肽在64％乙腈下洗脱。
通过MALDI-MS确认结构
计算的MW＝3056.4
实施例2
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys33)GLP-1(7-33)酰胺，
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制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝32min
MALDI-MS＝3901
计算的MW＝3900.5
实施例3
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26，Glu30)GLP-1(7-33)酰胺，
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝32.9min
MALDI-MS＝3858.7
计算的MW＝3859.3
实施例4
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-33)酰胺
NH
2-H A E G T F T S D V S S Y L E E Q A V R E F I A W L V-NH
2 制备方法：A
HPLC(方法03_A1_1)
RT＝44，6min
LCMS：m/z＝1029,2(M+3H)
3+ 计算的MW＝3084.4
实施例5
[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺
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制备方法：B
肽在60％乙腈下洗脱。
通过MALDI-MS确认结构
计算的MW＝3171.5
实施例6
N ε20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Glu30]GLP-1(7-33)酰胺
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制备方法：B
肽在70％乙腈下洗脱。
通过MALDI-MS确认结构
计算的MW＝3887.4
实施例7
[Glu22，Arg26]GLP-1(7-33)肽
H-H A E G T F T S D V S S Y L E E Q A A R E F I A W L V-OH
制备方法：A
HPLC(方法B6)：
RT＝28.09min
LCMS：m/z＝1020(M+3H)
3+ 计算的MW＝3057.3
实施例8
[Glu22，Val25，Arg26]GLP-1(7-32)酰胺
NH
2-H A E G T F T S D V S S Y L E E Q A V R E F I A W L-NH
2 制备方法：A
HPLC(方法03_A1_1)
RT＝41，9min
LCMS：m/z＝996，0(M+3H)
3+ 计算的MW＝2985.3
实施例9
N ε-20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Arg26)GLP-1(7-33)酰胺
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和LC-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝34.31min
LCMS：m/z＝1277(M+3H)
3+ 计算的MW＝3831
实施例10
N-ε31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31)GLP-1(7-33)酰胺
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和LC-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝34.02min
LCMS：m/z＝1253(M+3H)
3+ 计算的MW＝3759
实施例11
N ε-20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(去氨基His7，Lys20，Glu22，Arg26)GLP-1(7-33)酰胺
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和LC-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝33.3min
LCMS：m/z＝1257.7(M+3H)
3+ 计算的MW＝3773
实施例12
N-ε31{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(去氨基His7，Glu22，Arg26，Lys31)GLP-1(7-33)酰胺
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和LC-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝33.2min
LCMS：m/z＝1233.9(M+3H)
3+ 计算的MW＝3699
实施例13
N ε-20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Glu30，Lys31)GLP-1(7-32)酰胺
![]()
制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝32.6min
MALDI-MS：3715.5
计算的MW＝3714.3
实施例14
N ε-20{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-(Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Nle30，Lys31)GLP-1(7-32)酰胺
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制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(Method 02_B6_1)：
RT＝33min
MALDI-MS：3696.9
计算的MW＝3698
实施例15
N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-({反式-4-[(19-羧基十九烷酰基氨基)甲基]环己烷羰基}氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基]-[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31]GLP-1-(7-33)酰胺
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制备方法：方法C，除了使用8-10倍摩尔过量的氨基酸、DIC和HOAt/HOBt(1∶1)在来自Advanced Chemtech的Apex396上制备肽，Mtt基团用六氟异丙醇脱保护。最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(方法02_B6_1)：
RT＝39.3min
MALDI-MS：3696.9
计算的MW＝3698
实施例16
[去氨基His7，Glu22，Arg26]-GLP-1(7-34)
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HPLC(方法I_BDSB2)
RT＝5.65min
LCMS：m/z＝1057.5(M+3H)
3+ 计算的MW＝3170.5
实施例17
[Aib8，Lys20，Glu22，Val25，Arg26，Leu27，Lys31]GLP-1(7-32)酰胺
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制备类似于SPPS方法B。
HPLC方法02_B6_1：
RT＝27.09min
LCMS：m/z＝735(M+4H)
4+ 计算的(M)＝2940.3
实施例18
N-ε31-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-羧基-4-(17-羧基十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基][去氨基His7，Asp11，Glu18，Glu22，Val25，Arg26，Asp27，Glu30，Lys31]GLP-1(7-33)-肽酰胺
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制备方法B在ChemMatrix Rink Amide树脂(0.24mmol/g，0.4g)上。
HPLC(02B44)：Rt＝10,649min；99.6％纯度
HPLC(03A31)：Rt＝8.491min；94.3％纯度
MALDI-MS：α-氰-4-羟基肉桂酸；m/z：3824.543(负模式)
实施例19
[Aib8，Glu22，Val25，Lys31]GLP-1(7-33)-酰胺
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制备方法：肽通过SPPS方法C来制备，最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(02-B6-1)：RT＝31,5min
HPLC(04-A3-1)：RT＝8,6min
MALDI-MS：3043,6
计算的MW＝3040,4
实施例20
N-ε31-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[4-羧基-4-(17-羧基-十七烷酰基氨基)丁酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙酰基}-N-beta34-(2-(二羧基甲基氨基)乙酰基)[Aib8，Glu22，Val25，Arg26，Lys31，Dap34]GLP-1(7-34)酰胺。
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制备方法：肽通过SPPS方法C来制备，最终产物通过分析性HPLC和MALDI-MS来表征。
HPLC(02-B6-1)：RT＝36,7min
HPLC(A4-A3-1)：RT＝8,9min
MALDI-MS：4015,9
计算的MW＝4015,5
生物学发现
在i.v.或s.c.施用后GLP-1衍生物的延长
本发明的许多GLP-1化合物的延长通过使用如下所述的方法在向健康猪sc施用之后监视其浓度来确定。为了比较，也可以跟踪sc.施用之后GLP-1(7-37)在血浆中的浓度。本发明的其他GLP-1化合物的延长可以以同样的方法测定。
迷你猪中GLP-1类似物的药物动力学测试 测试物质溶于适合于皮下或静脉内施用的载体中。调整浓度，从而给药体积是大约1ml。
在来自Ellegaard
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Minipigs ApS的12只雄性
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迷你猪中进行研究。在动物进入研究前容许的驯化期是大约10天。在驯化期的开始，迷你猪约5月龄，体重范围8-10kg。
研究在室温设置在21-23℃、相对湿度≥50％的适合的动物房中进行。房间被照亮，给出12小时光线和12小时黑暗的周期。光线是从06.00到18.00h。
动物置于有稻草作为床的围栏中，每个围栏中六只一起。
在研究期间动物自由摄取民用质量的饮用水，但是在给药前一天的大约下午4点开始禁食，直到给药后约12小时。
动物在到达时和在给药当天称重。
动物接受单次静脉内的或皮下的注射。在颈部的右侧、离耳朵约5-7cm、离颈部中间约7-9cm处给予皮下注射。用针头上的止动器给予注射，容许0.5cm针头引入。
每种测试物质给予三只动物。每个动物接受2nmol/kg体重的剂量。
六只动物每周给药，而其余六只静止。
从每个动物获得全血浆浓度-时间分布。根据以下时间表采集血液样品：
在静脉内的施用以后： 给药前(0)、注射后0.17(10分钟)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时。
皮下施用之后： 给药前(0)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时。
在每个采样时间，从每个动物抽取2ml血液。血液样品采自颈静脉。
血液样品采集到含有缓冲液的试管中，用于稳定化以免GLP-1化合物的酶促降解。
血浆立即转移到Micronic试管。大约200μl的血浆转移到每个Micronic试管。血浆保存在-20℃直到被分析。利用免疫分析分析血浆样品的GLP-1化合物含量。
通过非区室药物动力学分析来分析血浆浓度-时间分布。在每个场合计算以下药物动力学参数：AUC、AUC/Dose、AUC％
Extrap、C
max、t
max、λ
z、t
1/2、CL、CL/f、V
z、V
z/f和MRT.
选择的本发明的化合物在丹麦长白猪中测试。
GL P-1化合物在猪中的药物动力学测试 猪(50％杜洛克猪、25％约克夏猪、25％丹麦长白猪，约40kg)在实验开始时禁食。对每只猪，施用处于50μM等渗溶液(5mM磷酸盐、pH7.4，0.02％
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-20(Merck)、45mg/ml甘露醇(无热原的，Novo Nordisk)中的0.5nmol测试化合物每公斤体重。从颈静脉中的导管抽取血液样品。5ml的血液样品注入含有175μl以下溶液的钢化玻璃容器中：0.18M EDTA、15000KIE/ml抑酶肽(NovoNordisk)和0.30mM缬氨酸-Pyrrolidide(Novo Nordisk)，pH 7.4。在30分钟内，样品在5-6000*g离心10分钟。温度保持在4℃。上清液吸移到不同的玻璃容器中，保持在负20℃待用。
肽的血浆浓度在夹心ELISA中、或通过利用不同单克隆或多克隆抗体的RIA来测定。抗体的选择取决于GLP-1化合物。取决于所选择的特定GLP-1化合物，达到血浆中的峰值浓度的时间在大范围内变动。
96孔微滴定板中夹心ELISA的一般分析方案
包被缓冲液(PBS) ：磷酸盐缓冲盐水，pH7.2
洗涤-缓冲液(PBS-wash) ：磷酸盐缓冲盐水，0.05％v/v Tween
20，pH 7.2
分析-缓冲液(BSA-buffer) ：磷酸盐缓冲盐水，10g/l牛血清白蛋白
(Fluka 05477)，0.05％v/v Tween 20，
pH 7.2
链霉抗生物素蛋白-缓冲 液磷酸盐缓冲盐水，0.5M NaCl，0.05％
v/v Tween 20，pH 7.2
标准物 ：血浆-基质中单独的化合物
A-TNP ：无义抗体
AMDEX ：链霉抗生物素-辣根过氧化酶
(Amersham RPN4401V)
TMB-底物 ：3，3’，5，5’四甲基联苯胺(＜0.02％)，
过氧化氢
如下进行分析(体积/反应孔)：
1.)用100μl PBS-缓冲液中5μg/ml的捕获抗体包被
·孵育o/n，4℃
·5x PBS-wash
·在最少30分钟内用最后的洗涤(last wash)封闭
·然后清空平板
2.)20μl样品+在具有10μg/ml A-TNP的100μl BSA-缓冲液中1μg/ml的生物素化的检测抗体
·室温，在摇动器上孵育2h 5x PBS-wash，然后清空平板
3.)100μl的链霉抗生物素蛋白-缓冲液中的AMDEX 1∶8000
·室温，在摇动器上孵育45-60分钟
·5x PBS-wash，然后清空平板
4.)100μl TMB-底物
·在摇动器上在室温下孵育x分钟
·用100μl 4M H
3PO
4终止反应
读取450nm处的吸光度，620nm的作为参考
样品中的的浓度从标准曲线计算。
RIA的一般分析方案
DB-缓冲液 ：80mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清白蛋白、10
mM EDTA，0.6mM硫柳汞，pH 7.5
FAM-缓冲液 ：40mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清白蛋白、
0.6mM硫柳汞、pH 7.5
活性炭 ：40mM磷酸盐缓冲液、0.6mM硫柳汞、16.7％
牛血浆、15g/l活性碳、pH 7.5(使用前在4℃混
合悬浮液最少1小时)
标准物 ：血浆-基质中单独的化合物
分析在minisorp试管12x75mm(体积/试管)中如下进行：
![]()
总计 1,5mL
NSB 1,5mL
样品 1,5mL
混合-在4℃孵育30分钟-在3000rpm离心30分钟-在将上清液转移到新试管中之后立即地用塞子封闭，在γ计数器上计数1分钟。
样品中的的浓度从单独的标准曲线计算。
GLP-1放射受体分析(RRA)：
所述方法是利用LEADseeker成像颗粒的放射测量的-配体结合分析。分析由下列组成：含有GLP-1受体的膜片段、未标记的GLP-1类似物、用
125I标记的人类GLP-1、以及用麦胚凝集素(WGA)包被的PS LEADseeker颗粒。冷的和
125I标记的GLP-1将竞争与受体的结合。当添加LEADseeker颗粒时，它们将经由WGA残基结合膜片段上的碳水化物残基。
125I分子与LEADseeker颗粒之间的接近引起来自颗粒的光发射。LEADseeker将成像发射光，它将与样品中存在的GLP-1类似物的数量逆相关。
试剂&材料：
动物血浆的预处理：动物血浆在56℃热处理4小时，在10.000rpm离心10分钟。此后，添加Val-Pyr(10μM)和抑酶肽(500KIE/mL)，在＜-18℃保存待用。
GLP-1类似物校准物：GLP-1类似物掺入热处理过的血浆中，产生从约1μM到1pM的稀释度系列。
GLP-1RRA分析缓冲液：25mM Na-HEPES(pH＝7.5)，2.5mMCaCl
2，1mM MgCl
2，50mM NaCl，0.1％卵清蛋白，0.003％tween 20，0.005％bacitracin，0.05％NaN
3.
GLP-1受体悬浮液：GLP-1受体膜片段从稳定地表达人类胰腺GLP-1受体的婴儿仓鼠肾脏(BHK)细胞纯化。保存在＜-80℃待用。
WGA偶联的聚苯乙烯LEADseeker成像珠子(RPNQ0260，Amersham)：珠子用GLP-1RRA分析缓冲液重构到13.3mg/ml的浓度。然后添加GLP-1受体膜悬浮液，使用之前翻滚冷孵育(2-8℃)至少1小时。
[
125I]-GLP-1(7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S).保存在＜-18℃待用。
乙醇99.9％vol(De Dansk Spritfabrikker A/S)：保存在＜-18℃待用。
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Solvinert 0.45μm疏水性PTFE平板(MSRPN0450，Millipore Corp.)
聚丙烯平板(cat.no.650201，Greiner Bio-One)
白色聚苯乙烯384孔平板(cat.no.781075，Greiner Bio-One)
设备：
水平板混合器
具有标准的摇摆-桶微量滴定板转子部件的离心机
UltraVap-Drydown样品浓缩机(Porvair)
LEADseeker
TM多模式成像系统(Amersham)
分析过程：
样品制备：
在化学可比较的接受平板(即，聚丙烯平板)上固定
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Solvinert滤板来采集滤液。
添加150μL冰冷的乙醇99.9％到
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Solvinert滤板的空反应孔中，随后添加50μl的校准物或血浆样品。将保存盖置于滤板上。
在水平板混合器上在18-22℃孵育15分钟。
将带有盖子的组装的滤器和接受平板置于标准摇摆桶微量滴定板转子部件中。然后在1500rpm在接受平板的空反应孔中采集滤液2分钟。
通过使用UltraVap和加热的(40℃)N
2干燥滤液持续时间15分钟。通过向每个反应孔添加100μlGLP-1RRA分析缓冲液重构干燥的材料。在水平混合器上孵育5分钟。
GLP-1放射受体分析：
使用以下吸移方案和白色聚苯乙烯384孔平板：
·35μLGLP-1RRA分析缓冲液
·5μL重构的滤液。
·10μL[
125I]-GLP-1(7-36)酰胺.贮备溶液溶液在使用前在GLP-1RRA分析缓冲液中稀释到20.000cpm/孔。
·预包被到WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠子(0.2mg/孔)的15μLGLP-1受体膜片段(≈0.5μg/孔)
封闭平板，在18-22℃孵育过夜
通过使用LEADseeker
TM多模式成像系统检测每个反应孔的光发射持续10分钟。
实施例21：表达克隆的人类GLP-1受体的细胞系中cAMP形成的刺激
本发明的许多GLP-1类似物和衍生物(实施例1-7、9-17和19-20的化合物)的效价如下所述地测定，即，作为含有人类GLP-1受体的介质中环化AMP(cAMP)的形成的刺激。为了对比，还测定了截短的天然的人类GLP-1(7-33)的效价。
来自表达人类GLP-1受体的稳定转染的细胞系BHK467-12A(tk-ts13)的纯化的质膜用所讨论的GLP-1化合物刺激，cAMP生产的效价使用来自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreen
TM cAMP分析试剂盒测定。
稳定转染的细胞系在NN A/S，Denmark制备，选择高表达克隆用于筛选。细胞在DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和0.5mg/ml的选择标记物G418中在5％CO
2下生长。
在近似80％汇合的细胞用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤两次，用Versene(乙二胺四乙酸的四钠盐的水溶液)收获，在1000rpm离心5分钟，除去上清液。其他步骤全部在冰上进行。细胞团通过Ultrathurax在10mL缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH＝7.4)匀化20-30秒，在20.000rpm离心15分钟，团粒重悬浮在10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH＝7.4)中。悬浮液匀化20-30秒，在20.000rpm离心15分钟。缓冲液2中的悬浮，匀质化和离心重复一次，膜重悬浮在缓冲液2中，准备用于进一步分析或保存在-80℃。
功能性受体分析通过由AlphaScreen Technology测量肽诱导的cAMP生产来进行。AlphaScreen Technology的基本原理是内源的cAMP和外源添加的生物素-cAMP之间的竞争。cAMP的捕获通过利用与接受体珠子缀合的特异性抗体来实现。形成的cAMP在AlphaFusion微量培养板分析仪上计数和测量。利用Graph-Pad Prisme软件(版本5)计算EC
50值。
截短的天然的GLP-1(7-3)肽具有极低的效价(11.3nM的高EC
50值)。所有测试的本发明的GLP-1化合物具有非常高的效价(六种化合物EC
50低于0.10nM，六种化合物和EC
50处于0.10-0.50nM的范围内)。
有趣地，实施例1、4、5和7的化合物，其都没有衍生化，也具有低于0.30nM的EC
50，这是强烈地令人惊讶的。
实施例22：对GLP-1受体的细胞外结构域的结合
对于许多本发明的GLP-1化合物(实施例1-17的化合物)，与GLP-1R受体的分离的N-末端细胞外结构域(nGLP-1R)的结合的亲和力如下所述地测量。为了对比，还测定了截短的天然的人类GLP-1(7-33)的效价。
亲和力是所讨论的GLP-1衍生物替换
125I-Exendin-4(9-39)与nGLP-1R的结合的能力，与nGLP-1R的结合在以下分析中测量：如Runge et al2007(Biochemistry，vol.46，pp.5830-5840)所描述的制备蛋白质nGLP-1R，生物素化并固定在链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子上。在0.1M NaHCO
3中的nGLP1R利用75μg BNHS(SigmaH1759)生物素化为1mg蛋白质。生物素化的nGLP1R随后相对于PBS来透析。所有试剂和衍生物在具有0.05％v/v Tween 20的PBS中稀释。结合分析在200μl的最终体积中在96孔OptiPlates(PerkinElmer 6005290)中进行。每个反应孔含有2mg的链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠子(PerkinElmer RPNQ007)、0.1pmol生物素化的nGLP1R、50pCi
125I-Exendin(9-39)和终浓度从1000nM到0.064nM的测试肽。平板在RT在摇动器上孵育3小时。SPA颗粒通过在1500rpm离心10分钟来旋转沉降，平板在TopCount-NXT(PerkinElmer)中计数。
作为替换50％的
125I-Exendin-4(9-39)对nGLP-1R的结合的所讨论的GLP-1化合物的浓度，从相应的曲线读取IC
50值。
截短的(天然的、人类)GLP-1(7-33)对nGLP-1R的亲和力(IC
50)被测定为886nM。十一种测试的本发明的GLP-1化合物具有低于600nM的亲和力(IC
50)(从20-556nM)，六种化合物低于100nM。因而本发明的几种GLP-1化合物展现了对N-末端GLP-1受体非常好的结合亲和力(IC
50值越低，结合越好)。在实施例21中也讨论的化合物1、4、5和7具有在200-1500nM范围内的可接受的结合亲和力，它们的三种在200-600nM范围内。
实施例23：对GLP-1受体的亲和力
许多本发明的化合物GLP-1(实施例1-7和9-18的化合物)对人类GLP-1受体的结合亲和力通过它们从受体替换
125I-GLP-1的能力的方式来测量。
条件
物种(体外)：仓鼠
生物学终点：受体结合
分析方法：SPA
受体：GLP-1受体
细胞系：BHK tk-ts13
膜纯化：
细胞(近似地80％汇合)在PBS中洗涤两次，收获(PBS+EDTA或Versene)，之后它们通过在1000rpm离心5分钟来分离。细胞/细胞团必需在随后的步骤中尽可能保持在冰上。细胞团在适合的数量的缓冲液1(取决于细胞的数量，但例如，10ml)中用Ultrathurrax匀化20-30秒。匀浆物在20000rpm离心15分钟。团粒在10mL缓冲液2中重悬浮(匀化)并重新离心。这个步骤再次重复。产生的团粒重悬浮在缓冲液2中，测定蛋白质浓度。膜保存在-80℃。
缓冲液1：20mM Na-HEPES+10mM EDTA，pH 7.4
缓冲液2：20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA，pH 7.4
结合分析：
SPA：
测试化合物/肽、膜、SPA-颗粒和[
125I]在分析缓冲液中稀释。25μ1(微升)的测试化合物/肽添加到Optiplate中。添加缓冲液(50μl)。添加5-10μg蛋白质/样品(50μl)，其相应于0.1-0.2mg蛋白质/ml(优选地对每种膜制品优化的)。添加SPA-颗粒(麦胚凝集素SPA珠子)RPNQ 0001)0.5mg/反应孔(50μl)。开始用[I
125]-GLP-1(终浓度0.05nM，其相应于49.880DPM，25μl)孵育。平板用PlateSealer密封。在30℃孵育120分钟，同时摇动。离心平板(1500rpm，10分钟)，在Topcounter中计数。
分析缓冲液：50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl
2 0.005％Tween 20
pH 7.4
IC
50值可以从曲线中作为从受体替换50％的
125I-GLP-1的浓度来读取。
GLP-1(7-33)(截短的天然GLP-1)的IC
50值是241nM。除了一种化合物以外，所有测试的本发明的化合物具有与GLP-1受体更好的结合(即，更低的IC
50值)。六种化合物具有低于1.00nM的值，五种化合物处在1-10nM的范围内，五种化合物处在20-200nM的范围内。在早先的实施例中讨论的化合物1、4、5和7具有处在0.24nM到44nM的范围内的IC
50值，它们中的三种低于2.0nM。
【序列表】
<110>Novo Nordisk A/S
<120>截短的GLP-1衍生物和它们的治疗用途
<130>7695.204-WO
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(29)
<400>1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
20 25
<210>2
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>式I(GLP-1类似物)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(29)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa7是L-his，D-his，去氨基-his，2-氨基-his，
beta-羟基-his，高his，Nalpha-乙酰基-his，
alpha-氟甲基-his，alpha-甲基-hist，3-吡啶基丙氨酸，
2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa8是Ala，Gly，Val，Leu，Ile，Lys，Aib，(1-氨基环丙基，
-丁基-，-戊基-，-己基-，-庚基-，或-辛基)羧酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa9是Glu或Glu衍生物，例如alpha，alpha二甲基-Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa16是Val或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa18是Ser，Lys，Cys或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>Xaa20是Leu，Lys或Cys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>Xaa23是Gln，Glu，Lys，Cys或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>Xaa24是Ala或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>Xaa25是Ala或Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>Xaa27是Glu，Ala或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa30是Ala，Glu，Lys，Arg或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>Xaa31是Trp，Lys，Cys或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa33是Val，Lys，Cys或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>Xaa34是Lys，Glu，Asn，Arg，Cys或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>Xaa35是Gly，Aib或没有；
<400>2
Xaa Xaa Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Glu Glu
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa
20 25
<210>3
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>式II(GLP-1类似物)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(29)
<220>
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<222>(1)..(1)
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beta-羟基-his，高his，Nalpha-乙酰基-his，
alpha-氟甲基-his，alpha-甲基-his，3-吡啶基丙氨酸，
2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
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-丁基-，-戊基-，-己基-，-庚基-，或-辛基)羧酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>Xaa30是Ala，Glu，Lys，Arg或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>Xaa34是Lys，Glu，Arg或没有
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<400>3
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20 25