改良的紫杉烷递送系统.pdf

实施本发明的方式

本发明提供改善了紫杉烷递送性质的组合物，其中紫杉烷配制成通过乙醇酸连接疏水基团的前药。因为可以通过操控疏水基团的性质、以及操控胶束或纳米颗粒的组分来控制制剂的药代动力学，可以获得所需的药物递送特性。这些药代动力学可用于匹配含有其他抗肿瘤剂的制剂的药代动力学，以便有机会提供协调药物递送的改良系统，其中递送到肿瘤的抗肿瘤剂和紫杉烷药物比例维持在与给药时基本相同的水平。所以，联合使用改良的紫杉烷制剂和相容的一种或多种附加抗肿瘤剂的制剂可以将体外测定的协同比保持在一个小到1.5或2的系数范围。当然，这些制剂可以用于治疗癌症和其他过度增殖病症。可以通过测定药剂在血液或血浆中随时间变化的水平，来检测这一比例的维持。在至少1小时或4小时或甚至24小时内，该协调组合物能将血液或血浆中测得的给药比例维持在前述范围内。

如上文所提到的，本发明组合物中携带紫杉烷前药的纳米颗粒或胶束组分，是由脂质和/或两性稳定剂组成的。

如本发明所用，“紫杉烷”指由紫杉醇及其类似物组成的一类药物。紫杉醇最初来源于紫杉树，其类似物包括多烯紫衫醇和相似结构的其他化合物。泰素(泰素^TM)是紫杉醇与克列莫佛(Cremophor^TM)配制的一种商品化制剂。

形成前药一部分的“疏水基团”通常为能通过乙醇酸连接与紫杉烷结合的高分子量醇。醇可以是6个或更多碳的直链醇、支链醇、或环醇，通常为6-30个碳，或在一些实施方式中为6-20个碳。还可以为类固醇例如胆固醇，或生育酚例如维生素E和相关部分。

在本发明的纳米颗粒组合物中与前药相结合的脂质典型地有磷脂，例如二硬脂酰磷酯酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、和相应的磷脂酰乙醇、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油等等。脂肪酸链也可以是不饱和的，包括例如油酸和亚油酸。脂肪酸不必是相同的。此外，脂质部分可为鞘氨醇例如鞘磷脂或其本身，生育酚酯例如维生素E琥珀酸酯和维生素E己二酸酯。

两性稳定剂是含有亲水部分和疏水部分的多聚化合物。代表性的疏水多聚物包括聚苯乙烯和疏水的聚甲基丙烯酸酯衍生物以及聚乙烯衍生物。代表性的亲水组分包括聚乙二醇和疏水聚合物的亲水衍生物，以及右旋糖苷和右旋糖苷衍生物和多聚氨基酸。该列表只是列举而不是穷举。通常，两性稳定剂的分子量大于约500，但可以有更高的分子量1,000-50,000克/摩尔。

下面的实施例中，描述了设计用于配制在亲脂纳米颗粒中的一系列紫杉醇前药。通过用琥珀酸或二乙醇酸交联剂把一系列疏水性提高的脂质锚定物连接到药物上，提高了紫杉醇的疏水性。紫杉醇本身在水中几乎不溶解，而它的水溶性足够高，能够从脂基递送系统中很快的分配出来，通常半衰期为约数分钟。本发明控制配制的药物在体内的药代动力学，使其功效最大化。将前药配制在良好限定的嵌段共聚物稳定化的纳米颗粒中。这些纳米颗粒在体内的消除半衰期约为24小时。通过调节脂质锚定物的疏水性，可以控制前药从纳米颗粒释放的速率，获得1-24小时的释放速率。

纳米颗粒制剂可以在4℃稳定保存数月。

为了评估各种紫杉醇前药的疗效，向带有HT29人结肠异种移植肿瘤的小鼠静脉内给予纳米颗粒制剂。由于前药的血浆半衰期和曲线下面积增加，抗HT29肿瘤的活力也提高了。当都用泰素的最佳治疗方案和最大耐受剂量(MTD)进行治疗时，紫杉醇前药纳米颗粒作用下HT29肿瘤达到400mg的时间是泰素作用下的时间的2倍以上。

这种纳米颗粒制剂在体内通常可能是通过单个聚合物链随着时间从颗粒中分离出来进行清除的。稳定剂组分的逐渐丢失使得颗粒不稳定，会导致任何还没有被分离出来的有效载荷被消除。药物/稳定剂比例高的颗粒清除很快，因为相对少量的聚合物丢失就会使颗粒的核心暴露出来与蛋白相互作用。药物/稳定剂比例低的颗粒对于丢失聚合物的耐受性更高，并且存留时间长到足以通过体内的其他机制来进行清除。所以，一个理想的递送系统应该为接近胶束尺寸、药物/聚合物比例相对低、优选含有分离速率低的稳定剂。

带有疏水性不同的脂质锚定物的前药从同样的颗粒组合物分离的速率不同。在这些纳米颗粒中，药物理化特性更多地表明药物从运载体上的释放，而不是运载体本身降解。这一行为导致例如泰素和纳米颗粒中的紫杉醇前药之间存在显著差异。注射后紫杉醇从克列莫佛胶束中快速分离出来，并广泛分布在血液区室中所遇的亲脂池(lipophilic sink)内。在消除前，随着时间推移药物重新分配到到血液区室中。前药纳米颗粒不出现这一早期分布期，而是随着时间持续释放药物，其速率取决于前药组分的分离速率。如下文所示，前药分离速率与功效直接相关，并且该速率可以通过改变前药的脂质锚定物(并从而改变疏水性)来进行调节。

功效对于分离速率的依赖性，可以根据纳米颗粒在肿瘤中积聚后前药的逐步释放来进行合理化调整。能够快速释放有效载荷或能从循环中快速清除的纳米颗粒，递送到肿瘤部位的药物较少，从而预计其功效下降。

本发明的组合物还可以包含附加抗肿瘤剂。因为在本发明的组合物中可以控制紫杉烷前药的药代动力学，可以在类似的组合物中或是在另一可选制剂中为附加抗肿瘤剂提供相似的药代动力学特性，并与本发明的组合物混合或者同时给予对象。因此，附加抗肿瘤剂可以配制在用于模拟紫杉烷药代动力学的脂质体、胶束、可选纳米颗粒、或其他组合物中。合适的抗肿瘤剂多种多样，并为本领域所熟知，例如包括蒽环类抗生素如柔红霉素和阿霉素，含铂药物如卡铂和顺铂，包含依立替康及其类似物的家族，氟嘧啶类，以及各种其他常用药剂例如甲氨喋呤。用于模拟紫杉烷制剂的药代动力学的附加抗肿瘤剂的制剂(或药剂)可以与前述紫杉烷制剂混合，或者作为单独组合物基本同时给予。

在一个实施方式中，紫杉烷前药可以与如阿霉素等水溶性药剂的疏水前药类似物配制在一起，并且在注射后较长时间内双药纳米颗粒能保持血浆内两种药剂的注射药物：药物比例。在纳米颗粒中配制疏水前药提供了一个新方向，来共同递送理化性质差异很大的抗癌药物组合，并且在体内维持最佳药物：药物比例。

本发明的组合物可以通过任何合适的途径进行给予，优选肠胃外给予。待治疗的对象包括人类，其他高等动物，和实验室模型，例如小鼠和大鼠。

下列实施例只用于进行说明，而不用于限制本发明的范围。

实施例

缩写：VES，维生素E琥珀酸酯；POPC，1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱；CVIJ，封闭体积碰撞射流；2kPS3k，聚(乙二醇)₂₀₀₀-b-聚苯乙烯₃₀₀₀；2.5kPS3k，聚(乙二醇)₂₅₀₀-b-聚苯乙烯₃₀₀₀；³H-CHE，氚标记的胆固醇十六烷基醚；TLC，薄层层析；DIPC，二异丙基碳二亚胺；DMAP，N，N-4-二甲氨基吡啶。

材料：除非特别指出，所有的试剂都购自安大略省奥克维尔的加拿大西格玛奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville，ON)。溶剂从安大略省米西索加的VWR公司(VWR International，Mississauga，ON)获得。紫杉醇购自意大利米兰的英第爱娜公司(Indena S.p.A.，Milan，Italy)。³H-CHE从沃尔瑟姆的珀金埃尔默生物和分析科学公司(Perkin Elmer Life and AnalyticalSciences Inc.，Waltham，MA)获得。POPC获自伯纳比的北方油脂公司(NorthernLipids，Burnaby，BC)。在Bruker Advance 400核磁共振仪上用CDCl₃记录¹HNMR光谱。HT-29人结肠腺癌细胞获自弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC(ATCC，Manassas，VA.)。Foxn1^nu小鼠获自印第安纳州印第安纳波利斯的哈兰公司(Harlan，Indianapolis，IN.)。封闭体积碰撞射流混合器由普林斯顿大学定制。所有的动物实验都根据英国哥伦比亚大学的动物保护委员会批准的方法进行，并且符合加拿大动物保护理事会建立的当前指导规范。

实施例1

前药的合成

各种通常可用的脂醇可以用作锚定组分(方案1)，包括α-生育酚(1和3)、油醇(2和4)、十八烷醇(5)、二十烷醇(6)、二十二烷醇(7)、胆固醇(8)和1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(9)。先是用相应的环酐进行处理，然后在N，N-4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在时用二异丙基碳二亚胺(DIPC)使锚定物-连接体与紫杉醇缩合，从而使脂质与交联剂偶联。琥珀酸(1-2)和二乙醇酸(3-9)作为交联剂。相对于琥珀酸酯类似物，后者的3-oxa部分能够提高交联剂的2’-酰基基团对水解的易感性。

方案1.亲脂紫杉醇前药的合成

通过利用紫杉醇2’-和7-羟基基团之间反应速率的差异，可以选择性地制备2’-酰基紫杉醇衍生物。TLC监测显示，在本发明所用的反应条件下，在显著水平的2’，7-二酰基产物产生之前，大多数的紫杉醇已经被消耗掉了。采用柱层析去除未反应的紫杉醇、2’，7-二酰基产物和未加工的反应混合物中的其他杂质。分别用HPLC和NMR分析来确认终产物的纯度和同一性。

为了合成脂质锚定物，用3个当量的琥珀酸酐或二乙醇酸酐在室温下过夜处理吡啶中的脂醇。用旋转蒸发器去除溶剂，用二氯甲烷从稀盐酸中萃取残余物。有机馏分用无水硫酸镁干燥，过滤并去除溶剂。用TLC监测向合适的酸的转化，多数情况下为100％。获得的产物可以真空干燥或者从苯中冻干。脂酸可以在后续步骤中使用而不需要进一步纯化。

为了合成紫杉醇偶联物，紫杉醇(1个当量)、脂酸(2个当量)和4-N，N-二甲氨基吡啶(3个当量)溶解在不含醇的氯仿中。然后加入二异丙基碳二亚胺(1.3个当量)，在室温下搅拌溶液。用TLC监测反应直至消耗掉大多数紫杉醇(通常2-4小时)。然后用稀盐酸洗涤反应混合物，并用无水硫酸镁进行干燥。在去除了溶剂之后，用甲醇/氯仿梯度使粗产物通过硅胶柱，从苯中冻干纯化的前药，然后室温保存。

制备的化合物为

2’-O-(4”-O-生育酚琥珀酰)-紫杉醇1.由紫杉醇和生育酚琥珀酸酯合成。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝7.25Hz)；4.22(1H，d，J＝8.60Hz)；4.33(1H，d，J＝8.60Hz)；4.46(1H，dd，J＝10.88Hz，J′＝6.58Hz)；4.99(1H，d，J＝9.54Hz)；5.52(1H，d；J＝3.22Hz)；5.70(1H，d，J＝6.98Hz)；5.98(1H，dd，J＝9.13Hz，J′＝3.22Hz)；6.27(1H，t，J＝8.6Hz)；6.97(1H，d，J＝8.87Hz)。

2’-O-(4”-O-油酰琥珀酰)-紫杉醇2.由紫杉醇和油酰琥珀酸酯合成。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ3.82(1H，d，J＝7.0Hz)；3.96(2H，t，J＝6.81Hz)；4.21(1H，d，J＝8.38Hz)；4.33(1H，d，J＝8.38Hz)；4.46(1H，br，s)；4.98(1H，d，J＝8.45Hz)；5.36(2H，m)；5.50(1H，d，J＝2.89Hz)；5.69(1H，d，J＝7.00Hz)；6.00(1H，dd，J＝9.04Hz，J′＝2.74Hz)；6.26(1H，t，J＝8.91Hz)；7.08(1H，d，J＝9.06Hz)。

2’-O-(5”-O-生育酚二乙醇酰)-紫杉醇3.由紫杉醇和生育酚二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.84(1H，d，J＝6.98Hz)；4.22(1H，d，J＝8.3Hz)；4.34(1H，d，J＝8.6Hz)；4.99(1H，d，J＝7.79Hz)；5.64(1H，d，J＝2.96Hz)；5.70(1H，d，J＝6.98Hz)；6.06(1H，dd，J＝9.27Hz，J′＝2.82Hz)；6.30(1H，t)；6.97(1H，d，J＝9.13Hz)。

2’-O-(5”-O-油酰二乙醇酰)-紫杉醇4.由紫杉醇和油酰二乙醇酸酯合成。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝7.0Hz)；4.46(1H，t，J＝7.96Hz)；4.99(1H，d，J＝8.45Hz)；5.35(2H，m)；5.60(1H，d，J＝2.74Hz)；5.70(1H，d，J＝7.08Hz)；6.05(1H，dd，J＝9.25Hz，J′＝2.55Hz)；6.28(1H，t，J＝8.9Hz)；7.04(1H，d，J＝9.29Hz)。

2’-O-(5”-O-十八烷二乙醇酰)-紫杉醇5.由紫杉醇和十八烷二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝7.0Hz)；4.46(1H，dd，J＝10.74Hz，J′＝6.70Hz)；4.99(1H，d，J＝8.45Hz)；5.60(1H，d，J＝2.82Hz)；5.70(1H，d，J＝7.00Hz)；6.05(1H，dd，J＝9.25Hz，J′＝2.55Hz)；6.28(1H，t，J＝8.9Hz)；7.05(1H，d，J＝9.29Hz)。

2’-O-(5”-O-二十烷二乙醇酰)-紫杉醇6.由紫杉醇和二十烷二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝6.98Hz)；4.0-4.4(5H，m)；4.46(1H，dd，J＝10.75Hz，J′＝6.72)；4.99(1H，d，J＝9.40Hz)；5.60(1H，d，J＝2.96Hz)；5.70(1H，d，J＝7.25Hz)；6.05(1H，dd，J＝9.27Hz，J′＝2.82)；6.29(1H，t，J＝8.3Hz)；7.05(1H，d，J＝9.13Hz)。

2’-O-(5”-O-二十二烷二乙醇酰)-紫杉醇7.由紫杉醇和二十二烷二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝6.98Hz)；4.0-4.4(5H，m)；4.46(1H，dd，J＝10.75Hz，J′＝6.72Hz)；4.99(1H，dd，J＝9.40Hz，J′＝1.61Hz)；5.60(1H，d，J＝2.96Hz)；5.70(1H，d，J＝6.98Hz)；6.05(1H，dd，J＝9.40Hz，J′＝2.95Hz)；6.28(1H，t，J＝8.3Hz)；7.05(1H，d，J＝9.40Hz)。

2’-O-(5”-O-胆固醇基二乙醇酰)-紫杉醇8，由紫杉醇和胆固醇基二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.83(1H，d，J＝x Hz)；4.0-4.4(5H，m)；4.47(1H，dd，J＝10.6Hz，J′＝6.8Hz)；4.63(1H，m)；4.99(1H，d，J＝7.79Hz)；5.38(1H，d，J＝3.76Hz)；5.61(1H，d，J＝2.69Hz)；5.70(1H，d，J＝7.25Hz)；6.06(1H，dd，J＝9.13Hz，J′＝2.69Hz)；6.28(1H，t，J＝8.3Hz)；7.09(1H，d，J＝9.40Hz)。

2’-O-(5”-O-(1’”，2’”-二肉豆蔻酰-sn-甘油二乙醇酰)-紫杉醇9.由紫杉醇和3-(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油)二乙醇酸酯合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.84(1H，d，J＝6.98Hz)；4.47(1H，dd，J＝10.6Hz，J′＝6.8Hz)；4.99(1H，dd，J＝9.54Hz，J′＝1.75Hz)；5.20(1H，m)；5.61(1H，d，J＝2.96Hz)；5.71(1H，d，J＝7.25Hz)；6.07(1H，d，J＝9.27Hz，J′＝2.82Hz)；6.31(1H，t)；7.11(1H，d，J＝9.40Hz)。

实施例2

纳米颗粒制剂

前药、辅助脂质和稳定剂聚合物(通常重量比为1∶1∶2)以浓度为40mg/ml溶解在乙醇/THF(4∶1)中。采用四端口CVIJ混合器^13，14用水快速稀释溶剂，流速设置在12/12/53/53ml/分钟(溶剂/水/水/水)。采用哈佛仪器PHD2000注射泵(Harvard Apparatus PHD2000syringe pump)控制流速。所得溶液对水进行透析，去除残余溶剂。最终药物浓度通常为约0.7mg/ml。当需要较高浓度时，透析后溶液用等体积的600mM蔗糖稀释，然后用新泽西州皮斯卡塔维的通用电气医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)的100kD、0.5mm管腔、60cm通路长度的米德基环状套管(MidGee hoop cartridge)和蠕动泵进行浓缩。用马尔文公司的Zetasizer Nano-ZS粒度仪来检测颗粒大小，并作为体积加权数据报告。

制剂包含重量比为1∶1∶2的前药、辅助脂质和两性稳定剂，浓度为每毫升溶剂中40mg。使用较高的起始浓度(＞40mg/ml)，通常导致产生危及制备的下游操作的大颗粒。辅助脂质为能促进加工的α-生育酚琥珀酸酯(VES)或POPC。在后来的制剂中用POPC代替VES，因为VES在4℃长期储存会发生沉淀。用聚(乙二醇)-b-聚苯乙烯(2kPS3k或2.5kPS3k)作为两性稳定剂。也可以使用其他稳定剂。使用快闪沉降方法，前药/VES/2kPS3k纳米颗粒的平均颗粒直径为10-20nm，前药/POPC/2kPS3k纳米颗粒的平均颗粒直径为20-30nm。

在长期4℃保存后用HPLC监测纳米颗粒制剂的稳定性。

通过剧烈涡流震荡混合含有纳米颗粒的样品(50μL)与150μL稀释剂(甲醇∶乙腈，体积比2∶1)，然后10,000g离心10分钟。取上清液(20μL)注入沃特斯HPLC(Waters HPLC)进行定量，使用Phenomenex SynergiFusion反相分析柱在277nm紫外探测来进行监测。用1mL/分钟的甲醇和10mM醋酸钠缓冲液(pH5.6)流动相梯度洗脱进行层析，从最初的溶剂混合比70∶30到100∶0。柱床温度设定为30℃。在进行HPLC分析前，样品4℃保存在自动取样舱内。

在非缓冲的300mM蔗糖中把4、5、6和POPC/2kPS3k(1∶1∶2)配制在一起，分析显示，在保存11周之后，只有少于5％的游离紫杉醇存在。对照功效实验显示这一水平的游离药物没有抗肿瘤活力(结果未显示)。因此，认为稳定性适用于在这些研究中进行体内实验。

4℃保存在蔗糖溶液或水中的纳米颗粒制剂，直观检察发现其三个月物理性质稳定，除了8在保存1-2周后在一些制剂组合物中形成了沉淀。用VES作为辅助脂质的制剂也导致缓慢形成胶状或晶体状沉淀，可能由于VES从水相分离出来随之在纳米颗粒外形成沉淀。所以VES制剂只适合于短期研究，而不适用于长期实验例如功效评估。

可以通过涡流震荡水、150mM盐水或300mM蔗糖中的前药/辅助脂质/2.5kSP3k(1∶1∶2)后，检测颗粒大小的变化，来研究制剂的物理稳定性(表1)。这些制剂主要由直径在20-30nm纳米颗粒构成。当遇到这些条件时，对于机械压力敏感的颗粒发生聚合或相分离，导致在样品中形成较大颗粒。采用动态光散射监测颗粒大小增加，在剧烈涡流震荡前后检测样品的平均Z值(颗粒分布的强度加权平均大小)。Z_平均值的变化作为由于机械不稳定性形成聚集或沉淀的读出示值代表。ΔZ_平均值较高表示有较高水平的聚集或沉淀(表1)。在盐存在下，用POPC作为辅助脂质的纳米颗粒要比用VES制备的或不含辅助脂质的纳米颗粒明显稳定得多(制剂5分别为ΔZ_平均＝24，372和774nm)。在多数情况下，与水相比，300mM蔗糖存在下稳定性显著提高。ΔZ_平均在0-40nm范围内的蔗糖样品只含有非常少或没有微米大小的材料(＜2％样品)。一些在这些条件下在水和盐水中会产生较高水平聚集(ΔZ_平均＝100-200nm)的前药制剂(3和9)，在蔗糖中是稳定的(ΔZ_平均＝0-40nm)。研究的结论为在300mM蔗糖中配制纳米颗粒采用POPC辅助脂质，可以获得最佳稳定性。

表1

前药制剂的物理稳定性。所有制剂制成溶于水中的前药/辅助脂质/2.5kPS3K(1∶1∶2)纳米颗粒。颗粒直径为由马尔文Nano-ZS粒度仪确定的体积加权平均值。通过监测在涡流震荡30秒之后，稀释在等体积的水、300mM盐水或600mM蔗糖中样品的Z_平均的变化(ΔZ_平均)，来评估稳定性。

当用大样品制备所需的正常加工步骤处理样品时，获得了相似的结果。当暴露于机械应力时，配制在水中或与VES或没有辅助脂质一起配制的纳米颗粒不稳定，在用膜渗滤的浓缩步骤中出现了明显的沉淀形成。可以通过在浓缩前用蔗糖稀释纳米颗粒溶液达到蔗糖终浓度为300mM，来改善浓缩制剂时的稳定性。用POPC作为辅助脂质会进一步改善保存和后续加工中的物理稳定性，与较早的稳定性研究结果一致。本发明后续使用的所有浓缩样品都基于POPC作为辅助脂质并在300mM蔗糖中制备。在这些条件下，在药物浓度为高达8mg/mL时沉淀形成都可以忽略不计。

正如根据酯连接相对不稳定来预测的那样，二乙醇酸酯连接要比琥珀酸酯连接更容易水解。二乙醇酸酯连接的反应性提高，使得正确分析生物样品中的前药更加困难。甲醇∶乙腈(体积比1∶4)能使血浆蛋白几乎全部沉淀，并使前药从纳米颗粒中释放出来。然而，在基质检查和HPLC分析中，观察到在处理血浆样品后游离紫杉醇随时间稳定增加，表明发生水解。二乙醇酸酯前药6在9小时后完全水解，而琥珀酸酯前药2在68小时后减少到约25％。样品用醋酸缓冲到pH4时，没有观察到水解。不存在血浆时未缓冲的6/POPC/2kPS3k样品没有出现这种水解，表明这些制剂中前药的时间依赖性水解更可能是由于存在不沉淀的血浆组分。这些结果提示在颗粒中的前药是稳定的，前药释放后在生物介质中水解。

实施例3

体外活力

MCF-7人肿瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。A2780人肿瘤细胞系购自欧洲细胞培养物保藏中心(英国)。

细胞接触16个的浓度系列稀释的前药/POPC/2.5kPS3k(1∶1∶2)纳米颗粒制剂72小时，3个复孔。在加入DMSO后用标准的3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)检测法在570nm定量测定活细胞。处理后的存活率用相对于未处理对照孔的平均百分率来表示。

用蒸馏水配制的前药/POPC/2.5kPS3k(1∶1∶2)制剂处理A2780和MCF-7人肿瘤细胞，来进行前药细胞毒性的评估(表2)。不含有前药的对照制剂证实其他纳米颗粒组分并不对细胞生长抑制起作用。此外，使用许多不同纳米颗粒制剂(1/VES/2kPS3k；1/2kPS3k和1/克列莫佛)来对1进行评估，表明观察到的活力不依赖于所用制剂的类型。

表2

前药/POPC/2kPS3k(1∶1∶2)制剂对人肿瘤细胞系的抑制作用

琥珀酸酯-连接前药(1和2)要比游离紫杉醇对A2780和MCF-7细胞的效力低1-2个数量级。在多数测试的细胞系中观察到了这个趋势。观察到的活力下降可能是琥珀酸酯基团对水解的阻抗性的结果。后面的前药(3-9)是用二乙醇酸酯连接基团制备的，由于存在3-氧杂(3-oxa)基团它更容易水解。二乙醇酸酯前药都在生长抑制测试中显示出相似的效力(～20nM)，并且比紫杉醇阳性对照的效力低一个数量级。琥珀酰类似物总是要比相应的二乙醇酸酯前药效力低。例如，与紫杉醇的2.4nM相比，在A2780细胞系中琥珀酸酯前药1和二乙醇酸酯前药3的IC₅₀值分别为192nM和25.3nM。同样地，琥珀酸酯前药2和二乙醇酸酯前药4的IC₅₀值分别为75.1和28.4nM。这些结果与相关化合物的文献报道相一致，在MCF-7乳腺癌细胞系中紫杉醇、2’-O-十六烷酰紫杉醇和2’-(2”-溴化十六烷酰紫杉醇的IC₅₀值分别报道为＜1、8600和70nM。

实施例4

体内血浆中纳米颗粒的消除

向无胸腺裸小鼠(n＝3/时间点)静脉内注射测试样品(10微克/克体重，最大量为250μl)。在设定的时间点通过心脏穿刺收集血液并且放到EDTA包被的末梢血微量采集管(BD生物科技公司)中。将该管2800rpm离心10分钟。回收血浆并取50μl等分试样用HPLC分析药物含量。用PicoFluor40^TM闪烁液体(Packard)稀释含有³H-CHE(50μl)的样品，然后用贝克曼库尔特LS 6500多用闪烁计数器(Beckman-Coulter LS 6500 Multipurpose scintillation counter)进行计数。假定每克体重0.04125mL血浆体积，计算每个小鼠血液区室中的总药物(计数)。.

通常用药物运载体系统对大量水相透析，来测定亲脂药物从脂基颗粒制剂中的分离速率。在这些情况下，药物在水相溶解度低，会导致药物分散回到运载体系统中的概率高于通过透析膜上洗脱的概率，引起虚假的低表观分离速率。这一试验没有准确反映体内观察到的疏水药物行为，游离药物能很快分配到存在的大疏水储库(例如，细胞膜或亲脂蛋白)中而不是回到递送载体上。因此透析实验没有如实表明这些制剂的真实分离速率。测定体内真实分离速率的最精确的方法，是用非交换标记物来追踪药物和颗粒。因此，需要鉴别这样一个标记物并且确定它反映了颗粒的药代动力学。

进行追踪前药和颗粒的消除研究，能对前药在体内的分配行为进行更为精确的描述(图1)。前药消除后用HPLC分析，用氚化的胆固醇十六烷基醚(³H-CHE)标记纳米颗粒来测定颗粒消除速率。该标记广泛用于在体内追踪脂质体，因为它在这些系统中被认为是不可交换、不可代谢的脂质标记物。预计该分子的疏水性和低水合水平使其从本研究中所用的纳米颗粒中分离出来的速率低，并且从而可以提供颗粒命运的评估，只要能保持颗粒的完整性。

进行许多实验来确定前述假设的正确性和估计颗粒血浆消除速率。用痕量的³H-CHE标记含有1/VES/2kPS3k(1∶1∶2)和2/VES/2kPS3k(1∶1∶2)的制剂，并监测Foxn1^nu小鼠血浆中标记物和前药的水平(图1，A部分)。在两组中以同样的速率清除³H-CHE标记物，半衰期约为24小时。在这一系统中，前药1以约与³H-CHE相同的速率清除，而2明显清除得更快。比较前药/³H-CHE比例(图1，B部分)显示1与颗粒标记物的比例在实验过程中基本上没有变化，提示其分离半衰期明显要比实验持续时间长得多。相对于³H-CHE，前药2以与分离半衰期约4小时相一致的速率减少。实验数据可与四参数双指数衰减相匹配，意味着分离速率随时间持续变化，大概是因为对药物从个体颗粒中分离出来所致局部环境变化而引起的。

通过在体内使用1/2kPS3k、1/POPC/2kPS3k和³H-CHE标记的1/VES/2kPS3k(1∶1∶2)制剂来比较1和³H-CHE的血浆消除，测定制剂组合物对消除的效果(数据未显示)。对于所有三个制剂，标记物和前药的消除速率都与图1中观察到的1的消除速率相类似，表明在这些制剂中，辅助脂质对于1的消除速率产生很少影响或没有影响。用³H-CHE标记的2kPS3k胶束和POPC/2kPS3k(1∶2)纳米颗粒进行额外的消除研究，两者都不含有前药(数据未显示)。两种情况下，³H-CHE标记都以与图1中观察到的1几乎相同的速率清除。最后用1/VES/3kPS3k和1/VES/2.5kPS1.6k制剂的研究表明稳定剂聚(乙二醇)/聚苯乙烯比例的适度变化对相对于图1所见1的消除几乎没有影响(数据未显示)。

这些制剂中1的消除不依赖于辅助脂质和稳定剂组合物，并且与³H CHE标记物随时间的丢失相对应。这些结果提示不管颗粒组成如何变化，在整个药代动力学试验中³H-CHE标记物与颗粒保持在一起。这些颗粒的循环半衰期特别长(约24小时)，比报道的在这些浓度下用其他聚合物制备的胶束高一个数量级，可以与长循环脂质体所观察到的半衰期相当。

测定前药分离对于血浆药物消除的作用。用前药/POPC/2kPS3k(1∶1∶2)纳米颗粒在Foxn1^nu小鼠中筛选前药，测定不同前药偶联物的消除速率(图2)。前药的循环水平似乎主要依赖于前药分离速率，并且从而间接反映这一速率，因为颗粒足够稳定能够在实验过程中保持完好。偶联物配制成0.7mg/ml的浓度。浓度的差异并不影响颗粒的消除速率，因为1/VES/2.5kPS1.6k(1∶1∶2)的血浆消除在3-25mg/kg的范围内基本不依赖于剂量(结果未显示)。

为了估计每个前药的分离半衰期，假设基于上面讨论的结果1来追踪颗粒消除速率。然后将所有其他前药的消除与四参数双指数式衰减曲线相拟合，并且用1进行标准化。制剂中存在或不存在前药并不显著影响颗粒的消除行为，提示由于药物分离出去引起的组成随时间的变化并不影响颗粒消除速率。所以，用1进行前药消除的标准化，产生这些制剂中前药相对分离半衰期的合理近似值。

前药1在24小时内的分离速率可以忽略不计，而该组合物中2分离出去的半衰期约为1.7小时。这两种前药都使用琥珀酸酯交联剂，在体外活性显著低于紫杉醇。这些化合物的二乙醇酸酯形式(分别为3和4)的消除速度高于它们的琥珀酸酯母体化合物，分离半衰期分别约为13小时和1小时。这与在分配进入水相时因为二乙醇酸连接中存在3-氧杂基团造成水合水平提高相一致。

用分别带有油酰(ΔC18)、十八烷酰(C18)、二十烷酰(C20)和二十二烷酰(C22)基团的4、5、6和7系列化合物来测定脂质锚定物大小的小变化的作用。基于图2的结果，我们估计这些前药的分离半衰期分别为约1小时、1.7小时、6.5小时和10小时。这些结果表明前药从纳米颗粒的释放可以通过调节所用烷基锚定物的长度来进行调节。

也检测了其他常用脂质类型对于分离动力学的作用。胆固醇基二乙醇酸酯偶联物(8)要比直链脂肪族保存时间长得多，估计的分离半衰期约为21小时。不幸的是，储存的8容易从纳米颗粒中相分离，并且在本研究的后续功效研究中未进行充分评估。对1，2’-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-琥珀酸酯衍生物(9)进行评估，因为它带有2个C14锚定物，预期要比7保持更长时间，然而它分离出来速度更快，半衰期为8.5小时。分离速率较高可能是由于在纳米颗粒交换过程中甘油骨架的水合水平提高。

实施例5

体内功效

用26号针头向雌性无胸腺裸小鼠(7-8周龄)皮下接种100μl HT29人结肠癌细胞(2x10⁶细胞)。小鼠随机分组(n＝6/组)，在第一次处理前，平均肿瘤大小在80-120mg之间(大于200mg或小于30mg的肿瘤被弃去)。按10μl药物/克体重的体积注射测试样品，最大值为250μl。根据设定的时间表进行后续注射。每周2-3次记录肿瘤长度和宽度检测、体重和生活现象观察。根据公式(LxW²)/2计算肿瘤重量。

根据Q4Dx6方案，用36μmol/kg的剂量在HT29模型中，测定1、2、4、5、6和7纳米制剂的相对功效。用盐水作为阴性对照。用亚极值剂量进行的前期实验表明该剂量会导致包括阳性对照和阴性对照组的行为在内的一系列应答，并且以这种方式可以识别每种前药物质的相对治疗潜力。这个研究中不包括前药8，因为在储存中该药物从制剂中沉淀出来。前药3和9也从中删除了，因为他们的分离半衰期与6和7相似。

2个琥珀酸酯连接前药1和2在34μmol/kg剂量时没有表现出任何疗效。这个结果与体外细胞生长抑制测试中观察到的这些前药的效力要比紫杉醇低1-2个数量级(表2)相关联。2和1的分离半衰期相差很大，从2的1.7小时到1在实验时限中基本上不可交换。这些结果表明即使琥珀酸酯连接物质2可以用于细胞，但是水解率低并且伴随的紫杉醇释放不足以提供有意义的治疗应答。

初步体内颗粒分布研究表明，肿瘤蓄积水平平台出现在～3％注射剂量/克肿瘤组织时，大部分蓄积发生在最初的8小时内。文献报道了相似的结果。在分离半衰期分别为约1和1.7小时的4和5前药的情况下，预期药物递送到肿瘤的水平明显更低，可能导致这些物质观察到的功效降低。前药6和7以较低的速率释放药物，分离半衰期分别为约6.5和10小时。因为预期在所有情况下肿瘤中颗粒的蓄聚是相似的，所以这些前药的制剂能把更多的药物递送到肿瘤。

4、5、6和7等4种二乙醇酸酯连接物质都导致对肿瘤生长不同程度的抑制。这些前药的体外生长抑制研究表明，二乙醇酸酯连接前药的细胞毒性大于它们的琥珀酸酯类似物(表2)。这些制剂的消除数据表明，脂肪链的长度与前药的分离半衰期相关，分别为1小时、1.7小时、6.5小时和10小时。这与观察到的功效趋势很好地关联起来，分离半衰期最长的前药(也就是二十二烷基偶联物)具有最强的抗肿瘤应答。用治疗诱导的达到肿瘤平均大小500mm³的延迟时间来测定相对功效，产生的数值分别为3、4、15和17天。基于这些结果，着手进行进一步研究以优化7的纳米颗粒制剂的剂量和时间安排。

实施例6

剂量对于7功效的影响

在HT29肿瘤模型中比较0.25到3摩尔紫杉醇当量的剂量的功效(图4)，来确定POPC/2.5kPS3k纳米颗粒制剂中7相对于紫杉醇的活力。按Q2Dx5方案用23μmol/kg剂量给予泰素作为阳性对照。选择这样的给药方案，是由于按Q2D的方案7获得最佳功效，这对泰素(Taxol)也是最优的，在这一泰素剂量下最大耐受疗程为5次注射。按这一方案7的最大耐受剂量为约3紫杉醇当量(69μmol/kg)。

用两种方法分析肿瘤生长数据，确定哪一个剂量的7会等同于泰素阳性对照。在第一个方法中，只考虑肿瘤消退的治疗组。检测从治疗开始到达到125mg大小肿瘤的延迟时间，并且用泰素组观察到的延迟进行标准化。用相对延迟对7的紫杉醇剂量当量作图，形成了直到7的MTD为线性剂量反应的一组数据。拟合曲线表明7在1.75倍紫杉醇剂量当量的剂量时达到相当于泰素的效果。在第二个分析中，检测了相对于盐水阴性对照，达到300mg大小肿瘤的延迟时间，并且用泰素组观察到的延迟进行标准化。用相对延迟对7的紫杉醇剂量当量作图，产生线性剂量反应，表明7在1.65倍紫杉醇当量时达到相当于泰素的效果。重要的是，用2摩尔紫杉醇当量(69μmol/kg)，即其MTD(69μmol/kg)给予7的纳米颗粒制剂时，它的抗肿瘤活性要显著高于用MTD量给予泰素所得的活性。特别是，用MTD量的7纳米颗粒制剂治疗的肿瘤在60天还保持在50mg以下，而用MTD量的泰素治疗的肿瘤长到了约300mg(图4)。

图5显示达到相当于泰素^TM效果的7的紫杉醇当量数的计算。

相对于泰素评估剂量对于7纳米颗粒功效的影响。在HT29实体肿瘤模型中Q2D给药方案获得了最佳治疗反应。用于配制7的纳米颗粒的消除半衰期约24-36小时，而7本身的分离半衰期为约10小时。这些值与给予后约2天时间中前药在肿瘤位点的有效释放相匹配，符合Q2D方案。与MTD的泰素相比，确定0.25x到3x紫杉醇当量的药物剂量的功效，表明7在约1.7紫杉醇当量达到了等价的功效。由于7的剂量反应直到MTD是线性上升的，所以可以使用更高剂量的7将功效显著提高到泰素最大耐受剂量以上。在纳米颗粒中比7保留特性更好的前药可以在甚至比7更低的剂量获得相当的功效。