二氨基吩噻嗪的治疗用途.pdf

实施例

实施例1-2期临床试验TRx-014-001

概述

利用其中MTC作为有效药物成分(API)的试验药(IMP)，进行了50周2期探索性寻找剂量范围的研究用于治疗轻度和中度的阿尔茨海默类型痴呆。该研究是随机、双盲的、安慰剂对照的研究，其主要目的是调查三种剂量(30、60和100mg，各自3次/天)的MTC与安慰剂相比对认知能力的作用(通过ADAS-cog量表测量：阿尔茨海默病评定量表-认知子量表(subscale))。有322个随机化的受试者，其中245个(74％)完成了首24周的治疗。这245个当中，227个(93％)选择继续治疗另外6个月，该227个当中177个(78％)于2007年7月2日完成了50周的治疗。最后的分析包括完成了24周治疗的245个受试者与于2007年7月2日完成了50周治疗的177个受试者的ITT/OC(治疗意向/观察到的案例)群体的分析。研究设计总结于图1中。由于道德上的原因，在首6个月阶段最初随机化服用安慰剂的受试者转换为在该研究的第二个6个月扩展阶段(“E1”)中100mg剂量。

24周分析

初步预定的结果是在24周时采用协方差方法分析对相对于基线的ADAS-cog变化的ITT/OC分析，其包括对rember^TM治疗效果与用CDR(临床痴呆评定量表)定义的基线严重度之间的相互作用的评价。该分析表明以60mg tid给药rember^TM的积极效果，其在ITT/OC和ITT/LOCF(治疗意向/最近一次观察结转(Last Observation Carried Forward))群体中均达到了统计显著。发现基线的CDR严重度是非常重要的辅助因子，并且当其包含在模型中时显示24周时rember^TM的效果仅在基线为CDR中度的受试者中是显著的。在服用安慰剂的CDR轻度受试者中没有衰退，这阻止了该组中首个24周内的功效分析。然而，rember^TM在该组中的功效在通过24周时功能性脑扫描分析以及通过50周时的ADAS-cog得到了确认。

表1.在CDR-中度受试者中24周时ADAS-cog作用大小(以ADAS-cog单位计)

1.100mg剂量称为“低剂量(100mg)”以说明在其目前的制剂中100mg胶囊的治疗功效与标称剂量不对应。

2.p-值来自一项考察值是否显著不同于安慰剂的试验。

在针对ITT/OC群体的基线处为CDR中度的亚组的分析中(图2)，60mgtid剂量的rember^TM的作用大小为-5.4ADAS-cog单位和3.4MMSE(微精神状态检查，Mini-Mental State Examination)单位(MMSE数据未示出)。用安慰剂治疗的受试者下降了5.1个ADAS-cog单位，而在用在以30mg或60mg tid剂量rember^TM治疗24周的受试者中没有下降的迹象。非认知结果变量(它们测量精神病学障碍和日常生活技能活动)也确认了rember^TM在中度组中稳定疾病的性质和功效大小。接受60mg tid剂量的rember^TM的受试者在24周时相对于安慰剂显示1.4-1.9单位的作用大小(基于CGIC量表(Clinical GlobalImpression of Change Scale)，由不知晓其它结果量度的临床评定者记录)。对于服用60mg剂量rember^TM的受试者，其CGIC无衰退的优势比较之安慰剂好9倍。CDR-箱子总数参数(另一整体临床量度)显示了-1.7个单位的效益。最后，在日常生活活动的ADFACS(阿尔茨海默病功能性评定量表)量度上，60mg剂量rember^TM显示了显著的效益，在24周时间内的作用大小为3.1～6.1单位。在24周时所有的心理测量学分析中，100mg胶囊显示最小的功效，这与下面将进一步讨论的该剂量强度的胶囊的制剂缺陷相符。

所述100mg剂量称为“低剂量(100mg)”以说明在其目前的制剂中100mg胶囊的治疗功效与标称剂量不对应。这将在下面的实施例中进一步地讨论。

功能性脑扫描分析

通过分析135个受试者(他们已经历了平均间隔6个月的两次SPECT扫描)中的功能性脑扫描变化(图3)，独立地确认了24周内的衰退阻止(prevention of decline over 24 weeks)。接受安慰剂的受试者显示脑的额区和颞顶区的预期退化模式，而接受30mg或60mg剂量rember^TM的受试者在任何脑区中均未显示出现退化的迹象。当单独检查在基线处为CDR-轻度的亚组时，在接受安慰剂的受试者中6个月内也存在显著衰退的迹象，总计损失8％的功能性神经元体积(functioning neuronal volume)。在整个群体中观察到的治疗效果也可在CDR-轻度亚组中观察到，这表明rember^TM在CDR-轻度AD中的功效。6个月期间内在轻度亚组中存在进行性功能性衰退的客观证据而没有任何的心理测量学量表上的衰退的相应证据的事实，确认了在轻度AD中认知储备(cognitive reserve)具有强的致混淆影响。总的来说，尽管存在该效应，SPECT扫描显示的基线功能性缺陷与基线ADAS-cog得分高度相关，而ADAS-cog量表显示的rember^TM治疗的效益同样与SPECT扫描显示的功能上的效益相关。功能性脑扫描所观察到的rember^TM的作用强烈暗示了，rember^TM逆转τ蛋白聚集病理学(已知τ蛋白聚集病理学发生在与那些显示功能性脑扫描缺损的脑区相同的区)的能力，是其阻止在相同区内皮质脑功能衰退的能力的原因。考虑到SPECT在检测衰退和治疗效果方面具有较高的敏感性并具有预测治疗响应的能力(参见下面的50周分析)，我们的结论是SPECT可以在将来旨在揭示疾病缓解手段(disease modification)的临床试验中充当替代或代理标志。

50周分析

50周研究扩展和确认了24周研究的发现，并显示了在总的ITT/OC和ITT/LOCF群体中在CDR-轻度和CDR-中度受试者中显著的效益(图4；表2和3)。最初被随机化到安慰剂组的受试者在24周后转换为低剂量(100mg)给药2次/天。这称为“安慰剂-低剂量”治疗臂(arm)。由于在首个24周治疗期间所述“低剂量”(100mg)就任何心理测量学量表而言功效均为最小，方便地将安慰剂-低治疗臂作为50周研究的最小暴露剂量比较器臂。

在用安慰剂治疗的受试者中在50周研究期间观察到的平均衰退为7.8ADAS-cog单位(图4)。对于用60mg tid剂量的rember^TM治疗的受试者，50周期间观察到的衰退在受试者的ADAS-cog量表或MMSE量表上与0差别不显著。在ADAS-cog量表上，约60％的受试者在50周时得到了改善或保持。在MMSE量表上，62％的受试者在50周时得到了改善或保持。服用60mg剂量的患者在上述两种量表中的任一量表上不衰退的几率好于安慰剂-低剂量约3.4倍。在50周试验期间相应的作用大小是-6.8ADAS-cog单位和3.2MMSE单位。除了上述对疾病进展的作用，在60mg剂量还存在初期症状改善：在15周时有1.6ADAS-cog单位和0.8MMSE单位的改善，与使用AChE抑制剂所观察到的效果可以比拟。

表2.在50周时由混合作用分析推断出的作用大小(以ADAS-cog为单位)

表3：在50周时由最小二乘法分析推断出的作用大小(以ADAS-cog为单位)

CDR-轻度受试者50周内在安慰剂-低臂中在非认知量表上没有衰退。CDR-中度受试者在50周时的非认知结果确认了24周分析的发现。NPI(神经精神调查表，Neuropsychiatric Inventory)表明rember^TM治疗50周的效益。尽管安慰剂-低剂量臂的受试者在患者-障碍量表上衰退了9.6单位和在护理者痛苦(carer-distress)量表上衰退了4.9单位，但是在用rember^TM持续治疗50周的受试者中未观察到这样的衰退，相应的最好作用大小为-9.2单位和-4.6单位。

相对于低剂量(100mg)臂，安慰剂-低剂量臂提供了与延迟开始设计(delayed start design)的近似模拟，从而确认了rember^TM在形式调节(formalregulatory)的意义上是疾病缓解性的。晚些开始接受具有最小表观治疗功效(通过ADAS-cog在最初的24周判断)的剂量的受试者在50周时相对于一直接受低剂量(100mg)的受试者保持显著的不同。此外，持续接受低剂量(100mg)的受试者显示了疾病进展速度的减缓。尽管在两种臂之间胶囊给药方案不同(tid与bd)，但血液学副作用，其显示清楚的剂量响应曲线，对于这两给药方案是不可区分的，这支持了生物暴露(biological exposure)的近似等价性，因而支持了rember^TM具有缓解疾病性的推断。这一点也通过rember^TM在60mg剂量在50周时能阻止疾病进展，以及在30mg和低剂量(100mg)在50周时降低了疾病进展速率得到确认。

rember^TM临床安全性的总结

rember^TM试验中的总体不良事件概况显著好于在the Cochrane Review(Birks，2006)中报道的最佳治疗剂量的AChE(乙酰胆碱酯酶)抑制剂。与AChE抑制剂相比，服用30mg或60mg tid剂量的rember^TM的受试者经历任何副面反应而退出或者由于不良事件而退出的机率不存在显著的差异。腹泻是用rember^TM尤其是低剂量(100mg)治疗的受试者报道的最常见的不良事件，其最可能由于未吸收的rember^TM转移至远端肠，由于MTC的轻度抗生活性而引起消化道菌丛的再增殖所引起，所述的MTC轻度抗生活性在文献(Kristiansen and Amaral，1997；Gunics等人，2000)中已有清楚的记载。尽管接受rember^TM的受试者发展腹泻的几率高于接受AChE抑制剂的受试者，但是据报道接受rember^TM的受试者具有显著更少的恶心、呕吐、厌食和腹痛、头痛、疲劳和焦虑。来自一些试验中心的经验指出腹泻可用合适的益生制剂(例如，干燥的乳杆菌制剂)进行控制。

在所有的常规临床化学参数中未观察到有临床意义的变化。在用rember^TM治疗的受试者中观察到红细胞数、血红蛋白、高铁血红蛋白和白细胞数的小的下降，所述变化是剂量相关的。这些变化对于30mg tid剂量是可忽略的，但是60mg和低剂量(100mg)tid，这些变化是统计显著的。对于红细胞参数，24周出现变化，但50周变化消退(resolve)，只是有证据表明60mg tid剂量在24周时提高了高铁血红蛋白水平并随后保持稳定。在该剂量下，高铁血红蛋白的平均水平从正常的平均值血红蛋白的0.4％增至血红蛋白的0.8％，但是仍然低于正常值的上限(1％)。对于白细胞，同样30mg tid剂量而言变化是可忽略的，但是就60mg剂量而言，在50周内，白细胞数的值先降低而后保持稳定在与30mg剂量没有显著差别的水平。我们的结论是：血红蛋白被甲基硫堇鎓部分的氧化形式所氧化是引起红细胞参数变化的最可能的机理。

在研究期间，这些变化都不是临床上显著的，均很好地保持在正常范围内。因此，可作出结论：这些变化不足以引起风险/效益比上的担忧，从而不会影响人们对30mg和60mg剂量强度的进一步临床开发。目前的低剂量(100mg)的制剂不适合进一步的临床开发，这是因为下面将要讨论的其功效/副作用曲线较差。

实施例2-试验药(IMP)的制剂和强度

在TRx-014-001中使用的rember^TM的制剂由包含半固体的填充物的Size 1蓝/蓝明胶胶囊组成，所述填充物包含MTC、Gelucire 44/14和Aerosil200。胶囊的三种强度仅仅区别在填充物重量上，制备的胶囊的目标强度分别是30、60和100mg的MTC。提供了仅包含Gelucire 44/14的匹配安慰剂。硬的明胶胶囊和用于胶囊绑扎的明胶符合当前的关于传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies)的指导方针。

利用欧洲药典和美国药典的旋转桨方法，通过外观、填充物重量均一性、测定(改编自USP 27)、色谱纯度(TLC，如USP 27中所规定)以及溶出测试胶囊的均一性。制备了6个生产批次的胶囊，测试它们的均一性和稳定性。

通过这些溶出研究，发现100mg胶囊在所有的体外条件下的溶出慢于30mg胶囊，并且该差异随着制造后的时间的增长而增大(图5)。相对于图5中所示的30mg和100mg数据，60mg胶囊具有居中的溶出曲线。进一步研究已经显示：尽管随后从破裂的胶囊中溶出是快速的，在高填充物重量的MTC(即，尤其是100mg胶囊)存在下明胶胶囊的加速交联降低了最初的胶囊破裂的可能性。在体外τ蛋白聚集测定中发现从胶囊中释放出的MTC保持了生物活性的预期水平(WO96/030766)。

100mg胶囊的溶出的这种延迟可能使吸收的主要场所从胃转变至肠，导致吸收降低(引起腹泻)和主要被吸收的生物可利用的剂量为无治疗活性的二聚体。下面将进一步讨论的暗含的剂量响应关系说明：在当前制剂中，在与30mg和60mg剂量的认知活性相比时从100mg胶囊可得的相当的认知上活性的剂量是约25mg。

当前的制剂限制了较高剂量的rember^TM能在未来的临床研究中临床上探究的程度。如下所进一步讨论的，60mg剂量的功效平台不存在理论基础。可作出结论：60mg tid的表观平台反映了较高剂量的rember^TM在溶解度、溶出和吸收的方面一系列限制。

实施例3-数学功效模型

已经发展了动力学数学模型，用于更好理解τ蛋白聚集过程及其与认知退化定量关系。该模型的结构示于图6中，显示了相关的速率常数。

范围广泛的经验数据输入被用来得出在上面模型中的主要速率常数的估计值。这些包括：关联人的τ蛋白聚集和MMSE得分的定量临床-病理研究、Braak期随时间的进展速率的估计(Braak和Braak，1991)、在细胞模型中和在τ蛋白结合体外测定中的药物剂量响应关系、在转基因动物的τ蛋白病理学的减少(reduction)中的药物剂量响应关系、以及在下面将进一步讨论的关联在动物和在人中rember^TM的剂量与估计可得的脑水平的药代动力学模型，等等。

使用临床试验数据来确认所述功效模型，该功效模型进而可以解释在τ蛋白聚集、临床痴呆和rember^TM的临床功效曲线之间的关系。具体而言，形式上不再需要作进一步暗示β-淀粉样蛋白或其它未知的神经递质因子的堆积的假设。鉴于本领域中通常假定的AD病理生理学的复杂性，出乎意料的是，极其节省的假定和速率常数可为关联临床痴呆进展速率、上述的τ蛋白聚集级联的动力学与τ蛋白聚集抑制剂治疗介入的功效的一组形式上可定义的关系提供完整的基础。

在解释rember^TM的作用机理中，可从上述模型得出重要的推断。通过降低k3的速率来抑制τ蛋白聚集速率(即在输入方进行抑制)对于解释功效将会是重要的，尽管这看起来是先验的并且是通常在本领域中所假定的，但是其未经数学模型证明。该模型可用于说明：仅作用于聚集级联(例如降低进入聚集τ蛋白的阶段的产品的上游供应的策略)的流入方的理论药物的影响只会以分步的方式短暂地降低τ蛋白的聚集，该降低会随时间被持续的聚集所抵消。换句话说，这样的药物的理论影响也只是对症的，不会改变疾病的进展速率，即使此类药物的机理似乎有缓解疾病的潜力(因为其靶向的是原发病理)。该模型仍然存在τ蛋白聚集随时间渐进的堆积，并且其速度与没有药物时一样。这主要是因为τ蛋白聚集的清除通路在AD受试者中仍然不起作用并随时间恶化，其速度可用Braak期随时间的进展速度来衡量。对于潜在的抑制τ蛋白的策略而言，这尤其适用于可能基于抑制τ蛋白磷酸化的方法，即使τ蛋白磷酸化被假定为对于τ蛋白聚集是速率上关键的(本发明的发明人对此有异议(例如Wischik等人，1997))也是如此。这还适用于基于β-淀粉样蛋白可能以某种至今未知的方式引起τ蛋白聚集的速率的观点，如AD发病机理的Aβ理论的最近流行看法(例如Selkoe，2004)所断言。

rember^TM的最重要的治疗作用在于其能通过溶解聚集体和将先前聚集的τ蛋白以单体形式释放出而提高τ蛋白聚集的清除，该清除可通过有效得多的清除通路(即蛋白酶体通路)进行。就该模型而言，rember^TM的主要作用是提高或者展开图6B中的速率常数k4b。本质上，这开启了τ蛋白聚集的一种新的原来没有的清除通路。该新的清除通路(蛋白酶体清除通路)通过图6B中的k4b速率常数得到说明。

动力学模型中清除的提高的有力效果是由于聚集体的自催化作用，因为聚集速率直接与聚集体浓度成比例。这是引起长期预测的疾病进展速率的变化的基本机理，它已经被TRx-014-001临床试验所证实。该模型给出了下面的可能：rember^TM如果在疾病进展(即，在临床MCI时或者甚至之前)的更早些给药，也可缓解在神经元的清除通路中的结构损坏，并提供rember^TM用作初期的预防治疗的又一原理。

所述动力学模型的另一特征是它可预测由于现存的τ蛋白聚集负荷的初始溶出而出现的早期对症效果。该模型预测，这种现存的聚集体的清除的初始爆发有助于早期的症状改善。这也得到了rember^TM 2期临床试验的证实。

rember^TM的后期疾病调节作用取决于τ蛋白低聚物的产生进行速率以及ELM/蛋白酶体清除通路随时间的延续降解(其是在整个Braak期随时间的内在进展速率的最终决定性因素)可在多大程度上被τ蛋白低聚物的溶剂化/增溶所致的提高的清除所中和。由于这些因素与聚集体浓度成正比，药物的药代动力学曲线的小的变化可对疾病的进展速率产生大的影响。该模型的这些特征再次得到了2期临床试验的证实，并且强调了需要最大化被吸收的治疗活性物的生物利用度。具体而言，在以其当前形式的模型内不存在可预测剂量响应平台的内在机理。

实施例4-认知活性与血液学活性之间的关系

在100mg胶囊的制剂中存在如上所总结的缺陷，其导致溶出延迟随制造以后的时间而增长。其它体外研究表明这极可能是因为在高填充物重量(即，100mg胶囊)的MTC存在下明胶胶囊的更快交联。

已经发表的体外研究说明MTC的吸收是个复杂的过程，其部分取决于内在的细胞-表面噻嗪染料还原酶活性(Merker等人，1998；Merker等人，2002；May等人，2004)。基于已经发表的对人的研究发展了一种药代动力学(“PK”)模型(下面将进行讨论，参见DiSanto和Wagner，1972a，b，c；Peter等人，2000)，其说明MTC从主要吸收室中消失的半衰期为30分钟，这与胃是口服MTC的主要吸收场所相一致。

当在非还原性环境下MTC在pH 7时呈氧化型，其是高度离子化的。因此，MTC的脂溶性差。然而，通过接受两个电子还原成还原(“L-MT”)形式得到了易于吸收的无电荷物质。体外研究表明该还原步骤只能发生在低pH的生理条件下。该性质可以解释为什么胃是最可能的主要吸收场所。对啮齿类动物、猪和灵长类动物的PK研究说明在组织中发现的甲基硫堇鎓部分的主要形式是无色的L-MT形式，以及在口服后只有小部分对氧化型有贡献，这可在血中容易地测量。因此，可能的是只有L-MT形式可穿过血-脑屏障，在此处的神经元内建立氧化型与还原型之间的新的稳态。在静脉给药之后，可在血中检测出比在口服相同剂量之后显著更高水平的氧化型(Peter等人，2000)。对猪的进一步PK研究表明这是因为在口服后循环中的L-MT形式的水平的差异，而不是因为Peter等人所提议的口服的生物利用度差。这表明MTC在口吸收和随后的组织分布过程中发生了还原。

在溶出延迟的情形中，就rember^TM试验中使用的100mg胶囊而言，通过还原酶作用机理(前述的)可能只发生了标称剂量的有限吸收。这会引起在较高pH时自肠的延迟吸收。基于体外研究可推断出这些情形会有利于形成氧化型MTC单体的二聚体(文献中已有很好的说明，参见Rabinowitch和Epstein，1941；Lewis等人，1943；Spencer和Sutter，1979)。该二聚体因其反向平行堆叠而不带静电荷。因此我们预期，延迟溶出可引起氧化态的MTC在肠的较高pH下的延迟吸收。根据体外研究，我们预期二聚体不会具有治疗活性，但是因其能氧化血红蛋白而会具有血液学作用。

上述的延迟溶出假说与源于rember^TM试验的数据一致。事实上，试验已经表明MTC具有两种全身性药理学作用即认知作用和血液学作用。认知作用不显示单调的剂量响关系，而血液学作用则显示单调的剂量响关系(图8)。这说明这两种药理学活性由两种不同的种类所引起：有益的认知活性是由以无电荷的L-MT形式吸收的MTC所致，而血红蛋白的氧化是由以氧化型二聚体形式吸收的MTC所致。如果是这样的话，那么可预期能导出关联不同胶囊强度的溶出时间与这两种不同药理学活性的关系。如图8中所示，事实上确实如此。

在归一化的溶出(表示为在30分钟之前或之后的溶出百分数)与归一化的相对认知活性或血液学活性指数之间，发现了非常高的相关性(r＝0.996)。对于相对溶出，计算了在30分钟之前或之后体外发生的总溶出百分数。如图7中所示，得出总的药理学活性的相应分配。

应注意，在各标称剂量时的相对认知活性表示为在各标称剂量时总的药理学活性(即，认知活性和血液学活性)的比例。因此，尽管30mg剂量的绝对认知作用比60mg剂量小，但是因为30mg剂量的血液学活性比60mg剂量更少的，所以30mg剂量相对于总的药理学活性的相对认知活性指数较高。

相反地，在50周时的ADAS-cog的功效分析中观察不到单调的剂量响应关系，这暗示：从100mg胶囊中可得的有效治疗剂量如图8中所指出，即大约25mg，或者说是标称剂量的四分之一，类似于30mg剂量在50周时的活性。正是基于上述分析中的原因，将该100mg剂量称为“低剂量(100mg)”以表示这些胶囊的制剂使得预期的标称剂量以其治疗活性形式的递药和吸收不成比例。脑中治疗活性的主要决定因素似乎取决于L-MT形式的吸收，该吸收可以通过该形式穿过血-脑屏障的能力得到调节。

这些分析强烈地表明，通过对制剂进行优化，可能将MTC的甲基硫堇鎓部分的有益认知作用与其不期望的血液学作用分离开。如在先前提交的未公开的专利申请(PCT/GB2007/001103，其内容通过参考具体地并入本文)中所讨论的，一种新的稳定化的还原型盐的形式(记为“L-MTx”)会具有绕开还原酶活性的效益，所述还原酶活性是MTC的甲基硫堇鎓部分的吸收所必需的。已经发现稳定的L-MTx具有比MTC更高的溶解度，并且在溶出时基本上保持无色的还原状态超过1小时，从而允许可直接以还原的甲基硫堇鎓形式被吸收。稳定的L-MTx的另一效益可以是能获得高得多的功效，这是因为较高剂量的治疗活性形式可被吸收而不受到下面的限制：一方面胃的噻嗪染料还原酶活性的容量，以及另一方面血液学副作用和腹泻。这些将在下面进行讨论。

由目前的分析预测，已经发现L-MT盐形式具有比MTC显著更少的血液学毒性。图9显示在每天给药14天的大鼠中在整个口服剂量范围内MTC和L-MTx在主要的红细胞参数上的差异。可看出，L-MTx给药的动物具有较高的红细胞数(“RBC”)，较高的血红蛋白水平(“HB”)和较高的红细胞血红蛋白浓度(“MCHC”)。平均红细胞体积更小(“MCV”)，这说明更多的成熟红细胞从骨髓中释放出，并且降低了MTC的溶血作用引起的网织血球过多(“RETI”)。

表4：在MTC给药和L-MTx给药的大鼠中主要的红细胞参数的差异的统计分析

实施例5-可用的研究

从前述的讨论中可看出，合适治疗剂量的MTC及其制剂的优化是复杂的。对此的主要障碍是缺乏合适的药代动力学模型。尽管已有产生PK模型的努力，这些努力是相互矛盾且没有考虑到所有的可用数据。因此，需要一种完全新的发展PK模型的方法。在提出该方法之前，对可用的数据和模型进行了总结。

已有3项已出版的对MTC在人中的研究。对这些研究首先进行总结再一起进行讨论。还有另外一项已出版的对人的研究(Rengelshausen等人，(2004)Pharmacokokinetic interaction of chloroquin and methylene blue combinationagainst malaria.Eur.J.Clin.Pharmacol.60：709-715)，它在本文中没有进一步采用，因为其方法学和发现与下面将讨论的Peter等人(2000)的方法学和发现类似。

1)现有技术研究1

首个系统的参考研究是由DiSanto和Wagner作出的(1972)并报道于3篇系列文章中，其中两篇总结于下：

1a)DiSanto AR和Wagner JG(1972a)Pharmacokinetics of highly ionizeddrugs I：whole blood，urine and tissue assays.J Pharmaceut Sc 61：598-601

该文章报道了MTC在全血、尿和组织中的分析方法。本质上，该方法包括制备具有高盐浓度(＞2M)的含水基质，将MTC萃取至二氯乙烷中，以及测量总的二氯乙烷萃取液在660nm的吸光度。在尿中发现MTC的稳定化的白色形式(“白色-MTC”)，但是化学上未鉴定出。这可通过下面方法进行分析：在萃取至二氯乙烷中之前，先通过添加5N HCl和在沸水浴中加热2分钟将其转化为“游离的MTC”。在酸处理之后从尿中回收的MTC与未经酸处理从尿中回收的MTC之间的区别(“游离的MTC”)报道为“白色-MTC”。

1b)DiSanto AR和Wagner JG(1972b)Pharmacokinetics of highly ionizeddrugs II：absorbtion，metabolism and excrection in man and dog after oraladministration.J Pharmaceut Sc 61：1086-1090。

在该研究中，7位成年男性志愿者(年龄21～40岁，重54.5～95.3公斤)摄入10mg的MTC USP。在下表列出的时间间隔里收集尿液。氧化型MT(“Ox-MT”，也称为“游离的MB”)和白色-MT(“L-MT”)的平均尿排泄速率及其相应的标准误差示于表5以及图10和11中。

表5：来自DiSanto和Wagner(1972)的氧化型MTC(“Ox-MT”)和还原型MTC(“L-MT”)的排泄速率和标准误差(“se”)。

表6：Ox-MTC和L-MT的尿排泄数据

在表中采用了下列标准缩写：Kel(终端排除速率常数)，K12(从假定的区室1转移至区室2的速率常数)，K21(从假定的区室2转移至区室1的速率常数)，Ka(吸收速率常数T_滞后(在药物出现在中央区室(即，血)中的吸收时间滞后)。VcF(Vc x F)，F(计算生物利用度)，Vc(药物在中央区室中分配的理论体积)，AUC(曲线下的面积，血中的总体药物的量度)，MRT(平均停留时间，给药剂量的632％被排除所花的时间)，T1/2(半衰期)。

根据尿排泄数据，Ox-MT和L-MT在分配期和表观生物利用度上不同。然而，终端排除半衰期(约16hr)和校正的表观中央体积(4L)是相当的(表6)。尿中总的回收率是6.465mg(即剂量的65％)，其中23％以Ox-MT排出而77％以L-MT排出。

2)现有技术研究2

这项研究参见Peter C，Hongwan D，Kupfer A，Lauterberg BH(2000)Pharmacokinetics and organ distribution of intravenous and oral methylene blue.Eur J Clin Pharmacol 56：247-250。

在该研究中，7位志愿者(4男3女，年龄19～53)在间隔至少1周的3个时刻给药MTC 100mg(313μM)，以单一静脉注射(20mg/ml在0.9％NaCl中的溶液，历时30秒)、或者两颗50mg明胶胶囊、或者两颗50mg明胶胶囊及800mg的Mesna(巯基乙磺酸钠)的形式。此处包括Mesna的联合给药的药代动力学效果，这是因为在MTC临床上用于基于异环磷酰胺(ifosfamide)的癌症化疗方案中联合给药Mesnais以避免尿毒性。

对血的分析方法学在以下方面不同于DiSanto和Wagner所采用的分析方法学：

●包含内标

●将己磺酸钠用作提高至二氯乙烷的萃取的离子对

●色谱分离采用Nucleosil 100-5CN柱和恒溶剂组成的流动相，流出液在660nm进行监控。

Peter等人还测量了直至24小时的Ox-MT和L-MTC的尿排泄，但仅报道了在给药后2、4、6、10、14、24小时时结束的间隔期间的总排泄的平均。尿的分析方法据说与DiSanto和Wagner的分析方法基本上相同。

Peter等人未在表中列出结果，但是在图中给予示出，如图14和15再现的。

从这些图中读取数据，列于下表中。

表7.在静脉给药100mg的MTC之后在全血中Ox-MT的浓度

表8.在口服100mg的MTC之后在全血中Ox-MT的浓度(给药Mesna和不给药Mesna的平均)。

Peter等人报道了下面的药代动力学参数(表9)。

表9.Peter等人(2000)报道的MTC静脉给药和口服的药代动力学参数

1.Cl：清除，单位时间内清除了药物的血的体积。

Peter等人还指出，在尿中以L-MB形式排出的总MT的分数约为总数的1/3，并且这在口服和静脉给药之间没有区别。

3)现有技术研究3

该项研究参见Moody JP，Allan SM，Smith AHW，Naylor GJ(1989)Methylene blue excretion in depression.Biol Psychiat 26：847-858。

这是对服用15mg/天(5mg t.i.d.)或者300mg/天(100mg t.i.d.)的抑郁受试者在3周试验期内24小时尿排泄的有限研究。在7、14或21天治疗结束时取得7位受试者的24小时尿的收集。分析方法据说与DiSanto和Wagner的相同。结果总结于下表10中。

表10：来自Moody等人(1989)的研究的人的MTC尿排泄数据总结

已经将该研究的单剂量数据与DiSanto & Wagner以及Peter等人的研究数据进行合并，以提供对基于总MT在48小时时的尿排泄的表观的口服生物利用度的估计。

主要结果的讨论

在基于上表中的数据发展的模型中存在几个不一致的方面。最重要的是，Peter等人从血药浓度数据的分析得到的终端排除半衰期(5.5～6.3hr)与DiSanto和Wagner从尿排泄数据得到的终端排除半衰期(15～16.5hr)不一致。这还与在针对手术在手术中IV给药MTC用以定位甲状旁腺之后观察到的尿的长期变色不一致(Kuriloff和Sanborn，2004)。出现这问题是因为在遵循相同的药代动力学方法的Rengelshausen等人(2004)的情况下Peter等人(2000)基于4hr或12hr获得的血液数据作出估计。这些分析未能虑及终端排除期，这是因为遇到了在血中浓度降至低于检测限之后估计血中Ox-MT水平的技术难题，这即使使用LC-MS(液相色谱-质谱)仍然存在。采用尿排泄数据可更好地对终端排除期进行分析。尽管众所周知尿排泄速率可提供一种在简单系统中估计排除速率常数的有效方法(例如，Gibaldi和Perrier(1982)Pharmacokinetics)，但是与可得的MTC数据相关的问题是复杂的，并且不存在关联血液数据和尿排泄数据到一个简单紧凑整合的模型中显然的方法，所述模型能同时解决静脉给药和口服的案例。提供该问题的解决方法对于发展可用于优化治疗AD以及在其它治疗环境中MTC或其它MT形式的剂量的合适预测模型是关键的。下面将讨论该问题的解决方法。

实施例6-整合药代动力学模型的发展

i)口服生物利用度

Peter等人数据提供了口服或静脉给药之后血中浓度的有用指示。比较4hr时间段内的AUC值说明口服之后的血中浓度是静脉给药之后的血中浓度的8.2％。然而，该估计值不能用于确定口服生物利用度。这与Peter等人的在24小时时尿回收数据不一致，其中发现在口服之后尿中的回收率是静脉给药之后得到的65％(参见表5)。该图与自DiSanto和Wagner以及Moody等人的研究得到的尿排泄数据相当。

在图16中合并这些研究的数据以提供对口服生物利用度的总体估计。这说明口服生物利用度是40％～80％之间的数，该数取决于在10～100mg范围的剂量。根据图16还显然可见，如口服之后尿中的回收率所测定的，存在与剂量相关的生物利用度下降。

因此，由在血中直接测量确定的口服生物利用度估计值与由尿排泄确定的口服生物利用度估计值之间存在偏差。这意味着在口服之后在血中观察到的低的血中浓度不能仅仅通过Peter等人(2000)所提议的吸收限制得到解释。在口服之后在血中观察到的低的血中浓度更可能是反映了MTC口服和静脉给药的表观分配体积(apparent volume of distribution)的差异。DiSanto和Wagner确认了快速早期组织摄取，他们报道了在大鼠给药后2分钟时29.8％的MTC静脉给药能在心、肺、肝和肾中回收。这种先是早期快速分配期，10小时之后继以缓慢的排除期的图景也与图12和图13中所示的尿排泄数据一致。因此，Peter等人提供的4hr时间段收集的血液数据不足以得到对MT在吸收、中央区室和周边区室之间的再分配的有效估计。

ii)通过合并Peter等人的血液数据(表7和8)和来自DiSanto和Wagner的尿排泄数据(表5)构建模型

从可得的研究中得出药代动力学模型的一种方法是使用线性微分方程来直接确定可适用于可用数据组的区室的系统。采用的数据是表5中所列的DiSanto和Wagner的7位受试者的尿排泄数据组，考虑了Ox-MT和L-MT的排泄差异。该数据与表7和8中列出的Peter等人的也基于7位受试者的血中浓度数据合并。基于Peter等人测定的尿排泄曲线对于这两种给药途径而言是类似的，假定DiSanto和Wagner的数据在合适的缩放之后可与IV和口服的血药浓度数据组关联(图17)。

然而，将DiSanto和Wagner的尿排泄数据组优选于Peter等人数据用于拟合，这是因为Peter等人数据没有明确考虑到Ox-MT和L-MT的排泄差异，并且其取样间隔相对于从DiSanto和Wagner数据组得到的是粗糙的。

分两个阶段进行建模：

在第一的阶段，将Peter等人的直至单次静脉给药100mg的MTC之后4小时的血药浓度数据与DiSanto和Wagner的针对单次口服10mg的MTC剂量直至120小时的尿排泄数据组合并。第二阶段是看相同或类似的区室的系统是否可适用于Peter等人的单次口服剂量100mg的MTC之后血药浓度数据与DiSanto和Wagner的针对单次口服10mg的MTC剂量直至120小时的尿排泄数据组的组合。在这两种情形下，均通过相应的模型来估计允许剂量相差10倍的缩放参数。

图18显示了各区室的最佳分配以及相应的速率常数，它们可适用于3组数据组(Peter等人的静脉给药血药浓度数据[表7]，DiSanto和Wagner的尿中Ox-MT数据[表5]和尿中L-MT数据[表5])。中央区室是C2。对于尿中Ox-MT(S-Ox)和尿中L-MT(S-L)，通过该模型明确地估算缩放参数，并示于表11中，所述缩放参数用来解决血液数据组和尿数据组中所用的剂量存在10倍的差别的事实。该模型的解析需要两个周边区室(在图18中示为C3和C4)以及另外的排泄区室(C5)。存在两个源于C5的输出，一个输出代表缩放的观测到的L-MT尿排泄(在表11记为K50)，而另一个输出代表未经测量的损失(在表11记为K500)，其假定代表通过胆汁以未经测量的代谢物而排泄的MT次级肝代谢。源于C3的输出(在表11记为K30)代表作为尿中Ox-MT的被测量。所示出的百分数表示预测的总排泄在120小时时的配分，其通过相应的AUC值估计。

通过所述模型估计的各参数列于下表11中。

表11：针对单次静脉给药100mg MTC估计的模型参数。速率常数如图18中所指出。K50是源于C5的尿排泄速率常数，K500是源于C5的假定肝排泄速率常数。V2是通过模型算得的MT在C2中的表观分配体积。S-Ox和S-L是通过模型算得的缩放参数，用来解决这样的事实，即尿数据来自其中MTC以10mg口服剂量给药的实验，而血液数据来自其中MTC以单次的100mg静脉剂量给药的实验。

在第二阶段，将相同的基础模型适用于Peter等人的单次口服剂量100mg的MTC之后血药浓度数据(表8)以及来自DiSanto和Wagner的单次口服剂量10mg的MTC之后尿排泄的经缩放的数据(表5)。

图22显示了各区室的最佳分配以及相应的速率常数，它们可适用于3组数据组(Peter等人的口服血药浓度数据[表7]，DiSanto和Wagner的尿中Ox-MT数据[表5]和尿中L-MT数据[表5])。口服模型假定在中央区室(C2)之前存在两个另外的区室。它们是C1(主要吸收区室，假定对应于胃)和另一个中央前区室(C6，假定代表首过代谢肝区室(first-pass metabolism hepaticcompartment))。存在来自C1的损失(在表12记为K100)，其假定代表非吸收的MTC；还存在来自C6的损失(在表12记为K600)，其假定代表因首次通过代谢而引起的损失。对于尿中Ox-MT(S-Ox)和尿中L-MT(S-L)，通过该模型明确地估算用于解决血液数据组和尿数据组中所用的剂量存在10倍的差别的事实的缩放参数，并示于表12中。对于IV模型，模型的解析需要两个周边区室(在图22中示为C3和C4)以及另外的排泄区室(C5)。存在两个源于C5的输出，一个输出代表缩放的观测到的L-MT尿排泄(在表12中记为K50)，而另一个输出代表未经测量的损失(在表12中记为K500)，其假定代表通过胆汁以未经测量的代谢物而排泄的MT的次级肝代谢。源于C3的输出(在表12中记为K30)代表作为尿中Ox-MT的被测量。所示出的百分数表示来自系统排泄的预测总输出在120小时时的百分比，其通过相应的AUC值估计。

通过所述模型估计的各参数列于下表12中。

表12：针对100mg MTC的单次口服剂量估计的模型参数

对于模型的口服形式，明确地将用于使来自DiSanto和Wagner的尿中Ox-MT和L-MT(10mg口服剂量)适合Peter等人的数据(100mg口服剂量)的缩放因子分别估计为S-Ox和S-L。实现对口服数据的适用而需要进行的另一处变化是针对来自DiSanto和Wagner的尿排泄数据引入时间延迟。该延迟被估计为非线性函数：针对1小时之前的排泄时间，时间延迟的范围为0.2～1小时；而后为1小时的恒定时间延迟。

从表11和12中可看出，在模型的输出和输入数据组之间存在非常高的相关性(均大于0.96)，这也可从图19-21和23-25中容易地看出。因此，该模型非常接近地适合这些实验数据。

iii)模型输出与其它数据源的比较

作为对口服模型的核查，将模型的输出与其它可得的数据组进行比较。

首先将口服模型的输出(图22)与Peter等人(2000)报道的并示于图18中尿排泄速率进行比较。该比较示于图26中。除了2～4小时收集间隔(此时Peter等人报道的水平是通过模型预测的水平的一半)之外，总体一致性良好。排除去该值后，二者之间的相关性为0.86。通过模型预测的总的24小时排泄与Peter等人报道的在图26中也进行了比较。该模型预测总的尿排泄为剂量的23％，而Peter等人的估计值为18.6％。

作为对该模型进行进一步核查，将总的预测的48小时尿排泄与图16中所示的数据(其汇集来自DiSanto和Wagner以及Moody等人的尿排泄数据)进行比较。这也显示于图27中，其中模型输出标记为“M”，而Peter等人数据标记为“P”。

最后，对区室的预测与来自口服研究的结果进行比较，在该研究中猪给药单次20mg/kg剂量并测定MT的脑水平。对猪以20mg/kg体重的目标剂量水平单次口服MTC。在直至48小时止的定期的时间点收集血液(0.5、1、2、4、8、12、24和48小时)和尿(1、2、3、4、5、6、7、8、12和24小时)。在给药后1、8、24和48小时分别处死两只动物并保留脑样品。MTC的游离碱的药代动力学评价在全血和脑组织样品上进行。对各只动物提取两批脑组织样品然后基本上如Peter等人(2000)所述进行分析。

对脑组织(500mg)进行涡旋然后用二氯乙烷(5ml)抽提，在氮气使有机相干燥至干燥。用甲醇接纳提取物，然后用配备紫外检测的反相HPLC进行分离。采用内标，在10～2000ng MTC/克组织的范围内验证了方法的有效性。在20、100和1600ng/g时MTC的平均各次之间的准确度(mean inter-occasionaccuracy)分别是107％、95％和105％，在各水平时的变异系数不超过20％。

发现对于血液和脑在猪中终端排除半衰期均为23.5小时，这与DiSanto和Wagner的尿排泄发现结果一致，DiSanto和Wagner的尿排泄发现结果说明终端排除期远长于Peter等人(2000)或Rengelshausen等人(2004)所估计的。

为了使用猪的数据来确定哪个人模型的区室预示脑水平，对猪的数据的时间基准加以重新缩放以对应于人的半衰期(15.7hr)。

结果示于图28中。已将所有的区室重新缩放至它们的相应最大值。可从图28中看出，中央区室(C2，血液)和C4的走向相互非常地接近，这说明MT可在C2与C4之间自由地交换。

另一方面，可看出MT从猪脑中的排除与预测的从C3的排除是平行的，而不是从C4的排除。因此可看出，在模型的两个内区室(C4和C3)中，C3提供了对预期脑水平的预测。

iii)MTC的整合药代动力学模型的解释

现在对静脉和口服模型的主要动力学特征进行比较。

a)人的IV模型

人的静脉模型的主要动力学特征总结于下表13中。数据已归一化至单次100mg剂量(313μM)的情形。

表13：人的静脉内PK模型的主要动力学特征的总结

1.对于各区室，吸收期的半衰期(A-T1/2)，分配期的半衰期(D-T1/2)和排除期的半衰期(E-T1/2)按小时计算，采用模型输出数据的三-指数的近似。

2.对于各“内”区室中的MT计算了AUC_∞(μmol-hr/l)。

3.对于各后中央区室中的MT计算了AUC_∞(μmol-hr/l)，并且将它们用百分数示出。

4.Tmax是在各内区室中MT水平达到最大时所处的给药后计算时间(hr)

5.MRT是在各区室中的平均停留时间，计算为63.2％的给药剂量被排除所需的时间。

中央区室.从表13中可看出，也可从图28中看出，C2和C4区室中的MT的动力学性质基本上相同，这支持了这样的观念：MT在C4中的形式与在C2内作为血中Ox-MT的血液浓度测量的形式处于易于交换的平衡。由于C4区室是尿中测得的L-MT形式的尿排泄的主要决定因素，因此可作出结论：MT的C4形式代表着体内存在的L-MT-Ox-MT平衡的L-MT一侧。在静脉给药之后，MT在C4中的量在30分钟内达到其最大水平，而后以通常的终端排除速率排除。

深区室.与之相比，可看出在IV情形中的C3具有不同的动力学性质。在给药后它花费4小时达到最高C3水平，而且在C3中的平均停留时间比C2或C4的长得多。考虑该猪脑数据，推断C3区室代表动力学上禁锢于细胞内的MT的池，如May等人(2004)所述。

根据May等人(2004)，为了穿过细胞膜MT必须是为L-MT形式。在细胞内存在新的L-MT-Ox-MT平衡，其取决于胞内环境中占主导的还原氛围和细胞内常见的pH(pH约7)的组合。体外实验(未示出)表明，利用生理可接受的浓度的生理上可接受的还原剂很难使MT在pH 7保持为还原状态。也就是说，如果不是细胞内保持的占主导的还原条件的话，那么在pH 7时MT往往会主要以Ox-MT状态存在。然而，Ox-MT形式的MT不能从细胞中扩散出去。这创造了新平衡的条件，由此MT禁锢于细胞内，导致胞内对抗浓度梯度的MT的堆积，这可在组织培养中得到证实(未示出)。这解释了看似矛盾的药代动力学观察结果，即MT在IV给药之后快速地分配到组织中(如DiSanto和Wagner报道)但是排除非常缓慢。因此DiSanto和Wagner发现，大鼠在静脉给药2分钟内大约25％可从主要的器官中回收。

根据人的IV模型，在尿中以Ox-MT形式测得的MT的水平与禁锢于胞内环境中(包括脑，如猪脑数据所说明)的种类在动力学上紧密相关。

b)人的口服模型

人的口服模型的主要动力学特征总结于下表14中。数据已归一化至单次100mg剂量(313μM)的情形。

表14：人的口服PK模型的主要动力学特征的总结(具体参见表13的脚注)。

主要吸收区室.在口服模型中，在MT出现在中央区室(C2和C4)中之前存在2个输入区室(C1和C6)。如在上面认知活性与血液学活性之间的关系的小节中所讨论，C1的性质在确定生物利用度和MT被吸收的形式中是至关重要的。如表14中所示，C1内的平均停留时间是30分钟。可计算出，30分钟之前50％的MT已经被吸收，而1小时之前90％的MT已经被吸收。这说明C1是胃，此处低的pH(pH约2)有利于从MT向易于被吸收的L-MT形式的酶介导转化(May等人，2004)。重要的是，应注意到给药的MTC的23％逃避了吸收而后发生损失(在表14中以C100示出)。因此，源于C1的吸收在确定有多少MTC通过胃肠道到达远端肠中也是至关重要的，在远端肠中MTC的轻度抗菌活性通过远端肠菌丛的再增殖引起腹泻。因此，C1的性质在优化MTC的吸收和功效以及最小化副作用上是至关重要的，所述副作用源于如临床试验中所示的未吸收的MTC(腹泻)和迟缓吸收的MTC(血液学副作用)。

中央区室.对于IV模型，C2和C4区室的动力学性质基本上与口服模型相同。在IV与口服情形之间的显著差异是在IV情形中速率常数K24(3.94)比口服情形(K24：0.67)高4倍多。这说明在IV给药之后存在给药的Ox-MT转变成L-MT形式的大量流动。相反，在口服情形中MT的大部分在进入中央区室之前已经还原成L-MT形式。

可发现IV模型与口服模型之间的另一显著区别是MT的表观分配体积的估计值在口服情形(320L，表12)中远高于IV情形(66L，表11)。这几乎4倍的差异很大程度地解释了在血中观察到口服之后比在IV给药之后更低浓度的Ox-MT。Peter等人(2000)错误地将其解释为是由于低的生物利用度。尽管事实上大约一半的口服剂量通过非吸收(在表14和图22中，C100损失)和首过代谢(在表14和图22中，C600损失)而损失，但是在口服情形中的C2AUC是在IV情形中的C2AUC的64％。因此，通过血液AUC比确定的表观生物利用度非常接近于根据DiSanto和Wagner尿排泄数据计算的表观生物利用度，这说明对于10mg剂量的情形65％的给药剂量可在尿中回收。

深区室.给药后2hr在中央区室中观察到MT的最高水平。作为对比，在给药5小时后才在深区室(C3)中达到峰值水平。同样，C3中MT的平均停留时间比中央区室长得多(25hr与16hr)。因此，C3的特征在IV和口服模型中基本上相同。

比较在口服和静脉给药情形中MT在C3中的表观生物利用度(其代表脑水平)是重要的。口服C3的AUC是IV C3的AUC的50％。因此，与IV情形相比，基本上一半的口服剂量在细胞内可用。

实施例7-整合药代动力学模型对给药的影响

在以下方面，整合药代动力学模型是种重要的工具：

●给药方案的优化

●制剂的优化

●建立血液水平与功效之间的关系

可从药代动力学模型得到的主要的计划参数是对重复给药所实现的稳态水平的预测。显然的是，假定终端排除半衰期为5～6小时(Peter等人，2000；Rengelshausen等人，2004)的模型将产生对最佳给药方案与假定排除半衰期为16小时的模型完全不同的估计。可从已经发展的整合模型估计出，在假定排除半衰期为6hr和16hr时，3次/天的给药方案会在预测的稳态水平的方面具有非常不同的影响。因此，如果等人的估计是正确的话，则8小时给药将观察到的堆积因子(R，即稳态水平与单次剂量水平之比)应为1.4。作为比较，如果16hr的估计值是正确的话，则对于8小时给药(8-hourly dosing)相应的R值为4.8。这说明根据这两模型预测的MT稳态水平(在血中和在脑内)会存在3.4倍的差异。因此，在没有有效的药代动力学模型的情况下难以确定剂量和功效或副作用之间的正确关系。

将剂量与功效关联起来的主要介入变量是对在不同的常规给药频率时在关键的区室中MT稳态水平的估计。该模型允许这些作为在C2和C3中的预测的平均稳态水平(如在表15中所示)被确定。

表15.作为给药频率的函数的在区室C2和C3中预测的平均MT稳态水平(值以μmol为单位)。

          C2         C3

3次/天    4.8        295.5

2次/天    3.2        197.0

1次/天    1.6        98.5

基于人的口服药代动力学模型预测的临床功效与观察值之间的相关性

我们首先考查观察到的临床功效(在50周时的作用大小，按ADAS-cog单位)与在深区室(C3，如上所讨论，其与在猪中测得的脑水平相关)中的预测的MT稳态水平之间的关系。也就是说，MT在C3中的量与MT在脑中的浓度通过一常数关联，所述常数取决于达到脑中的MT的分数以及脑内总MT的检测准确度。由于该缩放因子在人的情形中目前仍是未知的，因而为了进一步讨论将MT在C3中的量作为预测的脑水平的替代(proxy)。该关系示于图29中。

从图29中可看出，在预测的平均MT脑内稳态水平与在TRx-014-001中30mg 3次/天和60mg 3次/天剂量的rember^TM的临床作用大小之间存在非常密切的关系。由于在认知活性与血液学活性之间的关系的小节中所讨论的原因，该关系对于100mg胶囊不成立。在本质上，TRx-014-001中使用的100mg胶囊制剂的溶出延迟不允许MTC以其治疗活性形式的成比例吸收。

如图30中所示，可定义在MT的稳态血中浓度(即由C2确定)与作用大小之间的相同关系。

基于整合的人口服药代动力学模型预测的临床功效与观察值之间的相关性对给药和制剂的影响

根据前面的分析，可预期在可临床测量的MT的血中浓度与作用大小之间清楚单调的剂量响应关系。由此，可计算出考虑了测量方法学的合适的列线图。也就是说，功效可与血中浓度关联，并且利用合适的分析方法学可以指定出起治疗作用的血中浓度。

图30所示的关系的另一影响是计算在观察到的胶囊溶出与功效不足之间的关系(即观察到的作用大小与预测的作用大小之间的作用大小差异)。这显示在图31中。

从图31中可看出，随着在30分钟时观察到的胶囊溶出百分数降至低于20％，预测功效发生急剧降低。这确认了上面在认知活性与血液学活性之间的关系的小节中所下的结论，并确认了速溶对于治疗活性是至关重要的。如在MTC的整合药代动力学模型的解释的小节中进一步讨论，这可通过在MT部分以其治疗活性形式的吸收中胃有至关重要的作用得到解释。

因此，在设计MTC的改进制剂中，实现预测的功效关键取决于试验药(即片剂或胶囊)在标准条件下的溶出在30分钟内大于50％的要求。

本文所述的这些关系会影响实现较方便的给药方案(即2次/天或1次/天)的常规方法。这些给药方案对于痴呆患者(他们健忘，因而需要提示服用药物)中将是非常理想的。常规实现较方便的给药方案的手段是制备缓释制剂。然而，相反的是，本文的分析表明：如TRx-014-001中的100mg胶囊的性质所方便地例示的那样，治疗产品的基于MTC的形式的非常高载量的缓释制剂将会基本上丧失功效。

从图29和30可得到另一推论是：为了达到相当与60mg的单位剂量给药3次/天的TRx-014-001临床试验中所观察到的功效水平，治疗产品的基于MTC的形式的剂量需要以120mg或更高的单位剂量给药。

从图29和30可得到又一推论是：达到高于TRx-014-001临床试验中所观察到的功效水平要求100mg以上的单位剂量给药3次/天。然而，如在2期临床试验TRx-014-001的总结的小节中所讨论，由于当剂量大于或等于100mg 3次/天时负面的血液学作用和腹泻越来越严重，因而在本发明的制剂中对可给药的MTC的量存在限制。

对改进制剂和给药方案的影响

从图31中可看出，随着在30分钟时观察到的胶囊溶出百分数降至低于20％，预测功效发生急剧下降。

因此，在设计MTC的改进制剂中，实现预测的功效关键取决于试验药(即片剂或胶囊)在标准条件下的溶出在30分钟内大于50％的要求。

本文所述的这些关系会影响实现较方便的给药方案(即2次/天或1次/天)的常规方法。这些给药方案在痴呆患者(他们健忘因而需要提示服用药物)中将是极其令人期望的。实现较方便的给药方案的常规方法是制备缓释制剂。然而，相反的是，本文的分析表明：如TRx-014-001中的100mg胶囊的性质所方便地例示的那样，治疗产品的基于MTC的形式的缓释制剂将会基本上丧失功效。

从图29和30可得到另一推论是：为了达到相当与60mg的单位剂量给药3次/天的TRx-014-001临床试验中所观察到的功效水平，治疗产品的基于MTC的形式的剂量需要以120mg以上的单位剂量给药。

从图29和30可得到又一推论是：达到高于TRx-014-001临床试验中所观察到的功效水平要求100mg以上的单位剂量给药3次/天。然而，如在2期临床试验TRx-014-001的总结的小节中所讨论，由于当剂量大于或等于100mg 3次/天时负面的血液学作用和腹泻越来越严重，因而在本发明的制剂中对可给药的MTC的量存在限制。

基于整合的人口服药代动力学模型预测的与观察到的血液学副作用之间的相关性

现在我们考虑在TRx-014-001研究中在C2(血液)中MT的预测稳态水平与观察到的血液学副作用之间的关系。在24周时红细胞的损失被认为是最有信息含量的指示参数。该关系显示于图31B中。

从图31B中可看出，红细胞的损失水平比血液中MT的预测稳态水平高得多。这有力地确证了认知活性与血液学活性之间的关系的小节中概述的延迟溶出假说。具体而言，根据延迟溶出假说，血液学副作用由一种截然不同形式的MT所引起。这被假定为二聚体，所述二聚体的形成在肠和肠道后段的碱性条件下是有利的。因此，如果如所述的那样在胃中被吸收，则在TRx-014-001中观察到的血液学副作用是在该研究中所用的明胶胶囊制剂的特定结果，而不可能是MT部分自身的内在特性。

实施例8-对改善的组合物和给药方案的影响

吸收和功效

从前述分析可看出，使用基于MTC的药品所能达到的治疗功效水平的限制性因素是对吸收的限制与副作用限制的组合。本小节讨论的内容是，结合本文所作的分析(所述整合的药代动力学模型使这些分析成为了可能)，如何来克服这些限制。

我们首先比较图32中的实际剂量和有效剂量，所述有效剂量是利用图16中所讨论的相同关系计算得到的。

可看出，限制功效的因素是吸收限制和上述首过代谢的组合。这些因素联合起来严重地限制了增大剂量理论上可实现的效益。事实上，上面在图7中所暗示的表观功效平台几乎完全是由使用基于现有MTC的形式的药品所能传递的有效剂量的限制所决定的。

先前提交的未公开申请PCT/GB2007/001103描述了甲基硫堇鎓部分的某些稳定的还原型盐形式(在下文中称为“L-MTx”)。在此我们使用整合的药代动力学模型以及由其定义的与在TRx-014-001中观察到的治疗功效的关系，以确定这种新型组合物如何可用于优化基于甲基硫堇鎓部分的AD治疗。

首先我们考虑口服L-MTx中预期会被吸收的预测分数。这基于源于首过代谢的损失(即，源于C6的损失，在表14中记为C600并在图22中示出)可通过以L-MTx形式给药得到消除进行计算。然而，预期由于来自C1的最初的非吸收(即，来自C1的损失，在表14中记为C100并在图22中示出)会通过以L-MTx形式给药而得以消除。这是因为L-MTx形式(特别是二氢溴酸盐，参见PCT/GB2007/001103)的溶解度是MTC的两倍多，并且预期可绕开噻嗪染料还原酶(May等人，2004)，所述噻嗪染料还原酶被推定存在于胃中并被推定是吸收所必需的。基于这些假定，根据该模型提供的数据计算出被吸收剂量的预测分数，示于图33中。具体而言，在100mg剂量情形中总的前中央区室损失达给药剂量的54％。在该总的损失中，43％是由于C1的不吸收。将这应用于各个剂量以估计给药的L-MTx的预测生物利用度，同时考虑到源于随后的首过代谢的损失。

一旦发生了至中央区室中的吸收，可根据上述的关联在C3或C2中的稳态水平与观察到的作用大小的关系确定预测功效。对于C3而言，这些示于图34中。

对于从1次/天至3次/天不等的给药方案范围，在图35中示出了甲基硫堇鎓部分的基于L-MTx形式的预测临床功效与预测的MT在C2(血)中的平均稳态水平之间的相应关系。

可从图34和35看出，100mg的L-MTx形式给药2次/天的给药方案预期可-8.1ADAS-cog单位的功效水平，这也可通过60mg给药3次/天来实现。预期采用100mg以上给药3次/天会实现更高的功效水平。

因此，推断利用甲基硫堇鎓部分的L-MTx形式可获得显著更高的功效和更好的给药方案。

甲基硫堇鎓部分的L-MTx形式的安全性和可耐受性

如上面在认知活性与血液学活性之间的关系的小节中所讨论的，对于能在多大程度上给予更高剂量的MTC以实现更好的功效，一个重要的限制因素是血液学副作用的增加和由于腹泻所致的耐受性差的联合结果。尽管L-MTx形式可能会相当程度地减少腹泻，但是不清楚预期的血液学作用将会怎样。

如在图9以及在认知活性与血液学活性之间的关系的小节中的表4中所示，基于上面对大鼠研究的讨论可预期L-MTx形式会具有较小的血液学副作用。此外，如在基于整合的人口服药代动力学模型预测的血液学副作用与观察值之间的相关性小节中所讨论，在抗痴呆活性所要求的剂量范围内，血液学作用不可能是MT部分本身固有的。在较高的口服剂量例如在上面的大鼠研究中所示的剂量时，清楚的是会观察到血液学副作用，但是在药品的基于MTC的形式的临床使用中不太可能会达到这些剂量。

鉴于如上面在认知活性与血液学活性之间的关系的小节中所讨论的在大鼠研究中观察到的剂量响应关系，可计算在总的红细胞数上的预期效果，如图36所示。可看出，红细胞数下降所指示的预期血液学副作用预期是可忽略的。

甲基硫堇鎓部分的L-MTx形式的延迟释放制剂的可行性

尽管由于上述原因制造基于MTC的药品的延迟释放制剂是不可行的，但是对于甲基硫堇鎓部分的基于L-MTx的形式却并非如此。这是因为甲基硫堇鎓的白色形式不能形成二聚物。这是因为甲基硫堇鎓的白色形式不是‘扁平’的分子(这与Ox-MT不同)，并且其不具有允许通过电荷中和稳定二聚体形式的电荷。

因此，甲基硫堇鎓部分的基于L-MTx形式的延迟释放制剂可能会是可行的，而不会遇到延迟吸收的负面结果。这可以制成1日1次剂量形式。

实施例1-8的参考文献

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实施例9-稳定的结晶型还原形式DAPTZ化合物的化学合成

下面的公开内容主要对应于先前提交的未公开的申请PCT/GB2007/001103(通过参考具体地并入本文)，但是其包含在此处是仅仅出于完整性考虑。

例如，可利用例如亚硝酸钠和醋酸及氯仿，将合适的吩噻嗪转化为相应的3，7-二硝基-吩噻嗪。然后采用例如醋酸酐和吡啶对环上的氨基进行保护，例如通过形成醋酸酯的形式进行保护。然后可利用例如二氯化锡(II)和乙醇，将所述硝基还原成氨基。所述氨基可接着被取代，例如被二取代(例如被甲基二取代)，例如利用碘甲烷、氢氧化钠、DMSO和四正丁基溴化铵进行。然后可以对氨基进行脱保护，例如，可以用浓盐酸水溶液将N-乙酰基除去。接着制备成相应的盐，例如用浓盐酸水溶液，例如在脱保护的同时进行。该方法的实例如下方案所示：

方案1

因此，本发明另一方面涉及制备用于上述治疗方法的具有如下结构式的3，7-二氨基-10H-吩噻嗪化合物的方法：

其中，R¹、R⁹、R^3NA、R^3NB、R^7NA、R^7NB、HX¹和HX²如本申请所定义(例如，其中HX¹和HX²各自为HCl)，所述方法包括如下步骤：

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(v)环上的氨基脱保护(DP)；和

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(iv)胺取代(AS)，

任选的(v)环上的氨基脱保护(DP)，和

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(iii)硝基还原(NR)，

(iv)胺取代(AS)，

(v)环上的氨基脱保护(DP)，和

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

任选的(ii)环上的氨基保护(AP)，

(iii)硝基还原(NR)，

(iv)胺取代(AS)，

(v)环上的氨基脱保护(DP)，和

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(i)硝化(NO)，

(ii)环上的氨基保护(AP)，

(iii)硝基还原(NR)，

(iv)胺取代(AS)，

(v)环上的氨基脱保护(DP)，和

(vi)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述步骤是以所列的顺序进行的(即列表中任一步骤在列表中的前一步骤的同时或之后进行)。

在一种实施方案中，步骤(v)环上的氨基脱保护(DP)和步骤(vi)成盐(SF)同时(即作为一个步骤)进行。

在一种实施方案中，所述硝化(NO)步骤为：

(i)硝化(NO)，其中将10H-吩噻嗪转化成3，7-二硝基-10H-吩噻嗪，例如：

在一种实施方案中，硝化是利用亚硝酸盐进行的，例如用亚硝酸钠，例如亚硝酸钠及醋酸和氯仿进行。在一种实施方案中，R¹⁰为-H。

在一种实施方案中，环上的氨基保护(AP)步骤为：

(ii)环上的氨基保护(AP)，其中将3，7-二硝基-10H-吩噻嗪的环上的氨基(-NH-)转化为经保护的环上的氨基(-NR^保护)，例如：

在一种实施方案中，环上的氨基保护采用醋酸酯形式，例如利用醋酸酐形成醋酸酯形式，例如采用醋酸酐及吡啶进行保护。

在一种实施方案中，所述硝基还原(NR)步骤为：

(iii)硝基还原(NR)，其中将经保护的3，7-二硝基-10H-吩噻嗪的每一个硝基(-NO₂)转化为氨基(-NH₂)，例如：

在一种实施方案中，硝基还原可利用如二氯化锡(II)，例如利用二氯化锡(II)及乙醇进行还原。

在一种实施方案中，胺取代(AS)步骤为：

(iv)胺取代(AS)，其中，将经保护的3，7-二氨基-10H-吩噻嗪中的氨基(-NH₂)转化为二取代的氨基，例如：

在一种实施方案中，胺取代是利用烷基卤化物进行的，例如利用烷基碘化物如碘甲烷进行的，如利用碘甲烷及氢氧化钠、DMSO和四正丁基溴化铵进行胺取代。

在一种实施方案中，所述环上的氨基脱保护(DP)步骤是：

(v)环上的氨基脱保护(DP)，其中将保护基团R^保护除去，例如：

在一种实施方案中，环上的氨基脱保护可利用酸如盐酸进行，用利用浓盐酸水溶液进行。

在一种实施方案中，所述步骤为：

(vi)成盐(SF)，其中形成相应的盐，例如：

在一种实施方案中，成盐可利用酸如盐酸来进行，如利用浓盐酸水溶液进行。

在一种实施方案中，环胺脱保护步骤和成盐步骤同时进行(即作为一步)，例如在一步反应中，由化合物(2)得到化合物(1)。

在另一方法中，将合适的锍氯化物(例如甲基硫堇鎓氯化物，MTC)转化为相应的卤化物，例如通过与碘化钾(如碘化钾水溶液)反应进行转化。然后将所得的锍碘化物进行还原，例如用碘乙烷和乙醇还原，形成相应的盐。类似的方法公开在Drew，H.D.K和Head，F.S.H.，“Derivatives of Methylene-blue，”Journal of the Chemical Society，1933，248-253页中。这种方法的实例如下方案所示：

方案2

因此，本发明另一方面涉及制备用于上述治疗方法的具有如下结构式的3，7-二氨基-10H-吩噻嗪(DAPTZ)化合物的方法：

其中，R¹、R⁹、R^3NA、R^3NB、R^7NA、R^7NB、HX¹和HX²如本申请所定义(例如，其中HX¹和HX²各自为HI)，所述方法包括如下步骤：

(ii)还原并形成碘化物盐(RISF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(i)碘交换(iodide exchange，IE)；和

(ii)还原并形成碘化物盐(RISF)。

在一种实施方案中，所述步骤是以所列顺序进行的(即列表中任一步骤与列表中的前一步骤同时进行或相继进行)。

在一种实施方案中，所述碘交换(IE)步骤为：

(i)碘交换(IE)，其中将3，7-二(二取代的氨基)-锍盐转化为相应的3，7-二(二取代的氨基)-锍碘化物，例如(其中Y-为阴离子反离子，例如为卤素离子，例如为氯离子或为溴离子)：

在一种实施方案中，碘交换(IE)是通过与碘化钾反应进行的，例如利用碘化钾水溶液进行碘交换。

在一种实施方案中，还原并形成碘化物盐(RISF)步骤为：

(ii)还原并形成碘化物盐(RISF)，其中3，7-二(二取代的氨基)-锍碘化物被还原并转化为相应的3，7-二氨基-10H-吩噻嗪碘化物，例如：

在一种实施方案中，还原和形成碘化物盐(RISF)是通过与碘乙烷反应进行的，例如采用碘乙烷及乙醇进行反应。

在另一方法中，同时还原合适的锍盐，例如乙基锍-半(二氯化锌)，并保护环上的氨基，例如通过与苯肼、乙醇、醋酸酐和吡啶进行反应。然后可制备成相应的盐，例如利用浓盐酸水溶液制备成相应的盐，例如在脱保护的同时进行。这种方法的实例如下方案所示：

方案3

因此，本发明另一方面涉及制备如下结构式的3，7-二氨基-10H-吩噻嗪(DAPTZ)化合物的方法：

其中，R¹、R⁹、R^3NA、R^3NB、R^7NA、R^7NB、HX¹和HX²如本申请所定义(例如，其中HX¹和HX²各自为HI)，所述方法包括如下步骤：

(iv)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(iii)环上的氨基脱保护(DP)，和

(iv)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(ii)环上的氨基保护(AP)，

(iii)环上的氨基脱保护(DP)，和

(iv)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(i)还原(RED)

(ii)环上的氨基保护(AP)，

(iii)环上的氨基脱保护(DP)，和

(iv)成盐(SF)。

在一种实施方案中，所述步骤是以所列顺序进行的(即列表中任一步骤与列表中的前一步骤同时进行或相继进行)

在一种实施方案中，(i)还原(RED)步骤和(ii)环上的氨基保护(AP)步骤同时进行(即作为一步)。

例如，在一种实施方案中，还原(RED)步骤和环上的氨基保护(AP)步骤的结合如下：

(i)还原(RED)和环上的氨基保护(AP)，其中将3，7-二(二取代的氨基)-锍盐还原得到相应的3，7-二(二取代的氨基)-10H-吩噻嗪，将3，7-二(二取代的氨基)-10H-吩噻嗪的环上的氨基(-NH-)转化为经保护的氨基(-R保护)，得到相应经保护的3，7-二(二取代的氨基)-10H-吩噻嗪，例如

在一种实施方案中，Y代表Cl^-。

在一种实施方案中，还原(RED)步骤和环上的氨基保护(AP)步骤的结合是利用苯肼和醋酸酐进行的，例如利用苯肼、乙醇、醋酸酐和吡啶进行还原步骤和环上的氨基保护步骤。

在一种实施方案中，(iii)环上的氨基脱保护(DP)步骤和(iv)成盐(SF)步骤是同时进行的(即作为一个步骤)。

例如，在一种实施方案中，环上的氨基脱保护(DP)步骤和成盐(SF)步骤的结合如下：

(ii)环上的氨基脱保护(DP)和成盐(SF)，其中将经保护的3，7-二(二取代的氨基)-10H-吩噻嗪的保护基团脱除，得到3，7-二(二取代的氨基)-10H-吩噻嗪，形成相应的盐，例如：

在一种实施方案中，环上的氨基脱保护(DP)步骤和成盐(SF)步骤的结合可利用酸如盐酸进行，例如利用浓盐酸水溶液进行环上的氨基脱保护步骤和成盐步骤。

在一个相似的方法中，首先将合适的锍氯化物(例如甲基锍氯化物，乙基锍氯化物)还原和乙酰化，得到相应的1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮，例如通过与肼(NH₂NH₂)、甲肼(MeNHNH₂)或硼氢化钠(NaBH₄)反应，并与醋酸酐((H₃CCO)₂O)反应；例如在合适碱如吡啶(C₅H₅N)或许尼希碱(二异丙基乙胺，C₈H₁₉N)的存在下，例如在合适的溶剂如乙醇和乙腈中进行反应。然后对该被还原和乙酰化的化合物进行脱保护(通过脱除乙酰基)，例如在任选地添加有合适的醚例如乙醚的情况下，例如通过与合适的氢卤酸如盐酸或氢溴酸，例如在合适的溶剂如乙醇中反应来进行脱保护。

具体的实施例如下：

化学合成

合成1

3-硝基-10H-吩噻嗪

将亚硝酸钠(20.00g，210mmol)加到10H-吩噻嗪(20.00g，50mmol)、氯仿(100cm³)和醋酸(20cm³)的混合物中，将所得混合物在室温搅拌1小时。然后向混合物中加入醋酸(20cm³)，再搅拌18小时。过滤所得悬浮液，用醋酸、乙醇、水和最后用乙醇分别洗涤得到紫/棕色固体。将残余物溶解在热DMF中，冷却后过滤，得到二硝基化合物，为紫色固体。浓缩所述DMF溶液，用水和甲醇洗涤沉淀物，得到标题所示的单-硝基化合物(15g，～50％)，为棕色固体；v_max(KBr)/cm^-1：3328(NH)，3278(NH)，3229(NH)，3119(CH)，3049(CH)，1557(NO₂)，1531(NO₂)；δ_H(250MHz；DMSO)：6.64(5H，m，ArH)，7.68(1H，d，J2.5，ArH)，7.79-7.84(1H，dd，J2.75，6.5，ArH)；δ_C(62.9MHz；DMSO)：113.3(ArC)，115.3(ArC)，116.9(ArC)，121.8(ArC)，123.6(ArC)，123.7(ArC)，124.6(ArC)，126.4(ArC)，128.1(ArC)，138.8(ArC)，141.0(ArC)，147.8(ArC)。

合成2

3，11-二硝基-10H-吩噻嗪

遵循合成3-硝基-10H-吩噻嗪的步骤，利用3-硝基-10H-吩噻嗪(10.00g，41mmol)、氯仿(40cm³)、醋酸(2x10cm³)和亚硝酸钠(11.86g，173mmol)进行反应。所得残余物从DMF重结晶，得到标题所示的二-硝基化合物(6.60g56％)，为紫色针状物；v_max(KBr)/cm^-1：3331(NH)，3294(NH)，3229(NH)，3101(CH)，3067(CH)，1602(NO₂)，1558(NO₂)；δ_H(250MHz；DMSO)：6.73-6.76(2H，d，J 9，ArH)，7.78(2H，s，ArH)，7.89-7.85(2H，d，J 9，ArH)。

合成3

1-(3，7-二硝基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

将3，11-二硝基-10H-吩噻嗪(3.00g，10.37mmol)、醋酸酐(15.88g，155.50mmol)和吡啶(30cm³)形成的溶液搅拌回流18小时。然后将所得热溶液小心倒入冰水中。过滤，得到形成的沉淀，并将其溶解在二氯甲烷中，用硫酸镁干燥，过滤、浓缩，得到棕/橙色固体，该固体经柱色谱纯化(SiO₂，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶3，以二氯甲烷溶液形式加载)得到浅黄色固体状的标题化合物(2.46g，71％)，其可从丙酮重结晶，得到浅黄色针状物；v_max(KBr)/cm^-1：3091(CH)，3063(CH)，1680(C＝O)，1575(NO₂)，1510(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)：2.28(3H，s，CH₃)，7.65-7.69(2H，d，J 9，ArH)，8.22-8.26(2H，dd，J 2.75，8.75，ArH)，8.33-8.32(2H，d，J 2.5，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)：168.2(C＝O)，146.3(ArC)，143.3(ArC)，133.6(ArC)，127.8(ArC)，123.4(ArC)，122.9(ArC)，23.1(CH₃)；m/z(ES)331.0(80％，[M]⁺)。

合成4

1-(3，7-二氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

将1-(3，7-二硝基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(2g，6.04mmol)、二氯化锡(II)二水合物(14.17g，62.8mmol)和乙醇(50cm³)形成的混合物加热回流并在该温度搅拌5小时。然后将所得混合物冷却到室温并倒在冰水上(poured over icewater)。用5％碳酸氢钠将pH调节到pH7，然后用乙酸乙酯(3x50cm³)萃取产物。萃取物用盐水洗涤并经硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到标题化合物(1.64g，100％)，其为蓝紫色固体；v_max(KBr)/cm^-1：3445(NH)，3424(NH)，3368(NH)，3322(NH)，3203(NH)，3054(CH)，2995(CH)，1706(C＝O)，1650(NO₂)，1590(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)：2.01(3H，s，CH₃)，5.09-5.43(4H，brd s，NH)，6.47-6.51(2H，dd，J 1.5，8.25，ArH)，6.61(2H，s，ArH)，7.11-7.15(2H，d，J 8，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)：169.1(C＝O)，147.2(ArC)，128.1(ArC)，127.6(ArC)，127.3(ArC)，112.3(ArC)，111.5(ArC)，22.6(CH₃)；m/z(ES)293.9(95％，[M+H，Na]⁺)，272.0(20％，[M+H]⁺)，227.9(100％，[M+H，-Ac]⁺)。

合成5

3，7-二氨基-吩噻嗪双(盐酸)(B4)

将1-(3，7-二氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(0.25g，0.921mmol)溶解在盐酸(5N，10cm³)中，将所得溶液加热回流并搅拌30分钟。浓缩该反应混合物，得到标题化合物，为淡蓝色固体。δ_H(250MHz；D₂O)：6.60(2H，brd d，ArH)，7.07(4H，brd s，ArH)。

合成6

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

将1-(3，7-二氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(0.25g，0.92mmol)溶解在DMSO(3cm³)中。加入甲苯(10cm³)、碘甲烷(1.96g，13.8mmol)、四丁基溴化铵(50mg)，最后加入氢氧化钠水溶液(50％，1.25cm³)。将所得混合物在室温搅拌2小时。然后再加入氢氧化钠水溶液(50％，1.25cm³)和碘甲烷(1.96g，13.8mmol)。在室温将所得混合物再搅拌3小时，然后加入第三份氢氧化钠水溶液(50％，1.25cm³)和碘甲烷(1.96g，13.8mmol)，将所得混合物再搅拌18小时。所得粘稠的悬浮液用水(3x75cm³)洗，收集甲苯萃取物。将所述水洗物用二氯甲烷(3x50cm³)萃取，所得萃取物与甲苯合并，经硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到深紫色固体。残余物用柱色谱纯化(SiO₂，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶3，以二氯甲烷溶液形式加载)，得到标题化合物产物(0.12g，40％)，其为淡紫色固体；v_max(KBr)/cm^-1：2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)：2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)：170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)。

合成7

N，N，N′，N′-四甲基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(盐酸)(B3)

将1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(0.5g，1.84mmol)溶解在盐酸水溶液(5N，15cm³)中，将所得溶液加热至回流温度并搅拌30分钟。浓缩反应混合物，得到标题化合物，为绿/蓝色固体；δ_H(250MHz；D₂O)：3.18(12H，s，NCH₃)，6.67(2H，d，J 8.5，ArH)，7.16(4H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；D₂O)：144.3(ArC)，138.9(ArC)，122.4(ArC)，120.8(ArC)，120.7(ArC)，117.6(ArC)，48.9(NCH₃)。

合成8

甲基硫堇鎓碘化物

向圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物(MTC，次甲蓝)(2g，6.25mmol)和水(50cm³)，将所得混合物搅拌10分钟，或搅拌直到固体溶解。然后向所述混合物中加入碘化钾(1.56g，9.4mmol)，形成黑绿色悬浮液。将反应加热到沸腾，然后自然冷却得到标题化合物(2.03g，79％)，为亮绿色针状物。分析：C₁₆H₁₈N₃SI的计算值：C，46.72；H，4.41；N，10.22；S，7.80；I，30.85。实测值：C，46.30；H，4.21；N，10.14；S，7.86；I，29.34。

合成9

N，N，N′，N′-四甲基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(氢碘酸)(B6)

向圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓碘化物(2g，4.86mmol)、乙醇(100cm³)和碘乙烷(75.8g，486mmol)，将所得混合物加热回流18小时，其间颜色发生变化，从绿/蓝色变为棕色，并伴有黄色沉淀物出现。一经冷却到室温就将混合物过滤，用乙醚(20cm³)洗涤，得到标题化合物(1.99g，76％)，为淡绿色固体。δ_H(250MHz；D₂O)：3.20(12H，s，NCH₃)，6.76(2H，d，J 8.5，ArH)，7.22(2H，brds，ArH)；δ_C(62.9MHz；D₂O)：145.0(ArC)，139.3(ArC)，122.6(ArC)，121.1(ArC)，120.9(ArC)，117.9(ArC)，48.9(NCH₃)。

合成10

1-(3，7-双-二乙基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

向干燥的25cm³圆底烧瓶中加入乙基锍氯化锌(0.5g，1.13mmol)和乙醇(10cm³)。然后在氮气气氛下滴加苯肼(0.134g，1.24mmol)。将所得混合物在25℃搅拌1小时，高真空浓缩。然后加入吡啶(50cm³)和醋酸酐，将所得混合物在60℃搅拌18小时。将所得溶液倒入冰/水(250cm³)中，将有机物萃取到乙酸乙酯(3x50cm³)中。所述萃取物用饱和硫酸铜溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤浓缩，得到棕色油状的粗品。将粗品用快速柱色谱纯化(用40％乙酸乙酯：60％石油精(40-60℃)洗脱，硅胶为40-63μ)，得到标题化合物(0.18g，41％)，其为绿色玻璃状固体。δ_H(250MHz；CDCl₃)：7.0-7.5(2H，brds，ArH)，6.64(2H，s，ArH)，6.52(2H，d，ArH)，3.35(8H，q，7，NCH₂)，2.18(3H，s，CH₃)，1.16(12H，t，7，CH₃)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)：12.5(CH₃)，22.9(CH₃)，44.6(NCH₂)，110.1(ArC)，127.4(ArC)，146.5(ArC)，170.2(C＝O)。

合成11

N，N，N′，N′-四乙基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(盐酸)

向25cm³圆底烧瓶中加入3，7-二乙基氨基-10-乙酰基-吩噻嗪(0.125g，0.33mmol)和盐酸水溶液(5M，5cm³)。将所述混合物在100℃加热2小时，然后冷却到室温，浓缩，得到标题化合物(0.11g，81％)，为黄绿色玻璃状固体。δ_H(250MHz；CD₃OD)：7.07(4H，brd，ArH)，6.65(2H，brd，ArH)，3.35(8H，brd，NCH₂)，0.97(12H，brd，CH₃)；δ_C(62.9MHz；CD₃OD)：10.8(CH₃)，55.1(NCH₂)，116.6(ArC)，120.4(ArC)，121.5(ArC)，123.6(ArC)，132.6(ArC)，144.5(ArC)。

合成12

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用甲肼/吡啶分两锅进行合成。向置于氩气气氛中的250cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(26.74mmol，10g)、乙醇(100cm³)和甲肼(58.83mmol，2.71g)。将所得混合物加热到40℃，搅拌2小时。将所得黄/绿色悬浮液冷却到5℃，氩气气氛下过滤，用乙醇(20cm³)洗涤，干燥得到淡绿色固体状的白色次甲蓝(leuco-methylene blue)。向该白色产物中加入醋酸酐(40cm³)和吡啶(10cm³)，将所得溶液在100℃加热18小时。然后将其冷却并小心倒在冰水上，同时搅拌，得到沉淀物，滤出该沉淀物，用水洗，60℃干燥2小时得到标题化合物(5.82g，66％)，为亮棕色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成13

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用甲肼/许尼希碱通过一锅法合成。氮气气氛下向5000cm³反应容器中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(0.54mol，200g)和乙腈(1000cm³)。向其中逐滴加入甲肼(1.07mol，49.36g)，滴加速度为每分钟1.5mL。混合物的温度升高到32℃，搅拌20分钟。向所得的黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(5.35mol，541g)，然后加入许尼希碱(二异丙基乙胺)(1.55mol，200g)。将混合物在90℃加热2小时。然后将冷却的混合物小心倒入分成10份、每份200cm³的冰水(2000cm³)中，同时搅拌，得到沉淀物。将所得沉淀物搅拌45分钟，过滤，用水洗(3x250cm³)。空气干燥30分钟。将所得粗品物质用热乙醇(2750cm³)重结晶，得到标题化合物(112.1g，64％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成14

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用甲肼/吡啶通过一锅法合成。在氮气气氛下向250cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(26.74mmol，10g)和乙腈(50cm³)。将甲肼(53.5mmol，2.46g)分成四等份历时30分钟加入。混合物的温度用冷水浴保持在35℃，搅拌30分钟。向所得黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(267mmol，27.3g)和吡啶(80.2mmol，6.35g)。将所得混合物在90℃加热2小时。然后将冷却的混合物分成10等份小心倒入冰水(200cm3)中，同时搅拌，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，然后滤出，用水洗(3x50cm³)并空气干燥30分钟。所得粗品物质用热乙醇(120cm³)重结晶，得到标题化合物(5.97g，68％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成15

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用硼氢化钠/吡啶通过一锅法合成。氮气气氛下向500cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(0.134mol，50g)和乙腈(250cm³)。将硼氢化钠(0.174mol，6.6g)分成4等份历时30分钟加入。混合物的温度用冷水浴保持在35℃，搅拌30分钟。向所得黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(0.535mol，55g)和吡啶(0.174mol，13.76g)。将所得混合物在90℃搅拌2小时。然后搅拌下将冷却的混合物分成10份小心倒入冰水(250cm³)中，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，滤出，用水洗(3x50cm³)，空气干燥30分钟。所得粗品物质用热乙醇(500cm³)结晶，得到标题化合物(26.7g，61％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-12910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成16

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用硼氢化钠/许尼希碱通过一锅法合成。氮气气氛下向500cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(80.2mmol，30g)和乙腈(150cm³)。将硼氢化钠(104mmol，3.94g)分成4等份历时30分钟内加入。所得混合物的温度用冷水浴保持在35℃，搅拌30分钟。向所得黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(321mmol，32.75g)和许尼希碱(二异丙基乙胺)(120mmol，15.55g)。将所得混合物在90℃加热2小时。然后搅拌下将冷却的混合物分成10等份小心倒入冰水(200cm³)中，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，过滤并用水洗(3x50cm³)，空气干燥30分钟。所得粗品物质用热乙醇结晶(300cm³)得到标题化合物(13.55g，52％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成17

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用一水合肼/吡啶通过一锅法合成。氮气气氛下向250cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(26.74mmol，10g)和乙腈(50cm³)。向其中加入一水合肼(58.8mmol，2.95g)，将所得对混合物加热回流并搅拌10分钟，然后冷却到25℃。向所得黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(424mmol，43.3g)和吡啶(124mmol，9.78g)。将所得混合物在90℃加热2小时。然后搅拌下将冷却的混合物分成10等份小心倒入冰水(100cm³)中，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，过滤，用水洗(3x50cm³)，空气干燥30分钟。将所得粗品物质用热乙醇(100cm³)结晶，得到标题化合物(4.87g，56％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成18

1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

利用一水合肼/许尼希碱通过一锅法合成。氮气气氛下向250cm³圆底烧瓶中加入甲基硫堇鎓氯化物三水合物(80.2mmol，30g)和乙腈(150cm³)。向其中加入一水合肼(176.5mmol，8.84g)，将所得混合物加热回流并搅拌10分钟，然后冷却到25℃。向所得黄/绿色悬浮液中加入醋酸酐(794mmol，81.2g)和许尼希碱(二异丙基乙胺)(232mmol，29.97g)。将所得混合物在90℃加热2小时。然后搅拌下将冷却的混合分10等份小心倒入冰水(400cm³)中，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，过滤，用水洗(3x100cm³)，空气干燥30分钟。将所得粗品物质用热乙醇(400cm³)结晶，得到标题化合物(17.15g，65％)，为浅灰色固体。Mp 137℃；v_max(KBr)/cm^-1 2910(CH)，2876(CH)，2856(CH)，2799(CH)，1659(C＝O)，1596(NO₂)，1502(NO₂)；δ_H(250MHz；CDCl₃)2.16(3H，s，CH₃)，2.93(12H，s，NCH₃)，6.59-6.62(2H，d，J 8.5，ArH)，6.69-6.71(2H，d，J 2.75，ArH)，7.08-7.47(2H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)170.3(C＝O)，148.9(ArC)，127.2(ArC)，127.1(ArC)，127.0(ArC)，110.9(ArC)，110.7(ArC)，40.7(NCH₃)，22.9(CH₃)；m/z(ES)284.2(100％，[M-OAc]⁺)，328.1(15％，[M+H]⁺)，350.1(41％，[M+Na]⁺)。

合成19

3，7-二硝基-10H-吩噻嗪

向10H-吩噻嗪(20.00g，100mmol)、二氯甲烷(100cm³)和醋酸(40cm³)的混合物中加入亚硝酸钠(20.07g，300mmol)，将所得混合物在室温搅拌10分钟。接着加入另外的醋酸(40cm³)、二氯甲烷(100cm³)和亚硝酸钠(20.07g，300mmol)。还加入120cm³醋酸以试图使粘稠的反应混合物散开。将所得混合物搅拌3小时。过滤所得悬浮液，用乙醇、水、最后再用乙醇(各100cm³)洗涤得到紫/棕色固体。将残余物在热DMF中搅拌，冷却后过滤所述二硝基产物，将所述产物用乙醇(150cm³)洗涤、干燥，得到标题化合物(24.88g，86％)，为棕色固体；v_max(KBr)/cm^-1 3331(NH)，3294(NH)，3229(NH)，3101(CH)，3067(CH)，1602(NO₂)，1558(NO₂)；δ_H(250MHz；DMSO)6.73-6.76(2H，d，J 9，ArH)，7.78(2H，s，ArH)，7.89-7.85(2H，d，J 9，ArH)。

合成20

1-(3，7-双-二乙基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮

氮气气氛下向250cm³圆底烧瓶中加入乙基锍硝酸盐一水合物(7.13mmol，3g)和乙腈(20cm³)。向其中加入一水合肼(16.4mmol，0.82g)，将所得混合物加热回流并搅拌10分钟，然后冷却到25℃。向所得棕色溶液中加入醋酸酐(114mmol，11.65g)和许尼希碱(二异丙基乙胺)(21.4mmol，2.77g)。将所得混合物在90℃加热2小时。然后在搅拌下将冷却的混合物分成10份小心倒入冰水(40cm³)中，得到沉淀物。将所述沉淀物搅拌30分钟，然后过滤，用水洗(3x25cm³)、空气干燥30分钟。将所得粗品物质用热乙醇(50cm³)结晶，得到标题化合物(1.73g，63％)，为浅灰色固体。δ_H(250MHz；CDCl₃)7.0-7.5(2H，brds，ArH)，6.64(2H，s，ArH)，6.52(2H，d，ArH)，3.35(8H，q，7，NCH₂)，2.18(3H，s，CH₃)，1.16(12H，t，7，CH₃)；δ_C(62.9MHz；CDCl₃)12.5(CH₃)，22.9(CH₃)，44.6(NCH₂)，110.1(ArC)，127.4(ArC)，146.5(ArC)，170.2(C＝O)。

合成21

N，N，N′，N′-四乙基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(盐酸)

向圆底烧瓶中加入1-(3，7-双-二乙基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(0.5g，1.30mmol)、乙醇(5cm³)和盐酸(37％，1.3cm³)，将所得溶液在80℃搅拌1小时。一经冷却到室温就将混合物浓缩，得到标题化合物(0.54g，100％)，为淡绿色玻璃状物。δ_H(250MHz；CD₃OD)7.07(4H，brd，ArH)，6.65(2H，brd，ArH)，3.35(8H，brd，NCH₂)，0.97(12H，brd，CH₃)；δ_C(62.9MHz；CD₃OD)10.8(CH₃)，55.1(NCH₂)，116.6(ArC)，120.4(ArC)，121.5(ArC)，123.6(ArC)，132.6(ArC)，144.5(ArC)。

合成22

N，N，N′，N′-四乙基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(氢溴酸)

向圆底烧瓶中加入1-(3，7-双-二乙基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(0.5g，1.30mmol)、乙醇(5cm³)和氢溴酸(48％，0.75cm³)，将所得溶液在80℃加热1小时。一经冷却到室温就将混合物浓缩，得到标题化合物(0.65g，100％)，为亮黄色玻璃状物。δ_H(250MHz；D₂O)7.05(4H，brd，ArH)，6.79(2H，brd d，ArH)，3.43(8H，brd，NCH₂)，1.05(12H，brd t，CH₃)；δ_C(62.9MHz；D₂O)12.3(CH₃)，56.2(NCH₂)，117.9(ArC)，121.4(ArC)，122.4(ArC)，124.5(ArC)，133.5(ArC)，145.1(ArC)。

合成23

N，N，N′，N′-四甲基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(盐酸)

向圆底烧瓶中加入1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(1g，3.05mmol)、乙醇(10cm³)和盐酸(37％，3cm³)，将所得溶液在80℃加热1小时。一经冷却到室温就在搅拌下向其中加入乙醚直到得到恒定浊度的溶液。经一定时间后有沉淀物生成，过滤，得到所述沉淀物，用乙醚(10cm³)洗涤得到标题化合物(0.98g，90％)，为淡绿色固体。Mp(分解)230℃；v_max(KBr)/cm^-13500-3229(NH)，3061(CH)，3021(CH)，2948(CH)，2879(CH)，2679(CH)，2601(CH)，1604(CH)，1483(CH)，1318(CH)；δ_H(250MHz；D₂O)3.18(12H，s，NCH₃)，6.67(2H，d，J 8.5，ArH)，7.16(4H，brd s，ArH)；δ_C(62.9MHz；D₂O)144.3(ArC)，138.9(ArC)，122.4(ArC)，120.8(ArC)，120.7(ArC)，117.6(ArC)，48.9(NCH₃)；m/z(ES)286.1(100％，[M-H，2Cl]⁺)，285.1(40％)，284.1(41％，[M-3H，2Cl]⁺)。

合成24

N，N，N′，N′-四甲基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(氢溴酸)

向圆底烧瓶中加入1-(3，7-双-二甲基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(1g，3.05mmol)、乙醇(10cm³)和氢溴酸(48％，4cm³)，将所得溶液在80℃加热1小时。一经冷却到室温就有沉淀物产生，过滤得到所述沉淀物，用乙醚(10cm³)洗涤得到亮芥色产物(1.22g，89％)。Mp(分解)230℃；v_max(KBr)/cm^-13500-3229(NH)，3061(CH)，3021(CH)，2948(CH)，2879(CH)，2679(CH)，2601(CH)，1604(CH)，1483(CH)，1318(CH)；δ_H(250MHz；D₂O)3.18(12H，s，NCH₃)，6.66(2H，d，J 8.75，ArH)，7.15(4H，s，ArH)；δ_C(62.9MHz；D₂O)144.3(ArC)，138.9(ArC)，122.4(ArC)，120.8(ArC)，120.7(ArC)，117.6(ArC)，48.9(NCH₃)。

合成25

N，N，N′，N′-四乙基-10H-吩噻嗪-3，7-二胺双(氢溴酸)

向圆底烧瓶中加入1-(3，7-双-二乙基氨基-吩噻嗪-10-基)-乙酮(1.0g，2.60mmol)、甲醇(10cm³)和氢溴酸(48％，2.94cm³)，将所得溶液在80℃加热1小时。一经冷却到5℃就向混合物中加入乙醚，得到混浊溶液。将所述浑浊溶液搅拌30分钟得到标题化合物(0.83g，63％)，为浅黄色固体。δ_H(250MHz；D₂O)7.05(4H，brd，ArH)，6.79(2H，brd d，ArH)，3.43(8H，brd，NCH₂)，1.05(12H，brd t，CH₃)；δ_C(62.9MHz；D₂O)12.3(CH₃)，56.2(NCH₂)，117.9(ArC)，121.4(ArC)，122.4(ArC)，124.5(ArC)，133.5(ArC)，145.1(ArC)。

实施例10-其它认知障碍或CNS障碍

本发明利用氧化或还原形式的DAPTZ化合物的治疗、预防、诊断或预后方法可以在任一方面适用于下列疾病中的任一种或多种。

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实施例11-标准溶出试验

题目：对于包含DAPTZ的胶囊模拟肠液溶出。

实施者：Encap Drug Delivery，Units 4，5 & 6，Oakbank Park Way，Livingston，West Lothian，EH53 0TH，Scotland，UK.

1.目的

该方法适于用作溶出试验方法，以提供数据用于确定包含DAPTZ的剂量单位在溶出媒介物模拟肠液(simulated intestinal fluid，SIF)中随时间的溶出百分数，所述模拟肠液在USP(http://www.usp.org)中有说明。

以Gelucire 44/14配制成的30mg、60mg和100mg MTC胶囊为例说明该方法，采用标准USP<711>“溶出，装置2”(搅拌桨(paddle)和溶出杯(sinker))。在下面的有关部分，可用备选的DAPTZ化合物以合适的载量代替MTC。

2.方法条件

2.1.试剂

水-实验室等级或相当等级

正磷酸二氢钾-实验室等级或相当等级

氢氧化钠-实验室等级或相当等级

胰酶-USP等级

盐酸-实验室等级或相当等级

2.2.安全性

试剂是可能刺激性的和可能有害的。

2.3.溶出条件

溶出装置

装置-USP<711>溶出，装置2(搅拌桨和溶出杯)

样品-1个置于溶出杯中的胶囊

转速-75rpm

温度-37℃±0.5℃

溶出媒介物-1000ml模拟肠液

取样时间-15、30、45、60分钟

试验持续时间-60分钟

样品大小-5ml(未更换)(不要过滤)

UV分光光度计条件

测定波长-665nm

参照-稀SIF

路径长度-10mm

带宽-2.0nm

2.4.制备模拟肠液(SIF)

对于所需的每升SIF，将6.8g正磷酸二氢钾溶于250ml水中，混合并添加77ml的0.2N氢氧化钠和500ml水。添加10.0g胰酶预混剂(USP)，用0.2N氢氧化钠或0.2N盐酸将所得溶液的pH调至6.8±0.1。用水稀释至1000ml。

该溶液必须每天新鲜配制。

2.5.标准溶液(一式两份制备)

精确称量约100mg的MTC，加至100ml容量瓶中。借助15分钟超声将其溶于80ml的50/50乙醇水溶液中，然后用50/50乙醇水溶液定容并混合均匀(1000μg/ml)。将5.0ml的该溶液转移至100ml容量瓶中，用SIF定容并混合均匀(50μg/ml)。从所得溶液中移取4.0ml加至100ml容量瓶中，用水定容并混合均匀(2.0μg/ml)。得到的溶液即为标准溶液。

2.6.溶出步骤

在6个溶出容器中各添加1000ml模拟肠液。插入以正确转速旋转的搅拌桨，使液体平衡至37℃±0.5℃。在6个不锈钢溶出杯中分别放置1个胶囊，在每个溶出容器中加入1个溶出杯，同时记录时间。

在各规定的时间点取样5ml。

2.7制备本底对照

将4.0ml的SIF转移至100ml容量瓶中，用水定容并混合均匀。该溶液用作UV分光光度计中的本底对照。

2.8样品制备

对于30mg胶囊，将3.0ml的该溶液转移至50ml容量瓶中，用水定容并混合均匀(1.8μg/ml)。

对于60mg胶囊，将3.0ml的该溶液转移至100ml容量瓶中，用水定容并混合均匀(1.8μg/ml)。

对于100mg胶囊，将1ml的该溶液转移至50ml容量瓶中，用水定容并混合均匀(2.0μg/ml)。

这些是样品溶液。

2.9.步骤

开启UV分光光度计并使其温热至工作温度，测定标准溶液和样品溶液。

2.10标准检定

检定两个标准溶液的平均响应因子。标准2必须检定为标准1的98～102％。

2.11计算

所有的计算进行至小数点后两位。

利用合适的公式，求出各样品相对于参照标准的MTC释出百分数：

100mg胶囊的％＝A_样品/A_标准×W_标准/(100mg)×P×100

60mg胶囊的％＝A_样品/A_标准×W_标准/(60mg)×2/3×P×100

30mg胶囊的％＝A_样品/A_标准×W_标准/(30mg)×1/3×P×100

A_样品是单个样品在665nm的MTC吸光度。

A_标准是两个标准在665nm的平均MTC吸光度。

W_标准是所用的MTC标准的平均重量(mg)。

P是所用的参考标准的纯度，记为小数(例如0.999)。

(当输入物质用作标准时，应用校正因子1作为P)

在一张图上用MTC释出百分数对溶出时间作图，各容器单独作图。

在一张图上将所有6个容器的平均MTC释出百分数与溶出时间作图。

因此，通常可使用下面的公式。

x mg胶囊的释出百分数＝A_样品/A_标准×W_标准/(x)×d×P×100

本领域的技术人员会理解，‘d’是对于样品制备(如上述步骤2.8)中的稀释的校正(如果需要的话)。

2.12模拟胃液(SGF)的标准试验

该标准试验如上所述进行，但是用SGF代替SIF。SGF根据USP29制备如下：

模拟胃液，TS-将2.0g氯化钠和3.2g经纯化的胃蛋白酶(其源自猪的胃黏膜，活性800～2500单位/毫克蛋白质)溶于7.0mL盐酸和充足的水中以形成1000mL溶液。[胃蛋白酶活性描述于Food Chemicals Codex规定的GeneralTests andAssays下]。该试验溶液的pH为约1.2。

实施例12-阿尔茨海默病的进展和治疗的定量模型

阿尔茨海默病背后的化学过程是τ蛋白的聚集和截短。在本实施例中，我们使用τ蛋白反应路径的动力学模型，以描述该疾病的进展和治疗效果，以及比较靶向所述路径的不同部分的治疗的有效性。

1.平衡模型的公式表述

图37A显示τ蛋白与截短的τ蛋白的聚集体结合，然后τ蛋白被截短而形成更大的聚集体。在细胞内该反应被嵌入一个更大的路径中，所述更大的路径包括产生新的τ蛋白的通道和清除聚集体的通道。

图37B显示了一个自然模型。此处，S表示可溶τ蛋白的量，而A表示聚集的截短的τ蛋白的量。为了产生动力学模型，我们需要确定速率。已知的是τ蛋白的聚集速率随S的可用性和A的可用性而增大[Wischik，C.M.，Edwards，P.C.，Lai，R.Y.K.，Roth，M.& Harrington，C.R.(1996)Selectiveinhibition of Alzheimer disease-like tau aggregation by phenothiazines.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 93，11213-11218]。人们自然会假定在S的形成中涉及某种反馈机制，因此S的产生速率取决于S的量[Lai，R.Y.K.，Gertz，H.-J.，Wischik，D.J.，Xuereb，J.H.，Mukaetova-Ladinska，E.B.，Harrington，C.R.，Edwards，P.C.，Mena，R.，Paykel，E.S.，Brayne，C.，Huppert，F.A.，Roth，M.& Wischik，C.M.(1995)Examination of phosphorylatedtau protein as a PHF-precursor at early stage Alzheimer′s disease.Neurobiologyof Aging 16，433-445]。对于所示的其它路径，我们将进行标准动力学假定，即反应速率与反应物的量成比例。

这给了我们如图37C中所示的动力学模型。我们通过该图表达这样的意思：例如，若S(t)是在时间t时可溶的τ蛋白的量，则

d/dt S(t)＝λ(S(t))-k_S0S(t)-kA(t)S(t)    [方程1]

疾病进展的时间量程和动力学的时间量程

该模型的一个重要方面是阿尔茨海默病进展的时间量程，及其与方程1等方程起作用的时间量程(time scale over which equations like equation 1operate)的关系。我们认为动力学等式的动力学的发生历时以小时或天计，而疾病的进展是由于k_A0等参数以年为时间量程的缓慢变化导致的。然而Wischik等人(1995)采用了相反的观点，即动力学的时间量程按年计，而疾病的进展反映的是动力学模拟的A(t)的逐渐增长。

存在两条支持疾病进展的时间量程与动力学的时间量程分离的主要证据。第一条证据是，将可溶τ蛋白与固相截短的τ蛋白温育的体外实验[WO96/30766]表明多数可溶τ蛋白在几小时内发生了结合。第二条证据来自表达了人截短τ蛋白的转基因小鼠的体内实验[WO 02/059150]。这些小鼠经过几个月缓慢表现出阿尔茨海默病τ蛋白病理学，如认知试验和神经病理学检查所测量的[Zabke，C.，Dietze，S.，Stamer，K.，Rickard，J.E.，Harrington，C.R.，Theuring，F.，Seng，K.M.& Wischik，C.W.(2008)Early and advanced stages oftau aggregation In transgenic mouse models.International Conference onAlzheimer′s Disease，Chicago，26-31 July 2008，P1-054]。当在17天时间内每日口服MTC进行治疗时，阿尔茨海默病病理学减少[Harrington，C.，Rickard，J.E.，Horsley，D.，Harrington，K.A.，Hindley，K.P.，Riedel，G.，Theuring，F.，Seng，K.M.& Wischik，C.M.(2008)Methylthioninium chloride(MTC)acts as a tauaggregation inhibitor(TAI)in a cellular model and reverses tau pathology intransgenic mice models of Alzheimer’s disease.International Conference onAlzheimer′s Disease，Chicago，26-31 July 2008，O1-06-04]。因此，动力学的时间量程是以天为量级，而所述疾病进展的时间量程要长得多，在这些小鼠中是数以月计。

因此，我们的数学方法必须是这样：我们假设任何患者都具有取决于其患病时间有多长的速率常数，如k_A0(a)等，其中a是发作以来的年数；并且我们假设所得的S和A的水平是该动力学系统的平衡值。具体而言，我们需要解如下列方程1的改进形式的方程：

λ(S)-k_S0S-kAS＝0.[方程2]

我们省去了t，因为我们对系统的动力学不感兴趣，而只对平衡行为感兴趣。我们有时会记下S(a)等，以强调对速率常数值的依赖性。

新聚集体的生成的解释

聚集反应(图37A)始于一个聚集体分子而终于一个聚集体分子，因此它描述了已有聚集体的生长而不是新的聚集体的生成。类似地，在动力学系统(图37C)中，如果我们不对聚集体的生成进行模拟，则A的集合将稳步下降，这意味着平衡解为A＝0。

解释新聚集体的生成的最简单方法是通过改变聚集反应的化学计量。具体而言，我们将假定图37D中所示的方案(尽管n₁和n₂的实际值未知)。

例如，若n₁＝2.3且n₂＝1.87，则自230个τ蛋白分子和100个聚集体分子，产生了87个新的聚集体分子。

模型的总结

我们已经提出了图37E中所示的动力学系统模型。

该系统的平衡态的等式是：

λ(S)＝k_S0S+n₁kAS      [方程3]

n₂kAS＝kAS+k_A0(α)A    [方程4]

在该实施例的其余部分，我们描述了几个实验，这些实验使我们能量化速率常数，从而能预测治疗效果。

2.疾病进展的定量法

Lai等人(1995)进行了多例阿尔茨海默病患者的死后研究，发现了A与S之间的关系：

S＝f(A)＝α/A^β-1    [方程5]

其中α＝2450，β＝0.3459。

Mukaetova-Ladinska等人(Mukaetova-Ladinska，E.B.，Garcia-Siera，F.，Hurt，J.，Gertz，H.J.，Xuereb，J.H.，Hills，R.，Brayne，C.，Huppert，F.A.，Paykel，E.S.，McGee，M.，Jakes，R.，Honer，W.G.，Harrington，C.R.& Wischik，C.M.(2000)Staging of cytoskeletal and β-amyloid changes in human isocortex revealsbiphasic synaptic protein response during progression of Alzheimer’s disease.American Journal of Pathology 157，623-636)进行了多例阿尔茨海默病患者的死前和死后研究，发现PHF水平与患者的Braak期B之间关系：

PHF＝g(B)＝Exp(γB/(δ-B))-1    [方程1]

其中，γ＝4.8383，δ＝9.8156。

可合理假定PHF水平与τ蛋白聚集水平成比例：

A＝εPHF  [方程2]

尽管ε是未知的。

Ohm等人[Ohm，T.G.，Müller，H.，Braak，H.& Bohl，J.(1995)Close-meshed prevalence rates of different stages as a tool to uncover the rate ofAlzheimer′s disease-related neurofibrillary changes.Neuroscience 64，209-217]研究了Braak期在人群中的分布，在附录中我们描述了根据他的数据我们如何能够得到平均Braak期B与痴呆发作以来的时间a(按年计)之间的关系：

B＝h(a)＝***    [方程8]

利用这3个关系，我们可以改写平衡方程3-4得到：

λ(S)＝k_S0S+n₁kf^-1(S)S         [方程9]

k_A0(a)＝(n₂-1)kf(εg(h(a)))    [方程10]

3.对药效的量化

WO 02/055720描述了阿尔茨海默病的一种细胞模型，以及说明MTC对A的水平的影响的量度。所述细胞经过了基因修饰从而以恒定的速率产生可溶的τ蛋白S。这自身不会自发形成聚集体，因此已对这些细胞进一步修饰使其以恒定的速率产生截短的τ蛋白T。我们假定这些细胞具有消灭T的正常机制，并假定药物的作用是开启一种使A溶解并转化为T的路径。简单起见，我们假定此处S仅被用在阿尔茨海默病的途径中。因此，我们得到图37F中所示的动力学模型。

我们记下k_AT(d)以强调该速率常数依赖于剂量水平d，并且我们假定k_AT(0)＝0。我们应该严格地记下k_A0(a_细胞)，其中a_细胞是对于这些细胞而言自疾病发作以来的时间(按年计)，尽管我们将会在我们的方程中消除(suppress)该项。

该系统的平衡方程为：

λ＝kASn₁    [方程11]

μ+k_AT(d)A＝T(k_T0+k_TA)    [方程12]

k_TAT+n₂kAS＝kAS+A(k_AT(d)+k_A0)  [方程13]

利用方程11和12，我们可从方程12中消去S和T得到：

A＝[(n₂-1)/n₁λ+k_TA/(k_T0+k_TA)μ]/[k_A0+k_AT(d)k_T0/(k_T0+k_TA)]

若将不存在任何药物的情况下τ蛋白聚集体的基线水平记为A(0)，则：

A(0)＝[(n₂-1)/n₁λ+k_TA/(k_T0+k_TA)μ]/k_A0

方便地使这两方程相消告诉我们：

k_AT(d)/k_A0＝(1+k_TA/k_T0)(A(0)/A(d)-1)

(我们在此记下A(d)，以强调观察的聚集体水平A是剂量d的函数)。

WO 02/055720报道了：

A(d)/A(0)＝g(d)＝ζd^θ/(η^θ+d^θ)+1    [方程14]

其中ζ＝-1.0665，η＝51.735和θ＝1.3328。

4.对总的效果的量化

现在我们要问：我们如何预期药物改变疾病的进展？我们的动力学模型现在是在图37G中所示的模型，其具有平衡方程：

λ(S)＝k_S0S+n₁kAS    [方程15]

k_AT(d)A＝T(k_T0+k_TA)  [方程16]

k_TAT+n₂kAS＝kAS+A(k_AT(d)+k_A0(a))  [方程17]

我们希望针对A＝A(a，d)解这些方程。为此，最方便的是利用方程16将T以A表示：

T＝Ak_AT(d)/(k_T0+k_TA)

然后代入17以得到S＝S(a，d)的表达式

(n₂-1)kS(a，d)＝k_A0(a)+k_AT(d)k_T0/(k_T0+k_TA)

最后利用方程15和9将该式转化为A(a，d)的表达式

A(a，d)＝f^-1(S(a，d))    [方程18]

S(a，d)的表达式可更有用地写成含S(a₀，0)的比，其中a₀是开始接受治疗时距疾病发作的时间。我们还将针对k_A0(a)和k_AT(d)得到的表达式代入，得到：

S(a，d)/S(a₀，0)＝k_A0(a)/k_A0(a₀)+k_A0(a_细胞)/k_A0(a₀)(1/g(d)-1)    [方程19]

g(d)的公式在上面的方程14中给出，f的公式在上面的方程8中给出，k_A0(a)的公式在上面的方程9中给出。

对结果的解释

如果我们使d＝0，则方程19给出：

S(a，0)/S(a₀，0)＝k_A0(a)/k_A0(a₀)

随着a增大，聚集体被清除的路径退化，且k_A0(a)下降趋向0；从而S(a，0)下降趋向0，并且根据方程18，A增至无穷大。通过以某种固定剂量给药治疗，我们阻止S降至低于某一阈值：

S_阈值＝k_A0(a_细胞)/k_A0(a₀)(1/g(d)-1)

这是指我们阻止A增至某一阈值f^-1(S_阈值)之上。简而言之，该治疗不仅仅延缓所述疾病的进展，而且还使所述疾病的进展停止。

5.可供选择的治疗模型

已经有人提出，可通过抑制τ蛋白之间的结合反应等方法来治疗阿尔茨海默病等疾病(Wischik，C.M.，Edwards，P.C.，Lai，R.Y.K.，Roth，M.&Harrington，C.R.(1996)Selective inhibition of Alzheimer disease-like tauaggregation by phenothiazines.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 93，11213-11218)。该治疗对疾病的进展的效果如何呢？考虑图37H中所示的动力学模型，其中k(d)是在反应通过剂量d的该假定药物得到抑制之后速率常数的值。平衡方程有：

λ(S)＝k_S0S+n₁k(d)AS

n₂k(d)AS＝k(d)AS+Ak_A0(a)

解这些方程，并代入方程8中，我们得到：

S(a，d)/S(a₀，0)＝[k_A0(a)/k_A0(a₀)]/[k(d)/k(0)]

A(a，d)＝f^-1(S(a，d))/[k(d)/k(0)]

可看出：对于任何固定的剂量d，S(a，d)的水平随时间a的增大降至0。因此，A的水平增至无穷大。简而言之，纯粹基于对τ蛋白之间的结合反应的抑制的治疗会延缓该疾病的进展，但是不能阻止疾病。

6.数值结果

图37I以数值方式示出了这些结果。左边曲线说明药物的作用，所述药物如小节3中所述产生了新的路径A→T；左边曲线说明药物的作用，其如小节错误！未找到引用源。中所述抑制了路径S+A→A。我们不对τ蛋白聚集体水平A作图，而是利用根据Ohm等人(1995)的数据得到的MMSE与Braak期B之间的关系对MMSE作图。

MMSE＝σ(τ-B)/(ρ-B)

其中σ＝56.2204，τ＝6.5969，ρ＝11.599，以及方程6和7中的关系，并设定ε＝1。对于在MMSE＝15时开始接受治疗的患者，我们将其作为治疗开始以来的年数(number of years since the beginning of treatment)的函数来作图。图37中的虚线表示没有治疗的情况下MMSE变差；其它线表示在不同剂量水平下的治疗效果。此处我们图示的剂量水平是(对于左边曲线)d＝25、50和90；以及(对于右边曲线)k(d)/k0)＝45％、20％、7％。

7.τ蛋白聚集体的清除对疾病进展的影响

这些图(图37I)说明了我们已经在代数上解释的内容，也就是，抑制τ-τ聚集只能延缓疾病的进展，而通过开启溶解聚集体的新途径可阻止疾病的进展。这可示意于图39中。τ蛋白聚集可通过影响两处得到阻止：第一通过抑制τ蛋白向聚集循环的输入，以及第二通过提高聚集体从聚集循环中的清除(图39)。聚集的τ蛋白或双股螺旋形细丝的水平随着年龄的增长而稳步地发展。如果τ蛋白的输入得到阻止，那么PHF的水平将会降至某一水平，其通过Braak分期来预测，此后进展速率又恢复到以前水平。只有当提高了对聚集的τ蛋白的清除，它们的τ蛋白水平才会开始随时间下降(图39)。在这种情况下，可以认为具有这样作用的药物是疾病缓解性的。Wischik等人已经讨论了(Wischik，C.M.，Lai，R.Y.K.& Harrington，C.R.(1997)Modellingprion-like processing of tau protein in Alzheimer’s disease for pharmaceuticaldevelopment.In Microtubule-Associated Proteins：Modifications in Disease.(Eds.J.Avila，R.Brandt，& K.S.Kosik)Harwood Academic Publishers，Amsterdam，185-241)与年老相关的线粒体更新所产生的蛋白质(例如复合体III的核心蛋白2，孔蛋白和ATP合成酶亚基9)可能充当τ蛋白聚集的种子。这些τ蛋白聚集体可组装成PHF和/或进入核内质-溶酶体清除通路，增添该通路随年龄增长的拥堵(图40)。τ蛋白聚集体从该通路中清除的提高将减轻神经元内部的代谢负担。该实施例说明了这能阻止所述疾病的进展，而不仅仅是延缓其进展。